專利名稱：使用抗ErbB抗體－類美坦素偶聯(lián)物的治療方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及用抗ErbB受體的抗體與類美坦素的偶聯(lián)物進(jìn)行ErbB受體靶向癌癥治療的方法，以及其中所用的制品。
相關(guān)技術(shù)說明1.美坦素和類美坦素最早，美坦素分離自非洲灌木Maytenus serrata(美國(guó)專利3,896,111)。后來發(fā)現(xiàn)，有些微生物也能產(chǎn)生類美坦素，例如美坦醇和C-3美坦醇酯(美國(guó)專利4,151,042)。以下專利中描述了美坦醇及其類似物美國(guó)專利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533。
美坦素和類美坦素具有強(qiáng)細(xì)胞毒性，但它們?cè)诎┌Y化療中的應(yīng)用受到極大限制，因?yàn)樗鼈儗?duì)腫瘤的選擇性差會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。美坦素的臨床試驗(yàn)因其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道系統(tǒng)的嚴(yán)重副作用而中止(Issel等，癌癥治療回顧5199-207(1978))。
2.ErbB族受體酪氨酸激酶和抗ErbB抗體ErbB族受體酪氨酸激酶是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活重要的介質(zhì)。該受體家族包括4個(gè)不同成員上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR或ErbB1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
最早鑒定的p185neu是化療大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。neu原癌基因的活化形式緣于其編碼蛋白跨膜區(qū)內(nèi)的一個(gè)點(diǎn)突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳房癌和卵巢癌中可觀察到人neu擴(kuò)增，且與預(yù)后差相關(guān)(Slamon等，科學(xué)，235177-182(1987)；Slamon等，科學(xué)，244707-712(1989)；和美國(guó)專利4,968,603)。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)人腫瘤發(fā)生類似neu原癌基因中的點(diǎn)突變。在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌等其他癌癥中也存在ErbB2過量表達(dá)(通常但非一定是因?yàn)榛驍U(kuò)增)。見King等，科學(xué)，229974(1985)；Yokota等，柳葉刀，1765-767(1986)；Fukushigi等，分子細(xì)胞生物學(xué)，6955-958(1986)；Geurin等，癌基因研究，321-31(1988)；Cohen等，癌基因，481-88(1989)；Yonemura等，癌癥研究，511034(1991)；Borst等，婦科醫(yī)學(xué)與腫瘤學(xué)，38363(1990)；Weiner等，癌癥研究，50421-425(1990)；Ken等，癌癥研究，505184(1990)；Park等，癌癥研究，496605(1989)；Zhau等，分子癌癥學(xué)，3354-357(1990)；Aasland等，英國(guó)癌癥雜志，57358-363(1988)；Williams等，病理生物學(xué)5946-52(1991)；和McCann等，癌癥，6588-92(1990)。ErbB2還可能在前列腺癌中過量表達(dá)(Gu等，癌癥通訊，99185-9(1996)；Ross等，人類病理學(xué)，28827-33(1997)；Ross等，癌癥，792162-70(1997)；和Sadasivan等，泌尿?qū)W雜志，150126-31(1993))。2000年4月13日的PCT公開WO00/20579描述了一種erbB2癌基因的剪接形式，該形式編碼一種組成型酪氨酸磷酸化的ErbB2受體。由這種剪接變異體編碼的erbB2蛋白框內(nèi)缺失了16個(gè)氨基酸(CVDLDDKGCPAEQRAS)，其中2個(gè)是保守性半胱氨酸。
大鼠p185neu和人ErbB2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已有所描述。Drebin與其同事獲得了抗大鼠neu基因產(chǎn)物p185neu的抗體。見例如Drebin等，細(xì)胞，41695-706(1985)；Myers等，酶促方法，198277-290(1991)；和WO94/22478。Drebin等在癌基因，2273-277(1988)中稱，與p185neu兩個(gè)不同區(qū)域反應(yīng)的抗體的混合物對(duì)植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞具有抗腫瘤協(xié)同作用。另可見例如1998年10月20日的美國(guó)專利5,824,311。
以下文獻(xiàn)中描述了其他不同特性的抗ErbB2抗體Tagliabue等，世界癌癥雜志，47933-937(1991)；McKenzie等，癌基因，4543-548(1989)；Maier等，癌癥研究515361-5369(1991)；Bacus等，癌發(fā)生分子學(xué)，3350-362(1990)；Stancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991)；Bacus等，癌癥研究522580-2589(1990)；Xu等，世界癌癥雜志53401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等，癌癥研究522771-2776(1992)；Hancock等，癌癥研究514575-4580(1991)；Shawver等，癌癥研究541367-1373(1994)；Arteaga等，癌癥研究543758-3765(1994)；Harweuth等，生物化學(xué)雜志26715160-15167(1992)；美國(guó)專利5,783,186；和Klapper等，癌基因142099-2109(1997)。
Hudziak等在分子細(xì)胞生物學(xué)9(3)1165-1172(1989)中描述了一組抗ErbB2抗體的產(chǎn)生，這種方法的特征在于使用人乳房癌細(xì)胞線SK-BR-3。在SK-BR-3細(xì)胞與抗體接觸72小時(shí)后，通過細(xì)胞單層結(jié)晶紫染色測(cè)定了細(xì)胞的相對(duì)增殖率。用該試驗(yàn)，最大抑制來自被稱為4D5的抗體，該抗體可抑制56％的細(xì)胞繁殖。該組中其他抗體在該試驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞繁殖的抑制程度較低。還發(fā)現(xiàn)，抗體4D5可以使得ErbB2過量表達(dá)的乳房癌細(xì)胞對(duì)TFN細(xì)胞毒作用敏感。另可見例如1997年10月14日的美國(guó)專利5,677171。Hudziak等所述的抗ErbB2抗體在以下文獻(xiàn)中得到了進(jìn)一步的鑒定Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)；Kotts等，體外26(3)59(A)(1990)；Sarup等，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)172-82(1991)；Shepard等，臨床免疫學(xué)雜志11(3)117-127(1991)；Kumar等，分子細(xì)胞生物學(xué)11(2)979-986(1991)；Lewis等，癌癥與免疫學(xué)與免疫治療學(xué)37255-263(1993)；Pietras等，癌基因91829-1838(1994)；Vitetta等，癌癥研究545301-5309(1994)；Sliwkowski等，生物化學(xué)雜志269(20)14661-14665(1994)；scott等，生物化學(xué)雜志26614300-5(1991)；D′souza等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)917202-7206(1994)；Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996)；和Schaefer等，癌基因151385-1394(1997)。
小鼠單克隆抗HER2抗體可抑制過量表達(dá)HER2達(dá)2+和3+水平的乳房癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是對(duì)于低水平表達(dá)HER2的細(xì)胞則沒有作用(Lewis等，癌癥與免疫學(xué)與免疫治療學(xué)(1993))。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，將4D5人源化(Carter等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)894285-4289(1992))。在經(jīng)傳統(tǒng)化療后仍過量表達(dá)HER2的乳房癌患者中對(duì)稱為HERCEPTIN的這一人源化版本(huMAb4D5-8，rhuMAbHER2，美國(guó)專利5,821,337)進(jìn)行了測(cè)試(Baselga等，臨床腫瘤學(xué)雜志14737-744(1996)；Cobleigh等，臨床腫瘤學(xué)雜志172639-2648(1999))。該試驗(yàn)中的大多數(shù)患者有3+水平的HER過量表達(dá)，但其中一部分是2+腫瘤。值得注意的是，HERCEPTIN在15％的患者中誘導(dǎo)產(chǎn)生了臨床反應(yīng)(4％為完全反應(yīng)，11％為部分反應(yīng))，反應(yīng)持續(xù)時(shí)間的中值為9.1個(gè)月。1998年9月25日，HERCEPTIN經(jīng)食品與藥物管理委員會(huì)準(zhǔn)許上市用于治療過量表達(dá)ErbB2蛋白的惡性乳房癌患者。
同源性篩選發(fā)現(xiàn)了另外2個(gè)ErbB受體家族的成員ErbB3(美國(guó)專利5,183,884和5,480,968，以及Kraus等，PNAS(USA)869193-9197(1989)和ErbB4(歐洲專利申請(qǐng)599,274；Plowman等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)901746-1750(1993)；和Plowman等，自然366473-475(1993))。這2種受體都在至少部分乳房癌細(xì)胞線中過量表達(dá)。
3.類美坦素-抗體偶聯(lián)物為了提高治療指數(shù)，目前將美坦素和類美坦素與特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的抗體偶聯(lián)。含類美坦素的免疫偶聯(lián)物可見例如美國(guó)專利5,208,020；5,416,064和歐洲專利0 425 234 B1。Liu等在美國(guó)科學(xué)院院報(bào)938618-8623(1996)中描述了含類美坦素DM1與抗人結(jié)腸直腸癌單克隆抗體C242相連的免疫偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞具有強(qiáng)細(xì)胞毒作用，并在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)中表現(xiàn)出抗癌活性。Chari等在癌癥研究52127-131(1992)中描述的免疫偶聯(lián)物中，類美坦素通過二硫鍵與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞線上抗原的小鼠抗體A7偶聯(lián)，或與結(jié)合HER2/neu癌基因的小鼠單克隆抗體TA.1偶聯(lián)。體外測(cè)定了TA.1-類美坦素偶聯(lián)物對(duì)人乳房癌細(xì)胞線SK-BR-3的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞線每細(xì)胞表達(dá)3×105HER-2表面抗原。該藥物偶聯(lián)物獲得了與游離類美坦素藥物相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，這種毒性可以通過增加每個(gè)抗體上結(jié)合的類美坦素分子數(shù)量來提高。A7-類美坦素偶聯(lián)物在小鼠中的全身性細(xì)胞毒性較低。
雖然HERCEPTIN是曾嘗試過多種抗癌治療的ErbB2過量表達(dá)型乳房癌治療史的一次突破，但約85％的受治者對(duì)HERCEPTIN療法無反應(yīng)或者只有弱反應(yīng)，而且，在獲準(zhǔn)上市前的臨床試驗(yàn)中，全部受治患者的發(fā)病前時(shí)間中值僅為3.1個(gè)月。所以，臨床上亟需進(jìn)一步開發(fā)HER2-靶向的抗癌藥物，以用于哪些對(duì)HERCEPTIN療法無反應(yīng)或者只有弱反應(yīng)的HER2過量表達(dá)型腫瘤或其他HER2表達(dá)相關(guān)性疾病的患者。
本發(fā)明概述本發(fā)明的基礎(chǔ)是出人意料的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HERCEPTIN-類美坦素偶聯(lián)物治療HERCEPTIN療法無反應(yīng)或弱反應(yīng)型HER2(ErbB2)過量表達(dá)型腫瘤治療中非常有效。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一涉及治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，所述腫瘤的特征在于過量表達(dá)ErbB受體，而且對(duì)單克隆抗ErbB抗體治療無反應(yīng)或弱反應(yīng)，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的抗ErbB抗體與類美坦素的偶聯(lián)物。
在優(yōu)選實(shí)施方式之一中，所述患者是人。另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述ErbB受體是(人)ErbB2(HER2)。所述方法不受所用抗ErbB抗體作用機(jī)制的限制。因此，所述抗ErbB抗體可具有，例如，生長(zhǎng)抑制特性和/或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或凋亡。在一特定優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法涉及對(duì)乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌等癌癥的治療。較好的是，乳房癌，尤其是過量表達(dá)ErbB2達(dá)2+水平或以上的乳房癌，達(dá)3+水平更好。優(yōu)選組的抗體具有4D5單克隆抗體的生物學(xué)特征，或與4D5單克隆抗體結(jié)合相同的表位，特別好的是鼠源單克隆抗體4D5(ATCCCRL 10463)的人源化形式。
本發(fā)明偶聯(lián)物所用的類美坦素可以是美坦素，或者，美坦醇或美坦醇酯更好。所述抗體和類美坦素可通過例如N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)丙酸酯(SPDP)或N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)等雙特異性化學(xué)接頭偶聯(lián)?？贵w與類美坦素之間的接頭可以是例如二硫鍵，硫醚，酸不穩(wěn)定性基團(tuán)，光不穩(wěn)定性基團(tuán)，肽酶不穩(wěn)定性基團(tuán)，或酯酶不穩(wěn)定性基團(tuán)。
本發(fā)明的另一內(nèi)容涉及一種制品，它包括一個(gè)容器和其中的組合物，該組合物包含抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物，還包含包裝內(nèi)說明或標(biāo)簽，上面說明了該組合物可用于治療以ErbB受體過量表達(dá)(最好達(dá)2+水平或以上)為特征的癌癥。


圖1是類美坦素“DM1”的結(jié)構(gòu)。
圖2是HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)。
圖3是HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物在Sephacryl S300凝膠過濾柱上的洗脫曲線。
圖4是HER2轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建物的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，該構(gòu)建物指導(dǎo)天然人HER2(ErbB2)在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中的表達(dá)。該圖還包括HER2(ErbB2)cDNA插入片段的核苷酸序列(SEQ ID NO2)，以及HER2(ErbB2)的推定氨基酸序列(SEQ ID NO3)，包括信號(hào)序列。在SEQ ID NO3中，殘基22-645是HER2(ErbB2)的胞外區(qū)。
圖5顯示HERCEPTIN-DM1對(duì)HER2轉(zhuǎn)基因腫瘤的作用。將2mm3大小的MMTV HER2-轉(zhuǎn)基因腫瘤切片移植到FVB小鼠的乳房脂肪層中。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到250mm3時(shí)，連續(xù)5天給一組8個(gè)小鼠i.v.注射HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物。另2組小鼠每周用10mg/kg HERCEPTIN或RITUXAN進(jìn)行IP處理兩次。
圖6顯示人源化抗HER2抗體2C4的重鏈可變區(qū)序列。
圖7顯示人源化抗HER2抗體2C4的輕鏈可變區(qū)序列。
本發(fā)明的詳細(xì)描述1.定義除非另作說明，本文中科技術(shù)語的意義與本領(lǐng)域的常規(guī)理解相同。Singleton等，微生物學(xué)和分子生物學(xué)辭典，第2版，J.Wiley & Sons(New York，NY 1994)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)看出，還有許多與本文所述相似或等效的方法和材料可用于本發(fā)明。實(shí)際上，本發(fā)明并不局限于后文所述的方法和材料。本發(fā)明中術(shù)語的含意如下“ErbB受體”或“ErbB”指屬于ErbB受體家族的酪氨酸激酶受體蛋白，包括ErbB1(EGFR)，ErbB2，ErbB3和ErbB4受體，以及將來可能鑒定到的該家族其他成員。該定義特別包括相應(yīng)erbB癌基因剪接形式所編碼的ErbB受體，這包括但不限于已公開PCT申請(qǐng)WO00/20579(2000年4月13日公開)中所述的ErbB2缺失變體。ErbB受體一般包括一個(gè)結(jié)合ErbB配體的胞外區(qū)；親脂性跨膜區(qū)；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)；和包含數(shù)個(gè)可磷酸化酪氨酸殘基的羧基末端信號(hào)區(qū)。所述ErbB受體可以是“天然序列”的ErbB受體，或其功能性衍生物，例如“氨基酸序列變體”。優(yōu)選的是天然序列人ErbB受體。
“ErbB1”，“表皮生長(zhǎng)因子受體”和“EGRF”在本文中通用，都表示天然序列的EGFR，例如Carpenter等，生物化學(xué)年度回顧，56881-914(1987)所述，包括其天然突變體(例如Humphrey等，PNAS(USA)，874207-4211(1990)所述的缺失突變EGFR，及其功能性衍生物，例如氨基酸序列變體。erbB1表示編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。
“ErbB2”或“HER2”在本文中通用，都表示天然序列的人HER2蛋白，見例如Semba等，PNAS(USA)，826497-6501(1985)和Yamamoto等，自然319230-234(1986)(Genebank登錄號(hào)X03363)，及其功能性衍生物，例如氨基酸序列變體。erbB2指編碼人HER2的基因，neu表示編碼大鼠p185neu的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列的人HER2。結(jié)合HER2的抗體的例子包括MAbs4D5(ATCC CRL10463)，2C4(ATCC HB-12697)，7F3(ATCC HB-12216)和7C2(ATCC HB 12215)(見，美國(guó)專利5,772,997，WO98/77797；和美國(guó)專利5,840,525)。人源化抗HER2抗體包括美國(guó)專利5,821,337中表3中的huMAb4D5，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)；人源化520C9(WO93/21319)。有關(guān)人抗HER-2抗體可見1998年6月30日的美國(guó)專利5,772,997和1997年1月3日公開的WO97/00271。
“ErbB3”和“HER3”指受體多肽(例如美國(guó)專利5,183,884和5,480,968以及Kraus等，PNAS(USA)869193-9197(1989)所述)，及其功能性變體，包括其氨基酸序列變體。結(jié)合HER3的抗體的例子包括美國(guó)專利5,968,511(Akita和Sliwkowski)所述，例如8B8抗體(ATCC HB12070)或其人源化變體。
“ErbB4”和“HER4”指受體多肽(例如歐洲專利申請(qǐng)599,274；Plowman等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)901746-1750(1993)；和Plowman等，自然，366473-475(1993)，及其功能性變體，包括其氨基酸序列變體，例如WO99/19488所述的HER4同種異型。
“天然”或“天然序列”EGFR，HER2，HER3或HER4多肽可以分離自大自然，也可以用重組DNA技術(shù)、化學(xué)合成法，或以上及類似技術(shù)的聯(lián)合制得。
“功能性衍生物”包括氨基酸序列變體，以及天然多肽的共價(jià)衍生物，條件是它們保留了與天然多肽相當(dāng)?shù)纳锘钚?。氨基酸序列變體與天然氨基酸序列的差異一般在于天然氨基酸序列中中一個(gè)或多肽氨基酸的取代、缺失和/或插入。缺失變體包括天然多肽的片段和N端和/或C端截短變體。通常，氨基酸序列變體與天然多肽應(yīng)具有至少70％，甚至至少80％，甚至至少90％的同源性。
“同源性”指氨基酸序列排列對(duì)比后(為了獲得最大同源性百分比，可以引入必要的空距)相同殘基的百分比。用于序列排列對(duì)比的方法和計(jì)算機(jī)程序都是本領(lǐng)域所熟知的。此類程序之一是Genetech Inc.的“Align 2”，已于1991年12月10日向美國(guó)版權(quán)局(Washington，DC 20559)登記。
“ErbB配體”指能結(jié)合和/或激活ErbB受體的多肽。本發(fā)明中特別有意義的ErbB配體是天然序列人ErbB配體，例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Savage等，生物化學(xué)雜志2477612-7621(1972))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)(Marqardt等，科學(xué)2231079-1082(1984))；雙調(diào)蛋白(又稱施旺細(xì)胞或角質(zhì)形成細(xì)胞自泌生長(zhǎng)因子(Shoyab等，科學(xué)2431074-1076(1989)，Kimura等，自然348257-260；和Cook等，分子細(xì)胞生物學(xué)112547-2557(1991))；betacellulin(Shing等，科學(xué)2591604-1607(1993)；和Sasada等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊1901173(1993))；肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)(Higashiyama等，科學(xué)251936-939(1991))；上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin)(Toyoda等，生物化學(xué)雜志2707495-7500(1995)；和Komurasaki等，癌基因152841-2848(1997))，heregulin(見后文)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway等，自然387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhang等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)949562-9567(1997))；或cripto(CR-1)(Kannan等，生物化學(xué)雜志272(6)3330-3335(1997))。結(jié)合ERFR的ErbB配體包括EGF，TGF-α，雙調(diào)蛋白，betacellulin，HB-EGF和上皮調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)合HER3的ErbB配體包括heregulin。結(jié)合HER4的ErbB配體包括betacellulin，HB-EGF，NRG-2，NRG-3和heregulin。
“heregulin(HRG)”指激活(即結(jié)合后誘導(dǎo)復(fù)合物中酪氨酸殘基的磷酸化)ErbB2-ErbB3和ErbB2-ErbB4蛋白質(zhì)復(fù)合物的多肽。其所包括的各種heregulin多肽可見Holmes等，科學(xué)2561205-1210(1992)；WO92/20798；Wen等，Mol，Cell，Biol.，14(3)1909-1919(1994)和Marchiomi等，自然362312-318(1993)所述。該術(shù)語包括天然HRG多肽的生物活性片段和/或變體，例如其EGF-樣區(qū)域片段(例如HRGβ177-244)。
“Erb異寡聚物”是至少兩種不同ErbB受體非共價(jià)偶聯(lián)的寡聚物。當(dāng)表達(dá)兩種或兩種以上ErbB受體的細(xì)胞接觸ErbB配體時(shí)就會(huì)形成此類復(fù)合物，它們可以按照例如Sliwkowski等，生物化學(xué)雜志269(20)14661-14665(1994)所述通過免疫沉淀進(jìn)行分離，用SDS-PAGE進(jìn)行分析。此類ErbB異寡聚物的例子包括EGFR-HER2，HER2-HER3和HER3-HER4復(fù)合物。而且，所述ErbB異寡聚物還包括兩個(gè)或兩個(gè)以上HER2受體與HER3、HER4或EGFR等另外的ErbB受體的組合。所述異寡聚物也包括細(xì)胞因子受體亞基(例如gp130)等其他蛋白質(zhì)。
在有關(guān)HER2變體(例如HER2片段)的描述中，“具有天然人HRE2的生物學(xué)活性”表示當(dāng)所述片段在本發(fā)明(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物模型中過量表達(dá)時(shí)，其誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)的能力與天然HER2相當(dāng)。
“腫瘤”指各種瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(不論其是惡性還是良性)，以及各種癌前和癌性細(xì)胞和組織。
“癌”和“癌性”表示哺乳動(dòng)物中以細(xì)胞生長(zhǎng)失控為特征的生理狀況。癌的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，乳房癌，肉瘤，和白血病或淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌，包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺部的腺癌和肺部的鱗狀細(xì)胞癌，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，惡性膠質(zhì)瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳房癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，陰道癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
過量表達(dá)某種ErbB受體的癌指細(xì)胞表面ErbB受體(例如HER2)水平明顯高于同類組織非癌性細(xì)胞。這樣的過量表達(dá)可能是因?yàn)榛驍U(kuò)增或轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強(qiáng)所致。ErbB受體過量表達(dá)可以在診斷或預(yù)后試驗(yàn)中通過測(cè)定(例如通過免疫組織化學(xué)試驗(yàn)IHC)細(xì)胞表面ErbB蛋白質(zhì)水平升高來判斷，也可以通過測(cè)定細(xì)胞中ErbB編碼核酸的水平(例如通過原位熒光雜交FISH；見WO98/45479，1998年10月公開)，Southern印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(例如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR))。還可以通過檢測(cè)血清等生物液中的脫落抗原(shed antigen)(例如ErbB胞外區(qū))來研究ErbB受體過量表達(dá)(見，例如美國(guó)專利4,933,294，1990年6月12日授權(quán)；WO91/05264，1991年4月18日公開；美國(guó)專利5,401,638，1995年3月28日授權(quán)；和Sias等，免疫學(xué)方法雜志13273-80(1990))。除此之外，還可以采用各種已知的體內(nèi)試驗(yàn)。例如，可以讓患者體內(nèi)的細(xì)胞與抗體(可以帶有放射性同位素等可檢測(cè)標(biāo)記)接觸，然后通過體外放射性掃描或分析接觸抗體前取自患者的活組織樣品來測(cè)評(píng)抗體與細(xì)胞的結(jié)合。
可根據(jù)每個(gè)細(xì)胞表達(dá)的HER2分子拷貝數(shù)(這可以用生物化學(xué)方法測(cè)定)將過量表達(dá)HER2的腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)分并進(jìn)行生物化學(xué)分級(jí)0＝0-10,000拷貝/細(xì)胞，1+＝至少約200,000拷貝/細(xì)胞，2+＝至少約500,000拷貝/細(xì)胞，3+＝至少約2,000,000拷貝/細(xì)胞。3+水平的HER2過量表達(dá)可引起酪氨酸激酶的非配體依賴性激活(Hudziak等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)847159-7163(1987))，可見于約30％的乳房癌，這些患者的無復(fù)發(fā)存活率和總存活率大大降低(Slamon等，科學(xué)244707-712(1989)；Slamon等，科學(xué)235177-182(1987))。
相反，“并非以ErbB受體過量表達(dá)為特征的”癌指，在診斷試驗(yàn)中，與同類組織的非癌細(xì)胞相比，其表達(dá)ErbB受體并不高于正常水平。
“非激素依賴性”癌指其增殖不依賴于存在結(jié)合癌細(xì)胞表面受體的激素。此類癌在臨床給予降低腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍激素濃度的藥物或手術(shù)不能緩解。非激素依賴性癌的例子包括非雄激素依賴性前列腺癌，非雌激素依賴性乳房癌，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。此類癌可能始于激素依賴性腫瘤，在接受抗激素治療后，由激素敏感期發(fā)展成為非激素控制性腫瘤。
“抗體”在此取其最廣義的解釋，具體包括完整單克隆抗體，多克隆抗體，由至少2個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們都具有所需的生物學(xué)活性。
“單克隆抗體”指該抗體來自一群基本均一抗體，即構(gòu)成該集群的各抗體完全相同，除了可能存在的少量天然突變。單克隆抗體具有針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)的高特異性。而且，與多克隆抗體制劑不同，多克隆抗體制劑包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體，每個(gè)單克隆抗體只針對(duì)抗原的一個(gè)決定簇。除了特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于在合成時(shí)可以不受其他抗體的污染。修飾語“單克隆”表示該抗體的特征在于來自一個(gè)基本均一的抗體群，而不應(yīng)理解成需由特殊方法制得。例如，本發(fā)明的單克隆抗體可以通過雜交瘤方法獲得(Kohler等，自然256495(1975))，或通過重組DNA方法制得(見美國(guó)專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可以如Clackson等，自然352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)所述，從噬菌體抗體庫中分離得到。
本發(fā)明中，單克隆抗體還特別包括“嵌合”抗體及其片段，即重鏈和/或輕鏈的一部分與某種、某類或某亞類抗體相同或同源，其余部分則與另一種、類或亞類抗體相同或同源，只要它們具有所需的生物學(xué)活性(美國(guó)專利4,816,567；和Morrison等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)816851-6855(1984))。本發(fā)明的嵌合抗體包括靈長(zhǎng)化(primatized)抗體，其中包含來自非人靈長(zhǎng)類(例如古猴，猩猩等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
“抗體片段”包括抗體的一部分，最好是抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2和Fv片段；二抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
“完整抗體”包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)，重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)。恒定區(qū)可以是天然序列(例如人天然恒定區(qū)序列)或其氨基酸序列變異體。較好的是具有一種或多種效應(yīng)功能的完整抗體。
非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指包含最少量非人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。大多數(shù)人源化抗體是人接受者免疫球蛋白的超變區(qū)殘基被換成具有所需特異性、親和力和功能的非人(例如小鼠、大鼠、兔子或非人靈長(zhǎng)類)超變區(qū)殘基(供者抗體)。有時(shí)，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基也被置換以非人殘基。而且，人源化抗體還可以包含受者抗體或供者抗體中沒有的殘基。這些修飾是為了進(jìn)一步優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體一般包含至少一個(gè)，通常是兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或幾乎所有超變環(huán)與非人免疫球蛋白的相對(duì)應(yīng)，而FR則完全或幾乎完全是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)(通常是人免疫球蛋白Fc)的至少一部分。有關(guān)細(xì)節(jié)見Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，當(dāng)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)見解2593-596(1992)。
人源化抗ErbB2抗體包括美國(guó)專利5,821,337的表3中的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)；和該專利圖6中的人源化2C4抗體。
抗體的“效應(yīng)功能”指抗體Fc區(qū)(Fc區(qū)天然序列或其氨基酸序列變異體)產(chǎn)生的生物學(xué)活性，例如C1q結(jié)合性；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合性；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體即BCR)下調(diào)，等。
完整抗體可根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列分為不同的“類”。主要的五類是IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾類還可以分為不同的“亞類”(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4；IgA1和IgG2。抗體不同類的重鏈恒定區(qū)分別稱為……。免疫球蛋白不同類的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型都是眾所周知的。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)”指以下由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，然后引起靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ACDD的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞只表達(dá)Fc RIII，單核細(xì)胞則表達(dá)Fc RI，F(xiàn)c RII和Fc RIII。Ravetch和Kinet，免疫學(xué)粘度回顧9457-92(1991)第464頁的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。可通過體外ADCC試驗(yàn)，例如美國(guó)專利5,500,362或5,821,337，來評(píng)價(jià)某分子的ADCC活性?？捎糜诖祟愒囼?yàn)的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。或者，也可以通過動(dòng)物模型體內(nèi)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)某分子的ADCC活性，例如Clynes等，PANS(USA)95652-656(1998)所述。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FeR，并具有效應(yīng)功能的白細(xì)胞。較好的是，此類細(xì)胞至少表達(dá)Fc RIII，并具有ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源中分離，例如自血液或PBMC中分離。
“Fc受體”或“FcR”指結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR應(yīng)能結(jié)合IgG抗體(γ受體)，這包括Fc RI、Fc RII和Fc RIII亞類，包括它們的等位變體和不同拼接形式。Fc RII受體包括Fc RIIA(“活化受體”)和Fc RIIB(“抑制受體”)，它們的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在于胞質(zhì)區(qū)。活化受體Fc RIIA的胞質(zhì)區(qū)含有一個(gè)免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc RIIB的胞質(zhì)區(qū)含有一個(gè)免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見M.Daeron，免疫學(xué)年度回顧15203-234(1997))。有關(guān)FcR可見Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年度回顧9457-92(1991)；Capel等，免疫學(xué)方法425-34(1994)；和的Hass等，實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志126330-41(1995)。本發(fā)明的“FcR”還包括將來鑒定到的FcR，還包括新生兒受體即FcRn，它負(fù)責(zé)IgG的母嬰傳遞(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指分子在補(bǔ)體存在下裂解白細(xì)胞的能力。補(bǔ)體活化路徑從補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)與某分子(例如抗體)與相應(yīng)抗原的復(fù)合物結(jié)合開始?？赏ㄟ^CDC實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)補(bǔ)體的激活，例如Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法雜志202163(1996)。
“天然抗體”通常為四聚糖蛋白，分子量約150,000道爾頓(Da)，由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條輕鏈通過一個(gè)二硫共價(jià)鍵與一條重鏈相連，免疫球蛋白不同同種型重鏈間二硫鍵的數(shù)量是不同的。每一重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈間二硫橋。每一重鏈的一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，后跟數(shù)個(gè)恒定區(qū)。每一輕鏈的一端為可變區(qū)(VL)，另一端為恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)對(duì)齊，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對(duì)齊?？梢哉J(rèn)為，特定的殘基在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間形成了一個(gè)界面。
抗體描述中的“可變”指抗體可變區(qū)的某些部分彼此之間差異很大，并被用于特定抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，抗體可變區(qū)的可變性分布是不均勻的。可變性主要集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)內(nèi)的超變區(qū)?？勺儏^(qū)中保守性較高的部分稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各有4個(gè)FR，一般為平面構(gòu)型，彼此間通過3個(gè)成環(huán)超變區(qū)相連，有時(shí)，超變區(qū)構(gòu)成平面的一部分。各鏈中的超變區(qū)通過FR緊靠在一起，并與另一鏈中的超變區(qū)靠近，由此形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(殘基Kabat等，免疫學(xué)上重要蛋白質(zhì)的序列，第5版，Public HealthService，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但也具有各種不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。
“超變區(qū)”指抗體中負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的氨基酸殘基序列。超變區(qū)主要包括輕鏈可變區(qū)中“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(輕鏈可變區(qū)內(nèi)的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變區(qū)內(nèi)的殘基31-35(H1)，50-56(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫學(xué)上重要蛋白質(zhì)的序列，第5版，Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))和/或“超變環(huán)”中的殘基(例如輕鏈可變區(qū)內(nèi)的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，和重鏈可變區(qū)內(nèi)的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基指可變區(qū)內(nèi)上所超變區(qū)殘基之外的殘基。
“分離的”抗體指從其自然環(huán)境中被鑒定，分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境中的雜質(zhì)組分指那些會(huì)影響其診斷或治療用途的物質(zhì)，這些雜質(zhì)包括酶、激素以及其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體被純化至(1)95wt.％(用Lowry法測(cè)定)，最好是99wt.％；(2)純化至可用轉(zhuǎn)杯測(cè)序儀測(cè)得至少15個(gè)N末端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度；或(3)純化至用還原或非還原Coomassie藍(lán)或銀染色(更好)的SDS-PAGE結(jié)果為均一。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榇藭r(shí)至少有一種該抗體天然環(huán)境中的組分將不存在。然而，分離抗體的制備至少需經(jīng)一個(gè)純化步驟。
“結(jié)合”所研究抗原(例如ErbB2抗原)的抗體指與該抗原的結(jié)合親和力足以適應(yīng)以下用途的抗體作為靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的診斷試劑和/或靶向傳送細(xì)胞毒性或其他化療藥物(例如類美坦素)的治療藥物。如果是結(jié)合ErbB2的抗體，它將優(yōu)先結(jié)合ErbB2而非其他ErbB受體，也可以是與EGFR、ErbB3或ErbB4等其他蛋白質(zhì)沒有明顯交叉反應(yīng)的抗體。此類實(shí)施方式中，用熒光活化細(xì)胞分選(FACS)試驗(yàn)或放射性免疫沉淀(RIA)測(cè)定，該抗體與非ErbB2蛋白質(zhì)的結(jié)合(例如細(xì)胞表面與內(nèi)源性受體的結(jié)合)程度應(yīng)低于10％。有時(shí)，抗ErbB2抗體與大鼠neu蛋白沒有明顯的交叉反應(yīng)，例如見Schecter等，自然312513(1984)和Drebin等，自然312545-548(1984)。
除非另作說明，“單克隆抗體4D5”和“4D5單克隆抗體”指含有來自鼠4D5抗體的抗原結(jié)合殘基的抗體。例如，單克隆抗體4D5可以是具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結(jié)合氨基酸殘基的鼠單克隆抗體4D5(ATCC CRL10463)或其變體，例如人源化抗體4D5。人源化4D5抗體的例子包括huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，見美國(guó)專利5,821,337，其中優(yōu)選huMAb4D5-8(HERCEPTIN)。
具有某指定抗體(例如單克隆抗體4D5)“生物學(xué)特征”的抗體指具有一個(gè)或多個(gè)該指定抗體區(qū)別于結(jié)合同一抗原(例如ErbB2)的其他抗體的生物學(xué)特征的抗體。例如具有4D5生物學(xué)特征的抗體以依賴于ErbB2表達(dá)水平的方式抑制ErbB表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)，和/或以相同于4D5的方式結(jié)合ErbB2胞外區(qū)內(nèi)的同一表位(例如阻抑單克隆抗體4D5結(jié)合ErbB2的抗體)。
“生長(zhǎng)抑制劑”指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞尤其是ErbB表達(dá)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是能顯著降低S期ErbB表達(dá)細(xì)胞百分比的物質(zhì)。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括(在S期以外)阻抑細(xì)胞周期發(fā)展的物質(zhì)，例如引起G1停滯和M期停滯的物質(zhì)。典型的M期阻抑劑包括長(zhǎng)春花提取物(包括長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)，taxanes和topo II抑制劑，例如阿霉素、表柔比星、柔紅霉素、依托泊甙和博來霉素。阻滯G1的物質(zhì)也參與S期阻滯，例如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和Ara-C等DNA烷基化劑。其他相關(guān)信息可見癌癥的分子基礎(chǔ)，Mendelsohn和Israel編，Murakami等的第一章“細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，致癌基因和抗瘤藥物”(WB SaundersPhiladelphia，1995)，p.13。
“生長(zhǎng)抑制”性抗體的例子是結(jié)合ErbB2并抑制過量表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體以0.5-30g/m1左右的濃度與SK-BR-3乳房癌細(xì)胞接觸6天后檢測(cè)，抑制培養(yǎng)的SK-BR-3乳房癌細(xì)胞達(dá)20％，更好的超過50％(例如50-100％)(1997年10月4日的美國(guó)專利5,677,171)。本發(fā)明后文將更詳細(xì)的描述SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性抗體是單克隆抗體4D5，例如人源化4D5。
“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”的分子(例如抗體)指使得活細(xì)胞變成非活性細(xì)胞的分子。所述的細(xì)胞一般為表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞，尤其是過表達(dá)該受體的細(xì)胞。較好的是，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞，例如乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌的癌細(xì)胞。在體外，所述細(xì)胞可以是SK-BR-3細(xì)胞，BT474細(xì)胞，Calu 3細(xì)胞，MDA-MB-453細(xì)胞，MDA-MB-361細(xì)胞或SKOV3細(xì)胞。體外細(xì)胞死亡可在沒有補(bǔ)體或免疫效應(yīng)細(xì)胞存在的條件下測(cè)定，以區(qū)別于抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒(CDC)所致的細(xì)胞死亡。因此，可采用熱滅活血清(即沒有補(bǔ)體)，并在沒有免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行細(xì)胞死亡試驗(yàn)。要確定某分子是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可通過碘丙鎓(PI)、臺(tái)盼藍(lán)(Moore等，細(xì)胞技術(shù)171-11(1995))或7AAD攝取來檢測(cè)細(xì)胞膜完整性的損傷，并與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比較。優(yōu)選的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)性抗體是能在BT474細(xì)胞PI攝取試驗(yàn)中引起PI攝取的抗體?？烧T導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體的例子包括抗ErbB2抗體7C2和7F3(WO98/17797)，包括其人源化和/或親和力成熟變體。
“誘導(dǎo)凋亡”的分子(例如抗體)是根據(jù)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破壞和/或膜泡(又稱凋亡體)測(cè)定，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的分子。所述細(xì)胞一般是過量表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞。較好的是，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，例如乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌的癌細(xì)胞。在體外，所述細(xì)胞可以是SK-BR-3細(xì)胞，BT474細(xì)胞，Calu 3細(xì)胞，MDA-MB-453細(xì)胞，MDA-MB-361細(xì)胞或SKOV3細(xì)胞。有多種方法可用于評(píng)價(jià)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)。例如，可通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來檢測(cè)磷酯酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)移；通過DNA序列梯來配件DNA斷裂；通過亞二倍體細(xì)胞的增多來評(píng)價(jià)與DNA斷裂相伴的核/染色質(zhì)收縮。較好的是，誘導(dǎo)凋亡的分子是在BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)中，誘導(dǎo)的膜聯(lián)蛋白結(jié)合是未處理細(xì)胞的2-50倍，5-50倍，甚至10-50倍的分子。有時(shí)，促凋亡分子會(huì)進(jìn)一步抑制ErbB受體的ErbB配體活化作用。其他情形中，促凋亡分子并不顯著抑制ErbB受體的ErbB配體活化作用。而且，所述分子可以誘導(dǎo)凋亡但并引起S期的細(xì)胞大量減少(例如，與對(duì)照相比，細(xì)胞百分比僅下降約0-10％)。誘導(dǎo)凋亡的抗體的例子包括抗ErbB2抗體7C2和7F3(WO98/17797)，包括其人源化和/或親和力成熟變體。
“抑制”ErbB受體的配體活化作用的抗體是如前所述降低或阻止所述活化作用的抗體，所述抗體能比單克隆抗體4D5更有效地抑制ErbB受體的配體活化作用，例如該抗體可以與單克隆抗體7F3或2C4或它們的Fab片段等效，更好的是與單克隆抗體2C4或其Fab片段等效。例如，抑制ErbB受體配體活化作用的抗體可以是抑制ErbB異寡聚物形成的效率比4D5高約50-100％的抗體。阻抑ErbB受體的配體活化作用可通過多種方式，例如干擾配體與ErbB受體結(jié)合，干擾ErbB復(fù)合物形成，干擾ErbB復(fù)合物中酪氨酸激酶活性和/或干擾ErbB受體內(nèi)或其近旁酪氨酸激酶殘基的磷酸化。抑制ErbB受體的配體活化作用的抗體的例子包括單克隆抗體2C4和7F3(抑制ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異寡聚物的HRG活化；以及EGF、TGF、雙調(diào)蛋白、HB-EGF和/或表調(diào)蛋白(epiregulin)對(duì)EGFR/ErbB2異寡聚物的活化)；和L26、L96和L288抗體(Klapper等，致癌基因142099-2109(1997))，它們抑制EGF和NDF與T47D細(xì)胞的結(jié)合，該細(xì)胞表達(dá)EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4，還包括上述抗體的人源化及親和力成熟變體以及其他抗體。
“表位”指多種抗原的(單克隆或多克隆)抗體結(jié)合位點(diǎn)。
結(jié)合特定表位的抗體可過“表位圖譜”來鑒定。有許多已知方法可用于蛋白質(zhì)上表位位置的制圖和特征分析，包括抗體-抗原復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，基因片段表達(dá)試驗(yàn)和基于合成肽的試驗(yàn)，見例如Harlow和Lane，抗體的使用，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，New York1999中的第11章。競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)可見后文。根據(jù)基因片段表達(dá)試驗(yàn)，隨機(jī)或特定的基因構(gòu)建使編碼蛋白質(zhì)的開放讀碼框斷裂，然后測(cè)定所表達(dá)的蛋白質(zhì)片段與所研究的抗體的反應(yīng)性?？梢酝ㄟ^例如PCR生成基因片段，然后體外轉(zhuǎn)錄，并在放射性氨基酸存在下翻譯成蛋白質(zhì)。通過免疫沉淀和凝膠電泳來檢測(cè)放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)片段與抗體的結(jié)合。有些表位也可以用大型噬菌體展示的隨機(jī)肽序列庫(噬菌體庫)來鑒定。還可以在單純結(jié)合試驗(yàn)中檢測(cè)已知的重疊肽片段庫是否與所測(cè)抗體結(jié)合。后一種方法適合鑒定約5-15個(gè)氨基酸的線性表位。
當(dāng)兩抗體識(shí)別相同或空間重合的表位時(shí)，“基本上結(jié)合同一表位”的抗體互為參比抗體。確定兩表位是否相同或空間重合最常用且最快的方法是競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，該試驗(yàn)用標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體進(jìn)行，可采用多種模式。通常，將抗原固定在96孔板上，用放射性或酶標(biāo)記來檢測(cè)非標(biāo)記抗體抑制標(biāo)記抗體結(jié)合的能力。
“表位4D5”指ErbB2胞外區(qū)內(nèi)抗體4D5(ATCC CRL10463)所結(jié)合的區(qū)域。該表位靠近ErbB2的跨膜區(qū)，是圖4 SEQ ID NO3中ErbB2胞外區(qū)氨基酸序列內(nèi)的殘基519-625，包含端值?？赏ㄟ^常規(guī)交叉抑制試驗(yàn)來篩選結(jié)合4D5表位的抗體，見例如Harlow和Lane，同上。也可以通過制作表位圖譜來確定抗體是否結(jié)合ErbB2的4D5表位(例如，SEQ ID NO3中殘基529-625之間的任一或多個(gè)殘基)。
“表位3H4”指ErbB2胞外區(qū)內(nèi)抗體3H4所結(jié)合的區(qū)域。該表位包括圖4 SEQID NO3中ErbB2胞外區(qū)氨基酸序列內(nèi)的殘基541-599。
“表位7C2/7F3”是位于ErbB2胞外區(qū)N末端7C2和/或7F3抗體(已在ATCC保藏，見后文)結(jié)合的區(qū)域。可通過常規(guī)交叉抑制試驗(yàn)來篩選結(jié)合表位7C2/7F3的抗體，見例如Harlow和David Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，New York 1988。也可以通過制作表位圖譜來確定抗體是否結(jié)合ErbB2上的7C2/7F3表位(例如，圖4 SEQ ID NO3中殘基22-53之間的任一或多個(gè)殘基)。
“對(duì)抗ErbB單克隆抗體治療無反應(yīng)或反應(yīng)差”的腫瘤在公認(rèn)動(dòng)物模型或人體臨床試驗(yàn)中，與無處理或安慰劑處理相比，抗ErbB抗體治療沒有引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的改善，或者，在抗ErbB抗體治療初期有反應(yīng)，但隨著治療的繼續(xù)，腫瘤繼續(xù)長(zhǎng)大。特別適合測(cè)定抗ErbB抗體效果的動(dòng)物模型是本發(fā)明實(shí)施例3所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。
“處理”或“治療”都指以預(yù)防或減緩惡化(例如癌癥的發(fā)展或擴(kuò)散)為目的的治療和預(yù)防手段。就本發(fā)明而言，理想的良好臨床效果包括但不限于緩解癥狀，減輕病重程度，穩(wěn)定疾病狀態(tài)(即不惡化)，延遲或減緩疾病發(fā)展，減輕病癥，和(部分或全面)恢復(fù)，不論可測(cè)知或不可測(cè)知?！爸委煛币部梢员硎鞠鄬?duì)于不接受治療的預(yù)期存活期相比，延長(zhǎng)了存活期。需要治療的包括已經(jīng)患病和易于發(fā)病的，或需要預(yù)防的個(gè)體。
“疾病”指各種可因本發(fā)明治療方法而緩解的病癥，包括慢性和急性疾病，或使得哺乳動(dòng)物易于患病的病理狀態(tài)。有待治療的疾病的例子包括但不限于良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其是乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。特別適合用本發(fā)明方法治療的疾病是過量表達(dá)ErbB受體(例如ErbB2和/或EGFR)，而且對(duì)于用所述過量表達(dá)的受體其抗體進(jìn)行的治療無反應(yīng)或反應(yīng)差的惡性腫瘤，例如乳房癌。特別適合的是對(duì)于HERCEPTIN治療無反應(yīng)或反應(yīng)差的、過量表達(dá)ErbB2受體的乳房癌。
“治療有效量”指藥物的用量可有效治療哺乳動(dòng)物的疾病。以癌癥為例，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞；縮小癌細(xì)胞；抑制癌細(xì)胞滲入周圍器官(即一定程度的減緩，最好是停止)；抑制腫瘤擴(kuò)散(即一定程度的減緩，最好是停止)；一定程度地抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度地緩解一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。藥物阻止已存在的癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或?qū)⑵錃⑺揽梢允峭ㄟ^細(xì)胞靜止作用或細(xì)胞毒性作用。就癌癥治療而言，可以通過測(cè)定疾病發(fā)展的時(shí)間(TTP)和/或反應(yīng)速度(RR)來確定效果。
“細(xì)胞毒試劑”在此指可抑制細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞破壞的的物質(zhì)，包括放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素)，化療試劑，以及來自細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物的毒性，例如小分子毒素或酶活性毒素，包括它們的片段和/或變體。
“化療試劑”指用于治療癌癥的化合物，包括烷基化劑，例如塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)等；烷基硫酸酯，例如白消安，英丙舒凡和哌博舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替哌；氮丙啶和methylamelamines，包括六甲蜜胺、曲他安、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和trimethylolomelamine；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、次氯酸氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法侖、novembicin、膽甾醇對(duì)苯乙酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司??；亞硝基脲，例如卡莫司汀、cholorozotocin、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，例如阿克拉霉素、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、刺孢霉素、carabicin、洋紅霉素、carzinophilin、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、marcellomycin、絲裂霉素、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌羅霉素、quelamycin、羅多比星、絳色霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈他司丁、佐柔比星；抗代謝藥，例如氨甲蝶啉和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如denopterin、氨甲蝶啉、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎激素類(anti-adrenals)，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，例如葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖定；bestrabucil；比生群；edatraxate；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；elfornithine；依利醋銨；依托革魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；nitracrine；噴司他丁；phenamet；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈胞菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2′-三氯三乙胺；脲烷；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)茅醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(Ara-C)；環(huán)磷酰胺；塞替派；taxanes，例如paclitaxel(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；gemcitabine；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶啉；鉑同系物，例如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊甙(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞賓；navelbine；novantrone；替尼泊苷；道諾霉素；氨蝶呤；xeloda；ibandronate；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波素；capecitabine；和以上所述化合物的藥學(xué)上認(rèn)可的鹽、酸或衍生物?！盎熢噭边€包括調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素試劑，例如抗雌激素藥物他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酯抑制性4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬；keoxifene；LY117018；onapristone和托瑞米芬(Fareston)等；和抗雄激素藥物氟他胺，尼魯米特，bicalutamide，亮丙瑞林和革舍瑞林；以及它們的藥學(xué)上認(rèn)可的鹽、酸或衍生物。
“前藥”在此指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，與親本藥相比，它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，但能被酶激活或轉(zhuǎn)化成活性較高的親本藥形式。見例如Wilman，“癌癥化療中的前藥”，生物化學(xué)協(xié)會(huì)會(huì)刊14，pp.375-382，Belfast第615次會(huì)議(1986)和Stella等，“前藥一種藥物靶向傳遞的化學(xué)方法”，定向藥物傳遞，Borchardt等編輯，pp.247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前藥包括但不限于含磷酸酯前藥，含硫代磷酸酯前藥，含硫酸酯前藥，含肽前藥，D氨基酸改性前藥，糖基化前藥，含內(nèi)酰胺前藥，含可取代苯氧基乙酰胺前藥或含取代苯乙酰胺前藥，5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前藥，它們能轉(zhuǎn)化為活性較高的細(xì)胞毒性游離藥?？山?jīng)衍生為細(xì)胞毒性藥物的本發(fā)明前藥形式的例子包括但不限于前述化療試劑。
“核酸”指聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，還包括由核苷酸類似物形成的DNA或RNA的等效物、類似物，單鏈(有義鏈或反義鏈)和雙鏈聚核苷酸?！胺蛛x的”核酸分子指經(jīng)過鑒定，并去除了至少一種其天然來源中通常與之結(jié)合的污染性核酸分子的核酸。分離的核酸其形式不同于其天然形式。因此，分離的核酸分子不同于存在于天然細(xì)胞內(nèi)的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括存在于抗體表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的核酸分子，即(例如)，其染色體位置不同于其天然細(xì)胞的核酸分子。
“載體”在此指能夠運(yùn)載另一核酸的核酸分子?！氨磉_(dá)載體”包括能夠合成自身所帶重組基因所編碼的HER2蛋白的質(zhì)粒、粘?；蚴删w。優(yōu)選載體能夠自復(fù)制和自表達(dá)與之相連的核酸。本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”混用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。
“轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件”和“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”在此混用，都指在特定宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)操作性連接的編碼序列所需的核酸(例如DNA)序列。例如，適用于原核細(xì)胞的調(diào)控序列包括啟動(dòng)子，可選的操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知，真核細(xì)胞使用的是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接信號(hào)和聚腺苷酸信號(hào)。所謂調(diào)控序列包括促進(jìn)或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的各種元件，包括啟動(dòng)子、RNA聚合物與轉(zhuǎn)錄因子間基本作用所需的核心元件，上游元件，增強(qiáng)子和應(yīng)答元件(Lewin，“基因V”，Oxford University Press，Oxford，pp.847-873)。本發(fā)明所稱某基因或一類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括該基因或該類基因的完整天然轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件區(qū)域，也包括其修飾形式。所述的修飾形式包括元件重排，元件缺失或異源序列，異源序列的插入。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件具有模塊性，有些調(diào)控元件(例如增強(qiáng)子)的功能沒有位置依賴性，這使得所述修飾成為可能。已有許多技術(shù)可用于剖析基因的調(diào)控序列，從而確定它們的位置和功能?？筛鶕?jù)需要用此類信息來指導(dǎo)調(diào)控元件的修飾。然而，較好的是使用完整的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件全區(qū)域。
“組織特異性啟動(dòng)子”指這樣一段核苷酸序列它可作為啟動(dòng)子調(diào)控與之操作性相連的選定DNA序列的表達(dá)，并能夠使得該選定DNA序列在特定組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，例如在乳腺細(xì)胞內(nèi)。在一說明性實(shí)施方式中，可用采用了乳腺特異性啟動(dòng)子的基因構(gòu)建物來指導(dǎo)HER2蛋白或其片段在乳腺組織內(nèi)的優(yōu)勢(shì)性表達(dá)。
將核酸“操作性連接”即使之處于與另一核酸序列具有功能關(guān)系的位置。例如，前導(dǎo)序列或分泌性前導(dǎo)肽的DNA與某多肽的DNA操作性連接，如果它們表達(dá)為參與所述多肽分泌的前體蛋白質(zhì)；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與一段編碼序列操作性連接，如果該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響著所述序列的轉(zhuǎn)錄；或者，核糖體結(jié)合位點(diǎn)與一段編碼序列操作性連接，如果其位置促進(jìn)翻譯?？偟恼f來，“操作性連接”表示連接后的DNA序列連是連續(xù)的，如果是分泌性前導(dǎo)肽，則應(yīng)連續(xù)而且在讀碼相內(nèi)。然而，增強(qiáng)子的連接不必是連續(xù)的。所述連接可通過常規(guī)限制性位點(diǎn)的連接反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。如果沒有這樣的位點(diǎn)，可根據(jù)已知方法使用合成的寡核苷酸接頭。
“轉(zhuǎn)染”表示通過核酸介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移將核酸分子(例如表達(dá)載體)導(dǎo)入宿主細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化”過程表示細(xì)胞的基因型因攝取了異源DNA或RNA而被改變，例如，轉(zhuǎn)化細(xì)胞將表達(dá)重組HER2。
“轉(zhuǎn)基因”在此指對(duì)于導(dǎo)入了基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞而言部分或完全異源的核酸序列，或者，其序列與導(dǎo)入了基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，但它插入動(dòng)物的基因組后改變了該基因組(例如，該同源序列插入在不同于天然基因所在的位置，或其插入造成基因敲除)?？蓪⑥D(zhuǎn)基因與一段或多段轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列或選定核酸表達(dá)優(yōu)化所需的其他核酸(例如內(nèi)含子)操作性連接。
因此，“轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物”指包含轉(zhuǎn)基因并可包含其他核酸的核酸序列，所述其他核酸例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列、聚腺苷酸化位點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)，標(biāo)記基因等，即對(duì)將轉(zhuǎn)基因插入宿主基因組整體操作可能有用的序列。
“轉(zhuǎn)基因的”在此表示某動(dòng)物或構(gòu)建物含有轉(zhuǎn)基因。例如，“轉(zhuǎn)基因生物”指其一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞經(jīng)人為導(dǎo)入(例如本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù))而含有異源核酸的動(dòng)物，尤其是非人動(dòng)物。通過精細(xì)的基因操作，例如微注射和重組病毒感染，將核酸直接導(dǎo)入細(xì)胞，或通過導(dǎo)入其前體而間接導(dǎo)入?！盎虿僮鳌辈话ㄓN和體外受精，而是指導(dǎo)入重組DNA分子。該分子可能整合到染色體內(nèi)，也可能成為染色體外復(fù)制的DNA。在本文所述的典型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，轉(zhuǎn)基因使得細(xì)胞表達(dá)或過量表達(dá)重組形式的HER2蛋白?！敖⒄呔€”或“建立動(dòng)物”表示這些動(dòng)物是導(dǎo)入了轉(zhuǎn)基因的胚胎的成熟產(chǎn)物，即，這些動(dòng)物由插入了DNA并被植入一種或多種代孕宿主的胚胎長(zhǎng)成。
“子代”和“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的子代”指原轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物每一后代的任一或所有后代?！胺侨藙?dòng)物”指哺乳動(dòng)物類中除人之外的所有成員?！安溉閯?dòng)物”指包括人在內(nèi)的所有哺乳類動(dòng)物，包括圈養(yǎng)動(dòng)物、放養(yǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園內(nèi)動(dòng)物、參賽動(dòng)物或?qū)櫸?，例如小鼠、大鼠、兔子、豬、綿羊、山羊、牛和高級(jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物。
“細(xì)胞”，“細(xì)胞線”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”在此混用，且都包括它們的后代。因此，“轉(zhuǎn)化子”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代細(xì)胞和由它們得到的培養(yǎng)物，不論存在幾次傳遞。還需要指出的是，所有子代的DNA內(nèi)容不一定完全相同，因?yàn)榇嬖谥S機(jī)突變。本發(fā)明包括篩選得到的與原轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有相同功能或生物學(xué)活性的突變子代。根據(jù)后文所述，根據(jù)需要，它們可能具有不同的稱謂。
“脂質(zhì)體”是由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的小泡，用于向動(dòng)物傳遞藥物(例如本發(fā)明的抗ErbB2抗體，或化療試劑)。脂質(zhì)體的組成一般排列成雙層，類似于生物膜的脂類排列。
“包裝內(nèi)說明”指治療產(chǎn)品市售包裝內(nèi)的說明書，其中的信息包括適應(yīng)癥、使用方法、劑量、給藥方式、禁忌癥和/或使用注意事項(xiàng)。
“心保護(hù)劑”指預(yù)防或減輕患者與服藥(例如抗ErbB抗體或其類美坦素偶聯(lián)物)有關(guān)的心肌功能異常(即心肌病和/或充血性心衰)的化合物或組合物。例如，心保護(hù)劑能夠預(yù)防和減弱自由基介導(dǎo)的心臟毒性作用和/或預(yù)防和減弱氧化性應(yīng)激損傷。本發(fā)明心保護(hù)劑的例子包括離子螯合劑dexrazoxane(ICRF-187)(Seifert等，藥物治療學(xué)年報(bào)281063-1072(1994))；降脂藥和/或抗氧化劑，例如普羅布考(Signal等，分子細(xì)胞心臟病學(xué)雜志271055-1063(1995))；氨磷汀(氨基硫醇2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇二氫磷酸酯，又稱WR-2721，及其去磷酸細(xì)胞攝取形式，又稱WR-1065)和S-3-(3-甲基氨基丙基氨基)丙基磷酸硫代酸(WR-151327)，見Green等，癌癥研究54738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.，Bristow MR.編的藥物引起的心臟病，New YorkElsevier 191-215(1980))；β-抑制劑，例如美托洛爾(Hjalmarson等，藥物47增刊431-9(1994)和Shaddy等，美國(guó)心臟病雜志129197-9(1995))；維生素E；抗壞血酸(維生素C)；自由基清除劑，例如石竹酸，烏索酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕集化合物，例如α-苯基-叔丁基硝酮(PBN)(Paracchini等，抗癌研究131607-1612(1993))；硒基化合物，例如P251(Elbesen)；等等。
2.詳細(xì)描述本發(fā)明的基礎(chǔ)是在一種新的鼠HER2轉(zhuǎn)基因腫瘤模型中所獲得的結(jié)果，該模型中，HERCEPTIN或由其得到的鼠抗體4D5對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)幾乎沒有作用。用該模型檢測(cè)HERCEPTIN和HERCEPTIN-類美坦素偶聯(lián)物的效用，意外發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)基因小鼠中移植腫瘤雖然對(duì)HERCEPTIN治療反應(yīng)較差，但HERCEPTIN-類美坦素偶聯(lián)物卻非常有效。
因此，本發(fā)明的基礎(chǔ)是用抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物來治療對(duì)抗ErbB抗體和/或類美坦素反應(yīng)不良的ErbB過量表達(dá)型腫瘤。
A.抗ErbB抗體的生成以下是本發(fā)明用來生成抗體的方法，只可視為舉例。以下將就抗ErbB2抗體來描述抗體的生產(chǎn)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，顯然可用類似方法生成和修飾ErbB受體家族其他成員的抗體。
用來生產(chǎn)抗體的ErbB2抗原可以是例如ErbB2蛋白的胞外區(qū)或其片段的可溶形式，其中應(yīng)包含所需的表位?；蛘?，也可使用在細(xì)胞表面表達(dá)ErbB2的細(xì)胞(例如經(jīng)轉(zhuǎn)化而過量表達(dá)ErbB2的NIH-3T3細(xì)胞；或SK-BR-3等癌細(xì)胞；見Stancovski等，PANS(USA)888691-8695(1991))來生產(chǎn)抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出，還可用其他形式的ErbB2來生產(chǎn)抗體。
(i)多克隆抗體可通過給動(dòng)物多次皮下注射(sc)或腹膜內(nèi)注射(ip)相關(guān)抗原和佐劑來產(chǎn)生多克隆抗體。按需要，可用雙官能劑或衍生劑將相關(guān)抗原與對(duì)待免疫動(dòng)物具有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，所述蛋白質(zhì)例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，所述雙官能劑例如馬來酰亞氨基苯甲酸基磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))，N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián))，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中的R和R1是不同的烷基。
例如，將100g(兔)或5g(小鼠)蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物與3倍體積弗氏完全佐劑混合，用此溶液多點(diǎn)皮下注射，如此以抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物。一個(gè)月后增強(qiáng)免疫，即用肽或偶聯(lián)物原用量的1/5至1/10與弗氏完全佐劑混合后多點(diǎn)皮下注射。7-14天后，放取動(dòng)物的血，檢測(cè)血清的抗體效價(jià)。繼續(xù)對(duì)動(dòng)物增強(qiáng)免疫，直至效價(jià)達(dá)到平臺(tái)期。較好的是用同一抗原與不同蛋白質(zhì)或通過不同的交聯(lián)劑形成的偶聯(lián)物增強(qiáng)免疫。也可以用重組細(xì)胞培養(yǎng)物生成的融合蛋白形式的偶聯(lián)物。而且，可適當(dāng)使用明礬等凝聚劑愛增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由一群基本均一的抗體獲得的，即該群中的各抗體除可能極少量存在的天然突變之外完全相同。因此，修飾語“單克隆”是指抗體不是不同抗體的混合物這一特征。
例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法制備，最早的相關(guān)報(bào)道是Kohler等，自然256495(1975)，也可用重組DNA方法制備(美國(guó)專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述地免疫小鼠或倉鼠等合適的宿主動(dòng)物，為的是激發(fā)生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)特異性結(jié)合免疫所用蛋白質(zhì)的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘咭部梢赃M(jìn)行淋巴細(xì)胞體外免疫。然后用合適的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原理和實(shí)踐，pp.59-103(AcademicPress，1986)。
將所得的雜交瘤細(xì)胞接種并培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有一種或多種可抑制非融合親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞沒有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨甲蝶啉和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這將阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)能有效融合，支持抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定而高水平地生產(chǎn)抗體，并對(duì)培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞線是鼠骨髓瘤細(xì)胞線，例如MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤衍生的細(xì)胞線(Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，California USA)和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA)。曾有人用人骨髓瘤和小鼠-人雜交骨髓瘤細(xì)胞線來生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozbor，J.，Immunol，1333001(1984)；和Brodeur等，單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
對(duì)雜交瘤生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行抗抗原單克隆抗體生產(chǎn)檢測(cè)。較好的是，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)來測(cè)定，例如放射性免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可用Munson等，生物化學(xué)年報(bào)107220(1980)所述的Scatchard試驗(yàn)來測(cè)定。
鑒定到所生產(chǎn)抗體具有所需特異性、親和力和活性的雜交瘤細(xì)胞后，將該克隆用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理和實(shí)踐pp.59-103(Academic Press，1986)。合適的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640。此外，也可以在動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，例如腹水瘤。
用常規(guī)抗體純化方法從培養(yǎng)基，復(fù)水或血清中分離出亞克隆分泌的單克隆抗體，純化方法例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳，透析或親和層析。
用常規(guī)技術(shù)不難分離得到編碼單克隆抗體的DNA并測(cè)序(例如，用特異性結(jié)合鼠抗體重鏈和輕鏈編碼基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的優(yōu)選來源。分離后，將DNA插入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染原本不生產(chǎn)抗體蛋白的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，由此在重組宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的合成。有關(guān)抗體編碼DNA在細(xì)菌內(nèi)的重組表達(dá)可見Skerra等，當(dāng)代免疫學(xué)觀點(diǎn)5256-262(1993)和Pluckthum，免疫學(xué)回顧，130151-188(1992)。
另一種實(shí)施方式中，可從用McCafferty等，自然348552-554(1990)所述方法建立的抗體噬菌體庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，自然352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)描述了用噬菌體庫分離獲得小鼠和人抗體。以后的文獻(xiàn)中曾用鏈改組(Marks等，生物學(xué)/技術(shù)，10779-783(1992))，聯(lián)用感染和體內(nèi)重組構(gòu)建極大型噬菌體庫(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))來生產(chǎn)高親和力的人抗體。因此，這些技術(shù)都可作為傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的備選用于分離單克隆抗體。
還可以對(duì)DNA進(jìn)行修飾，例如用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列取代同源性鼠序列(美國(guó)專利4,816,567；和Morrison等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)816851(1984))，或?qū)⒛撤N非免疫球蛋白多肽的完整或部分編碼序列與該免疫球蛋白編碼序列共價(jià)連接。
通常，所述用非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒區(qū)，或者取代抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之一的可變區(qū)，從而形成嵌合二價(jià)抗體，即包含某一抗原特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和另一抗原特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
(iii)人源化抗體非人抗體人源化的技術(shù)是已知的。較好的是，人源化抗體內(nèi)導(dǎo)入了來自其非人來源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為取自“輸入”可變區(qū)的“輸入”殘基。人源化可基本上按照以下方法即Winter及其同事(Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)2391534-1536(1988))，用超變區(qū)取代人抗體內(nèi)的相應(yīng)序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，不到一個(gè)完整的人可變區(qū)被相應(yīng)的非人序列所取代。實(shí)踐中，人源化抗體一般是人抗體，但其中部分超變區(qū)殘基，還可能包括部分FR殘基被鼠抗體相應(yīng)位置的殘基所取代。
挑選用來制造人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)對(duì)于降低抗原性來說十分重要。按照“最佳擬合”法，在整個(gè)已知人可變區(qū)序列庫中篩選鼠抗體的可變區(qū)序列。然后，將與鼠序列最近似的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志196901(1987))。另一種方法使用所有人抗體特定亞類輕鏈或重鏈衍生的共有序列作為特定的框架區(qū)。該相同框架區(qū)可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志1512623(1993))。
更重要的是，人源化抗體應(yīng)保留對(duì)抗原的高親和力及其他優(yōu)良生物學(xué)特性。為此，一種優(yōu)選方法制備人源化抗體的過程為用親本序列和人源化序列的三維模型來分析親本序列和各種理論人源化產(chǎn)物。三維免疫球蛋白模型是已有的，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？捎糜?jì)算機(jī)程序證明并展示特定候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對(duì)上述展示的研究可分析出個(gè)各殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析出影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的殘基。用該方法可選出FR殘基，并將受者序列與輸入序列結(jié)合，從而獲得所需的抗體特性，例如提高對(duì)靶抗原的親和力。通常，超變區(qū)殘基直接影響抗原結(jié)合，或影響最大。
后文實(shí)施例1以人源化抗ErbB2抗體為例描述了制備方法。本發(fā)明的人源化抗體在人重鏈可變區(qū)內(nèi)摻入非人超變區(qū)殘基，并可包含選自69H，71H和73H位置(采用Kabat的具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列(第5版)，Public Health Service，National Institute of Health，Bethseda，MD(1991)所述的可變區(qū)編號(hào)體系)的框架區(qū)(FR)取代。實(shí)施方式之一中，人源化抗體含有2個(gè)和全部69H，71H和73H位置的框架區(qū)(FR)取代。
考慮了各種不同形式的人源化抗體，例如，人源化抗體可以Fab等抗體片段，或者，人源化抗體可以是完整抗體，例如完整的IgG1抗體。
(iv)人抗體作為人源化的備選方案，可生產(chǎn)人抗體。例如，現(xiàn)在已經(jīng)能夠生成經(jīng)免疫后能生成完整人抗體庫而沒有內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，據(jù)稱，嵌合和種系突變小鼠內(nèi)抗體重鏈鉸鏈區(qū)(JH)純合缺失造成內(nèi)源性抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中，在收到抗原攻擊后即可生成人抗體。見，例如Jakpbovits等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)902551(1993)；Jakobovits等，自然362255-258(1993)；Bruggermann等，免疫學(xué)年報(bào)733(1993)；和美國(guó)專利5,591,669,5,589,369和5,545,807。
或者，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，自然348552-553(1990))，從非免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫中體外制備人抗體或抗體片段。根據(jù)這一技術(shù)，將抗體V區(qū)基因框內(nèi)克隆到絲狀噬菌體(例如M13或fd)的主衣殼蛋白或次衣殼蛋白基因中，在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒含有單鏈的噬菌體DNA拷貝，根據(jù)抗體功能的選擇同時(shí)選出了有此功能抗體的編碼基因。這樣，噬菌體模擬了B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示可用多種方式進(jìn)行，見例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)雜志3564-571(1993)。有多種V基因序列來源可用于噬菌體展示。Clackson等(自然352624-628(1991))從免疫小鼠脾臟V基因的隨機(jī)小組合庫中分離到抗噁唑酮抗體的多樣性列陣。按照Marks等的方法(分子生物學(xué)雜志222581-597(1991))或Griffith等(歐洲生物學(xué)雜志12725-734(1993))以及美國(guó)專利5,565,332和5,573,905所述的方法，可構(gòu)建出非免疫人供體的V基因庫，并分離到針對(duì)一抗原多樣性列陣的抗體。
如前所述，人抗體也可以通過體外激活B細(xì)胞來制備(見美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。
有關(guān)人抗ErbB2抗體可見1998年6月30日的美國(guó)專利5,772,997和1997年1月3日的WO97/00271。
(v)抗體片段已有多種技術(shù)可用于生成抗體片段。通常，這些片段通過完整抗體的酶消化衍生而得(Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志24107-117(1992)和Brennan等，科學(xué)22981(1985))。然而，現(xiàn)在，這些片段也可以直接由重組宿主細(xì)胞生成。例如，可用上述噬菌體庫中分離得到抗體片段?；蛘撸蓮拇竽c桿菌中直接回收Fab′-SH片段，然后化學(xué)偶聯(lián)成F(ab′)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1982))。另一種方法直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離F(ab′)2片段。其他生成抗體片段的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見。另一實(shí)施方式中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO93/16185；美國(guó)專利5,571,894和美國(guó)專利5,587,458。這種抗體片段又稱“線性抗體”，見美國(guó)專利5,641,870。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體即對(duì)至少兩種不同表位具有特異性的抗體，例如能結(jié)合ErbB2蛋白質(zhì)上兩個(gè)不同表位的抗體。其他此類抗體可將ErbB2結(jié)合位點(diǎn)與EGFR、ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合位點(diǎn)相組合?；蛘撸蓪⒖笶rbB2臂與另一臂結(jié)合，后者與白細(xì)胞上的觸發(fā)分子結(jié)合，使得細(xì)胞的防御機(jī)制集中針對(duì)表達(dá)ErbB2的細(xì)胞，所述觸發(fā)分子例如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受體(Fc R)FcRI(CD64)、Fc RII(CD32)和Fc RIII(CD16)。也可用雙特異性抗體將細(xì)胞毒試劑導(dǎo)向表達(dá)ErbB2的細(xì)胞。WO96/16673描述一種抗ErbB2/抗Fc RIII雙特異性抗體，美國(guó)專利5,837,234描述了一種抗ErbB2/抗Fc RI雙特異性抗體，WO98/02463描述了一種抗ErbB2/Fc雙特異性抗體，美國(guó)專利5,821,337描述了一種抗ErbB2/抗CD3雙特異性抗體。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。制備全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)方法以兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)為基礎(chǔ)，其中兩對(duì)鏈具有不同的特異性(Millstein等，自然305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈與輕鏈的隨機(jī)配對(duì)，這些雜交瘤(四交瘤)可產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種是正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化一般通過親和層析進(jìn)行，該過程相當(dāng)煩瑣，而且得率不高。WO93/08829和Traunecker等，歐洲生物學(xué)雜志103655-3659(1991)描述了類似的方法。另一種方法將具有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合，最好與包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。最好在至少一種融合體中含有輕鏈結(jié)合所必需位點(diǎn)的重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。根據(jù)需要，可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA和編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA分別插入不同的表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染合適的宿主。當(dāng)構(gòu)建過程使用不等量的三種片段可獲得最佳得率時(shí)，這為調(diào)節(jié)三段多肽片段相互比例提供了很大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩段片段等量時(shí)可獲得高得率，或者多肽之比無關(guān)緊要時(shí)，也可以將編碼兩段或三段多肽片段的聚核苷酸插入同一表達(dá)載體。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，雙特異性抗體的一臂包含具有第一結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，另一臂包含雜交的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(具有第二結(jié)合特異性)。已發(fā)現(xiàn)，這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于所需雙特異性化合物的分離，因?yàn)閮H雙特異性分子的一半含有免疫球蛋白輕鏈易于分離。該方法可見WO94/04690。有關(guān)制備雙特異性抗體更詳細(xì)的內(nèi)容可見Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
根據(jù)美國(guó)專利5,731,168描述的另一種方法，可對(duì)抗體分子對(duì)之間的界面進(jìn)行基因工程改造，從而盡可能提高從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收得到異二聚體的百分比。優(yōu)選界面至少包含抗體恒定區(qū)CH3的一部分。該方法中，第一抗體分子界面上的一段或多段小氨基酸側(cè)鏈用大氨基酸側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)置換。然后在第二抗體分子界面上通過用小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換大氨基酸側(cè)鏈形成大小與大側(cè)鏈相同或近似的補(bǔ)償性“穴”。這樣可使得異二聚體的得率高于均二聚體等其他不需要的終產(chǎn)物。
文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可通過化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，科學(xué)22981(1985)描述的過程中，完整抗體經(jīng)蛋白酶剪切生成F(ab′)2片段。二硫酚復(fù)合劑亞砷酸鈉存在下還原這些片段，穩(wěn)定相鄰的二硫酚，避免形成分子內(nèi)二硫鍵。然后將產(chǎn)生的Fab′片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后用巰基乙胺將Fab′-TNB衍生物之一還原成Fab′-硫醇，與等量的另一種Fab′-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。由此生成的雙特異性抗體可用于酶的選擇性固定化。
最近已可以直接從大腸桿菌中回收Fab′-SH片段，然后可通過化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志175217-225(1992)描述了一種全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。由大腸桿菌分別分泌各Fab′片段，然后直接體外化學(xué)偶聯(lián)成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過量表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，并觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對(duì)人乳房癌腫瘤的裂解活性。
已有多種從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接制造和分離雙特異性抗體片段的技術(shù)。例如，可用亮氨酸拉鏈來制造雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合將Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′片段連接。在鉸鏈區(qū)還原抗體均二聚體，形成單體，然后再氧化成抗體異二聚體。該方法也可以用來制造抗體均二聚體。Hollinger等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)906444-6448(1993)描述的“二抗體”技術(shù)提供了另一種制造雙特異性抗體片段的方法。其中的片段中，一段重鏈可變區(qū)(VH)通過一段連接肽與一段輕鏈可變區(qū)(VL)連接，這段連接肽很短以致不可能發(fā)生同一鏈內(nèi)兩區(qū)之間的配對(duì)。因此，一片段的VH和VL被迫與另一片段的互補(bǔ)VL和VH配對(duì)，于是形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還有另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制造雙特異性抗體片段的方法，見Gruber等，免疫學(xué)雜志1525368(1994)。
也可以制造二價(jià)以上的抗體，例如三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志14760(1991)。
(vii)其他氨基酸序列修飾可以對(duì)本發(fā)明中的抗ErbB2抗體進(jìn)行氨基酸序列修飾。例如，可能需要改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性。制備抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體可以通過在抗ErbB2抗體核酸內(nèi)引入合適的核苷酸改變，或者通過肽合成。所述的修飾包括例如抗ErbB2抗體氨基酸序列內(nèi)的缺失和/或插入和/或取代。只要最終結(jié)構(gòu)具有所需的特征，可以聯(lián)合運(yùn)用缺失、插入和取代來形成最終結(jié)構(gòu)。氨基酸改變還可以改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。
一種鑒定抗ErbB2抗體內(nèi)作為突變優(yōu)選位置的殘基或區(qū)域的方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，見Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989)。其中，確定一個(gè)殘基或一組殘基(例如arg、asp、his、lys和glu等帶電殘基)，置換以中性或負(fù)電氨基酸(最好是丙氨酸或苯丙氨酸)，從而影響氨基酸與ErbB2抗原之間的相互作用。然后，在取代位置導(dǎo)入更多或其他變異，從而進(jìn)一步分析對(duì)取代表現(xiàn)出功能性敏感的氨基酸殘基。因此，雖然導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)定的，但是該位置上突變的性質(zhì)不要求預(yù)定。例如，為例分析某給定位點(diǎn)上突變的性能，在目標(biāo)密碼子或區(qū)域進(jìn)行Ala掃描和隨機(jī)誘變，然后在表達(dá)出的抗ErbB2抗體變體中篩選所需的活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基末端融合，長(zhǎng)度可以從一個(gè)殘基到包含百多個(gè)殘基的多肽，還包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的鏈內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰基殘基的抗ErbB2抗體或該抗體與一段細(xì)胞毒性多肽的融合體?？笶rbB2抗體的其他插入變體包括其N或C末端與酶(例如ADEPT)或可延長(zhǎng)抗體血清半壽期的多肽的融合體。
另一種變體是氨基酸取代變體。這些變體中，抗ErbB2抗體內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基被其他殘基取代。最有意義的取代突變位點(diǎn)包括超變區(qū)，但也要考慮改變FR。表1中“優(yōu)選取代”列舉了保守性的取代。如果此類取代改變了生物學(xué)活性，則可引入更具實(shí)質(zhì)性的取代即表1中所謂“取代范例”或后文就氨基酸種類所述的取代，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行篩選。
表1

對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性改變是通過挑選對(duì)于維持以下特性的影響顯著不同的取代(a)取代區(qū)域內(nèi)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如平面或雙螺旋構(gòu)象，(b)目標(biāo)位點(diǎn)的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積。根據(jù)側(cè)鏈特征，可將天然殘基分為(1)疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水性cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香性trp，tyr，phe非保守性取代可能將一類的成員改變成另一類的。
也可以取代不參與維持抗ErbB2抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基，通常用絲氨酸，這可以提高分子的氧化穩(wěn)定性，避免誤交聯(lián)。另一方面，也可以在抗體內(nèi)增加半胱氨酸鍵以提高穩(wěn)定性(尤其當(dāng)抗體是Fv片段等抗體片段時(shí))。
特別優(yōu)選的取代變體中，親本抗體(人源化抗體或人抗體)超變區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基被取代。通常，選來進(jìn)一步研究的變異抗體應(yīng)具有優(yōu)于其親本的生物特性。產(chǎn)生此類取代變體的一個(gè)簡(jiǎn)便方法涉及采用噬菌體展示的親和成熟。簡(jiǎn)而言之，對(duì)多個(gè)超變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))進(jìn)行突變，形成各位置上所有可能的取代。由絲狀噬菌粒以單價(jià)形式展示這些抗體，且是與包裝在各噬菌粒內(nèi)的M13基因III的產(chǎn)物形成的融合體。然后如本文所述對(duì)噬菌體展示的變體進(jìn)行生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)篩選。為了確定進(jìn)行修飾的候選超變區(qū)位點(diǎn)，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對(duì)抗原結(jié)合性貢獻(xiàn)顯著的超變區(qū)殘基。也可以或還可以進(jìn)行抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析，確定抗體和人ErbB2的接觸點(diǎn)。這樣的接觸殘基及其附近殘基就是本文所述取代的候選位點(diǎn)。待此類變體產(chǎn)生后，就可根據(jù)本文所述對(duì)變體組進(jìn)行篩選，在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)試驗(yàn)中挑選具有優(yōu)良特性的抗體繼續(xù)研究。
可以就效應(yīng)功能對(duì)本發(fā)明抗體進(jìn)行修飾，例如增強(qiáng)抗體的抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體Fc區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。也可以或還可以在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域形成鏈間二硫鍵。由此形成的均二聚體抗體提高了內(nèi)化能力并/或提高了補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。見Caron等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.，免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。也可以用異雙官能交聯(lián)劑制備具有增強(qiáng)抗腫瘤活性的均二聚抗體，見Wolff等，癌癥研究532560-2565(1993)。也可以將抗體改造成具有2個(gè)Fc區(qū)，從而增強(qiáng)補(bǔ)體裂解和ADCC能力。見Stevenson等，抗癌藥物設(shè)計(jì)3219-230(1989)。
為了延長(zhǎng)抗體的血清半壽期，可以在抗體(特別是抗體片段)內(nèi)加入一個(gè)補(bǔ)救受體結(jié)合表位，見美國(guó)專利5,739,277。本文中的“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)Fc區(qū)內(nèi)能夠延長(zhǎng)IgG分子體內(nèi)血清半壽期的表位。
(viii)糖基化變體抗體在其恒定區(qū)內(nèi)的保守性位點(diǎn)被糖基化(Jefferis和Lund，化學(xué)免疫學(xué)65111-128(1997)；Wright和Morrison，TibTECH 1526-32(1997))。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能(Boyd等，分子免疫學(xué)321311-1318(1996)；Wittwe和Howard，生物化學(xué)294175-4180(1990))和糖蛋白分子內(nèi)區(qū)域間的相互作用，這可能影響糖蛋白的構(gòu)象和三維表面(Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner，當(dāng)代生物技術(shù)7409-416(1996))。寡糖還可能基于特殊的識(shí)別結(jié)構(gòu)將某糖蛋白靶向特定的分子。例如，據(jù)報(bào)道，在半乳糖基化的IgG中，寡糖部分“彈”出在CH2內(nèi)空間，末端的N-乙?；咸前窔埢蚨軌蚺c甘露糖結(jié)合蛋白結(jié)合(Malhotra等，自然醫(yī)學(xué)1237-243(1995))。用糖肽酶從中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞產(chǎn)生的CAMPATH-1H(一種重組人源化鼠單克隆IgG1抗體，能夠識(shí)別人淋巴細(xì)胞的CDw52抗原)中的去除部寡糖，導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解作用(CMCL)完全喪失(Boyd等，分子免疫學(xué)321311-1318(1996))，但是用神經(jīng)酰胺酶選擇性地去除唾液酸殘基則對(duì)DMCL沒有影響。另據(jù)報(bào)道，抗體糖基化還會(huì)影響抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。例如，據(jù)報(bào)道，抗體的糖基化會(huì)影響抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。具體地說，具有四環(huán)素調(diào)節(jié)的β(1，4)-N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶III(GnIII)(一種催化等分GlcNAc形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)的CHO細(xì)胞具有增強(qiáng)的DCC活性(Umana等，成熟生物技術(shù)17176-180(1999))。
抗體的糖基化一般是N連接或O連接的。N連接指糖基連接于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是糖基與天冬酰胺側(cè)鏈酶促結(jié)合的識(shí)別序列，其中的X是脯氨酸之外的任一氨基酸。因此，多肽內(nèi)存在以上三肽序列之一則形成一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。O連接糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸(一般為絲氨酸或蘇氨酸，但也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸)連接。
抗體的糖基化變體即抗體的糖基化方式被改變的變體。所謂“改變”即刪除一個(gè)或多個(gè)抗體內(nèi)的原糖基，增加一個(gè)或多個(gè)糖基，改變糖基化的組成(糖基化方式)和糖基化程度等。
給抗體增加糖基化位點(diǎn)可通過改變含有一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列的氨基酸序列(如果是N連接糖基化位點(diǎn))。改變還可以通過增加或取代原抗體的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(如果是O連接糖基化位點(diǎn))。同理，去除糖基化位點(diǎn)也可以通過改變抗體天然糖基化位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸。
改變氨基酸序列常可以通過改變其核酸序列。編碼抗ErbB2抗體氨基酸序列變體的核酸分子可用多種本領(lǐng)域已知方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源中分離(如果存在天然氨基酸序列變體)，或通過對(duì)抗ErbB2抗體的預(yù)制變體或非變異體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)(定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒誘變。
還可以改變抗體糖基化(包括糖基化方式)而不改變氨基酸序列或其核苷酸序列。糖基化主要依賴于表達(dá)該抗體的宿主細(xì)胞。因?yàn)橛脕肀磉_(dá)作為潛在治療劑的重組糖蛋白(例如抗體)的細(xì)胞一般都不是原天然細(xì)胞，所以可以期望抗體糖基化方式的顯著變異(見，例如Hse等，生物化學(xué)雜志2729062-9070(1997))。除選擇宿主細(xì)胞之外，在重組生產(chǎn)抗體過程中影響糖基化的因素還包括生長(zhǎng)模式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)物密度、給氧條件、pH、純化方法等。已有多種方法可用來在特定宿主內(nèi)改變糖基化方式，包括引入或過量表達(dá)參與寡糖生產(chǎn)的酶(美國(guó)專利5,047,335；5,510,261和5,278,299)?？梢杂妹咐鐑?nèi)切糖苷酶H(Endo H)消除糖蛋白的糖基化或某種類型的糖基化。此外，可以通過基因工程使得重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生缺陷，不能加工某種類型的多糖。以上技術(shù)或類似技術(shù)都是本領(lǐng)域已知的。
抗體的糖基化結(jié)構(gòu)可以通過常規(guī)糖分析技術(shù)來分析，包括凝集素層析，NMB質(zhì)譜，HPLC，GPC，單糖組成分析，順序酶促消化和HPAEC-PAD(通過高pH離子交換層析根據(jù)電荷來分離寡糖)。為分析目的解離寡糖的技術(shù)也是已知的，包括但不限于酶促處理(一般用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)腔-β-半乳糖苷酶)，用強(qiáng)堿性條件主要解離O連接結(jié)構(gòu)，和用無水肼釋放N和O連接寡糖的化學(xué)方法。
(ix)篩選具有所需特性的抗體以上描述了制備抗體的技術(shù)。根據(jù)需要，然后可以挑選具有某些生物學(xué)特征的抗體。
例如，要鑒定生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體，可以通過篩選抑制過量表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。實(shí)施方式之一中，所選的生長(zhǎng)抑制性抗體在約0.5-30g/ml濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物中SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制可達(dá)20-100％，較好的是約50-100％。為了鑒定這樣的抗體，可進(jìn)行美國(guó)專利5,677,171所述的SK-BR-3試驗(yàn)。根據(jù)該試驗(yàn)，將SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)在1∶1的F12和DMEM培養(yǎng)基中，其中補(bǔ)充了10％胎牛血清，谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素。在一個(gè)35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上接種20,000個(gè)SK-BR-3細(xì)胞(2ml/35mm培養(yǎng)皿)。每培養(yǎng)皿內(nèi)加0.5-30g/ml抗ErbB2抗體。6天后，用電子COULTER細(xì)胞計(jì)數(shù)儀清點(diǎn)細(xì)胞數(shù)，并與未處理細(xì)胞比較。挑選抑制SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)20-100％或50-100％的抗體作為生長(zhǎng)抑制性抗體。
要挑選誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，可以通過與對(duì)照相比評(píng)價(jià)由PI、臺(tái)盼藍(lán)或7AAD攝取反映的細(xì)胞膜破損。優(yōu)選試驗(yàn)是BT474細(xì)胞PI攝取試驗(yàn)。根據(jù)該試驗(yàn)，將BT474細(xì)胞(獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)培養(yǎng)在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)Ham′s F-12(50∶50)中，其中補(bǔ)充了10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺。(因此，該試驗(yàn)在無補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行)。以3×106/培養(yǎng)皿的密度將BT474細(xì)胞接種到100×20mm培養(yǎng)皿上，過夜附著。然后去除培養(yǎng)基，換以純新鮮培養(yǎng)基或含10g/ml相應(yīng)單克隆抗體的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)3天。每次處理后用PBS洗滌細(xì)胞單層，并通過胰蛋白酶消化解離。然后在4℃以1200rpm離心細(xì)胞5分鐘，將沉淀重懸于3ml冰冷的Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)，并等分后轉(zhuǎn)移到35mm濾網(wǎng)蓋12×75試管(1ml/管，每一處理組3管)內(nèi)，消除細(xì)胞塊。然后在試管內(nèi)加入PI(10g/ml)?？捎肍ACSCAN流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERT CellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。根據(jù)PI吸收測(cè)定，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著水平的抗體可選作細(xì)胞死亡誘導(dǎo)性抗體。
為了挑選誘導(dǎo)凋亡的抗體，可用BT474細(xì)胞進(jìn)行膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)。如前所述培養(yǎng)BT474細(xì)胞，并接種到培養(yǎng)皿中。然后去除培養(yǎng)基，換以純新鮮培養(yǎng)基和含有10g/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基。培養(yǎng)3天后，用PBS洗滌細(xì)胞單層，用胰蛋白酶消化解離。然后離心細(xì)胞，重懸于Ca2+結(jié)合緩沖液中，如前所述等分到試管中進(jìn)行細(xì)胞死亡試驗(yàn)。然后在試管內(nèi)加入帶標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(例如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(1g/ml)。可用FACSCAN流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERT CellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品?？商暨x與對(duì)照相比誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白結(jié)合達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平的抗體作為凋亡誘導(dǎo)性細(xì)胞。
除了膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗(yàn)之外，還可以采用BT474細(xì)胞DNA染色試驗(yàn)。為例進(jìn)行該該試驗(yàn)，將經(jīng)以上兩段所研究抗體處理的BT474細(xì)胞與9g/ml HOECHST33342在37℃共培養(yǎng)2小時(shí)，然后在EPICS ELITE流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(CoulterCorporation)上用MODFIT LT軟件(Verity Software House)進(jìn)行分析。挑選誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞百分比比未處理細(xì)胞(至多100％凋亡細(xì)胞)高2倍(3倍或以上更好)的抗體作為促凋亡抗體。
為了鑒定阻抑ErbB受體被配體活化的抗體，可測(cè)定抗體阻抑ErbB配體與表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞結(jié)合的能力(例如所研究的ErbB受體與另一ErbB受體偶聯(lián)成ErbB異寡聚體)。例如，可將天然表達(dá)或轉(zhuǎn)染后表達(dá)ErbB異寡聚體內(nèi)各ErbB受體的細(xì)胞與抗體共培養(yǎng)，然后接觸帶標(biāo)記的ErbB配體。然后，評(píng)價(jià)抗ErbB2抗體阻抑配體與ErbB異寡聚體內(nèi)ErbB受體結(jié)合的能力。
例如，可如后文實(shí)施例1所述，在24孔板內(nèi)，在冰上，用MCF7培養(yǎng)物單層進(jìn)行抗ErbB2抗體抑制HRG與MCF7乳房癌細(xì)胞線結(jié)合的試驗(yàn)?？稍诟骺變?nèi)加入抗ErbB2單克隆抗體，培養(yǎng)30分鐘。然后加入125I-標(biāo)記的rHRG 1177-224(25pm)，繼續(xù)培養(yǎng)4-16小時(shí)。制作量效曲線，己酸所研究抗體的IC50。實(shí)施方式之一中，在該試驗(yàn)中，阻抑ErbB受體被配體活化的抗體抑制HRG與MCF7細(xì)胞結(jié)合的IC50約50nM或以下，約10nM或以下更好。如果所述抗體是抗體片段，例如Fab片段，該試驗(yàn)中抑制HRG結(jié)合MCF7細(xì)胞的IC50約100nM或以下，約50nM或以下更好。
也可以或還可以評(píng)價(jià)抗ErbB2抗體阻抑ErbB配體激發(fā)ErbB異寡聚物內(nèi)ErbB受體的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可將內(nèi)源性表達(dá)或轉(zhuǎn)染表達(dá)ErbB受體的細(xì)胞與抗體共培養(yǎng)，然后用抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(可以與可測(cè)標(biāo)記偶聯(lián))分析ErbB配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。也可采用美國(guó)專利5,766,863所述的激酶受體活化試驗(yàn)來測(cè)定ErbB受體活化，和抗體對(duì)此活性的阻抑能力。
實(shí)施方式之一中，可篩選抑制HRG激發(fā)MCF7細(xì)胞內(nèi)p180酪氨酸磷酸化的抗體。例如，可將MCF7細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，在各孔中加入抗ErbB2單克隆抗體，室溫培養(yǎng)30分鐘；然后在各孔中加入rHRG 1177-224(0.2nM)，繼續(xù)培養(yǎng)8分鐘。抽干各孔中的培養(yǎng)基，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH6.8)終止反應(yīng)。各種樣品(25μl)在4-12％梯度凝膠(Novex)上電泳，然后電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜上。進(jìn)行抗磷酸酪氨酸(1g/ml)免疫印跡，用反射密度法定量測(cè)定Mr-180,000處主要反應(yīng)性帶的強(qiáng)度。所選抗體應(yīng)能顯著抑制HRG激發(fā)的p180酪氨酸磷酸化，即在該試驗(yàn)中僅為對(duì)照的0-35％。根據(jù)反射密度法測(cè)定，繪制抑制HRG激發(fā)p180酪氨酸磷酸化的量效曲線，并計(jì)算所研究抗體的IC50。實(shí)施方式之一中，阻抑配體活化ErbB受體的抗體抑制HRG激發(fā)p180酪氨酸磷酸化的IC50約為50nM或以下，10nM或以下更好。如果所述抗體是Fab等抗體片段，其在該試驗(yàn)中抑制HRG激發(fā)p180酪氨酸磷酸化的IC50約為100nM或以下，50nM或以下更好。
也可以按照Schaefer等，致癌基因151385-1394(1997)所述，評(píng)價(jià)抗體對(duì)MDA-MB-175細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。根據(jù)該試驗(yàn)，MDA-MB-175細(xì)胞可用抗ErbB2單克隆抗體(10g/ml)處理4天，然后用結(jié)晶紫染色?？笶rbB2抗體共培養(yǎng)對(duì)該細(xì)胞線造成的生長(zhǎng)抑制與單克隆抗體2C4相似。另一實(shí)施方式中，外源性HRG不能顯著逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。較好的是，不論是否存在外源性HRG，所述抗體都能夠比單克隆抗體4D5更強(qiáng)(或者比單克隆抗體7F3更強(qiáng))地抑制MDA-MB-175細(xì)胞的增殖。
實(shí)施方式之一中，根據(jù)共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)測(cè)定，所研究的抗ErbB2抗體可阻抑ErbB2與MCF7和SK-BR-3細(xì)胞內(nèi)ErbB3的heregulin依賴性結(jié)合，且比單克隆抗體4D5更有效，更好的是比單克隆抗體7F3更有效。
為了篩選能與某研究抗體所結(jié)合的ErbB2上的表位結(jié)合的抗體，可進(jìn)行常規(guī)交叉阻抑實(shí)驗(yàn)，例如抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane編輯(1988)所述。也可以或還可以用已知方法制作表位圖譜(見圖1A和1B)。
然后，可根據(jù)以上細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行動(dòng)物(例如鼠、模型、人臨床試驗(yàn))試驗(yàn)。例如，用后文實(shí)施例所述的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可證明某種抗體不能或能有限地治療ErbB2過量表達(dá)型腫瘤。
B.抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物(免疫偶聯(lián)物)制備抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物可通過將抗ErbB抗體與類美坦素分子化學(xué)連接，但不可顯著削弱抗體和類美坦素分子各自的生物學(xué)活性。類美坦素是本領(lǐng)域所熟知的，它可用已知方法合成，也可以從天然原料中分離。合適的類美坦素見美國(guó)專利5,208,020等專利和非專利出版物。優(yōu)選的類美坦素是美坦醇和在芳環(huán)或其他位置上被修飾的美坦醇類似物，例如各種美坦醇酯。
本領(lǐng)域內(nèi)已知許多接頭可用于制作抗體-類美坦素偶聯(lián)物，例如美國(guó)專利5,208,020或歐洲專利0425235B1和Chari等，癌癥研究52127-131(1992)所述。此類接頭包括以上專利中所述的二硫基，硫醚基，酸不穩(wěn)定性基團(tuán)，光不穩(wěn)定基團(tuán)，肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)，或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，其中優(yōu)選二硫基和硫醚基。
抗體與類美坦素的偶聯(lián)物可用多種雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，例如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙官能衍生物(例如鹽酸己二酰亞胺二甲酯)，活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)，醛(例如戊二醛)，二重氮化合物(例如二(對(duì)重氮苯甲?；?己二胺)，二重氮衍生物(例如二(對(duì)重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(例如2，6-二異氰酸甲苯酯)，和雙活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括可形成二硫鍵的N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，生物化學(xué)雜志173723-737(1978))和N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)。
可將接頭連接于類美坦素分子的各個(gè)位置，這取決于連接的類型。例如，可用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)在具有羥基的C3位，羥甲基修飾的C14位，羥基修飾的C15位，和具有羥基的C20位形成酯鍵。優(yōu)選實(shí)施方式之一中，連鍵形成于類美坦素或美坦醇類似物的C3位。
C.藥物制劑將具有所需純度的抗體與可選的藥學(xué)上認(rèn)可的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷明頓藥物科學(xué)，第16版，Osol，A.編(1980))混合，制備成凍干劑或水溶液形式的本發(fā)明抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療性制劑。認(rèn)可的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度對(duì)受主無毒，包括緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，和其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑，例如氯化十八烷基二甲基芐基銨，氯化己烷雙胺，亞芐基二氯，苯索氯銨，苯酚或芐醇，例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯的對(duì)羥基苯甲酸烷酯，兒茶酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇和間苯甲酚；低分子量(少于10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其他糖類，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖，山梨醇；成鹽反離子，例如鈉；精神復(fù)合物，例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物；和/或非離子性表面活性劑，例如TWEEN，PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。優(yōu)選的冷凍干燥抗ErbB2抗體制劑可見WO97/04810。
本發(fā)明的制劑也可以包含一種以上針對(duì)特定適應(yīng)癥的活性化合物，較好的是，彼此的活性相互補(bǔ)充而不相互消減。例如，同一制劑中可另含結(jié)合EGFR、ErbB2(例如結(jié)合ErbB2上其他表位)、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抗體或抗體-類美坦素偶聯(lián)物。組合物也可以或還可以含有化療試劑、細(xì)胞毒性試劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑、抗激素劑和/或心保護(hù)劑。這些分子以適宜的有效含量存在。
可以將活性成分包在微膠囊中。例如，可采用凝聚技術(shù)或界面聚合技術(shù)分別包入羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊內(nèi)，包于膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠囊)中或包于粗乳液中。此類技術(shù)可參考雷明頓藥物科學(xué)第16版，Osol，A.編(1980)。
可以制備成緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括內(nèi)含抗體的固體疏水性聚合物半透性有形(例如膜或微膠囊)基質(zhì)。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專利3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物，非可降解的乙烯-乙酸乙酯共聚物，可降解的乳酸-乙二酸共聚物，例如LUPRON DEOPT(由乳酸-乙二酸共聚物和乙酸leuprolide構(gòu)成的注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
體內(nèi)使用的制劑必須無菌。這可以通過除菌濾膜過濾做到。
D.使用抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物的治療方法本發(fā)明認(rèn)為，可用抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療多種疾病，例如良性或惡性腫瘤；白血病和淋巴癌；還包括例如神經(jīng)、膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、下丘腦、腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基底細(xì)胞、囊胚腔、炎癥、血管生成和免疫疾病。
所治的疾病主要是癌癥。本發(fā)明可治的癌癥例如但不限于惡性癌癥、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴癌。更具體的是鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌)，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳房癌，結(jié)腸癌，直腸癌，直腸結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
所治的癌應(yīng)包含ErbB表達(dá)細(xì)胞，這樣，本發(fā)明的抗ErbB抗體就能與以過量表達(dá)ErbB受體為特征的癌結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方式之一中，所述的癌包含ErbB2表達(dá)細(xì)胞，更好的是以過量表達(dá)ErbB2受體為特征的細(xì)胞?？捎枚喾N已知的診斷/預(yù)后試驗(yàn)來測(cè)定癌中ErbB例如ErbB2的表達(dá)。實(shí)施方式之一中，可通過IHC，用HERCEPTEST(Dako)來分析ErbB2過量表達(dá)?？捎媚[瘤活檢樣品的石蠟包埋組織切片進(jìn)行IHC試驗(yàn)，ErbB2蛋白染色強(qiáng)度定級(jí)如下0級(jí)沒有觀察到染色，或者，僅10％以下腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜被染色；1+級(jí)10％以上腫瘤細(xì)胞膜有弱染色/或難以察覺的染色。細(xì)胞僅部分細(xì)胞膜被染色。2+級(jí)10％以上腫瘤細(xì)胞的全細(xì)胞膜被弱-中度染色。3+級(jí)10％以上腫瘤細(xì)胞的全細(xì)胞膜被中度-強(qiáng)染色。
ErbB2過量表達(dá)呈0至1+級(jí)的腫瘤可認(rèn)為不具有過量表達(dá)ErbB2的特征，2+至3+的腫瘤則認(rèn)為以過量表達(dá)ErbB2為特征。
測(cè)定腫瘤中ErbB2過量表達(dá)的程度，也可以或還可以對(duì)福爾馬林固定或石蠟包埋的腫瘤組織進(jìn)行FISH試驗(yàn)，例如INFORM(Ventana，Arizona出售)或PATHVISION(Vysis，Illinois)。
實(shí)施方式之一中，癌癥表達(dá)(或過量表達(dá))EGFR。過量表達(dá)EGFR的癌癥例如鱗狀細(xì)胞癌(如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌(如小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌)，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳房癌，結(jié)腸癌，直腸癌，直腸結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
較好的是，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物和/或與之結(jié)合的ErbB(例如ErbB2)或EGFR蛋白由細(xì)胞內(nèi)化，這樣可提高免疫偶聯(lián)物殺死其所結(jié)合癌細(xì)胞的療效。優(yōu)選實(shí)施方式之一中，細(xì)胞毒試劑(類美坦素)靶向或干擾癌細(xì)胞內(nèi)的核酸。
本發(fā)明的治療針對(duì)的是對(duì)非偶聯(lián)抗ErbB抗體無反應(yīng)或反應(yīng)差的ErbB過量表達(dá)腫瘤。這些患者可能曾經(jīng)接受過無類美坦素偶聯(lián)抗ErbB抗體治療，但沒有獲得顯著改善，或者只得到暫時(shí)改善。然而，患者曾接受非偶聯(lián)抗ErbB抗體治療并不是其作為本發(fā)明治療候選者的條件。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員根據(jù)患者公開的臨床信息和記錄，不難判斷其是否適合本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物治療。對(duì)不曾接受(非偶聯(lián))抗ErbB抗體治療的哺乳動(dòng)物-尤其是人-進(jìn)行治療也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
可采用已知方法將抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物給予哺乳動(dòng)物尤其是人，例如靜脈內(nèi)(例如推注或連續(xù)滴注)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部、吸入途徑。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)或皮下給予抗體。
可將其他治療與抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療相聯(lián)合。聯(lián)合給藥包括用單獨(dú)制劑或單一制劑聯(lián)合給藥，和按一定順序給藥，最好存在著多種活性成分同時(shí)發(fā)揮各自生物學(xué)活性的時(shí)候。
優(yōu)選實(shí)施方式之一中，患者接受兩種或兩種以上不同抗ErbB抗體治療，至少其中之一的形式是與類美坦素的偶聯(lián)物。例如，患者接受第一抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療，其中的抗體是生長(zhǎng)抑制劑(例如HERCEPTIN)，并接受第二抗ErbB2抗體或抗體-免疫偶聯(lián)物治療，所述第二免疫偶聯(lián)物例如抗體-類美坦素偶聯(lián)物，可阻抑ErbB受體被配體活化(例如2C4或其人源化和/或親和成熟變體)或誘導(dǎo)ErbB2過量表達(dá)細(xì)胞凋亡(例如7C2，7F3或它們的人源化變體)。另一實(shí)施方式中，治療包括給予特異性結(jié)合兩種或兩種以上不同ErbB受體(例如ErbB2和EGFR受體)的抗體，其中至少一種抗ErbB抗體以類美坦素偶聯(lián)物形式給予。較好的是，以上聯(lián)合治療可獲得協(xié)同效應(yīng)。
也可將抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物與針對(duì)其他非ErbB受體族腫瘤相關(guān)抗原的抗體聯(lián)合給予。此處的其他抗體可(例如)結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，其形式可以是與類美坦素的偶聯(lián)物，或其他免疫偶聯(lián)物。
實(shí)施方式之一中，本發(fā)明的治療包聯(lián)合給予抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物與一種或多種化療制劑或生長(zhǎng)抑制劑，包括聯(lián)合給予不同化療制劑的混合物。優(yōu)選的化療制劑包括taxanes(例如paclitaxel和doxetaxel)和/或anthracycline抗生素。此類化療制劑的準(zhǔn)備和使用劑量可以按照制造商的說明書或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定。此類化療的準(zhǔn)備和使用劑量也可參考化療服務(wù)，M.C.Perry編，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
可將抗體-類美坦素偶聯(lián)物與抗激素化合物聯(lián)用，后者例如抗雌激素化合物，如他莫昔芬；抗孕酮化合物，例如onapristone(EP616812)；或抗雄激素化合物，例如氟他胺，它們的劑量是已知的。當(dāng)待治療的癌癥非激素依賴性時(shí)，患者可能已接收過抗激素治療，當(dāng)癌癥變?yōu)榉羌に匾蕾囆院?，可給予患者抗ErbB2抗體(和上述他藥物)。
有時(shí)，還可能優(yōu)選給患者聯(lián)用心保護(hù)劑(為了預(yù)防或減輕與治療相關(guān)的心肌功能不良)或一種或多種細(xì)胞因子。除以上治療方法之外，還可以對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)切除癌細(xì)胞和/或放射治療。
以上聯(lián)用制劑的劑量可以是目前所用的，也可以略低，因?yàn)檫@些制劑可能與抗ErbB2抗體產(chǎn)生疊加(協(xié)同)效應(yīng)。
就預(yù)防或治療疾病而言，抗體-類美坦素偶聯(lián)物的合適劑量取決于所治疾病的種類、程度和病程，抗體是用于預(yù)防還是用于治療，先前的治療，患者的臨床記錄和對(duì)抗體的反應(yīng)，以及主治醫(yī)生的考慮。抗體-類美坦素偶聯(lián)物可以一次性給予患者，或分多次給予。根據(jù)疾病的種類、程度，不論是一次性給予或多次給予或連續(xù)輸注，抗體-類美坦素偶聯(lián)物的初始候選劑量約為1g/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)。根據(jù)以上因素，典型的日用劑量約為1g/kg至100mg/kg或以上。如果是數(shù)日或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)給藥，根據(jù)病情，治療應(yīng)持續(xù)至癥狀抑制達(dá)到要求。一種優(yōu)選給藥方案包括抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物初始劑量約4mg/kg，然后每周的維持劑量約2mg/kg。然而，也可以采用其他給藥方案。可用常規(guī)技術(shù)和試驗(yàn)來監(jiān)測(cè)本發(fā)明治療的進(jìn)展。
E.產(chǎn)品本發(fā)明另一實(shí)施方式提供一種含有治療前述疾病所需材料的產(chǎn)品。該產(chǎn)品包括容器和容器上或與之在一起的標(biāo)簽或包裝內(nèi)說明。合適的容器包括例如瓶，管形瓶或注射管等。容器可以用玻璃或塑料等多種材料制成。容器內(nèi)裝用于治療疾病的組合物，并具有無菌接口(例如，容器可以是一個(gè)靜脈輸液袋或帶塞管形瓶，塞子可讓針頭穿透)。至少組合物中有效成分之一是抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物。標(biāo)簽或包裝內(nèi)說明指明，該組合物用于治療選定的疾病，例如癌癥。另一實(shí)施方式中，標(biāo)簽或包裝內(nèi)說明指明，含結(jié)合ErbB2的抗體的組合物可用于治療表達(dá)ErbB受體的癌癥，所述受體選自表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、ErbB2、ErbB3和ErbB4，最好是EGFR。此外，標(biāo)簽和包裝內(nèi)說明還指明，接受治療的患者所患應(yīng)是以ErbB受體(選擇EGFR，ErbB2，ErbB3或ErbB4)活化過度為特征的癌癥。例如，所述癌癥可以是過量表達(dá)上述受體之一和/或過量表達(dá)某種ErbB配體(例如TGF-)的癌癥。標(biāo)簽和包裝內(nèi)說明還可以指明，組合物也可以用來治療非以過量表達(dá)ErbB2受體為特征的癌癥。例如，雖然HERCEPTIN的包裝內(nèi)說明書指明該抗體用于治療其腫瘤過量表達(dá)ErbB2蛋白的乳房癌轉(zhuǎn)移患者，它還說明該抗體或組合物可用于治療對(duì)HERCETPIN無反應(yīng)或反應(yīng)差的癌癥。另一種實(shí)施方式中，包裝內(nèi)說明可以指明，該抗體-類美坦素偶聯(lián)物或組合物還可用于治療非激素依賴性癌癥，例如前列腺癌、結(jié)腸癌或結(jié)腸直腸癌。而且，本發(fā)明產(chǎn)品還可以包括(a)第一容器，其中的組合物含第一抗體與類美坦素的偶聯(lián)物，該抗體結(jié)合ErbB2并抑制過量表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)；和(b)第二容器，其中的組合物含第二抗體或其與類美坦素的偶聯(lián)物，該抗體結(jié)合ErbB2并阻抑ErbB受體被配體活化。本發(fā)明此實(shí)施方式的產(chǎn)品還包括說明該第一和第二抗體可治療癌癥的包裝內(nèi)說明書。本發(fā)明的產(chǎn)品也可以或還可以包括內(nèi)含藥學(xué)上認(rèn)可的緩沖液(例如注射用無菌水(BWFI)，磷酸鹽緩沖液，Ringer溶液和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。該產(chǎn)品還可以根據(jù)銷售和使用者需要包括其他物質(zhì)，例如其他緩沖液，稀釋劑，過濾器，針頭和注射管等。
以下非限定性實(shí)施例將進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1抗ErbB2單克隆抗體4D5的產(chǎn)生，鑒定和人源化按照Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)所述制備特異性結(jié)合ErbB2胞外區(qū)的鼠單克隆抗體4D5。簡(jiǎn)而言之，按Hudziak等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)847158-7163(1987)所述培養(yǎng)NIH 3T3/HER2-3400細(xì)胞(每細(xì)胞表達(dá)約1×105個(gè)ErbB2分子)，用含25mM EDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)收獲，用于免疫BALB/小鼠。在第0、2、5、7周，給小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射含107個(gè)細(xì)胞的0.5ml PBS。給予抗血清可免疫沉淀32P標(biāo)記的ErbB2的小鼠在第9周和第13周i.p.注射麥胚凝集素瓊脂糖(WGA)純化的ErbB2膜提取物。這以后，靜脈內(nèi)(i.v.)注射0.1ml ErbB2制劑，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞線X63-Ag8.653融合。通過ELISA和放射性免疫沉淀篩選ErbB2結(jié)合性雜交瘤上清液。表位圖譜和鑒定用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)(Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990))測(cè)定單克隆抗體4D5所結(jié)合的ErbB2表位。進(jìn)行交叉阻抑試驗(yàn)，即用PANDEXTM篩選儀定量測(cè)定完整細(xì)胞上的直接熒光。用標(biāo)準(zhǔn)方法(Wofsy等，細(xì)胞免疫學(xué)中的選擇方法，p.287，Mishel和Schiigi(編)，San FranciscoW.J.Freeman Co.(1980))將單克隆抗體與異硫氰酯熒光素酯(FITC)偶聯(lián)。用胰蛋白酶解離下鋪滿的NIH 3T3/HER2-3400細(xì)胞單層，洗滌一次，重懸于含0.5％胎牛血清白蛋白(BSA)和0.1％NaN3的冷PBS，濃度為1.75×106細(xì)胞/ml。加入膠乳粒子(IDC，Portland，OR)至1％，用以減少PANDEXTM板膜的堵塞。在PANDEXTM板的孔內(nèi)加入201細(xì)胞懸浮液和201純化單克隆抗體(100g/ml至0.1g/ml)，冰上培養(yǎng)30分鐘，各孔加入預(yù)定稀釋度的FITC標(biāo)記的單抗201，培養(yǎng)30分鐘，洗滌，用PANDEXTM定量測(cè)定熒光。如果單克隆抗體抑制彼此的結(jié)合比抑制無關(guān)對(duì)照抗體高出50％或以上，則可認(rèn)為它們針對(duì)相同的表位。該試驗(yàn)中，設(shè)定單克隆抗體4D5針對(duì)表位1(ErbB2胞外區(qū)內(nèi)氨基酸殘基529-625，包括端值，見SEQ ID NO3)。
用乳房癌細(xì)胞線SK-BR-3評(píng)價(jià)單克隆抗體4D5的生長(zhǎng)抑制特征(見Hudziak等，分子細(xì)胞生物學(xué)9(3)1165-1172(1989))。簡(jiǎn)而言之，用胰蛋白酶(0.25v/v％)解離下SK-BR-3細(xì)胞，懸浮于完全培養(yǎng)基，4×105細(xì)胞/ml。將100μl(4×104個(gè)細(xì)胞)的等份加入96孔微稀釋板孔中，待細(xì)胞附著后加入100ul純培養(yǎng)基或含單克隆抗體(最終濃度為5g/ml)的培養(yǎng)基。72小時(shí)后，用PBS(pH7.5)洗板2次，用結(jié)晶紫(甲醇中的0.5％溶液)染色，按Sugarnan等，科學(xué)230943-945(1985)所述分析相對(duì)細(xì)胞增殖。單克隆抗體4D5抑制SK-BR-3細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞繁殖達(dá)56％。
還評(píng)價(jià)了單克隆抗體4D5抑制HRG刺激MCF7全細(xì)胞裂解液中M，180,000蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的能力(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。據(jù)報(bào)道，MCF7細(xì)胞表達(dá)所有已知ErbB受體，但表達(dá)水平較低。由于ErbB2、ErbB3和ErbB4的分子大小幾乎相同，因此，用Western印跡分析法評(píng)價(jià)全細(xì)胞裂解液不可能分辨出是哪一蛋白被酪氨酸磷酸化。然而，這些細(xì)胞是HRG酪氨酸磷酸化試驗(yàn)理想的材料，因?yàn)樵谠囼?yàn)條件下，在沒有外源HRG加入的條件下，它們產(chǎn)生M，180,000范圍內(nèi)蛋白的酪氨酸磷酸化水平為零或不可能測(cè)得。
將MCF7細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板內(nèi)，在各孔內(nèi)加入抗ErbB2抗體，室溫下培養(yǎng)30分鐘；然后在各孔內(nèi)加入rHRG 1177-244至0.2nM最終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)8分鐘。小心地抽干各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT，25mM Tris-HCl，pH6.8)終止反應(yīng)。各樣品(251)在4-12％梯度凝膠(Novex)上電泳，然后電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯膜上。進(jìn)行抗磷酸酪氨酸(4G10，獲自UBI，用量為1g/ml)免疫印跡，按已知方法(Holmes等，科學(xué)2561205-1210(1992)和Sliwkowski等，生物化學(xué)雜志26914661-14665(1994))，用反射密度法定量測(cè)定M，180,000主反應(yīng)帶的強(qiáng)度。
單克隆抗體4D5顯著抑制M，180,000處HRG誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化信號(hào)產(chǎn)生，但在沒有HRG存在時(shí)，不能激發(fā)M，180,000范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。而且，該抗體與EGFR(Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990))、ErbB2、ErbB3或ErbB4無交叉反應(yīng)。單克隆抗體4D5阻抑HRG激發(fā)的酪氨酸磷酸化可達(dá)50％。
還評(píng)價(jià)了在有或沒有外源性rHRG1存在下，單克隆抗體4D5對(duì)MDA-MB-175和SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Schaefer等，致癌基因151385-1394(1997))。MDA-MB-175細(xì)胞內(nèi)的ErbB2水平比正常乳房上皮細(xì)胞高4-6倍，該細(xì)胞內(nèi)的ErbB2-ErbB4受體組成型地被酪氨酸磷酸化。不論有無外源HRG，單克隆抗體4D5都能抑制MDA-MB-175細(xì)胞的增殖。4D5對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用依賴于ErbB2表達(dá)水平(Lweis等，癌癥與免疫學(xué)與免疫治療學(xué)37255-263(1993))。SK-BR-3細(xì)胞內(nèi)測(cè)得的最大抑制為66％。然而，外源性HRG可抵消這一作用。人源化將鼠單克隆抗體4D5人源化，采用新的“基因轉(zhuǎn)變誘變”法，見美國(guó)專利5,821,337。以下實(shí)施例所用的人源化單克隆抗體4D5稱為huMAb4D5-8。該抗體為IgG1同種型。
實(shí)施例2HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物1.HERCEPTIN的純化將HERCEPTIN(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，美國(guó)專利5,821,337)(每管含440mg抗體)溶于50ml MES緩沖液(25mM MES，50mM NaCl，pH5.6)。將樣品上到陽離子交換柱(Sepharose S，15cm×1.7cm)上，該柱預(yù)先用同種緩沖液平衡。然后用該緩沖液洗柱(5倍柱體積)。將緩沖液內(nèi)NaCl濃度提高至200mM來洗脫HERCEPTIN。合并含抗體的流出組分，稀釋至10mg/ml，在含50mm磷酸鉀，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.5的緩沖液中透析。
2.用SPP修飾HERCEPTIN用N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)修飾純化后的HERCEPTIN，以引進(jìn)二硫吡啶基團(tuán)。用SPP(用2.3ml乙醇賠償5.3摩爾當(dāng)量)處理44.7ml含抗體(376mg，8mg/ml)的50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5，NaCl(50mM)，EDTA(1mM))。氬氣氛下環(huán)境溫度下培養(yǎng)90分鐘后，用Sephadex G25柱凝膠過濾反應(yīng)混合物，該柱先用35mM檸檬酸鈉，154mM NaCl和2mM EDTA平衡。合并含抗體的流出組分，并分析。如前所述測(cè)定抗體的修飾度。修飾抗體(HERCEPTIN-SPP-Py)的回收率為337mg(89.7％)，每個(gè)抗體有4.5個(gè)可釋放的2-硫吡啶基。
3.HERCEPTIN-SPP-Py與DM1的偶聯(lián)用前述35mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.5)稀釋修飾抗體(337.0mg，9.5μmol可釋放2-硫吡啶基)成2.5mg/ml最終濃度。然后在該抗體稀釋液中加入DM1(結(jié)構(gòu)見圖1)(1.7當(dāng)量，16.1μmol)以3.0mM二甲基乙酰胺(DMA，在最終反應(yīng)混合物中的濃度為3％(v/v))配制的溶液。反應(yīng)在氬氣氛下、環(huán)境溫度下進(jìn)行20小時(shí)。HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)見圖2。
將反應(yīng)液上樣到Sephacryl S300凝膠過濾柱(5.0cm×90.0cm，1.77L)上，該柱預(yù)先用35mM檸檬酸鈉，154mM NaCl(pH6.5)平衡。流量為5.0ml/min，收集65份組分(每份20.0ml)。主峰位于第47組分附近(圖3)。主峰含單體HERCEPTIN-DM1。合并第44-51組分并分析。通過測(cè)定252nm和280nm處的吸光度來測(cè)定每抗體分子所連接的DM1藥物個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)抗體分子連接3.7個(gè)藥物分子。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為了提高HERCEPTIN的臨床活性，制作了一種轉(zhuǎn)基因HER2小鼠模型，可用于進(jìn)行新的HER2定向療法的臨床前試驗(yàn)。表達(dá)neu突變活化形式(即大鼠HER2的類似物)的轉(zhuǎn)基因小鼠很容易形成腫瘤，但是乳房癌過量表達(dá)的HER2沒有發(fā)生突變，而且，在過量表達(dá)非突變HER2的轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)，腫瘤的形成也緩和得多(Webster等，癌癥生物學(xué)學(xué)報(bào)569-76(1994))。為了增強(qiáng)非突變HER2腫瘤的形成，進(jìn)一步增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)非突變HER2的過量表達(dá)。
在小鼠乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)HER2表達(dá)的任意啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明構(gòu)建物中。許多乳蛋白基因是由只在乳腺中具有活性的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件轉(zhuǎn)錄的。乳蛋白基因包括編碼酪蛋白(α-S1和β)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和乳清酸性蛋白的基因。綿羊β-乳球蛋白啟動(dòng)子在本領(lǐng)域內(nèi)了解較充分，且已廣泛使用(Whitelaw等，生物化學(xué)雜志28631-39(1992))。然而，類似的其他啟動(dòng)子DNA片段也適用。優(yōu)選啟動(dòng)子是小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)衍生的啟動(dòng)子。本發(fā)明的一種HER2轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物就采用了MMTV LTR啟動(dòng)子。
為了增強(qiáng)非突變HER2腫瘤的形成，我們用上游ATG缺失的HER2 cDNA質(zhì)粒來制造轉(zhuǎn)基因小鼠，該缺失是為了防止上游ATG密碼子啟動(dòng)翻譯，該密碼子啟動(dòng)翻譯會(huì)降低HER2下游真起始密碼子啟動(dòng)翻譯的頻率(見Child等，生物化學(xué)雜志27424335-24341(1999))。此外，可在5′端增加一個(gè)嵌合內(nèi)含子，這也將提高表達(dá)水平(見Neuberger和Williams，核酸研究166713(1988)，Buchman和Berg，分子細(xì)胞生物學(xué)84395(1988)；Brinster等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)85836(1988))。這一嵌合內(nèi)含子衍生自Promega的載體，即pCI-neo哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(bp890-1022)。cNDA的3′端側(cè)接人生長(zhǎng)素外顯子4和5，以及聚腺苷酸化序列。而且，選用FVB小鼠，因?yàn)樵撈废蹈菀仔纬赡[瘤。采用MMTV-LTR啟動(dòng)子來確保HER2在乳腺內(nèi)的組織特異性表達(dá)。為了使得動(dòng)物更容易形成腫瘤，飼以AIN 76A飲食(Rao等，乳房癌研究和治療45149-158(1997))。該轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建物的核苷酸序列(SEQ ID NO1)見圖4。
適合轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的動(dòng)物可從標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)來源獲得，例如Taconic(Germantown，N.Y.)。許多品系都適合，但優(yōu)選的是FVB雌鼠，因?yàn)樗鼈兏菀仔纬赡[瘤。用FVB雄鼠進(jìn)行交配，并用切除了輸精管的CD.1種鼠激發(fā)假孕。切除了輸精管的小鼠可從各供應(yīng)商處獲得。用假孕鼠與FVB小鼠或129/BL6×FVB的p53雜合小鼠交配。用p53等位基因雜合的小鼠來增強(qiáng)腫瘤形成，但這被證明并非必需。所以，有些F1腫瘤是混合品系的。建立了腫瘤的小鼠都是FVB品系的。獲得了6個(gè)建立鼠，具有某些發(fā)展中的腫瘤，不生育后代。
實(shí)施例4以HER2轉(zhuǎn)基因小鼠作為腫瘤模型評(píng)價(jià)HER2-定向治療實(shí)施例3制造的轉(zhuǎn)基因建立小鼠在2月齡左右，其乳腺組織活檢根據(jù)免疫組織化學(xué)染色顯示為3+級(jí)HER2表達(dá)。經(jīng)測(cè)定，脫落進(jìn)入血清的HER2胞外區(qū)約為1.2ng/ml(Huang等，同上)。該小鼠在在產(chǎn)下4窩仔后，約5月齡時(shí)發(fā)生乳房瘤。在無菌條件下手術(shù)切除該腫瘤，切取2mm3的小片，植入野生型FVB雌小鼠的乳房脂肪層中。31個(gè)接受移植的小鼠中22個(gè)發(fā)生腫瘤，潛伏期為5周。隨著繼續(xù)傳代，腫瘤形成的潛伏期越來越短，生長(zhǎng)越來越快，接受移植者中的腫瘤發(fā)病率提高至95％以上。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色監(jiān)測(cè)，在原代腫瘤中，HER2表達(dá)為3+級(jí)，但不一致，在第一代之后，則變成了一致的3+。
用HERCEPTIN或4D5(獲得人源化HERCEPTIN的原鼠抗體)治療患腫瘤小鼠，對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)僅有中等抑制作用(圖5)。HERCEPTIN或4D5治療期間生長(zhǎng)的腫瘤的HER2表達(dá)為3+，這說明沒有HER2陰性腫瘤選擇性。而且，將cy3-HERCEPTIN注射入患腫瘤小鼠后，檢測(cè)到其對(duì)腫瘤細(xì)胞的修飾，這說明無效并非因?yàn)榭贵w沒有與腫瘤接觸。
因?yàn)樵撃[瘤模型的持續(xù)性表達(dá)HER2，且對(duì)HERCEPTIN無反應(yīng)，如實(shí)施例3所述，用HERCEPTIN-類美坦素DM1偶聯(lián)物試驗(yàn)了一種新的方法。圖5顯示，在該模型中，HERCEPTIN-類美坦素DM1偶聯(lián)物具有顯著的抗腫瘤活性。RITUXAN是一種無關(guān)的抗CD20單克隆抗體，在以上研究中用作陰性對(duì)照。與對(duì)照抗體RITUXAN比較，對(duì)HERCEPTIN幾乎沒有反應(yīng)，但HERCEPTIN的類美坦素偶聯(lián)物卻具有顯著的抗腫瘤活性。如圖5所示，所有接受HERCEPTIN-類美坦素偶聯(lián)物治療的小鼠的腫瘤都顯著縮小，雖然都沒有消失。約4周后，腫瘤開始恢復(fù)生長(zhǎng)。此時(shí)，殺死5個(gè)小鼠，發(fā)現(xiàn)，它們的腫瘤表達(dá)HER2水平為3+?？梢姡瑢?duì)HER2陰性腫瘤沒有選擇性。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，在其后的5天內(nèi)用HERCEPTIN-類美坦素偶聯(lián)物對(duì)其余3只小鼠進(jìn)行治療，腫瘤因而再次減退。
生物材料的保藏以下雜交瘤細(xì)胞線已在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA)保藏抗體 ATCC號(hào)保藏日7C2 ATCC HB-122151996年10月17日7F3 ATCC HB-122161996年10月17日
4D5 AICC CRL-10463 1990年5月24日2C4 ATCC HB-12697 1999年4月8日保藏根據(jù)有關(guān)用于專利程序的微生物保藏的國(guó)際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約進(jìn)行(布達(dá)佩斯條約)。以上保藏確保培養(yǎng)物自保藏日起30年內(nèi)保持存活。ATCC根據(jù)布達(dá)佩斯相關(guān)條約，以及Genetech，Inc.與ATCC之間的協(xié)議獲得以上微生物，并保證自相關(guān)美國(guó)專利授權(quán)或在任一美國(guó)或國(guó)外專利申請(qǐng)最先公開后，培養(yǎng)物的后代永久地、無限制地對(duì)公眾開放，并保證對(duì)美國(guó)專利商標(biāo)局根據(jù)35 USC§122和委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定(包括37 CFR§1.12，尤其是886 OG 638)認(rèn)可的主體開放。
以上保藏如正在申請(qǐng)歐洲專利，則在歐洲專利公知將被授權(quán)，或授權(quán)被撤回或視為撤回之日之前，保藏微生物的樣品將只發(fā)放給需要樣品者授權(quán)的專業(yè)人士。(EPC規(guī)則28(4))。
本申請(qǐng)的受讓人同意，如果保藏物在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下死亡或滅失或破壞，將在收到通知后立即更換以同種培養(yǎng)物的活樣品。不應(yīng)將可以獲得保藏物理解為獲得許可實(shí)施本發(fā)明，這樣的理解將違反各國(guó)政府根據(jù)各自專利法所授予的權(quán)利。
以上說明書已足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明的范圍不應(yīng)僅限于保藏的構(gòu)建物，因?yàn)楸２氐膶?shí)施方式只是為了說明本發(fā)明某些方面的內(nèi)容，任何與之等效的構(gòu)建物都應(yīng)屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明對(duì)生物材料進(jìn)行保藏并不意味著以上描述不能滿足實(shí)施本發(fā)明包括最佳實(shí)施方式在內(nèi)的各項(xiàng)內(nèi)容所需，也不應(yīng)將其理解成將權(quán)利要求的范圍局限于具體描述所代表的內(nèi)容。實(shí)際上，根據(jù)以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難發(fā)現(xiàn)除本文所示和所述之外的修改，這些都應(yīng)歸入權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
需要指出的是，根據(jù)本文所述，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都能夠?qū)⒈景l(fā)明的技術(shù)運(yùn)用于具體的問題或場(chǎng)合。本發(fā)明產(chǎn)品的實(shí)施例及其代表性的分離方法、用途和制造方法都不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限定。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，其中的腫瘤以過量表達(dá)ErbB受體為特征，而且對(duì)抗ErbB抗體治療無反應(yīng)或反應(yīng)差，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的哺乳動(dòng)物是人。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述ErbB受體選自ErbB1(EGFR)，ErbB2(HER2)，ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述抗ErbB抗體是生長(zhǎng)抑制性抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述抗ErbB抗體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述抗ErbB抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述抗體是抗ErbB2抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述腫瘤是癌癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述癌癥選自乳房癌，卵巢癌，胃癌，子宮內(nèi)膜癌，唾液腺癌，肺癌，腎癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，甲狀腺癌，胰腺癌，前列腺癌和膀胱癌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述癌癥是乳房癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，所述乳房癌以2+或以上水平過量表達(dá)ErbB2。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，所述乳房癌以3+水平過量表達(dá)ErbB2。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，所述抗體具有4D5單克隆抗體的生物學(xué)特征。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，所述抗體與4D5單克隆抗體結(jié)合相同表位。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，所述抗體是單克隆抗體4D5(ATCC CRL10463)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，所述抗體是人源化抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，所述抗體選自以下人源化抗體huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，所述抗體是人源化抗體huMAb4D5-8(HERCEPTIN)。
19.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述抗體是抗體片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，所述抗體片段是Fab片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述類美坦素是美坦素。
22.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述類美坦素是美坦醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述類美坦素是美坦醇酯。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，所述類美坦素是美坦醇C-3位的酯。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，所述類美坦素是圖1所示的DM1。
26.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述抗體與類美坦素通過雙特異性化學(xué)接頭偶聯(lián)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，所述化學(xué)接頭是N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶硫)丙酸酯(SPDP)或N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)。
28.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，將所述抗體與類美坦素偶聯(lián)的接頭選自二硫鍵，硫醚，酸不穩(wěn)定、光不穩(wěn)定、肽酶不穩(wěn)定和酯酶不穩(wěn)定的基團(tuán)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，所述接頭是二硫鍵或硫醚基團(tuán)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，所述接頭是二硫鍵。
31.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述偶聯(lián)物的每個(gè)抗體分子連有1-10個(gè)類美坦素分子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，所述偶聯(lián)物的每個(gè)抗體分子連有3-5個(gè)類美坦素分子。
33.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括給予患者結(jié)合ErbB2并阻抑ErbB受體被配體活化的第二抗體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，所述第二抗體包括單克隆抗體2C4或人源化的2C4。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，所述第二抗體與細(xì)胞毒試劑偶聯(lián)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，所述細(xì)胞毒試劑是類美坦素。
37.一種產(chǎn)品，包括容器和裝于其中的組合物，該組合物含有抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物，該產(chǎn)品還包括包裝內(nèi)說明書或標(biāo)簽，上面指明所述組合物可用于治療以過量表達(dá)ErbB受體為特征的癌癥。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的產(chǎn)品，所述包裝內(nèi)說明書或標(biāo)簽指明所述組合物可用于治療以過量表達(dá)ErbB2受體為特征的癌癥。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的產(chǎn)品，所述癌癥是乳房癌。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的產(chǎn)品，所述癌癥的特征是以2+或以上水平過量表達(dá)ErbB2受體。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的產(chǎn)品，所述癌癥的特征是以3+水平過量表達(dá)ErbB2受體。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用抗ErbB抗體－類美坦素偶聯(lián)物的治療方法,以及此類方法中所用的制品。具體地說,本發(fā)明涉及用抗ErbB受體的抗體與類美坦素的偶聯(lián)物進(jìn)行ErbB受體靶向癌癥治療的方法。
文檔編號(hào)A61P13/12GK1387444SQ00811782
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者S·埃里克森, R·斯瓦爾 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司