專利名稱：朊病毒蛋白肽及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及PrPSc-特異性抗體以及用來(lái)產(chǎn)生所述抗體的肽。這些抗體適用于檢測(cè)樣品中的PrPSc以及純化PrPSc。另外，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)PrPSc的診斷輔助劑、含有或模擬PrPSc-特異性構(gòu)象表位的藥物以及凈化朊病毒的方法。
朊病毒是與神經(jīng)變性性綜合征相關(guān)的傳染因子，所述綜合征的特征為海綿狀變化(例如通常主要在灰質(zhì)中出現(xiàn)的腦微泡)、神經(jīng)元細(xì)胞喪失、與神經(jīng)元喪失不成比例的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、以及有時(shí)在腦中的離散性病斑內(nèi)累積異常淀粉樣蛋白。朊病毒病神經(jīng)變性可能與其它更常見(jiàn)的神經(jīng)變性性綜合征(例如早老性癡呆(Alzheimer’sDisease)、肌萎縮性側(cè)索硬化和帕金森病(Parkinson’s disease))的某些基本機(jī)制相同。
傳播這些疾病的病原明顯不同于病毒和類病毒，因?yàn)樵诟腥静牧现幸恢睕](méi)有重復(fù)檢測(cè)到核酸組分的化學(xué)或物理學(xué)證據(jù)(Prusiner，Science，216136-144，1982)。研究朊病毒和由朊病毒引起的疾病的一個(gè)主要步驟是發(fā)現(xiàn)并純化稱為朊病毒蛋白(PrP)的蛋白質(zhì)(Bolton等，Science，2181309-11，1982；Prusiner等，Biochemistry，216942-50，1982；McKinley等，Cell，3557-62)。當(dāng)采用蛋白酶K消化進(jìn)行純化時(shí)，在罹患瘙癢病的倉(cāng)鼠腦中發(fā)現(xiàn)了一種27-30 kD蛋白酶抗性蛋白，并將其稱為PrP 27-30，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是一種PrPSc片段(Bolton等，Science，2181309-1311，1982)。
按照朊病毒假說(shuō)，朊病毒感染性在于PrPSc。PrPSc至少與感染性密切相關(guān)，因此看來(lái)PrPSc是朊病毒感染的可靠替身。PrPSc是稱為PrPC的宿主編碼細(xì)胞蛋白的構(gòu)象變異體(Oesch等，Cell，40735-746，1985)，所述PrPC是連接糖基磷脂酰肌醇(GPI)的細(xì)胞表面蛋白，分子量為33-35 kD。
已從正常腦中分離出PrPC，并發(fā)現(xiàn)PrPC對(duì)蛋白酶敏感，與產(chǎn)生瘙癢病的活性無(wú)關(guān)(Bendheim等，Ciba Found.Symp.164-177，988)。按照朊病毒學(xué)說(shuō)，PrPC自動(dòng)催化轉(zhuǎn)換成PrPSc(Prusiner，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 9513363-83，1998)。最近，據(jù)報(bào)道PrPC可以在體外通過(guò)PrPSc轉(zhuǎn)變成蛋白酶抗性形式(Kocisko等，Nature，370471-473，1994)。PrPC是進(jìn)化上保守的膜蛋白，但其真正生物學(xué)功能或生理機(jī)能尚不了解。不含PrPC的小鼠也可存活，并且沒(méi)有神經(jīng)和身體障礙的明顯表現(xiàn)(Bueler等，Nature，356577-582，1992)。另外，這些小鼠對(duì)朊病毒感染不敏感，著重說(shuō)明了PrP在反復(fù)感染性方面的中心重要性(Bueler等，Cell，731339-1347，1993；Prusiner等，Proc.Natl.Acad. Sci，USA9010608-10612，1993)。針對(duì)性研究PrP敲出(knockout)小鼠揭示突觸功能障礙(Collinge等，Nature，370295-297，1994)以及睡眠調(diào)節(jié)改變(Tobler等，J Neurosci.，171869-79)。此外，已經(jīng)顯示PrPC改變由伴刀豆凝集素A刺激誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化(Cashman等，Cell 61185-192，1990)，表明該蛋白質(zhì)的功能作用。
朊病毒病是一組快速進(jìn)行性、致死性、無(wú)藥可治的神經(jīng)變性性綜合征。人類朊病毒病包括克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)，該病存在散發(fā)性、醫(yī)源性和家族性發(fā)病形式；以及變異型CJD(“vCJD”)，其可能原因是食用了污染牛海綿狀腦病病原的牛組織(參見(jiàn)綜述Cashman，Can.Med.Assoc.J.1571381-5，1997)。CJD偶爾也通過(guò)污染的尸體垂體激素、硬腦膜移植、神經(jīng)外科儀器和角膜移植而在人類中傳播(Brown等，Lancet 34024-7，1992)。通過(guò)血及血制品傳播CJD的潛在危險(xiǎn)性已受到全球廣泛關(guān)注。此外，與英國(guó)牛海綿狀腦病(俗稱瘋牛病)(BSE)一樣，羊瘙癢病在北美是一種常見(jiàn)的在經(jīng)濟(jì)上重要的朊病毒相關(guān)疾病。根據(jù)英國(guó)農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和食品部的統(tǒng)計(jì)，超過(guò)4,347,380頭牛已經(jīng)被銷毀，因?yàn)檎J(rèn)為這些?？赡軘y帶瘋牛病病原因子。據(jù)英國(guó)農(nóng)業(yè)部估計(jì)，截止到2002年，瘋牛病流行的總損失達(dá)到$713億(billion)。已經(jīng)證實(shí)英國(guó)全國(guó)已有超過(guò)173,000頭牛受到感染，然而無(wú)數(shù)的?？赡芤呀?jīng)進(jìn)入了未檢測(cè)到的食品供應(yīng)點(diǎn)。
另外，美國(guó)和加拿大現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)行BSE流行年和高峰年間居住在英國(guó)的個(gè)人供血者推遲供血。這樣一種限制作為防止傳播vCJD危險(xiǎn)性的預(yù)防措施已被正式通過(guò)，從1996年至今，已有60多名英國(guó)人受此限制。加拿大血液服務(wù)中心(Canadian Blood Services)估計(jì)，從1980年至今，該血液服務(wù)中心600,000有效供血者中120,000(或22％)曾經(jīng)到過(guò)英國(guó)(Montreal Gazette，1999年5月6日)。補(bǔ)充許多新供血者來(lái)代替所失去的供血者，引起了各種關(guān)注。一種這樣的關(guān)注是，新供血者的血液不安全，因?yàn)橹粚?duì)疾病例如肝炎和人免疫缺陷病毒進(jìn)行過(guò)篩選。
因此，需要適用于大量篩選朊病毒感染的血液或組織的診斷方法。因此能夠獲得把PrPC和PrPSc區(qū)分開(kāi)來(lái)的抗體將在開(kāi)發(fā)用于朊病毒感染的試驗(yàn)中具有重大價(jià)值。此外，需要預(yù)防和/或治療朊病毒病的治療藥物。
發(fā)明概述如本文所述，獲得的證據(jù)證實(shí)PrP的YYX連續(xù)表位可用于產(chǎn)生PrPSc特異性抗體。具體地說(shuō)，我們已經(jīng)證明，利用根據(jù)PrP序列連續(xù)合成的短肽的免疫方案可產(chǎn)生PrPSc特異性高親和力多克隆抗體和單克隆抗體。此外，也發(fā)現(xiàn)這類抗體對(duì)PrPC缺乏可檢測(cè)反應(yīng)性。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)從PrPC構(gòu)象變?yōu)镻rPSc構(gòu)象的分子建模分析，建模分析預(yù)測(cè)所述蛋白質(zhì)PrPSc同種型的分子表面的溶劑可及序列，從而選擇了包括YYR序列的肽。
因此，本發(fā)明的特征在于以高結(jié)合親和力結(jié)合哺乳動(dòng)物PrPSc連續(xù)YYX表位的表位特異性抗PrP抗體或其片段。所述抗體最好與哺乳動(dòng)物PrPSc的YYR表位、YYQ表位或YYD表位結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。這類抗體包括IgG抗體、IgM抗體、IgE抗體、IgD抗體或IgA抗體，以及多種片段，例如Fab片段或Fv片段。這樣的抗PrP抗體最好是針對(duì)特定PrPSc表位。另外，可以用與PrPSc結(jié)合的抗體定量測(cè)定任何標(biāo)準(zhǔn)診斷測(cè)定中的PrPSc。
再一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于表位特異性抗PrP抗體在免疫學(xué)檢測(cè)方法中的應(yīng)用，以便診斷傳染病特異性的朊病毒。如本文所述，可以用適當(dāng)改造的PrP肽制備與PrPSc特異性反應(yīng)的抗PrP抗體。本發(fā)明尤其涉及含有所述PrP肽和/或表位特異性抗PrP抗體的診斷輔助劑。另外，本發(fā)明涉及與疾病特異性的朊病毒蛋白選擇性結(jié)合而不與正常朊病毒蛋白結(jié)合的抗體。
另一方面，本發(fā)明的特征在于具有序列酪氨酸-酪氨酸-精氨酸(YYR)的朊病毒蛋白肽。最好是，所述肽是與一種載體連接的三肽，使所述肽免疫原性更強(qiáng)，可制備高親和力抗PrP抗體。本文介紹了這種三肽的合成。按照本發(fā)明，這類短肽(例如，YYR三肽、YYQ三肽或YYID三肽)為朊病毒蛋白PrPSc同種型存在、正常PrPC同種型不存在和/或以允許抗體檢測(cè)的方式在PrPSc中成簇的決定簇。例如，在所述三種朊病毒蛋白表位中的兩種內(nèi)含有YYR三肽；然而，該三肽以前沒(méi)有將其鑒定為PrPSc免疫反應(yīng)性的特異性基礎(chǔ)。此外，這類序列在許多物種之間是高度保守的，所述物種包括但不限于牛、人、綿羊、小鼠和倉(cāng)鼠(圖2)。
再一個(gè)方面，本發(fā)明還的特征在于具有下式的合成肽A-Tyr-Tyr-B-(Tyr-Tyr-B)n(SEQ ID NO1-11)其中A或者為任何氨基酸或者不存在；B或者為任何氨基酸或者不存在；n為0-10(包括0和10)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，A和B至少一個(gè)不為T(mén)yr。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，A或B選自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽與免疫載體連接。這類肽包括但不限于A-Tyr-Tyr-Arg(SEQ ID NO12)；A-Tyr-Tyr-Gln(SEQ ID NO13)；A-Tyr-Tyr-Asp(SEQ ID NO14)；或其任何藥學(xué)上可接受的鹽。
又一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于具有下式的合成肽A-Tyr-Tyr-B-C-Tyr-Tyr-D-Tyr-Tyr-(Tyr-Tyr-B)n(SEQ ID NO15-24)其中A或者為任何氨基酸或者不存在；B或者為任何氨基酸或者不存在；C或者為任何氨基酸或者不存在；D或者為任何氨基酸或者不存在；n為0-10(包括0和10)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，A、B、C和D中的至少一個(gè)不為T(mén)yr。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，A、B、C或D選自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，A選自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp，而B(niǎo)、C和D選自Arg、Gln、Asp、Glu、Phe或Trp。一種典型的肽包括但不限于A-Tyr-Tyr-Arg-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Tyr(SEQ ID NO25)或其藥學(xué)上可接受的鹽。在其它的實(shí)施方案中，所述肽與免疫載體連接。
另一方面，本發(fā)明涉及具有PrPSc抗原性的合成朊病毒短肽(例如，3-10個(gè)(包括3個(gè)和10個(gè))氨基酸或4-12個(gè)(包括4個(gè)和12個(gè))氨基酸)，所述朊病毒短肽包括一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸殘基見(jiàn)于小鼠PrP的T189-193的蘇氨酸四重復(fù)殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；小鼠PrP的M128、M133或M153氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；小鼠PrP的H186氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；小鼠PrP的Q159、Q167、Q185或Q216氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；小鼠PrP的N158氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；小鼠PrP的M128、M133或M153氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；小鼠PrP的L124或L129氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基；或者小鼠PrP的I181或I183氨基酸殘基或人PrP、綿羊PrP、山羊PrP或牛PrP的相應(yīng)氨基酸殘基。
按照本領(lǐng)域已知的方法，可以通過(guò)化學(xué)合成制備按照本發(fā)明的肽。
另外，按照本發(fā)明的PrP肽可以用來(lái)制備表位特異性抗PrPSc抗體。具體地說(shuō)，本發(fā)明的肽具有高度純物質(zhì)的各種優(yōu)點(diǎn)，并且適合于制備抗PrP抗體，所述抗PrP抗體可以例如在標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定(例如免疫沉淀法、ELISA和流式細(xì)胞術(shù))中用于檢測(cè)樣品中的PrPSc。按照本發(fā)明的PrP肽(例如，YYR)既可以用來(lái)制備表位特異性抗PrPSc多克隆抗體(抗血清)，又可以用來(lái)制備表位特異性抗PrP單克隆抗體。按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備這些抗體，并且所述抗體最好與載體材料結(jié)合，以便用于產(chǎn)生抗體。
此外，可以合理設(shè)計(jì)或者從組合文庫(kù)獲得發(fā)揮PrPSc特異性暴露的YYX的化合物，所述組合文庫(kù)模擬YYX與抗YYX抗體的相互作用。這些化合物可用于診斷朊病毒或者用作朊病毒病的治療藥物。
另一方面，本發(fā)明的特征在于用于治療和預(yù)防朊病毒病的藥用制劑，所述藥用制劑包含本發(fā)明的PrP肽或結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物、或多克隆抗體或單克隆抗體和藥用載體。這類藥物含有按照本發(fā)明的PrP肽或表位特異性抗PrP抗體。
如有需要，可以以藥學(xué)上可接受的鹽形式提供本發(fā)明的肽和抗體。優(yōu)選鹽的實(shí)例是與治療學(xué)上可接受的下列酸的鹽有機(jī)酸，例如乙酸、乳酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、水楊酸、甲磺酸、甲苯磺酸或撲酸(pamoic acid)；以及聚合酸，例如單寧酸或羧甲基纖維素；以及與無(wú)機(jī)酸的鹽，所述無(wú)機(jī)酸例如氫鹵酸(例如鹽酸、硫酸或磷酸)。另外，以一種傳統(tǒng)模式(例如，口服、胃腸外、經(jīng)皮或經(jīng)粘膜給藥)，可以采用生物降解的生物相容性聚合物的緩釋制劑或通過(guò)使用膠粒、凝膠和脂質(zhì)體將本發(fā)明的任何肽或抗體給予哺乳動(dòng)物、尤其是人。
再一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于治療或預(yù)防動(dòng)物(例如人、牛、綿羊、豬、山羊、狗或貓)朊病毒病的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括給予所述動(dòng)物治療有效量的一種表位特異性抗PrP抗體或PrP肽，所述表位特異性抗PrP抗體或PrP肽阻斷PrPC轉(zhuǎn)換為PrPSc、抑制PrPSc∶PrPSc集合物的形成、或者阻斷PrPC補(bǔ)充PrPSc。也可以用所述PrP肽免疫所述宿主，以通過(guò)刺激宿主產(chǎn)生PrPSc特異性抗體而抵抗朊病毒病。
在相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于用于檢測(cè)生物樣品中的PrPSc的方法和試劑盒。
再一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于用于凈化生物樣品中的PrPSc的方法和試劑盒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟(a)用所述多克隆抗體或單克隆抗體(或其片段或類似物)處理生物樣品，所述處理可形成抗體PrPSc復(fù)合物；和(b)從所述生物樣品中回收抗體PrPSc復(fù)合物。這種凈化方法也可以包括應(yīng)用抗體(或其片段或類似物)灌流生物樣品，以去除或滅活PrPSc。
另一方面，本發(fā)明的特征在于用于治療朊病毒病的化合物的鑒定方法。所述方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)化合物存在下，測(cè)定抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；和(b)在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)，測(cè)定抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；其中在所述試驗(yàn)化合物存在下所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平比在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平低，表明所述試驗(yàn)化合物是可用于治療朊病毒病的潛在治療化合物。最好是，所述抗YYX抗體為抗YYR抗體、抗YYD抗體或抗YYQ抗體。
另一方面，本發(fā)明的特征在于用于診斷朊病毒病的化合物的鑒定方法。所述方法包括以下步驟(a)在試驗(yàn)化合物存在下，測(cè)定抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；和(b)在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)，測(cè)定抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；其中在所述試驗(yàn)化合物存在下所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平比在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平低，表明所述試驗(yàn)化合物是可用于診斷朊病毒病的潛在化合物。
在相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于按照任一前述方法鑒定的治療化合物和診斷化合物。
“高結(jié)合親和力”是指親和常數(shù)小于10μM、優(yōu)選小于1μM、更優(yōu)選小于100nM、最優(yōu)選小于10nM的結(jié)合。
“朊病毒病”是指一組朊病毒介導(dǎo)的、快速進(jìn)行性、致死性、無(wú)藥可治的腦變性性疾病，包括但不限于人類中的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、變異型克-雅病、醫(yī)源性克-雅病、家族性克-雅病、庫(kù)魯病(Kuru)、格施綜合征(Gerstmann-Strussler syndrome)和致死性家族失眠癥(Prusiner，Science 2521515-1522，1991)、羊瘙癢病和牛海綿狀腦病、以及最近描述的其它反芻動(dòng)物和貓朊病毒病。
“朊病毒病的治療”是指減輕、預(yù)防、穩(wěn)定或延遲與朊病毒病相關(guān)的任何癥狀、尤其是導(dǎo)致海綿狀變化、神經(jīng)元細(xì)胞喪失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、PrPSc蛋白的累積、癡呆或死亡的朊病毒病改變的發(fā)生的能力。
“純化抗體”是指不含所述蛋白質(zhì)和與其天然結(jié)合的天然有機(jī)分子的至少60％(重量)的抗體。所述制劑中的抗體，例如YYX特異性抗體(例如YYR特異性抗體、YYQ特異性抗體或YYD特異性抗體)優(yōu)選為至少75％(重量)、更優(yōu)選至少90％(重量)、最優(yōu)選至少99％(重量)。例如采用底物結(jié)合YYX的親和層析和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以獲得純化抗體。
“YYX”是指具有序列酪氨酸-酪氨酸-X的肽，其中X為任何氨基酸?！癥YR”是指具有序列酪氨酸-酪氨酸-精氨酸的肽?！癥YQ”是指具有序列“酪氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺”的肽?！癥YD”是指具有序列“酪氨酸-酪氨酸-天冬氨酸”的肽。
“治療組合物”是指適合于給予動(dòng)物的組合物，所述動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物(例如人)、家畜(例如牛、山羊、豬或綿羊)或?qū)櫸铩?br> “小分子”是指分子量小于或等于10,000道爾頓、優(yōu)選小于或等于1000道爾頓、最優(yōu)選小于或等于500道爾頓的化合物。
根據(jù)以下描述的優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A為顯示小鼠重組PrPC的pH相關(guān)性構(gòu)象變化的圓二色性圖。在pH為7.0和3.0時(shí)PrPC的遠(yuǎn)紫外線圓二色光譜學(xué)顯示分子橢圓率改變與在生理pH下主要為α螺旋構(gòu)象變?yōu)樵诘蚿H下主要為β折疊構(gòu)象一致。
圖1B為顯示小鼠重組PrPC中的芳族環(huán)取向的pH相關(guān)性變化的熒光光譜曲線圖。酪氨酸側(cè)鏈和色氨酸側(cè)鏈的特異性熒光變化與用于溶劑可及性的相反傾向一致，因?yàn)閜H被降低。
圖2顯示以下PrP氨基酸序列的序列比對(duì)牛(SEQ ID NO26)、人(SEQ ID NO27)、綿羊(SEQ ID NO28)、小鼠(SEQ ID NO29)和倉(cāng)鼠(SEQ ID NO30)。方框突出顯示在氨基酸160-162和173-175上的兩個(gè)高度保守的YYR序列以及在氨基酸235-237上的YYQ/D序列(按照牛的序列)。
圖3顯示小鼠PrPC的NMR溶液結(jié)構(gòu)，突出顯示了YYR序列和YYD序列的位置和取向。沒(méi)有YYR基序顯示芳族環(huán)對(duì)分子表面的所謂垂直串聯(lián)取向。
圖4為示意圖，顯示基于PrPC構(gòu)象變?yōu)镻rPSc構(gòu)象的酪氨酸環(huán)取向改變的表位產(chǎn)生。如圖3所示，PrPC中兩個(gè)YYR基序的取向使得在所述分子內(nèi)的一個(gè)酪氨酸環(huán)為溶劑可及的，而另一個(gè)酪氨酸環(huán)為溶劑不可及的。(第三個(gè)YY基序(在該圖中未顯示)的取向使得所述酪氨酸環(huán)不能相互作用)。在PrP構(gòu)象轉(zhuǎn)換后，一個(gè)或多個(gè)YYX基序中的酪氨酸環(huán)以垂直串聯(lián)取向存在于分子表面，所述取向通過(guò)π-堆積(pi-stacking)作用穩(wěn)定。末端平面精氨酸(或在第三個(gè)基序中的天冬氨酸/谷氨酰胺)可以加強(qiáng)穩(wěn)定酪氨酸-酪氨酸的相互作用。
圖5顯示采用綴合對(duì)照蛋白的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀(IP)。將與磁珠(泳道9-12)或偶聯(lián)BSA的磁珠(泳道5-8)的非區(qū)別性PrP單克隆抗體6H4與正常(N)或ME7瘙癢病感染(Sc)的小鼠腦勻漿進(jìn)行反應(yīng)。在進(jìn)行免疫沉淀之前用蛋白酶K處理(+)或不用蛋白酶K處理(-)所述腦勻漿。泳道1-4(Load)顯示與用于免疫沉淀中的相同腦勻漿量的直接蛋白質(zhì)印跡。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖6顯示采用與抗YYR多克隆抗體pAbC2綴合的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀(IP)。將偶聯(lián)pAbC2的磁珠(泳道9-12)或與BSA偶聯(lián)的磁珠(磁珠，泳道5-8)與正常(N)或ME7瘙癢病感染(Sc)的小鼠腦勻漿進(jìn)行反應(yīng)。所述腦勻漿用蛋白酶K進(jìn)行處理(+)或不用蛋白酶K進(jìn)行處理(-)，然后進(jìn)行免疫沉淀。用于所述免疫沉淀中的相同腦勻漿量的直接蛋白質(zhì)印跡在泳道1-4(Load)中顯示。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖7顯示采用與pAbC2兔多克隆抗體綴合的磁珠的牛PrPSc的免疫沉淀。用6H4(泳道1和2)或pAbC2偶聯(lián)的磁珠(泳道3和4)免疫沉淀正?；駼SE腦勻漿。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖8顯示采用與抗YYR p165山羊多克隆抗體綴合的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀。將偶聯(lián)抗體的磁珠與正常(N)或ME7瘙癢病感染(Sc)的小鼠腦勻漿進(jìn)行反應(yīng)。瘙癢病小鼠腦勻漿樣品用蛋白酶K進(jìn)行處理(+)或不用蛋白酶K進(jìn)行處理(-)，然后進(jìn)行免疫沉淀。泳道1-3(p165)親和純化的山羊pAb；泳道4-6(IgG)山羊總IgG；泳道7-9(BSA)綴合BSA的磁珠；泳道10-12(6H4)非區(qū)別性抗PrP單克隆抗體6H4。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖9顯示采用與抗YYR小鼠單克隆抗體綴合的磁珠的小鼠PrPSc的免疫沉淀。將偶聯(lián)單克隆抗體的磁珠與正常(N)或ME7瘙癢病感染(Sc)的小鼠腦勻漿進(jìn)行反應(yīng)。該瘙癢病樣品用蛋白酶K進(jìn)行處理(+)或不用蛋白酶K進(jìn)行處理(-)，然后進(jìn)行免疫沉淀。1A4(泳道1-3)、2C(泳道4-6)和6B1(泳道7-9)為瘙癢病反應(yīng)性單克隆抗體。19E(泳道10-12)為不與PrP反應(yīng)的單克隆抗體。6H4(泳道13-15)為不能將PrPC和PrPSc區(qū)分開(kāi)的抗PrP單克隆抗體。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。在泳道10-12(相當(dāng)于19E)中，抗體-磁珠綴合物的免疫球蛋白重鏈(45 kDa)和輕鏈(30 kDa)分別與PrP二聚體和一種PrP糖基化變異體共遷移。
圖10顯示抗體-磁珠綴合物的免疫球蛋白輕鏈和重鏈滲漏。將單克隆抗體1A4和6B1磁珠綴合物加工后，在腦勻漿不存在時(shí)用于SDSPAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。對(duì)于這兩種抗體-磁珠綴合物均在非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，而對(duì)于未綴合的6H4單克隆抗體在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。印跡用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物顯色。
圖11顯示采用與抗YYR 1A4單克隆抗體偶聯(lián)的磁珠的多個(gè)小鼠PrPSc樣品的免疫沉淀。將1A4-磁珠綴合物與正常(N，泳道19)、4個(gè)ME7(泳道1-8)或5個(gè)139A(泳道9-18)瘙癢病感染的小鼠腦勻漿進(jìn)行反應(yīng)。所述瘙癢病樣品用蛋白酶K進(jìn)行處理(+)或不用蛋白酶K進(jìn)行處理(-)，然后進(jìn)行免疫沉淀。作為對(duì)照，將6H4-磁珠綴合物與正常(N，泳道20)小鼠腦勻漿進(jìn)行反應(yīng)。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖12顯示抗YYR單克隆抗體與PrPSc的反應(yīng)性的構(gòu)象依賴性。在SDS-PAGE凝膠中在非還原條件下分辨正常(N)、ME7或139A瘙癢病感染的小鼠腦勻漿。印跡用1A4(泳道1-3)或6B1(泳道4-6)進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。然后所述印跡不經(jīng)剝離再用6H4(泳道7-9)和山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖13顯示采用流式細(xì)胞術(shù)分析與熒光素化抗PrPSc單克隆抗體1A4、2B5、6B1、17B和18B反應(yīng)的解離的正常小鼠脾細(xì)胞。將熒光素化山羊抗小鼠Ig(GAMIg)用作對(duì)照。截獲時(shí)(on acquisition)通過(guò)特征性前向和側(cè)向散射參數(shù)門(mén)控細(xì)胞，并且排除碘化丙錠。虛線代表背景熒光；實(shí)線代表染色抗體。根據(jù)96孔板讀出器的熒光素發(fā)射測(cè)量，單克隆抗體被成功地?zé)晒馑貥?biāo)記，并且根據(jù)ELISA測(cè)定所述單克隆抗體保持對(duì)免疫抗原的反應(yīng)性。
圖14顯示采用抗YYR小鼠單克隆抗體和山羊多克隆抗體的倉(cāng)鼠PrPSc的免疫沉淀。將1A4單克隆抗體和p165多克隆抗體-磁珠綴合物與正常(N)或瘙癢病感染的倉(cāng)鼠腦勻漿(Sc)進(jìn)行反應(yīng)。該瘙癢病樣品用蛋白酶K進(jìn)行處理(+)或不用蛋白酶K進(jìn)行處理(-)，然后進(jìn)行免疫沉淀。在SDS-PAGE凝膠上在非還原條件下分辨所述免疫沉淀物。印跡用6H4單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)后，再用山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物進(jìn)行探測(cè)。
圖15顯示對(duì)正常牛腦中的蛋白酶敏感PrPC(泳道1和4)和BSE腦中的PrPC和蛋白酶抗性PrPSc(泳道2和3)的免疫印跡檢測(cè)。將用蛋白酶K處理或不用蛋白酶K處理的腦勻漿(+或-)在SDS-PAGE電泳上分辨后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行免疫印跡。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，將膜用mAb 6H4探測(cè)，洗滌，然后用ECL顯色，最后對(duì)X-光膠片曝光。
圖16顯示證明抗YYR兔多克隆抗體pAbC2特異性識(shí)別牛PrPSc的ELISA系統(tǒng)。與吸附的可溶性朊病毒受體胞外域(PC2)或?qū)φ盏鞍?Mek)反應(yīng)的BSE腦提取物按照ELISA顯示，在受體孔與對(duì)照孔中pAbC2對(duì)結(jié)合PrPSc的檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖A；p值＝0.008)。還顯示了用pAbC2或mAb6H4通過(guò)直接ELISA識(shí)別牛重組PrPC(bPrP)(圖B)。
發(fā)明詳述我們發(fā)現(xiàn)，在PrP中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的YYX表位(例如YYR)的酪氨酸選定芳族側(cè)鏈的取向限定PrPSc分子表面特異性的連續(xù)免疫表位，而按照公開(kāi)的PrPCNMR結(jié)構(gòu)溶液，已知同樣的酪氨酸側(cè)鏈在PrPC構(gòu)象中是隱蔽的(Riek等，Nature 382180，1996；Donne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9413452-7，1997；Zahn等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA，97145-50，2000)。這一發(fā)現(xiàn)有助于產(chǎn)生可用于診斷和治療目的的PrPSc特異性抗體，以及開(kāi)發(fā)篩選可用于檢測(cè)或消滅朊病毒及其相關(guān)疾病和障礙的新型化合物。制備抗PrPSc的表位特異性抗體抗體通過(guò)獨(dú)特的氨基酸決定簇或表位特異性識(shí)別蛋白質(zhì)。這些決定簇或表位可以為線性氨基酸序列或通過(guò)氨基酸以三維空間形成的特有構(gòu)象。認(rèn)為PrPC轉(zhuǎn)換為PrPSc涉及蛋白質(zhì)構(gòu)象的主要變化，可能是轉(zhuǎn)變后形成或暴露出獨(dú)特表位。因此，如本文所討論的，我們提出了關(guān)于朊病毒蛋白轉(zhuǎn)換的所謂側(cè)鏈假說(shuō)。按照該方案，通常隱蔽在溶劑不可及PrPC內(nèi)部的側(cè)鏈在PrPSc中成為溶劑可及的。因此，預(yù)期新暴露側(cè)鏈的優(yōu)勢(shì)在于是疏水性的，其證據(jù)是穩(wěn)定的PrPSc樣中間體中疏水性殘基的溶劑暴露增加(Swietnicki等，J.Biol.Chem.27227517-20，1997)。擠出的這些疏水性側(cè)鏈單獨(dú)或與通常存在于PrPC分子表面的側(cè)鏈一起構(gòu)成抗體識(shí)別PrPSc的獨(dú)特表位基礎(chǔ)。此外，預(yù)期這些表面可及的疏水性側(cè)鏈改變PrPSc的溶解度和聚集特性，與該結(jié)構(gòu)同種型的已知特性等同。新的可及側(cè)鏈也可以參與PrPC補(bǔ)充PrPSc的過(guò)程。
檢驗(yàn)該假說(shuō)，始于在體外檢查色氨酸環(huán)和酪氨酸環(huán)的兩個(gè)疏水性氨基酸側(cè)鏈的取向，其信息通過(guò)熒光光譜學(xué)研究獲得。首先，通過(guò)低pH誘導(dǎo)小鼠重組PrPC的β折疊轉(zhuǎn)換，以便模擬PrPC轉(zhuǎn)換為PrPSc的特征性結(jié)構(gòu)變化(Hornemann和Glockshuber，Proc.Natl.Acad.Sci.956010，1998)。圖1A說(shuō)明根據(jù)pH7.0-3.0的圓二色性，分子橢圓率的改變與PrPC從主要為α螺旋改變成主要為β折疊相一致(光譜在適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)頻率從雙最小變成單最小)。
其次，采用標(biāo)準(zhǔn)熒光光譜法，檢查重組PrPC中的酪氨酸側(cè)鏈和色氨酸側(cè)鏈隨pH增加的溶劑可及性(圖1B)。該研究基于以下原理與基它氨基酸側(cè)鏈相鄰的芳族側(cè)鏈(即在蛋白質(zhì)內(nèi))將具有與暴露于水的芳族側(cè)鏈不同的特定熒光(例如，Chin等，Biochemistry 311945-51，1992)。當(dāng)重組小鼠PrPC在低pH時(shí)，色氨酸和酪氨酸芳族基團(tuán)呈現(xiàn)與差別溶劑暴露一致的相反行為。
檢查人PrPC、牛PrPC和小鼠PrPC的氨基酸序列揭示出13個(gè)酪氨酸殘基(圖2)。人PrP和牛PrP中的11個(gè)酪氨酸、小鼠PrP中的10個(gè)酪氨酸位于所述蛋白質(zhì)C末端2/3中，所述蛋白質(zhì)C末端2/3包含朊病毒感染性必需的足夠蛋白酶抗性結(jié)構(gòu)域。值得注意的是，該結(jié)構(gòu)域中的6個(gè)酪氨酸以罕見(jiàn)的“YY”成對(duì)基序存在(圖2)。3對(duì)中的2對(duì)與C末端精氨酸(R)連接，而第3個(gè)YY基序在小鼠和倉(cāng)鼠中與C末端天冬氨酸(D)連接或在牛、綿羊和人中與C末端的谷氨酰胺(Q)連接。R含有一個(gè)末端胍基，而Q和D含有平面羧酰胺和羰基鍵。在YY基序中這樣的一個(gè)末端平面氨基酸可以與暴露的酪氨酸環(huán)相互作用，以穩(wěn)定或指導(dǎo)它們的免疫識(shí)別。
另外，檢查小鼠PrPC、倉(cāng)鼠PrPC和人PrPC的NMR解析結(jié)構(gòu)揭示，沒(méi)有鑒定的酪氨酸對(duì)的兩個(gè)環(huán)取向?yàn)榉肿颖砻婵杉暗拇怪贝?lián)構(gòu)型(Riek等，Nature，382180，1996；Donne等，Proc Natl.Acad.Sci.9413452，1997；Zahn等，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.97145-50,2000)(圖3)。推測(cè)是在酸處理的PrPC或PrPSc表面酪氨酸暴露增加可能與某些酪氨酸對(duì)有關(guān)。一種穩(wěn)定的酪氨酸環(huán)構(gòu)象稱為π-堆積，其中兩個(gè)酪氨酸環(huán)以略偏移的平行方式堆積(示意性說(shuō)明見(jiàn)圖4)。雖然穩(wěn)定，但是對(duì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行π-堆積表面可及酪氨酸環(huán)的初步檢索僅鑒定出4種其它具有類似取向的蛋白質(zhì)，其中沒(méi)有一個(gè)位于膜蛋白胞外域。因此，認(rèn)為新型PrPSc特異性表位是以π-堆積取向的酪氨酸對(duì)，存在或沒(méi)有精氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸側(cè)鏈(屬于平面氨基酸，也可能參與與其前面的酪氨酸的π-堆積作用)的作用。
除了PrPSc中酪氨酸側(cè)鏈取向方面的改變外，也可能所述三種YYR基序因?yàn)槠湎嗷タ拷淖兓钩蔀镻rPSc免疫學(xué)上更可及。典型IgG抗體的組成是兩個(gè)相同的抗原結(jié)合區(qū)通過(guò)柔性絞鏈區(qū)與一個(gè)恒定區(qū)連接。在PrPC構(gòu)象改變成PrPSc構(gòu)象期間，YYR基序可能彼此相對(duì)移動(dòng)(Korth等，Nature，39074-77，1997)，從相對(duì)分開(kāi)移至相對(duì)靠近。另外，IgG識(shí)別PrPC中的YYR基序可能是不利的，因?yàn)閮蓚€(gè)關(guān)鍵基序位于該分子的不同側(cè)面，使得識(shí)別為低親和力單價(jià)性質(zhì)，而不是其中兩個(gè)IgG抗原結(jié)合區(qū)都參與識(shí)別的高親和力相互作用。
我們用牛PrPC和PrPSc獲得的數(shù)據(jù)表明，根據(jù)免疫沉淀和ELISA測(cè)試，抗YYR抗體特異性識(shí)別PrPSc(參見(jiàn)下文)，與PrPSc中和/或YYR表位附近的酪氨酸側(cè)鏈的可及性改變相一致。還認(rèn)為氨基酸殘基精氨酸在YYR抗體的產(chǎn)生和識(shí)別特異性方面是重要的。認(rèn)為在極性酪氨酸側(cè)鏈和精氨酸高堿性側(cè)鏈之間的靜電作用歸因于YYR表位在通過(guò)YYR三肽免疫和衍生抗體識(shí)別PrPSc兩個(gè)方面的性質(zhì)。值得注意的是，在某些物種(包括人和牛)中，在末端PrP環(huán)中的第三個(gè)YY二聚體基序與谷氨酰胺結(jié)合，谷氨酰胺是對(duì)精氨酸的部分保守取代，在某些其它物種(包括小鼠和倉(cāng)鼠)中，末端PrP環(huán)中的第三個(gè)YY二聚體基序與天冬氨酸結(jié)合，為非保守取代。具有平面?zhèn)孺湹牡湫桶被岚ň彼帷⑻於彼岷凸劝滨０贰?br> PrPC構(gòu)象轉(zhuǎn)換為PrPSc構(gòu)象伴隨的氨基酸側(cè)鏈暴露現(xiàn)象可能不只適用于酪氨酸對(duì)?？赡芫哂写髠?cè)鏈的其它氨基酸可能存在PrPSc核心耐受性差的側(cè)鏈，這些側(cè)鏈單獨(dú)或與基它局部部分一起構(gòu)成PrPSc獨(dú)特免疫反應(yīng)性的基礎(chǔ)。在PrPC和PrPSc之間不同的免疫表位構(gòu)成用于PrPSc診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)，并且也可用于治療和免疫人和動(dòng)物，以抵抗朊病毒病。認(rèn)為疏水側(cè)鏈暴露使得PrPSc比PrPC的疏水性增加和聚集增強(qiáng)。
在PrPC中溶劑不完全可及的大側(cè)鏈的實(shí)例包括以下氨基酸(按照小鼠PrP序列對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào))1.非YYX基序包含的酪氨酸，包括Y127、Y156、Y217。
2.部分不暴露于溶劑的一個(gè)蘇氨酸四重復(fù)殘基T189-193。
3.組氨酸H186。
4.谷氨酰胺Q159、Q167、Q185、Q216。
5.天冬酰胺N158。
6.甲硫氨酸M128、M133、M153。
7.亮氨酸L124、L129。
8.異亮氨酸I181、I183。
如下所述，合成含YYR表位的肽。將這些肽與載體綴合后，用于免疫兔子或小鼠，以產(chǎn)生多克隆抗體或單克隆抗體。然后測(cè)試多克隆和單克隆抗體對(duì)PrPSc的特異性。結(jié)果表明，這樣的抗體以高結(jié)合親和力特異性結(jié)合PrPSc。
提供下述實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)認(rèn)為是限制本發(fā)明。PrPSc-特異性抗體在兔子中，針對(duì)與KLH連接的YYR肽產(chǎn)生多克隆抗血清pAbC2。在免疫方案后從每只兔子中收集血清，并用A蛋白柱純化總IgG。然后在免疫沉淀反應(yīng)中用得自正?；蝠W病感染小鼠的腦勻漿測(cè)試這些樣品的抗PrPSc活性。用于這些研究的腦勻漿的初步分析表明，正常腦提取物中的PrPC量(圖5，泳道1)和感染樣品中的PrP量(圖5，泳道3)均為可檢測(cè)量。同預(yù)期的一樣，PrPC對(duì)蛋白酶K(PK)消化敏感(圖5，泳道2)，而PK消化后顯示PrPSc蛋白酶抗性核心(命名為PrP 27-30)的特征性遷移改變(圖5，泳道4)。這些腦勻漿與偶聯(lián)BSA的磁珠一起溫育不能沉淀任何可檢測(cè)的PrP(圖5，泳道5-8)，而將所述樣品與用6H4(PrP特異性單克隆抗體)偶聯(lián)的磁珠一起溫育免疫沉淀正常腦的PrPC(圖5，泳道9)以及感染腦勻漿的PrPSc(圖5，泳道11)和PrP27-30(圖5，泳道12)。當(dāng)將pAbC2 IgG與所述磁珠偶聯(lián)后與正常腦勻漿一起溫育時(shí)，沒(méi)有免疫沉淀可檢測(cè)的PrP(圖6，泳道9和10)。引人注目的是，將偶聯(lián)pAbC2 IgG的磁珠與受感染樣品一起溫育免疫沉淀PrPSc(圖6，泳道11)和PrP 27-30(圖6，泳道12)。再一次證實(shí)，包括可檢測(cè)量的PrPC和PrPSc的這些組織(圖6，泳道1-4)和偶聯(lián)BSA的磁珠不能免疫沉淀任何PrP(圖6，泳道5-8)。
另外，類似的實(shí)驗(yàn)顯示，與6H4相比，pAbC2 IgG特異性免疫沉淀BSE感染的牛腦PrPSc(圖7)。此外，在ELISA系統(tǒng)中，采用可溶性PC2(朊病毒受體)作為捕獲試劑，pAbC2抗體可以識(shí)別牛PrPSc，但是在重組牛PrP直接吸附在板上的ELISA研究中不產(chǎn)生信號(hào)，盡管使用6H4單克隆抗體可檢測(cè)(圖16)。在蛋白質(zhì)印跡法中，抗YYRIgG不識(shí)別變性的重組牛PrPC(數(shù)據(jù)未顯示)，與以下詳述的用小鼠抗YYR單克隆抗體進(jìn)行的研究相似。
也針對(duì)與KLH連接的YYR產(chǎn)生山羊多克隆抗血清。收集血清，經(jīng)硫酸銨沉淀分離純化總IgG。也采用綴合YYR的柱子，通過(guò)親和層析，從同一血清純化YYR反應(yīng)性IgG。如上詳述，將這些抗血清進(jìn)行一系列的類似篩選并驗(yàn)證免疫沉淀反應(yīng)。3只免疫山羊中的其中一只產(chǎn)生PrPSc特異性抗血清(p165)(圖8)，并進(jìn)行進(jìn)一步特征鑒定。如同以上實(shí)驗(yàn)，偶聯(lián)6H4的磁珠不能區(qū)別性沉淀受感染小鼠腦的PrPC和PrPSc(圖8，泳道10和11)。在該實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀察到6H4免疫沉淀PrP 27-30(圖8，泳道12)，偶爾觀察到的原因未知。當(dāng)將免疫山羊的總IgG與所述磁珠偶聯(lián)時(shí)，從正常和受感染小鼠腦勻漿中沉淀的物質(zhì)即使有也很少(圖8，泳道4、5和6)。相反，當(dāng)將YYR親和純化的IgG(p165)與所述磁珠偶聯(lián)時(shí)，從受感染小鼠腦中僅沉淀PrPSc(圖8，泳道2)。與得自兔子的pAbC2多克隆不同，山羊抗YYR多克隆不沉淀PrP 27-30(圖8，泳道3)。PK消化后，這些提取物都含有可檢測(cè)PrP 27-30，與此同時(shí)使用相同勻漿評(píng)價(jià)單克隆抗體(參見(jiàn)下文)，并且在PK消化后檢測(cè)到PrP 27-30(圖9，泳道3、6和9)。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析腦勻漿揭示，受感染小鼠腦勻漿中可檢測(cè)到PrPSc和PrP 27-30(數(shù)據(jù)未顯示)。
除產(chǎn)生山羊多克隆抗體外，也產(chǎn)生針對(duì)同一PrPSc特異性表位的單克隆抗體，但是用原抗原的衍生物，在所述抗原衍生物中多個(gè)原YYR肽連接在一起成為一種連續(xù)序列。合成YYRRYYRYY(SEQ IDNO31)，試圖增加在所述肽序列中YYR表位的數(shù)目，以及增加酪氨酸堆積的機(jī)率和/或π-堆積的頻率。此外，在5個(gè)目的物種中，在朊病毒蛋白中的一個(gè)YYR序列前接一個(gè)精氨酸(圖2)。將YYRRYYRYY肽與KLH連接，隨后用該抗原免疫小鼠。分離這些小鼠的脾細(xì)胞，并將其與FO小鼠B細(xì)胞系(ATCC CRL-1646)融合，以產(chǎn)生特異性雜交瘤克隆。從克隆產(chǎn)生腹水，在ELISA中，腹水與綴合替代載體8map的YYR反應(yīng)。用A蛋白柱純化得自這些腹水的IgG，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。在免疫沉淀反應(yīng)中，用得自受感染小鼠的腦勻漿，鑒定出特異性識(shí)別PrPSc的5種單克隆抗體(1A4、6B1、2B5、2C和18B)。圖9說(shuō)明這些單克隆抗體中的3種1A4、2C和6B1特異性沉淀PrPSc。與陰性對(duì)照抗體19E(圖9，泳道10和11)以及非區(qū)別性抗體6H4(圖9，泳道14和15)相比，觀察到p165、1A4、2C和6B1特異性沉淀PrPSc(圖9，將泳道1、3和5分別與泳道2、4和6比較)。與p165相反，這些PrPSc特異性抗體中的所有3種均沉淀PrP 27-30(圖9，泳道3、6和9)。采用正常小鼠腦勻漿，在1A4、2C和6B1沉淀(圖9，泳道1、3和5)以及19E的沉淀中均存在模糊條帶，可能代表混合存在的PrPC和從磁珠洗脫出的小鼠IgG輕鏈及重鏈的非特異性背景沉淀，所述小鼠IgG輕鏈和重鏈隨后通過(guò)山羊抗小鼠Ig-HRP綴合物檢測(cè)到(圖10)。
繼續(xù)評(píng)價(jià)PrPSc特異性單克隆抗體揭示，PrPSc特異性單克隆抗體能夠通過(guò)構(gòu)象依賴性表位識(shí)別不同鼠品系的PrPSc。如圖11所示，將1A4用于對(duì)用感染鼠瘙癢病ME7或139A病毒株的不同小鼠制備的大量提取物的免疫沉淀。在這些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)1A4特異性沉淀PrPSc和PrP 27-30，與病毒株無(wú)關(guān)。對(duì)于其它PrPSc特異性單克隆抗體也觀察到這種結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)在SDS-PAGE凝膠中在非還原條件下將腦勻漿(正常、ME7和139A感染)進(jìn)行電泳，然后用一種PrPSc特異性單克隆抗體(1A4或6B1)或6H4探測(cè)PrP時(shí)，很明顯僅6H4能夠檢測(cè)變性PrPC和PrPSc(圖12，泳道7、8和9)。對(duì)于1A4和6B1，樣品變性后喪失PrPSc特異性決定簇，確定了所述表位的構(gòu)象敏感性。
另外，確定了在正常和PrP-/-敲出小鼠脾細(xì)胞表面或離體后立即解離的腦細(xì)胞表面，YYR反應(yīng)性單克隆抗體不識(shí)別任何細(xì)胞表面蛋白。通過(guò)ficol梯度，將脾細(xì)胞和腦懸浮液離心，分離小鼠活脾細(xì)胞和腦細(xì)胞。如圖13所示，用所列的綴合FITC的抗體(實(shí)線)或用同種型匹配的FITC標(biāo)記的對(duì)照抗體(虛線)染色脾細(xì)胞。用碘化丙錠排除分析中的死細(xì)胞。脾細(xì)胞(圖13)或腦細(xì)胞(未顯示)上缺乏表面免疫反應(yīng)性表明，YYR構(gòu)象表位罕見(jiàn)，與上述結(jié)構(gòu)檢索結(jié)果一樣。此外，缺乏明顯信號(hào)為研究脾細(xì)胞和其它受試細(xì)胞細(xì)胞表面的PrPSc免疫反應(yīng)性提供可接受的背景。細(xì)胞表面PrPSc的檢測(cè)可用作人和動(dòng)物朊病毒病感染的診斷試驗(yàn)。最后，細(xì)胞表面免疫反應(yīng)性的缺乏獨(dú)立證實(shí)了這樣的事實(shí)抗YYR抗體不識(shí)別PrPC，因?yàn)槠⒓?xì)胞和腦細(xì)胞具有通過(guò)6H4免疫組織化學(xué)可檢測(cè)到的表面PrPC(數(shù)據(jù)未顯示)。
還檢測(cè)了YYR表位的種特異性。在采用瘙癢病感染倉(cāng)鼠腦勻漿的研究中，發(fā)現(xiàn)上述PrPSc特異性單克隆抗體和多克隆抗體免疫沉淀倉(cāng)鼠PrPSc(圖14)。此外，也觀測(cè)到在采用感染小鼠組織的研究中存在的PrPSc和PrP 27-30相似特異性。例如，單克隆抗體1A4特異性免疫沉淀PrPSc和PrP 27-30(圖14，泳道3和4)，而多克隆山羊抗體p165僅特異性免疫沉淀感染倉(cāng)鼠腦的PrPSc(圖14，泳道7、8、9和10)。如果需要的話，可采用本文所述的任何技術(shù)特異性免疫沉淀除倉(cāng)鼠以外的感染綿羊、牛和人組織的PrPSc。材料與方法采用下列材料和方法獲得并測(cè)試上述PrPSc特異性抗體。圓二色性按照Hornemann和Glockshuber(Proc.Natl.Acad.Sci.956010，1998)介紹的方法進(jìn)行圓二色譜檢測(cè)。于25℃以0.1cm光徑的石英杯在62DS型Aviv圓二色譜儀(Lakewood，NJ)上記錄遠(yuǎn)紫外線圓二色譜。從195nm-260nm以1.0nm梯段、1.0nm帶寬和收集時(shí)間4秒/段獲取光譜。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均殘留橢圓率(residue ellipticity)(degθcm2dmol-1)。熒光光譜學(xué)按照Chin等介紹的方法(Biochemistry 311945-51，1992)進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。制備免疫性YYR肽為了獲得抗PrPSc抗體，合成具有氨基酸序列乙?；?Cys-Tyr-Tyr-Arg-NH2(YYR)(SEQ ID NO32)的肽，使其與KLH綴合，然后采用眾所周知的技術(shù)將所述肽肌內(nèi)注射到兔子體內(nèi)。
在所述肽的氨基末端，加入半胱氨酸殘基，使得所述肽可與蛋白載體綴合。經(jīng)乙?；忾]所述肽的氨基，經(jīng)酰胺化封閉所述肽的羧基。肽合成采用人工固相肽合成法或者自動(dòng)固相肽合成法(MPS396肽合成儀，Advanced ChemTech)合成肽。用Fmoc肽合成化學(xué)完成氨基酸殘基的偶聯(lián)(Fields等，1990，IJPPR 35，161)。在Wang樹(shù)脂或酰胺Rink樹(shù)脂上，用側(cè)鏈完全保護(hù)的氨基酸進(jìn)行合成。由于用Fmoc基團(tuán)保護(hù)氨基酸的α-氨基，因此對(duì)于三官能氨基酸側(cè)基選擇以下保護(hù)基半胱氨酸5-三苯基甲基(Trt)精氨酸2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)酪氨酸叔丁基醚(tBu)根據(jù)偶聯(lián)反應(yīng)的化學(xué)和難度，將BOP、PyBOP或TBTU用作活化劑。所有化學(xué)品購(gòu)自Advanced ChemTech，Bachem和Calbiochem/NovaBiochem。通過(guò)用3-6倍過(guò)量的偶聯(lián)劑和所說(shuō)的雙偶聯(lián)確保序列殘基之間的每個(gè)肽鍵的形成；意味著對(duì)于加入至生長(zhǎng)肽鏈中的每個(gè)氨基酸都重復(fù)偶聯(lián)反應(yīng)。從樹(shù)脂中切下fluo-肽合成后，用試劑K作為切割混合物水(2.5％)、TIS(2.5％)、EDT(2.5％)、TFA(92.5％)，從樹(shù)脂中切下所述肽。然后用冷乙醚沉淀所述肽。將沉淀物離心，用乙醚洗滌三次，溶于20％-50％AcCN/水混合物中，然后凍干。用分析型RP-HPLC和電霧化MS進(jìn)行粗制品的分析。HPLC純化使用RP-HPLC(反相高效液相層析)，在Vydac C18柱(2.5×25cm)上，使用10-50％線性梯度乙腈水溶液與0.06％TFA(1％/分鐘梯度，10ml/分鐘流速)，在215nm和254nm進(jìn)行UV監(jiān)測(cè)，從而純化所述粗制肽。用分析型RP-HPLC評(píng)價(jià)流分的純度。獲得的終產(chǎn)物為凍干肽，通過(guò)分析型RP-HPLC(Vydac C18，0.46×25cm，線性梯度10-60％乙腈水溶液，0.1％TFA，1％/分鐘，1ml/分鐘流速，在215nm和254nm進(jìn)行UV吸收檢測(cè))估計(jì)所述凍干肽的純度為至少95％。使用SCIEXAPI III質(zhì)譜儀，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)分子量分析鑒定該純肽。分析數(shù)據(jù)所述肽在RP-HPLC上的保留時(shí)間為21.215分鐘。所述肽的理論分子量計(jì)算值為644.74；分子量分析的實(shí)際分子量實(shí)測(cè)值為646.5(MW+H+)。肽與載體的偶聯(lián)將肽與載體偶聯(lián)，在本情況下載體為匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)?？捎糜谶@種偶聯(lián)的其它載體包括但不限于白蛋白、或卵清蛋白、8map、或溶菌酶。通過(guò)與半胱氨酸巰基的硫醚鍵實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。這種類型的健合有利于肽以確定方式與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。
與KLH偶聯(lián)如下進(jìn)行。將10mg肽溶于2ml磷酸緩沖液(PBS 1x)中。將1ml KLH(Pierce產(chǎn)品目錄號(hào)77100)加入肽溶液中并攪拌(1mole肽/50個(gè)氨基酸)。KLH濃度為10mg/ml。邊攪拌邊將20μl戊二醛(25％水溶液)加入肽/載體溶液中，溫育1小時(shí)后，加入甘氨酸終止液。通過(guò)PBS透析，從所述肽中分離出肽/載體綴合物。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法，例如本文介紹的方法，合成另外的YYR肽(例如，CYYRRYYRYY(SEQ ID NO33)和CKYEDRYYRE(SEQ ID NO34))。通過(guò)對(duì)上述合成方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，可以制備其它合成肽。也采用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法(例如本文介紹的方法)鑒定這類肽。免疫兔子按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備多克隆抗體，以3-8周的間隔，用重復(fù)強(qiáng)化注射增強(qiáng)免疫應(yīng)答。以蛋白質(zhì)印跡或ELISA或者兩種方法，通過(guò)測(cè)定抗體濃度證實(shí)免疫成功。更具體地說(shuō)，為了產(chǎn)生針對(duì)PrPSc的多克隆抗體，按照164天的免疫方案，將與KLH綴合的三肽YYR注射到兔子體內(nèi)，然后從產(chǎn)生特異性抗體的動(dòng)物取血。
為了取免疫前血清樣品，每只兔子抽取10ml血作為免疫前對(duì)照。首先用弗氏完全佐劑進(jìn)行初次免疫，隨后用弗氏不完全佐劑(IFA)加強(qiáng)免疫(1ml/只兔，0.5ml/每側(cè)股肌)。每次注射包含約200μg純肽。在第21天、第42天和第70天，用IFA給予強(qiáng)化注射。在第31天、第42天和第80天，從耳中央動(dòng)脈抽取10ml血液用于效價(jià)測(cè)定(6ml/kg/只兔)。在第80天，檢查血清效價(jià)，再以4周間隔注射(IFA)三次，注射后10天取血樣。最后一次加強(qiáng)免疫后10天，通過(guò)心臟穿刺對(duì)麻醉兔子進(jìn)行取血，并收集抗血清。免疫山羊按照標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生山羊多克隆抗體。如下免疫3只山羊。在第1天，所有山羊的初次免疫為接受1mg YYR-KLH綴合物的弗氏完全佐劑。對(duì)于3只山羊中的2只通過(guò)注射1mg YYR-KLH綴合物的弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，而第3只山羊按受1mg YYR-8map綴合物的弗氏不完全佐劑。通過(guò)ELISA，測(cè)試3次取血樣品的各血清樣品對(duì)YYR-BSA綴合物的反應(yīng)性。用第3組血樣品，經(jīng)硫酸銨沉淀純化總IgG，然后使用YYR親和柱純化YYR反應(yīng)性IgG。按照本文所述測(cè)試IgG流分對(duì)PrPSc的反應(yīng)性。嚴(yán)格免疫程序如下第1天，初次免疫；第21天，第1次加強(qiáng)免疫；第30天，第1次取血；第46天，第2次加強(qiáng)免疫；第53天，第2次加強(qiáng)免疫；第60天，第2次取血；第76天，第3次加強(qiáng)免疫；第83天，第3次加強(qiáng)免疫；第90天，第3次取血。
或者，可以采用本文所述的合成肽和標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)(參見(jiàn)例如Kohler等，Nature 256，1975；Kohler等，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hydridomas，Elsevier，NY，1981；Ausubel等，1999，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，NewYork)，制備單克隆抗體。制備單克隆抗體后還通過(guò)免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析(例如，通過(guò)采用Ausubel等介紹的方法，參見(jiàn)上文)測(cè)試單克隆抗體對(duì)PrP的特異性識(shí)別。免疫小鼠如下制備單克隆抗體。用含小鼠PrP-AP融合蛋白的桿狀病毒上清液的弗氏完全佐劑免疫小鼠，然后2周后用同樣抗原的弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后2周，用PrP-AP上清液加上100μgKLH-CYYRRYYRYY和100μg KLH-CKYEDRYYRE綴合物的混合物加強(qiáng)免疫小鼠。將這些小鼠的脾細(xì)胞與FO小鼠B細(xì)胞系(ATCCCRL-1646)融合，產(chǎn)生特異性雜交瘤克隆。通過(guò)ELISA篩選雜交瘤上清液。沒(méi)有對(duì)PrP-AP或CKYEDRYYRE序列反應(yīng)的上清液，但是有對(duì)YYR-8map綴合物反應(yīng)的克隆。抗體的純化采用Pharmacia A蛋白HiTrap柱，按照生產(chǎn)商的建議，從血清純化兔總IgG。概括地講，用3倍柱體積的起始緩沖液(0.2M磷酸鈉緩沖液，pH7.0)平衡HiTrap柱。使用注射器通過(guò)luer接管將血清加樣到柱子上。隨后用5ml起始緩沖液洗滌柱子。用0.1M甘氨酸，pH3.0洗脫結(jié)合蛋白，并收集于裝有1M Tris pH8.0(50μl/500μl樣品)的eppendorf管中。在SDS-PAGE上分析流分。
如上所述從血清樣品純化山羊多克隆抗體。
產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體為腹水，并用A蛋白柱試劑盒(Pierce)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，純化小鼠單克隆抗體。概括地講，用結(jié)合緩沖液以1∶1終比率稀釋腹水樣品。然后將樣品加樣到柱子頂部，該柱子先前已用結(jié)合緩沖液平衡，讓樣品流過(guò)基質(zhì)。收集流出物質(zhì)，用5倍體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子。將溫性洗脫緩沖液加入柱子中，以從基質(zhì)釋放結(jié)合的IgG抗體。通過(guò)轉(zhuǎn)換成IgG洗脫緩沖液收集其它抗體同種型。以1ml流分收集所有抗體，通過(guò)BCA以測(cè)定總蛋白含量以及經(jīng)SDS-PAGE電泳以確定抗體純度的程度來(lái)對(duì)該流分進(jìn)行分析。通過(guò)使流分通過(guò)D-鹽柱(Pierce)，使含有最大得率IgG的流分脫鹽。分配抗體流分，用PBS將其貯藏于-80℃。
隨后如下測(cè)試采用前述方法產(chǎn)生的抗體的高親和力結(jié)合。牛腦勻漿的制備使用兩種方法制備牛腦勻漿。在第一種方法(A)中，采用Polytron(OMNI GLH)，將腦樣品在組織勻漿緩沖液(10％蔗糖、20mM HEPESpH7.5、2％十二烷基肌氨酸鈉和5mM EDTA)中勻漿。使用的勻漿終濃度為1％(w/v)。
在第二種方法(B)中，將腦勻漿制成10％(w/v)溶液。使用Dounce勻漿器(帶一個(gè)Teflon研棒)以2倍體積的冷裂解緩沖液(100mMNaCl、10mM EDTA、0.5％Nonidet P-40、0.5％脫氧膽酸鈉的tris-HCl溶液，pH7.4)將牛腦搗碎。樣品在冰上孵育20分鐘后，再在勻漿器中勻漿15次。通過(guò)在4℃以3000rpm離心15分鐘來(lái)去除細(xì)胞碎片。隨后定量測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量。倉(cāng)鼠和小鼠勻漿的制備倉(cāng)鼠或小鼠腦組織加入足夠勻漿緩沖液(PBS 0.5％NP40、0.5％脫氧膽酸鹽)，產(chǎn)生10％(重量/體積)勻漿。重復(fù)通過(guò)18號(hào)針和22號(hào)針使組織勻漿。連續(xù)2次以500g離心20分鐘去除細(xì)胞碎片。用BCA試劑盒(Pierce)定量測(cè)定上清液中的總蛋白，用勻漿緩沖液將濃度調(diào)至終濃度為5mg/ml。制備成各200μl等份樣品，貯藏于-80℃。磁珠綴合采用生產(chǎn)商提供的方案，將60-150μl純化抗體或BSA與大約6×108甲苯磺?；罨拇胖?Dynal)綴合。概括地講，將每種抗體的1ml勻質(zhì)未綴合磁珠懸液洗滌兩次，重懸于含抗體或BSA的PBS pH7.4中。混合物在轉(zhuǎn)子上于37℃溫育20-24小時(shí)。然后旋轉(zhuǎn)下在PBS 0.1％BSA中將混合物洗滌兩次，每次5分鐘，然后旋轉(zhuǎn)下在封閉緩沖液(0.2M Tris pH8.5 0.1％BSA)中于37℃溫育4小時(shí)。用PBS 0.1％BSA再洗滌5分鐘后，將抗體-磁珠綴合物在PBS 0.1％BSA 1％Tween-20中洗滌10分鐘，再用PBS 0.1％BSA洗滌，然后貯藏于4℃。蛋白酶K消化將牛腦勻漿與蛋白酶K溶液(100μg/ml)于50℃溫育30分鐘。用蛋白抑制劑PMSF(2 mM)終止消化。
用45μg/ml終濃度蛋白酶K于37℃消化小鼠和倉(cāng)鼠腦勻漿30分鐘。加入19mM PMSF終濃度終止反應(yīng)。免疫沉淀法將10μl腦提取物加入950μl免疫沉淀緩沖液(PBS 3％NP-40、3％Tween-20)，于37℃溫育30分鐘或60分鐘。對(duì)于評(píng)價(jià)PrP 27-30與磁珠綴合物反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行溫育之前加入50μl 1mg/ml蛋白酶K。將未用蛋白酶K處理的樣品于37℃再溫育適當(dāng)時(shí)間。溫育后，兩組試管中都加入60μl 100mM PMSF溶液。然后將100μl重懸浮的磁珠綴合物加入至混合物中，邊旋轉(zhuǎn)邊于室溫下溫育2小時(shí)。用洗滌緩沖液(PBS 2％NP-40 2％Tween-20)洗滌磁珠3次，每次洗滌后通過(guò)渦旋進(jìn)行重懸。最后一次洗滌后，將磁珠重懸于20μl 2X加樣緩沖液(100mM Tris pH6 8、4％SDS、0.015％溴酚藍(lán)、20％甘油)中，于95℃加熱3分鐘。蛋白質(zhì)印跡按照標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定腦勻漿的PrPSc含量。將蛋白質(zhì)樣品與2x樣品緩沖液以1∶1比率進(jìn)行混合，于100℃煮沸5分鐘。按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。將樣品與預(yù)染色分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(Biorad)一起加樣到15％預(yù)制丙烯酰胺凝膠(Biorad)中。凝膠于100V進(jìn)行電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿到達(dá)凝膠底部。然后在100V將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上達(dá)1小時(shí)。在封閉緩沖液中將膜封閉30分鐘，封閉后用TBST洗滌膜3次。然后將膜與變性PrP特異性抗體一起于室溫下溫育2小時(shí)。如上所述洗滌膜后，將其與山羊抗小鼠IgG堿性磷酸酶綴合的第二抗體(1∶5000的TBST)一起于室溫下溫育1小時(shí)。洗滌后，用化學(xué)發(fā)光底物CDP-star產(chǎn)生信號(hào)，然后對(duì)X-光膠片曝光。流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)使組織通過(guò)金屬網(wǎng)，從Balb/c小鼠制備脾細(xì)胞懸液。用不含Ca2+或Mg2+的冷Dulbecco PBS洗滌細(xì)胞1次，在細(xì)胞懸液上加入Lympholyte(Cedarlane)并且以1300g離心20分鐘分離活細(xì)胞。用不含Ca2+或Mg2+2.5％胎牛血清的冷Dulbecco PBS洗滌細(xì)胞1次，將0.5×106細(xì)胞等份加至圓底96孔板的各孔中。將細(xì)胞離心后以1/10終濃度重懸于50μl抗體-FITC綴合物的不含Ca2+或Mg2+2.5％胎牛血清的冷Dulbecco PBS中，在冰上保持15分鐘。細(xì)胞用不含Ca2+或Mg2+2.5％胎牛血清的冷Dulbecco PBS洗滌2次后，重懸于含1μg/ml碘化丙錠的相同培養(yǎng)基中。在Coulter Epics流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞并根據(jù)大小和粒度(前向和側(cè)向散射)和活力(排除碘化丙錠熒光)門(mén)控細(xì)胞。FITC抗體綴合通過(guò)使用Fluorotag試劑盒(Sigma)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，制備熒光素標(biāo)記的mAb。概括地講，用濃碳酸氫鹽緩沖液使0.5mg每種抗體升高至pH9，加入FITC儲(chǔ)備液，使FITC∶抗體的比率為20∶1。然后將實(shí)驗(yàn)瓶于室溫下溫育2小時(shí)。通過(guò)使混合物通過(guò)Sephadex G-25M柱，將標(biāo)記抗體與游離FITC分開(kāi)。采用LJL Biosystems Analyst，通過(guò)測(cè)量綴合抗體在535nm的FITC發(fā)射光，來(lái)測(cè)試綴合抗體的成功熒光素化，用ELISA針對(duì)YYR-8map綴合物測(cè)試抗體保留的結(jié)合活性。腦勻漿PrP含量的測(cè)定使用mAb6H4通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)從腦樣品制備的提取物中存在PrPC和PrPSc(圖3)。在從正常和BSE感染的腦樣品制備的提取物中觀察到PrPC(33-35 kDa)的分散帶型。用蛋白酶K處理提取物后，PrPC被完全消化，而PrPSc顯示為27-30 kDa的條帶。
所有腦的特征在于存在PrPSc，在合并提取物中占總PrP含量的15-20％(圖15)。可溶性原鈣粘著蛋白-2(sPC2)的表達(dá)一種PrP結(jié)合蛋白PC2用作PrPC和PrPSc的捕獲試劑，以證明pAbC2的PrPSc特異性。將含有編碼所有6個(gè)鈣粘著蛋白結(jié)構(gòu)域、但在跨膜結(jié)構(gòu)域的起點(diǎn)處截?cái)嗟娜嗽}粘著蛋白-2序列的質(zhì)粒(HU-PC43 3’trunc/PC1nel)，轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中。收集含可溶形式的原鈣粘著蛋白-2的培養(yǎng)基，使用抗PC2單克隆抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法，測(cè)定sPC2的存在。題目是“朊病毒蛋白結(jié)合蛋白及其應(yīng)用”的WO97/45746描述了PC2作為朊病毒蛋白受體的應(yīng)用，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。用ELISA測(cè)試pAbC2采用ELISA方法確定與使用重組PrP(rbPrP)的PrP相比，pAbC2是否有效特異性識(shí)別牛腦提取物中的PrPSc，。用含PrPSc的腦提取物合并物或rbPrP測(cè)試pAbC2對(duì)PrPSc的特異性。
在含50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1mM CaCl2的TBS緩沖液中，用含PC2的培養(yǎng)上清液將Immunolon ELISA板(Dynex)各孔于4℃包被過(guò)夜。對(duì)于BSE腦提取物實(shí)驗(yàn)，將對(duì)照各孔用含Mek-4的上清液包被；對(duì)于rbPrP實(shí)驗(yàn)，將牛奶用作對(duì)照，以測(cè)定各孔中抗體的非特異性結(jié)合。用抗PC2單克隆抗體證實(shí)可溶性PC2對(duì)ELISA板的包被。使用SLT“Columbus”微量培養(yǎng)板洗滌儀(Tecan)，用含0.05％Tween-20的TBS，洗滌各孔4次，然后通過(guò)用0.2％I-Block(Tropix)的TBST填充各孔并將該板于37℃溫育1小時(shí)來(lái)進(jìn)行封閉。洗滌板，將牛腦勻漿(在TBS中稀釋至1％w/v)或rbPrP加入至設(shè)計(jì)的各孔中，于室溫下溫育1小時(shí)。用TBST洗滌各孔4次。將pAbC2加入至合適孔中，于室溫下溫育1小時(shí)，隨后再與100μl抗兔或小鼠IgG/辣根過(guò)氧化物酶綴合物(1∶5000)的含1％脫脂牛奶的TBST一起溫育45分鐘。用TBST洗滌各孔4次。用TMB/H2O2作為過(guò)氧化物酶的底物產(chǎn)生信號(hào)。15分鐘后通過(guò)加入100μl 2M磷酸終止反應(yīng)。采用SLT微量培養(yǎng)板讀出器，以620nm為參考波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)450nm的信號(hào)。通過(guò)將與PC2結(jié)合的PrP和與陰性對(duì)照Mek-2或牛奶結(jié)合的PrP進(jìn)行比較，測(cè)定特異性陽(yáng)性信號(hào)。免疫前對(duì)照顯示無(wú)結(jié)合。
在BSE感染的所有牛腦提取物的情況下，這些點(diǎn)記錄的絕對(duì)值都比得自正常腦提取物的記錄值高，無(wú)論所述板上是否存在sPC2?？赡蹷SE樣品中的聚集導(dǎo)致與ELISA板各孔的非特異性粘附，因此，記錄到的信號(hào)較高。然而，BSE樣品的值仍然比用Mek-4對(duì)照探測(cè)同一樣品獲得的值高。
pAbC2與結(jié)合PC2的物質(zhì)的反應(yīng)比與結(jié)合Mek-4的物質(zhì)的反應(yīng)更強(qiáng)，通過(guò)比與Mek-4對(duì)照的結(jié)合高1.5-2倍，表明與PrPSc的結(jié)合是特異性的(圖16)。在大多數(shù)情況下，pAbC2抗體作為第二檢測(cè)試劑僅與PrPSc陽(yáng)性樣品結(jié)合，表明這種試劑的組合可以在未經(jīng)蛋白酶預(yù)處理就能夠檢測(cè)PrPSc。采用免疫沉淀法檢測(cè)分析PrP
確定pAbC2識(shí)別ELISA測(cè)定中的PrPSc后，隨后進(jìn)行免疫沉淀法，以驗(yàn)證pAbC2是否可以免疫沉淀牛腦提取物中的PrP。將數(shù)個(gè)正?；駼SE感染的腦提取物的合并物用于本實(shí)驗(yàn)中，除非另有說(shuō)明。所有腦樣品先前已鑒定存在PrPSc。概括地講，將20μl 10％腦勻漿與各種已知與PrP結(jié)合的抗體(例如mAb6H4)以及含0.5M GuHCl的TBS中的pAbC2一起于室溫下溫育2小時(shí)。與25μl偶聯(lián)A蛋白的磁珠或偶聯(lián)G蛋白的磁珠(Dyna-beads)一起于室溫下溫育1小時(shí)后，用磁鐵沉淀瓊脂糖磁珠。洗滌沉淀3次后，在SDS樣品緩沖液中煮沸，用于蛋白質(zhì)印跡分析。用抗PrP多克隆抗體或單克隆抗體檢測(cè)PrP。
使用pAbC2，在含正常腦提取物的反應(yīng)中未檢測(cè)到PrP，然而，在含BSE感染樣品提取物的反應(yīng)中檢測(cè)到與PrP相似位置上的遷移條帶(圖7)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ELISA研究結(jié)果即pAbC2對(duì)PrPSc是特異性的而對(duì)PrPC無(wú)特異性。未偶聯(lián)的磁珠用作陰性對(duì)照，顯示不能沉淀PrPSc。在免疫沉淀反應(yīng)中mAb 6H4用作陽(yáng)性對(duì)照。如所預(yù)期的一樣，使用mAb 6H4有效沉淀正常腦的PrPC。用途可以將本文描述的PrP肽和PrPSc特異性抗體用于例如以下診斷、治療、疫苗和凈化目的，以及用于篩選可以用于診斷或?qū)闺貌《静〉幕衔锘騼艋貌《緲悠返男滦突衔?。用于診斷朊病毒病的試驗(yàn)試劑盒表位特異性抗PrP抗體主要具有在檢測(cè)或監(jiān)測(cè)朊病毒病方面的診斷用途。例如，采用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，可以將抗PrP抗體用于監(jiān)測(cè)生物樣品(例如活檢組織、細(xì)胞或液體)中是否存在PrPSc。免疫測(cè)定可以包括直接檢測(cè)PrPSc，并且尤其適合于篩選存在PrPSc的大量樣品。例如，針對(duì)連續(xù)YYX表位例如YYR產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體(如上所述)可以用于任何標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定形式(例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、流式細(xì)胞術(shù)或RIA測(cè)定)，以測(cè)定復(fù)合物的形成。另外，因?yàn)楸疚乃隹贵w對(duì)PrPSc有特異性，因此，如有需要，免疫分析前可以不用蛋白酶預(yù)處理待測(cè)樣品。在這些檢測(cè)方法中可以使用直接或間接顯現(xiàn)的任何合適的標(biāo)記物，包括但不限于任何放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記(例如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)標(biāo)記、可以用標(biāo)記的半抗原特異性抗體或其它結(jié)合配偶體(例如抗生物素蛋白)顯現(xiàn)的半抗原(例如洋地黃毒苷或生物素)。例如，在Ausubel等，參見(jiàn)上文，Harlow和Lane，AntibodiesA LaboratoryApproach，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)，以及Moynagh和Schimmel，Nature 400105，1999中描述了典型的免疫測(cè)定。例如，使用本文描述的抗體，采用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)法，例如本文所述的那些方法，在細(xì)胞表面(例如白細(xì)胞)可以容易地檢測(cè)到PrPSc。與合適對(duì)照樣品相比，標(biāo)記復(fù)合物水平增加的樣品說(shuō)明存在PrPSc，因此指示存在朊病毒相關(guān)疾病。
另外，使用本發(fā)明的抗體可以鑒定出可用于診斷朊病毒病的新型化合物。例如，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(例如平衡透析、Biacore分析或競(jìng)爭(zhēng)性抑制)，篩選組合化學(xué)文庫(kù)或小分子文庫(kù)，以鑒定能夠抑制一種或多種抗YYX抗體與YYX表位的結(jié)合作用的化合物。這樣的文庫(kù)按照本領(lǐng)域已知方法可以從天然產(chǎn)物、合成(或半合成)提取物或化學(xué)文庫(kù)獲得。藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，化合物的準(zhǔn)確來(lái)源對(duì)于本發(fā)明的篩選方法不是至關(guān)重要的。天然化合物來(lái)源的實(shí)例包括但不限于植物來(lái)源、真菌來(lái)源、原核生物來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源以及對(duì)現(xiàn)有化合物的修飾。許多方法也可用來(lái)隨機(jī)產(chǎn)生或定向合成(例如半合成或全合成)任何數(shù)量的化學(xué)化合物，包括但不限于糖、脂質(zhì)、肽和核酸型化合物。合成化合物文庫(kù)可以商業(yè)性獲得或可以按照本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生。此外，如有需要，采用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法、物理方法或生物化學(xué)方法，可以容易地改進(jìn)任一文庫(kù)或化合物。
在最低濃度下抑制抗YYX抗體與YYX表位結(jié)合的化合物被稱為“高親和力競(jìng)爭(zhēng)劑”并可用于本發(fā)明的診斷方法。隨后測(cè)試這類模擬抗YYX抗體(例如抗YYX抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”))活性的高親和力競(jìng)爭(zhēng)劑對(duì)PrPSc的有效識(shí)別和結(jié)合。鑒定出高親和力競(jìng)爭(zhēng)劑后，就可將其與固體支持物(例如ELISA孔或珠)偶聯(lián)，用作朊病毒感染的任何實(shí)際診斷試驗(yàn)的捕獲相。使抗PrPSc單克隆抗體轉(zhuǎn)換成IgM診斷方法也可以使用IgM抗體進(jìn)行，所述IgM抗體增加對(duì)PrPSc的親和力。為了增加對(duì)PrPSc的抗體親和力，可以如下將特異性結(jié)合的IgG Fab區(qū)基因構(gòu)建為五價(jià)IgM片段。
免疫球蛋白(Ig)分子由不同結(jié)構(gòu)域和功能域組成。每種免疫球蛋白由2條重鏈(每條50-80kD)和2條輕鏈(每條25kD)構(gòu)成。重鏈?zhǔn)?種免疫球蛋白基因VH、DH、JH和CH之一重排的產(chǎn)物。前3個(gè)基因統(tǒng)稱為可變區(qū)，它們組合形成重鏈的結(jié)合部位。第4個(gè)基因CH也稱為恒定區(qū)，不參與結(jié)合部位的形成，但起免疫系統(tǒng)其它組分識(shí)別重鏈的作用。同樣，輕鏈產(chǎn)生于三種免疫球蛋白基因VL、JL和CL之一拷貝的重排。與重鏈一樣，輕鏈的結(jié)合部位通過(guò)VL基因和JL基因組合產(chǎn)生，但不包括CL基因。因此任何特定抗體的結(jié)合部位通過(guò)兩個(gè)可變區(qū)VH-DH-JH多肽和VL-JL多肽的相互作用而產(chǎn)生。大多數(shù)抗體具有兩個(gè)這樣的結(jié)合部位。
在免疫應(yīng)答過(guò)程中，最早產(chǎn)生的免疫球蛋白類型稱為IgM。一般而言，IgM含有具有相對(duì)低親和力的結(jié)合部位，但是通過(guò)每個(gè)抗體分子表達(dá)五個(gè)結(jié)合部位而補(bǔ)償所述特性。隨著免疫應(yīng)答的進(jìn)展，產(chǎn)生其它抗體例如Ig G，Ig G比之前產(chǎn)生的IgM的親和力高得多，但每個(gè)分子僅有兩個(gè)結(jié)合部位。
如上所述，三肽YYR或相關(guān)基序在PrP序列中出現(xiàn)三次。在牛PrP、嚙齒類動(dòng)物PrP和人PrP中，所述基序以二次YYR和一次YYX出現(xiàn)。因此，可能的情況是，特定試劑檢測(cè)到的所述各基序越多，所述試劑就越敏感。在IgG分子中含有最高親和力結(jié)合部位。然而，因?yàn)樗鼈儍H有兩個(gè)結(jié)合部位，因此這些抗體不是檢測(cè)PrPSc的最佳試劑。IgM分子含有足夠的結(jié)合部位，但它們的親和力較低，因此它們也不是檢測(cè)PrPSc的最佳試劑。因此模塊式構(gòu)建Ig分子可解決該問(wèn)題而且提供了一種構(gòu)建用于檢測(cè)PrPSc的最佳Ig的方法。
用于產(chǎn)生抗PrPSc多克隆抗體的YYR-KLH抗原用來(lái)免疫小鼠。用本領(lǐng)域已建立的已知產(chǎn)生高親和力Ig G抗體的方法，免疫小鼠。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生B細(xì)胞雜交瘤，然后通過(guò)ELISA，測(cè)試這些細(xì)胞產(chǎn)生的含有分泌單克隆抗體的組織培養(yǎng)上清液對(duì)該抗原YYR部分的免疫反應(yīng)性。采用Heinrichs等(J.Immunol.Methods，178241-51，1995)介紹的單側(cè)PCR方法，克隆產(chǎn)生所述抗體的重排免疫球蛋白基因。僅需要克隆重鏈和輕鏈的可變區(qū)。然后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法，將這些克隆基因插入到含有合適恒定區(qū)的表達(dá)載體質(zhì)粒中，但是在這種情況下，分泌型IgM恒定區(qū)可以為任何其它Ig同種型。恒定區(qū)可以為小鼠來(lái)源或者人來(lái)源，人來(lái)源的IgM恒定區(qū)使所述抗體人源化，從而將其給予人后產(chǎn)生的副作用最小(關(guān)于綜述參見(jiàn)Winter和Harris，Immunol Today，14(6)243-6，1993；Vaughan等，Nature Biotech，16(6)535-9，1998)。然后用現(xiàn)已含有與恒定區(qū)(例如衍生自IgM分子)偶聯(lián)的產(chǎn)生自IgG分子的可變區(qū)的載體在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)中驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生重組抗PrPSc抗體。關(guān)于這種策略的實(shí)例參見(jiàn)Poul等，Immunotechnology，1189-96，1995。
另一方面，按照文獻(xiàn)(Marks等，J.Mol.Biol，222581-597，1991；Vaughan等，Nature Biotech，14309-14，1996)介紹從噬菌體展示文庫(kù)選擇對(duì)YYR-KLH抗原的YYR部分產(chǎn)生最佳反應(yīng)性的可變區(qū)的組合，然后進(jìn)行分離并亞克隆為上述全長(zhǎng)抗體。使抗PrPSc單克隆抗體轉(zhuǎn)換成IgE檢測(cè)樣品(例如血樣)中的PrPSc的一種替代方法包括使抗PrPSc單克隆抗體轉(zhuǎn)換成IgE。PrPSc形成各種大小的聚集物，而通常PrPC不形成這樣的聚集物。這些PrPSc多聚物可能存在于受感染個(gè)體的血液中。可以利用這種特征以生物測(cè)定檢測(cè)PrPSc。具體地說(shuō)，通過(guò)亞克隆，使PrPSc特異性或與PrPC和PrPSc交叉反應(yīng)性的單克隆抗體轉(zhuǎn)換成IgE同種型。這將包括與上述相同的方法，使用IgE恒定區(qū)代替IgM恒定區(qū)。
IgE恒定區(qū)特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合IgE抗體。這些受體廣泛分布于身體內(nèi)，并在變態(tài)反應(yīng)中起重要作用。這時(shí)所研究的受體，即對(duì)IgE(Fc RI)的高親和力受體存在于肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells)上。它是由3個(gè)多肽鏈組成的細(xì)胞表面受體，并對(duì)IgE具有非常強(qiáng)的親和力(Ka＝10-10M)。每個(gè)Fc RI結(jié)合一個(gè)IgE分子(Kulczycki和Metzger，J.Exp.Med.，1401676，1974；Barclay等，The Leukocyte Antigen Factsbook，SanDiegoAcademic Press，1997)。然而，為了起動(dòng)信號(hào)應(yīng)答，多個(gè)Fc RI受體與多價(jià)抗原交聯(lián)(Metzger，J.Immunol，1491477，1992)。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度與交聯(lián)程度成正比。交聯(lián)后表達(dá)Fc RI的細(xì)胞脫顆粒，引起快速釋放組胺和其它貯藏的介質(zhì)。
在目前生物測(cè)定法中，將血樣與PrPSc反應(yīng)性或PrPC和PrPSc交叉反應(yīng)性的單克隆抗體一起溫育。結(jié)合單體PrP和多聚體PrP(例如PrPSc集合物)后，將該混合物與表達(dá)Fc RI的細(xì)胞系例如RBL-2H3(已知表達(dá)2-3×105Fc RI/細(xì)胞)一起溫育(Barsumian等，Eur.J.Immunol，11317，1981)。這樣的細(xì)胞系可得自ATCC。由于Fc RJ的聚集是發(fā)生脫顆粒所需要的，所以無(wú)論是否與抗體結(jié)合的單體PrP都不引起細(xì)胞脫顆粒，然而，多聚體PrP可引起細(xì)胞脫顆粒。用標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定例如ELISA直接檢測(cè)所釋放的介質(zhì)。PrPSc疫苗本發(fā)明的肽及其混合物和組合也可用作疫苗的有效成分，所述疫苗能夠在對(duì)感染敏感的宿主和/或感染宿主中誘發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答以抵抗朊病毒病。給予途徑、抗原劑量、注射次數(shù)和頻率將隨物種而變化并且可以與目前臨床和/或?qū)嶒?yàn)用以產(chǎn)生針對(duì)其它傳染病或癌癥的免疫或治療療法同時(shí)使用。例如，疫苗是含有本發(fā)明肽、其類似物或混合物或其組合的藥學(xué)上可接受的組合物，用有效量的該組合物治療哺乳動(dòng)物(包括人)，產(chǎn)生的免疫力足以保護(hù)所治療的哺乳動(dòng)物在一定時(shí)間內(nèi)免患朊病毒病。用YYX(YYR、或YYD、或YYQ)或相關(guān)化合物免疫激發(fā)產(chǎn)生的PrPSc特異性免疫也可有效促進(jìn)降解PrPSc或緩解所述疾病的臨床表現(xiàn)，而不影響PrPC在腦和其它組織中的表達(dá)或功能，改善朊病毒病臨床癥狀性患者的臨床狀態(tài)。
按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以開(kāi)發(fā)出不同類型的疫苗。例如，疫苗可以是肽型、核酸型、細(xì)菌型或病毒型疫苗。更具體地說(shuō)，關(guān)于肽疫苗，相當(dāng)于PrPSc特異性表位的肽或其功能衍生物可用作多種形式的預(yù)防性疫苗或治療性疫苗，包括1)PrPSc序列的單體或多聚體，2)與可促進(jìn)所述表位聚集、促進(jìn)其提呈或加工的額外序列(例如I/II類靶向序列)和/或增強(qiáng)PrPSc特異性表位的免疫原性或作為增強(qiáng)所述疫苗效能的一種方法的額外抗體、T輔助細(xì)胞或CTL表位連續(xù)或非連續(xù)組合，3)進(jìn)行化學(xué)修飾或與可增強(qiáng)所述疫苗的免疫原性或傳遞的因子(例如脂肪酸或?；湣LH、破傷風(fēng)類毒素、霍亂毒素等)綴合，4)上述組分的任何組合，5)上述組分與佐劑(包括但不限于鋁鹽、皂甙或三萜、MPL和霍亂毒素)和/或傳遞媒介(包括但不限于脂質(zhì)體、VPL或病毒樣粒子、微乳狀液、減毒或滅毒細(xì)菌和病毒載體以及可降解微球體)的組合，6)通過(guò)任一途徑給予或一種方法是用抗原離體加載細(xì)胞。
核酸型疫苗用作預(yù)防或治療劑的實(shí)例包括1)任何編碼表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)PrPSc特異性表位的核酸，2)促進(jìn)加工和提呈、聚集、分泌、靶向(針對(duì)特定細(xì)胞類型)PrPSc特異性表位的額外核酸序列，為翻譯融合物或獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位，3)用作佐劑/免疫調(diào)制劑的額外核酸序列，為翻譯融合物或獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位，4)增加PrPSc特異性表位的免疫原性或疫苗效能的額外抗體、T輔助細(xì)胞或CTL表位，為翻譯融合物或者獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位，5)上述組分的任何組合，6)采用任何途徑或離體加載，以鹽水(“裸”DNA)或與佐劑(例如鋁鹽、QS-21、MPL)、免疫調(diào)制劑(例如rIL-2、rGM-CSF、rIL-12)和/或核酸傳遞因子(例如基于聚合物、脂質(zhì)、肽的可降解粒子、微乳狀液、VPL、減毒細(xì)菌或病毒載體)的組合給予上述組分。
減毒或滅活細(xì)菌或病毒載體可以用來(lái)傳遞抗原或編碼表達(dá)所述抗原的DNA/RNA。使用這些組分的一種方法也可以是用抗原離體加載細(xì)胞。朊病毒凈化本文所述的方法和組合物可用于凈化已知或懷疑污染朊病毒的生物樣品，例如用于移植的生物樣品。具體地說(shuō)，可以將生物樣品與抗PrPSc抗體一起溫育，然后采用標(biāo)準(zhǔn)方法去除復(fù)合物。或者，可以將抗PrPSc抗體與生物樣品一起溫育，以與其形式復(fù)合物，由此抑制朊病毒的感染性。朊病毒病治療藥物本發(fā)明的方法和組合物也提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物朊病毒病的方法，所述哺乳動(dòng)物包括但不限于人、綿羊、豬、牛、山羊、狗、貓和寵物。如上所述，PrP轉(zhuǎn)換成PrPSc時(shí)，酪氨酸二聚體中酪氨酸側(cè)鏈取向變化或YYX表位(例如YYR/D/Q)的成簇可能導(dǎo)致PrP的物理化學(xué)特性改變，例如疏水性和趨向聚集。這些殘基也可能在PrPC至PrPSc的轉(zhuǎn)換反應(yīng)中是重要的。如果這一點(diǎn)能得到證實(shí)，則治療朊病毒病可以基于破壞、抑制、減弱或中和與PrPC轉(zhuǎn)換成PrPSc相關(guān)的生物學(xué)事件的拮抗劑。YYX(例如YYR)肽免疫主動(dòng)產(chǎn)生的抗體或被動(dòng)轉(zhuǎn)移的抗YYX多克隆抗體或單克隆抗體可用于治療這些疾病。此外，本發(fā)明不僅包括完整單克隆抗體，而且包括免疫活性抗體片段。這種片段的實(shí)例包括Fab片段或(Fab)2片段、基因工程改造的單鏈FV分子和嵌合抗體(例如“人源化”抗體)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指這樣的抗體分子改變非抗原結(jié)合區(qū)的氨基酸序列，使得所述抗體更類似于人類抗體，而仍保留其原結(jié)合能力。按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如描述于以下文獻(xiàn)的方法Kutemeier等(Biotechniques 17242-246，1994)；Major 等(Hum.AntibodiesHybridomas 59-17，1994)；Jolliffe(Int.Rev.Immunol.10241-250，1993)；Carter等(Biotechnology 10163-167，1992)；Miyachi等(J.Clin.Lab.Anal.6343-50)和Leung等(Mol.Immunol.321413-1427，1995)，構(gòu)建和特征鑒定人源化型非人類(例如小鼠)抗體。人源化抗體可能具有較低免疫原性并可用于被動(dòng)免疫療法。此外，本發(fā)明的嵌合抗體可以包括(如果需要)非人類抗體的可變區(qū)(例如小鼠可變區(qū))和人類抗體的恒定區(qū)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將抗體或抗體片段與可檢測(cè)標(biāo)記連接?？蓹z測(cè)標(biāo)記的實(shí)例包括放射性標(biāo)記、非放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記和比色標(biāo)記。
此外，YYR表位結(jié)構(gòu)衍生的小分子(包括但不限于酪氨酸側(cè)鏈衍生物)可以阻斷所述轉(zhuǎn)換反應(yīng)。最后，直接化學(xué)修飾關(guān)鍵殘基，例如酶解酪氨酸環(huán)，或用大量取代共價(jià)衍生酪氨酸環(huán)也可以破壞PrPC至PrPSC的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，如果證實(shí)YYR表位中的氨基酸在轉(zhuǎn)換過(guò)程中是關(guān)鍵的話。
例如，這樣的化合物可以采用本發(fā)明的抗體進(jìn)行鑒定。因此，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(例如平衡透析、Biacore分析或競(jìng)爭(zhēng)性抑制)，篩選組合文庫(kù)或小分子文庫(kù)或兩者(參見(jiàn)下文)，鑒定具有抑制一種或多種抗YYX抗體與YYX表位結(jié)合作用的能力的化合物。抑制這種抗體結(jié)合的化合物可用于本發(fā)明的療法中。鑒定后測(cè)試這類化合物抵抗任何合適模型系統(tǒng)朊病毒病的能力。
評(píng)價(jià)試驗(yàn)拮抗劑是否對(duì)朊病毒病的體內(nèi)發(fā)生產(chǎn)生保護(hù)作用一般涉及采用已知罹患這種疾病的動(dòng)物(例如，Chandler，Lancet 61378-1379，1961；Eklund等，J.Infectious Disease 11715-22，1967；Field，Brit.J.Exp.Path.8129-239，1969)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用試驗(yàn)化合物處理一種合適的動(dòng)物(例如小鼠或倉(cāng)鼠)，與未處理對(duì)照動(dòng)物相比，朊病毒相關(guān)疾病的發(fā)病率降低或發(fā)病或病程延遲，則說(shuō)明產(chǎn)生了保護(hù)作用。將試驗(yàn)化合物給予先前已注射朊病毒因子的動(dòng)物，或者，使朊病毒和所述化合物預(yù)溫育，然后將朊病毒/化合物混合物注射到試驗(yàn)動(dòng)物，從而測(cè)試試驗(yàn)化合物中和朊病毒因子的能力。用于治療或預(yù)防朊病毒病的分子(例如，如上所述的拮抗劑)被稱為“抗朊病毒治療藥物”。
另一方面，PrPSc反應(yīng)性循環(huán)抗體可能通過(guò)穩(wěn)定PrPSc的構(gòu)象而起惡化所述疾病的作用。因此，阻斷這些內(nèi)源性抗體的作用可以減慢所述疾病的進(jìn)程或具有其它有益效應(yīng)。YYR特異性單克隆抗體可以用作產(chǎn)生對(duì)YYR特異性抗體結(jié)合部位反應(yīng)的另一組單克隆抗體的底物。第二組這些抗體被稱為抗獨(dú)特型抗體?？躬?dú)特型抗體可用于中和循環(huán)PrPSc反應(yīng)性抗體。
按照本發(fā)明的抗朊病毒治療藥物可以與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、或賦形劑一起以單位劑型給予。例如，可以使用常規(guī)藥學(xué)操作提供合適的制劑或組合物，將這樣的抗朊病毒治療藥物給予罹患朊病毒病或朊病毒病前癥狀或朊病毒病風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)物?？梢允褂萌魏魏线m給藥途徑，例如，胃腸外、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、顱內(nèi)、眼眶內(nèi)、眼、心室內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣霧劑或經(jīng)口給藥。
用于制備制劑的本領(lǐng)域熟知的方法可在例如“Remington’sPharmaceutical Sciences”中找到。用于胃腸外給藥的制劑可以含有例如賦形劑、無(wú)菌水、或鹽水、聚亞烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物油或氫化萘。生物相容的、生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制所述化合物的釋放。用于抗朊病毒治療化合物的其它潛在有效的胃腸外傳遞系統(tǒng)包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透泵、植入輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入制劑可以含有賦形劑(例如乳糖)，或可以為含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或可以為滴鼻劑形式或凝膠的油性溶液。
本發(fā)明的方法可以用于緩解或預(yù)防任何動(dòng)物的本文所述疾病，所述動(dòng)物例如人、家養(yǎng)寵物或家畜。當(dāng)治療非人類動(dòng)物時(shí)，所使用的抗朊病毒治療藥物最好是該物種專有的治療藥物。
本說(shuō)明書(shū)中所提及的所有出版物和專利申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合到本文中，其引用程度與每個(gè)單獨(dú)出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用具體而單獨(dú)地結(jié)合到本文中的程度一樣。
其它實(shí)施方案在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
序 列 表<110>卡普利昂藥品公司(Caprion Pharmaceuticals，Inc.)<120>朊病毒蛋白肽及其應(yīng)用<130>50111/002WO2<150>60/140,634<151>1999-06-23<160>34<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>1Xaa Tyr Tyr Xaa1<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(7)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>2Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(10)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>3Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10<210>4<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(13)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>4Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10<210>5<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(16)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>5Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15<210>6<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(19)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>6Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa<210>7<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(22)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>7Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20<210>8<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(25)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>8Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20 25<210>9<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(28)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>9Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20 25<210>10<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(31)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>10Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20 25 30<210>11<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(34)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>11Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr20 25 30Tyr Xaa<210>12<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>12Xaa Tyr Tyr Arg<210>13<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>13Xaa Tyr Tyr Gln1<210>14<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(4)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>14Xaa Tyr Tyr Asp1<210>15<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(13)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>15Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa1 5 10<210>16<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(16)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>16Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15<210>17<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(19)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>17Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa<210>18<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(22)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>18Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20<210>19<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(25)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>19Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20 25<210>20<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(28)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>20Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20 25<210>21<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(31)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>21Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa20 25 30<210>22<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(34)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>22Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr20 25 30Tyr Xaa<210>23<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(37)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>23Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr20 25 30Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa35<210>24<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(40)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>24Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa1 5 10 15Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr20 25 30Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa35 40<210>25<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>變異體<222>(1)...(10)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>25Xaa Tyr Tyr Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Tyr1 5 10<210>26<211>264<212>PRT<2 13>牛(Bos taurus)<400>26Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1 5 10 15Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly20 25 30Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly35 40 45Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His50 55 60Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His85 90 95Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys100 105 110Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala115 120 125Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala130 135 140Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr145 150 155 160Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro165 170 175Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn180 185 190Ile Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn195 200 205Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met210 215 220Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly225 230 235 240Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser245 250 255Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly260<210>27<211>253<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp1 5 10 15Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn20 25 30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg35 40 45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly50 55 60Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65 70 75 80Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His85 90 95Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met100 105 110Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr115 120 125Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp130 135 140Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln145 150 155 160Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val165 170 175His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr180 185 190Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg195 200 205Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala210 215 220Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val225 230 235 240Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250<210>28<211>256<212>PRT<213>綿羊(Ovis aries)<400>28Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala1 5 10 15Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly20 25 30Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly35 40 45Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His50 55 60Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His65 70 75 80Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly85 90 95Gly Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met100 105 110Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu115 120 125Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe130 135 140Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr145 150 155 160Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Arg Tyr Ser Asn Gln Asn165 170 175Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val180 185 190Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile195 200 205Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu210 215 220Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser225 230 235 240Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250 255<210>29<211>254<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>29Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp1 5 10 15Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn20 25 30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg
35 40 45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp50 55 60Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp65 70 75 80Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn85 90 95Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala100 105 110Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met115 120 125Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp130 135 140Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val145 150 155 160Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His165 170 175Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr180 185 190Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val195 200 205Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr210 215 220Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225 230 235 240Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly245 250<210>30<211>254<212>PRT<213>金倉(cāng)鼠(Mesocricetus auratus)<400>30Met Ala Asn Leu Ser Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Ala Met Trp1 5 10 15Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn20 25 30Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg35 40 45Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly50 55 60Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly65 70 75 80Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His85 90 95Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met100 105 110Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr115 120 125Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Met His Phe Gly Asn Asp130 135 140Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Asn Arg Tyr Pro Asn Gln145 150 155 160Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn Asn Phe Val165 170 175His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr180 185 190Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile Met Glu Arg195 200 205Val Val Glu Gln Met Cys Thr Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala210 215 220Tyr Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ala Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro225 230 235 240Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Met Val Gly245 250<210>31<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>31Tyr Tyr Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Tyr1 5<210>32<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>32Cys Tyr Tyr Arg1<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>33Cys Tyr Tyr Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr Tyr1 5 10<210>34<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>34Cys Lys Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu1 5 10
權(quán)利要求
1.一種抗體或其片段，該抗體或其片段以高結(jié)合親和力與哺乳動(dòng)物PrPSc的YYX表位結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體基本上不結(jié)合PrPC。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體與哺乳動(dòng)物PrPSc的YYR表位結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是針對(duì)PrPSc的YYR表位產(chǎn)生的多克隆抗體。
5.權(quán)利要求4的抗體，其中所述YYX表位是CYYR(SEQ ID NO32)的組成部分。
6權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是針對(duì)PrPSc的YYR表位產(chǎn)生的單克隆抗體。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述YYR表位是CYYRRYYRYY(SEQ ID NO33)的組成部分。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體片段是Fab片段或Fv片段。
10.一種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，所述單克隆抗體以高結(jié)合親和力與哺乳動(dòng)物PrPSc的YYX表位結(jié)合。
11.權(quán)利要求10的雜交瘤，其中所述抗體基本上不結(jié)合PrPC。
12權(quán)利要求10的雜交瘤細(xì)胞系，其中所述抗體與哺乳動(dòng)物PrPSc的YYR表位結(jié)合。
13.權(quán)利要求12的雜交瘤細(xì)胞系，其中所述YYR表位是CYYRRYYRYY(SEQ ID NO33)的組成部分。
14.一種組合物，該組合物包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物還包含一種載體。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物為治療組合物。
17.一種免疫試驗(yàn)試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體以及檢測(cè)所述抗體的方法。
18.一種用于檢測(cè)生物樣品中的PrPSc的方法，該方法包括以下步驟(a)在允許權(quán)利要求1-9的抗體和PrPSc形成復(fù)合物的條件下，使所述生物樣品與所述抗體接觸；和(b)檢測(cè)所述復(fù)合物，存在所述復(fù)合物說(shuō)明所述生物樣品中存在PrPSc。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體基本上不結(jié)合PrPC。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體是多克隆抗體或其片段。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述生物樣品包括組織或細(xì)胞、組織或細(xì)胞提取物、體液或活檢組織。
23權(quán)利要求18的方法，其中所述PrPSc來(lái)自人、家畜或?qū)櫸铩?br> 24.權(quán)利要求18的方法，其中采用ELISA、RIA、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所述復(fù)合物。
25.一種用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物PrPSc病的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物用藥學(xué)上可接受的載體配制的有效量的權(quán)利要求1-9的抗體。
26.一種包含YYX、YYR、YYD或YYQ氨基酸序列的肽，所述肽具有PrPSc抗原性。
27.權(quán)利要求26的肽，其中所述肽由18個(gè)或少于18個(gè)氨基酸組成。
28.權(quán)利要求26的肽，其中所述肽由12個(gè)或少于12個(gè)氨基酸組成。
29.權(quán)利要求26的肽，其中所述肽由8個(gè)或少于8個(gè)氨基酸組成。
30.權(quán)利要求26的肽，其中所述肽由5個(gè)或少于5個(gè)氨基酸組成。
31.權(quán)利要求26的肽，其中所述肽與一種免疫原性載體融合。
32.權(quán)利要求26的肽，其中所述免疫原性載體是血清清蛋白、卵清蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、8map或溶菌酶。
33.權(quán)利要求26的肽，其中所述肽是具有氨基酸序列YYR的三肽。
34.一種具有下式的合成肽A-Tyr-Tyr-B-(Tyr-Tyr-B)n其中A為任何氨基酸或者不存在；其中B為任何氨基酸或者不存在；和其中n為0-10，包括0和10。
35.權(quán)利要求34的肽，其中A和B中的至少一個(gè)不為T(mén)yr。
36.權(quán)利要求34的肽，其中A或B選自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。
37.權(quán)利要求34的肽，其中所述肽為A-Tyr-Tyr-Arg(SEQ ID NO12)或其藥學(xué)上可接受的鹽。
38權(quán)利要求34的肽，其中所述肽為A-Tyr-Tyr-Gln(SEQ ID NO13)或其藥學(xué)上可接受的鹽。
39.權(quán)利要求34的肽，其中所述肽為A-Tyr-Tyr-Asp(SEQ ID NO14)或其藥學(xué)上可接受的鹽。
40.權(quán)利要求34的肽，其中所述肽與一種免疫載體連接。
41.一種具有下式的合成肽A-Tyr-Tyr-B-C-Tyr-Tyr-D-Tyr-Tyr-(Tyr-Tyr-B)n其中A為任何氨基酸或者不存在；其中B為任何氨基酸或者不存在；其中C為任何氨基酸或者不存在；其中D為任何氨基酸或者不存在；和其中n為0-10，包括0和10。
42.權(quán)利要求41的肽，其中A、B、C和D中的至少一個(gè)不為T(mén)yr。
43.權(quán)利要求41的肽，其中A、B、C或D選自Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp。
44.權(quán)利要求41的肽，其中A為Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp，而B(niǎo)、C和D選自Arg、Gln、Asp、Glu、Phe或Trp。
45.權(quán)利要求41的肽，其中所述肽為A-Tyr-Tyr-Arg-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Tyr(SEQ ID NO25)或其藥學(xué)上可接受的鹽。
46.權(quán)利要求41的肽，其中所述肽與一種免疫載體連接。
47.一種用于產(chǎn)生以高結(jié)合親和力與哺乳動(dòng)物PrPSc結(jié)合的抗體的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一種朊病毒蛋白肽，該蛋白肽包含具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸側(cè)鏈的可及表位；(b)用步驟(a)的所述朊病毒蛋白肽免疫哺乳動(dòng)物；和(c)從所述哺乳動(dòng)物組織或從用所述組織制備的雜交瘤中純化所述抗體。
48權(quán)利要求47的方法，其中所述抗體基本上不結(jié)合PrPC。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗體是多克隆抗體或其片段。
50.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段。
51.權(quán)利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽包含YYX氨基酸序列。
52權(quán)利要求51的方法，其中所述朊病毒蛋白肽包含YYR或YYQ或YYD氨基酸序列。
53.權(quán)利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽由18個(gè)或少于18個(gè)氨基酸組成。
54.權(quán)利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽由12個(gè)或少于12個(gè)氨基酸組成。
55.權(quán)利要求47的方法，其中所述肽由8個(gè)或少于8個(gè)氨基酸組成。
56.權(quán)利要求47的方法，其中所述肽由5個(gè)或少于5個(gè)氨基酸組成。
57.權(quán)利要求47的方法，其中所述朊病毒蛋白肽包括權(quán)利要求34或權(quán)利要求41的肽。
58.一種抗PrPSc病的疫苗，該疫苗包含權(quán)利要求26、34或41中任一項(xiàng)的肽和一種藥學(xué)上可接受的載體。
59.一種針對(duì)PrPSc病免疫哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括給予有效量的權(quán)利要求58的疫苗。
60.一種組合物，該組合物包含權(quán)利要求26-46中任一項(xiàng)的肽。
61.權(quán)利要求60的組合物，其中所述組合物為治療組合物。
62.一種用于凈化生物樣品中的PrPSc的方法，該方法包括以下步驟(a)用權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體處理生物樣品，其處理時(shí)間足以允許形成抗PrPSc抗體PrPSc復(fù)合物；和(b)從所述生物樣品中回收所述抗PrPSc抗體PrPSc復(fù)合物。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述生物樣品為組織、體液或器官。
64.權(quán)利要求62的方法，其中用所述抗體灌注所述生物樣品。
65.一種抑制生物樣品中的PrPSc的方法，該方法包括用權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的抗體處理生物樣品，其處理時(shí)間足以允許形成抗PrPSc抗體PrPSc復(fù)合物。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述生物樣品為體液、組織或器官。
67.權(quán)利要求65的方法，其中用所述抗體灌注所述生物樣品。
68.一種鑒定治療朊病毒病的候選化合物的方法，該方法包括(a)測(cè)定在試驗(yàn)化合物存在下抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；和(b)測(cè)定在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；其中在所述試驗(yàn)化合物存在下所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平比在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平低，表明所述試驗(yàn)化合物是用于治療朊病毒病的潛在治療化合物。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述抗YYX抗體是抗YYR抗體、抗YYD抗體或抗YYQ抗體。
70.權(quán)利要求68的方法，其中所述朊病毒病影響人類、家畜或?qū)櫸铩?br> 71.權(quán)利要求68的方法，其中所述朊病毒病影響人類、牛、綿羊或山羊。
72.權(quán)利要求68的方法，其中所述試驗(yàn)化合物是一種小分子。
73.一種化合物，該化合物為按照權(quán)利要求68的方法鑒定的化合物。
74.一種鑒定用于診斷朊病毒病的化合物的方法，該方法包括(a)測(cè)定在試驗(yàn)化合物存在下抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；和(b)測(cè)定在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合；其中在所述試驗(yàn)化合物存在下所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平比在所述試驗(yàn)化合物不存在時(shí)所述抗YYX抗體與PrPSc的結(jié)合水平低，表明所述試驗(yàn)化合物是用于診斷朊病毒病的潛在化合物。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述抗YYX抗體是抗YYR抗體、抗YYD抗體或抗YYQ抗體。
76.權(quán)利要求74的方法，其中所述朊病毒病影響人類、家畜或?qū)櫸铩?br> 77.權(quán)利要求74的方法，其中所述朊病毒病影響人類、牛、綿羊或山羊。
78.權(quán)利要求74的方法，其中所述試驗(yàn)化合物是一種小分子。
79.一種化合物，該化合物是按照權(quán)利要求74的方法鑒定的化合物。
80.一種抗體，該抗體為按照權(quán)利要求47的方法產(chǎn)生的抗體。
全文摘要
總的來(lái)講本發(fā)明的特征在于PrP
文檔編號(hào)A61P25/28GK1370078SQ00811803
公開(kāi)日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月23日
發(fā)明者N·R·卡斯曼, E·帕拉米蒂奧蒂斯, J·斯倫－烏薩基維茨, A·哈希哈特, M·皮納德, T·勞頓 申請(qǐng)人:卡普利昂藥品公司