一種皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)dna疫苗及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物基因免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)設(shè)及一種皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表 達(dá)DNA疫苗及制備方法和應(yīng)用，包括將生長(zhǎng)抑素融合己肝表面抗原表達(dá)基因S/2SS和皮質(zhì) 抑素融合己肝表面抗原表達(dá)基因克隆到具有雙表達(dá)質(zhì)粒載體pIRES中，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 D冊(cè)a ;還設(shè)及該疫苗在促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 生長(zhǎng)抑素（S巧是下丘腦釋放的14膚激素，在動(dòng)物體內(nèi)具有廣泛的抑制作用，特別 對(duì)生長(zhǎng)及泌乳具有明顯的影響。許多研究證實(shí)，應(yīng)用SS主動(dòng)或被動(dòng)免疫動(dòng)物可W提高GH 水平，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和泌乳。由于生長(zhǎng)抑素分子量?。?658kD)，免疫原性弱，生長(zhǎng)抑素常規(guī) 免疫時(shí)都要與蛋白載體偶聯(lián)或與蛋白基因等重組W增強(qiáng)生長(zhǎng)抑素的免疫原性。國(guó)外已報(bào)道 的有應(yīng)用SS抗血清被動(dòng)免疫或化學(xué)合成SS制成免疫原主動(dòng)免疫羊、牛等家畜，可W顯著 提高增重效果，但免疫維持時(shí)間短，且化學(xué)合成多膚疫苗成本高，基因工程表達(dá)產(chǎn)物純化繁 雜，不利于生產(chǎn)推廣。國(guó)內(nèi)已開(kāi)發(fā)出激生I號(hào)、激生II號(hào)等促生長(zhǎng)產(chǎn)品，即利用基因工程原 理將SS與化sAg融合基因插入到痘苗病毒的TK基因，構(gòu)建重組痘苗病毒，接種到雞胚或細(xì) 胞上培養(yǎng)產(chǎn)生表達(dá)SS-冊(cè)sAg融合蛋白的痘苗病毒活載體苗。但此重組活載體疫苗常因誘 發(fā)機(jī)體對(duì)載體自身的免疫反應(yīng)而不能重復(fù)使用，此外還存在毒力回升等安全性問(wèn)題。生長(zhǎng) 抑素基因免疫可望克服該一缺點(diǎn)，成為促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的新途徑。
[0003] 生長(zhǎng)抑素DNA疫苗免疫原理是通過(guò)機(jī)體免疫體系激活識(shí)別反應(yīng)原從而產(chǎn)生SS抗 體，中和內(nèi)源性SS，達(dá)到促使體內(nèi)GH的增加，從而促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室在研究生 長(zhǎng)抑素DNA疫苗優(yōu)化構(gòu)建上梁愛(ài)屯、等構(gòu)建了真核pGM-CSF/SS生長(zhǎng)抑素基因疫苗（專利號(hào)： ZL 200610125580. 2)并在小鼠生長(zhǎng)上進(jìn)行口服免疫觀察對(duì)其生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示SS基 因免疫可W有效提高小鼠的體增重，且增重與產(chǎn)生的抗生抑素抗體呈顯著相關(guān)關(guān)系。同時(shí) 利用佐劑來(lái)提高生長(zhǎng)抑素免疫原性，薛春林等利用CpGDNA序列的核酸佐劑可W提高GH及 IGF-1的分泌水平，促進(jìn)生長(zhǎng)抑素DNA疫苗的免疫效果。嚴(yán)婷等（2006)構(gòu)建含化sA評(píng)S S 的減毒沙口氏菌口服SS基因疫苗，結(jié)果表明該疫苗進(jìn)入體內(nèi)不僅表達(dá)皿SPSS融合蛋白， 刺激機(jī)體產(chǎn)生SS抗體促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，還一定程度上產(chǎn)生增強(qiáng)免疫作用。Han等（2008) W VP22作為佐劑構(gòu)建生長(zhǎng)抑素祀GS2SS-V疫苗，證實(shí)小鼠試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組體增重方面提高14. 1 % (P < 0. 05)。由于DNA載體疫苗的抗性基因引起的生產(chǎn)成本高、導(dǎo)致臨床抗藥菌株的播散 及被免疫動(dòng)物的過(guò)敏不良反應(yīng)的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)梁愛(ài)屯、等成功構(gòu)建非抗性篩選菌生長(zhǎng)抑素真 核表達(dá)質(zhì)粒PGS/2SS (專利號(hào)；ZL 200810197981. 8)，采用肌肉注射和口服兩種方式免疫B a化/C鼠，且采用了不同劑量組、不同免疫次數(shù)來(lái)驗(yàn)證生長(zhǎng)抑素DNA疫苗效果。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 肌肉注射免疫效果要比口服注射的免疫效果IgA、IgG、IgGl、gG2a抗體水平反應(yīng)強(qiáng)烈，且增 重效果增加。
[0004] 生長(zhǎng)抑素DNA疫苗發(fā)展到現(xiàn)階段，選用了單表達(dá)SS真核質(zhì)粒，無(wú)論是在質(zhì)粒載體 上的選擇，SS基因片段數(shù)目（單拷貝和雙拷貝）W及通過(guò)增加佐劑提高生長(zhǎng)抑素DNA疫 苗促生長(zhǎng)效果都做了大量的研究工作，在該些基礎(chǔ)上，生長(zhǎng)抑素DM疫苗在免疫小型動(dòng)物 的免疫應(yīng)答和增重效果方面取得了較好的效果，但在大動(dòng)物中免疫裸質(zhì)粒的效果卻不是很 佳。
[0005] 皮質(zhì)抑素（cortistatin, CST)是de Lecea等1996年在哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)中發(fā) 現(xiàn)的能夠抑制皮質(zhì)活動(dòng)的神經(jīng)膚，在結(jié)構(gòu)上與生長(zhǎng)抑素SS具有高度同源性。CST能夠與 S種受體相結(jié)合；生長(zhǎng)抑素受體（somatostatin rec巧tors, SSTRs)、生長(zhǎng)激素促分泌物 覺(jué)體 la(grow hor mone secretagogues rec巧torla,細(xì)SRla)和 Mas 相關(guān)基因 X2 覺(jué)體 (Mas-related geneX化e c巧tor,化巧2)。CST的初級(jí)表達(dá)產(chǎn)物前皮質(zhì)抑素原由116個(gè) 氨基酸殘基組成，其序列同前生長(zhǎng)抑素原具有高度同源性。前皮質(zhì)抑素含有N-末端分泌 信號(hào)序列和成對(duì)的堿性氨基酸殘基是激素原轉(zhuǎn)化酶的作用位點(diǎn)。去信號(hào)膚序列后，皮質(zhì) 抑素原進(jìn)一步裂解產(chǎn)生成熟的CST膚：在大鼠和小鼠位14膚的CST(CST-14)和29膚的 CST(CST-29)。CST-14與SS-14由11個(gè)氨基酸殘基相同，其中包括FWKT四聚體結(jié)構(gòu)（FWKT 四聚體是SS與其受體結(jié)合的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)）和兩個(gè)同源性脫氨酸殘基。研究表明CST-14 和SS-14均相似程度地抑制正常人的生長(zhǎng)激素佑H)、膜島素和曲relin的分泌。CST-14 和SST-14也均能相似程度的抑制生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH)的促GH釋放反應(yīng)。化relin 比GHRH具有更強(qiáng)的促細(xì)釋放能力，而且能夠被CST-14或SS-14抑制炬roglio F，Arvat E，Benso A，et al. Endocrin e activities of cortistatin-Hand its interaction with GHRH and 組relin in humans. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87:3783-90.)。由 于生長(zhǎng)抑素DM疫苗在前期的研究主要處在生長(zhǎng)抑素SS和其他生長(zhǎng)因子的融合蛋白的作 用機(jī)理研究，但從內(nèi)分泌調(diào)控通路著手，通過(guò)利用有IRES元件的雙表達(dá)載體PIRESKat. No. 631605)將與SS相似生理作用的CST和SS共通構(gòu)建雙表達(dá)DM疫苗，從單個(gè)融合蛋白 的表達(dá)到SS和CST兩種融合蛋白的雙表達(dá)，從一種內(nèi)分泌生長(zhǎng)調(diào)控途徑的變成兩種，雙表 達(dá)皮質(zhì)抑素-生長(zhǎng)抑素DNA疫苗促生長(zhǎng)作用的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)類似報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了一種皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)的質(zhì)粒PIRES-S/ CST14-S/2SS，該質(zhì)粒可作為DM疫苗免疫動(dòng)物。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了 一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的DNA疫苗菌株 D冊(cè)a(pIRES-S/CST14-S/2S巧；該菌株已于2014年11月20日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 屯、保藏，分類命名；大腸桿菌巧scherichia coli)D冊(cè)a(pIRES-S/CST14-S/2S巧，保藏編號(hào)； CCTCC NO ;M2014583,該菌株通過(guò)SDS堿裂解法抽提即可得到PIRES-S/CST14-S/2SS質(zhì)粒。 [000引本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)的質(zhì)粒pIRES-S/ CST14-S/2S S或包含其的大腸桿菌在制備促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)疫苗中的應(yīng)用，將該質(zhì)粒作為疫苗 直接免疫動(dòng)物或與DNA疫苗佐劑混合后免疫動(dòng)物，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)施：
[0010] 一種皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)的DNA疫苗，是將合成好的皮質(zhì)抑素14膚基因片段 CS T14融合己肝表面抗原基因的融合基因（S/CST14)酶切回收后插入到質(zhì)粒pIRES上獲 得pi RES-S/CST14質(zhì)粒，再?gòu)馁|(zhì)粒PCS/2SS擴(kuò)增到含有雙拷貝生長(zhǎng)抑素14膚的己肝表面 抗原融合基因片段（S/2S巧插入到質(zhì)粒PIRES-S/CST14中，獲得皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá) DM質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS，該質(zhì)粒即為本發(fā)明的DM疫苗。
[0011] 具體如下：
[001 引 1)根據(jù) cortistatin (Mus mus州lus)基因序列 GenBank(NM_007745. 3)，合成 coi~tistatin-14(CST-14)的cDNA序列其兩端的酶切位點(diǎn)為Nde I和EcoR I，獲得CST14 片段；W含化P atitis B virus s1:rain Huashan 己肝表面抗原片段 GenBank (抓926424) 的質(zhì)粒pVAXl-S(將S片段佑enBank(抓926424)插入到pVAXl質(zhì)粒。）為載體，通過(guò)堿基合 成方法將CST14片段克隆到己肝表面抗原5'端后酶切位點(diǎn)Nde I，獲得能夠表達(dá)皮質(zhì)抑素 14膚融合己肝表面抗原質(zhì)粒PVAX1-S/CST14。
[0013] 2)將PVAX1-S/CST14和pIRES兩個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行Mie I和EcoR I酶切，連接，獲得質(zhì) 粒 pIRES _ S/CST14。
[0014] 3)利用PCS/2SS質(zhì)粒通過(guò)PCR克隆獲得生長(zhǎng)抑素融合基因片段S/2SS，上下游引 物為：
[00巧]P1 ;5, -ATAAGAATGCGGCCGCAATTCCCTGCGCTGAACATG-3,；
[0016] P2 ; 5 > -GCGTCGACCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTAC-3 >。
[0017] 4)S/2SS基因片段和真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRES - S/CST14進(jìn)行Not I和Sal I雙 酶切，連接，即獲得皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)DNA質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS。
[001引將該質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊(cè)a中，獲得了一株含有雙 表達(dá)皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)質(zhì)粒的重組大腸桿菌巧scherichia coli)D冊(cè)a(pIRES-S/ CST14-S/2SS)，該菌株已于2014年11月20日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，分類命 名：大腸桿菌巧 scherichia coli)D冊(cè)a(pIRES-S/CST14-S/2S巧，保藏編號(hào)；CCTCC NO; M2014583,該菌株通過(guò)SDS堿裂解法抽提即可得到PIRES-S/CST14-S/2SS質(zhì)粒。
[0019] 大腸桿菌巧scherichia coli)D冊(cè)a(pIRES-S/CST14-S/2S巧為含有雙表達(dá)皮質(zhì)抑 素生長(zhǎng)抑素真核表達(dá)質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS的混合培養(yǎng)物，通過(guò)SDS堿裂解法抽提即 可得到P IRES-S/CST14-S/2SS質(zhì)粒。培養(yǎng)基；1L LB固體培養(yǎng)基組成；lOg氯化鋼、5g酵母 提取物、lOg膜蛋白腺、1.5g瓊脂粉。培養(yǎng)條件；PH;6.8-7.8,溫度；37°C，為Amp+抗性；在 LB固體培養(yǎng)基中用平板劃線法檢測(cè)該培養(yǎng)物是否存活。
[0020] 一種皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素雙表達(dá)的質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS在制備促進(jìn)動(dòng)物生 長(zhǎng)疫苗中的應(yīng)用，將該質(zhì)粒作為疫苗直接免疫動(dòng)物或與DNA疫苗佐劑混合后免疫動(dòng)物。
[0021] 更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是：
[0023] 1、雙表達(dá)皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素DNA質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS，該質(zhì)粒能夠表達(dá)免 疫原性較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑素（S巧和皮質(zhì)抑素（CST)兩種蛋白。
[0024] 2、雙表達(dá)皮質(zhì)抑素生長(zhǎng)抑素DNA質(zhì)粒PIRES-S/CST14-S/2SS通過(guò)肌肉注射免疫小 鼠后，其生長(zhǎng)抑素和皮質(zhì)抑素聯(lián)合作用免疫協(xié)調(diào)促進(jìn)小