Ⅱ型抑瘤素m受體（osmr）在治療脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Ⅱ型抑瘤素M受體（OSMR）在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應用。本發(fā)明通過高脂飲食誘導的模型研究OSMR基因的功能，結果發(fā)現HFD組OSMR基因敲除小鼠的體重、空腹血糖水平均高于對照組WT小鼠，腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現OSMR基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱；從小鼠肝臟大體外觀、肝臟重量、肝臟/體重比值以及脂質成分病理染色結果等均說明HFD組的OSMR-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質蓄積顯著增加，這些結果表明OSMR基因敲除顯著惡化脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。針對OSMR的上述作用，OSMR可用于制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。
【專利說明】II型抑瘤素 Μ受體（OSMR)在治療脂肪肝和II型糖尿病中的 功能和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的功能與應用領域，特別涉及一種II型抑瘤素 Μ受體（0SMR)在治 療脂肪肝和II型糖尿病疾病中的功能和應用，以及0SMR作為靶基因在制備預防、緩解和/ 或治療脂肪肝和/或II型糖尿病的藥物中應用。

【背景技術】
[0002] 隨著老齡人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改變，肥胖、非酒精性脂肪肝 病、代謝綜合征和糖尿病等代謝異常人群劇增，現已經成為全球性的公眾健康的重要危害。 在過去的二三十年里，糖尿病患者數量已經翻倍，對全球人類的健康是一個極為嚴重的威 脅。在2010年，世界范圍內2. 85億人口患有糖尿病，其中90%的患者為II型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM)，預計到2030年患者的數量將增加到4. 39億，這意味著在全 球20-79歲成年人中將會有7. 7%是糖尿病患者。當前兒童，青少年及青年人群中II型糖尿 病及II型糖尿病前期發(fā)病率劇增，這也意味著在未來的糖尿病的發(fā)病人群將擴大，防治難 度將會大增。
[0003] 肝臟是物質代謝的中樞，它具有許多重要的生理功能，如葡萄糖的合成和分解，月旨 質合成和分解，膽汁合成和分泌等。高血糖可引起肝臟組織學和功能上的變化，并可促進膽 管紊亂，持久性高血糖狀態(tài)能導致肝功能衰退。另一方面，肝功能異常可導致葡萄糖代謝紊 亂和加劇糖尿病。肝臟作為人體的生化工廠，它具有六大生理功能：①代謝；②膽汁的生成 及排泄；③解毒；④免疫防御；⑤造血、凝血和調節(jié)循環(huán)血容量；⑥再生。三大能量代謝物 質的均需在肝臟這個工廠加工處理才能轉為機體所用，足見肝臟在代謝中重要地位。這三 大物質代謝紊亂，尤其是糖和脂肪代謝紊亂在2型糖尿病發(fā)病和進展中起著促進和惡化作 用。
[0004] 肝臟是人體生化工廠，脂質由肝臟合成和輸出。甘油三酯是由3個脂肪酸通過酯 鍵鏈接組裝到甘油主鏈上所構成的。而組裝肝臟甘油三酯的脂肪酸主要有3大來源：①食 物；②重新合成；③脂肪組織。食物來源脂肪在小腸吸收，然后組裝到甘油三酯豐富的乳糜 微粒，運送到全身循環(huán)系統。脂肪肝的形成主要是因為肝臟中的甘油三酯的需求和移出平 衡打破。當肝臟中的脂質內流和重新合成超過脂質流出及氧化消耗時，脂肪肝即可形成。
[0005] 0SMR是抑瘤素M(OSM)的受體，是一種具有多種生物學活性的細胞因子。0SM屬于 IL-6家族，作為一種多功能的細胞調節(jié)因子，可作用于多種細胞，具有多種生物學活性，能 調節(jié)基因活性、細胞存活、增殖和分化的潛在功能，在炎癥反應、造血作用、肝臟發(fā)育以及免 疫系統等方面展示出獨特的生物學活性，具有重要的生物學作用。0SM有兩種類型的受體， 分別為I型和II型0SM受體（OSMR)，I型0SMR與LIF (白血病抑制因子)受體（LIFR)相同， 由gpl30和和一個LIF的結合亞單位構成的異源二聚體；II型0SMR由1個gpl30與1個0SMR β亞單位（0SMR β)構成的異源二聚體(抑瘤素Μ的研究進展，2008,胡志清)。0SM通過增 加細胞增殖，減少細胞凋亡和上調SERPIN家庭成員來介導STAT3依賴的腸上皮細胞的修 復（Oncostatin M mediates STAT3_dependent intestinal epithelial restitution via increased cell proliferation, decreased apoptosis and upregulation of SERPIN family members. Beigel F, etal. PLoS One. 2014 Apr 7;9(4):e93498.);在成纖維細 胞中，OSM通過OSMR增強IL-1和TNF的表達，從而加重破壞炎癥性關節(jié)炎（Oncostatin Μ acting via OSMR, augments the actions of IL-1 and TNF in synovial fibroblasts. Benoit Le Goff, etal. 2014)。


【發(fā)明內容】

[0006] 為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種II型抑瘤素 M受 體（0SMR)基因在脂肪肝、II型糖尿病之間的相互關系，提供一個用于治療脂肪肝和/或II 型糖尿病的靶基因0SMR的新用途，進而把0SMR基因應用于脂肪肝和/或II型糖尿病的治 療。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現： 本發(fā)明以野生型C57小鼠與0SMR基因敲除小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導的肥胖 小鼠模型（diet induced obesity，DI0)模型研究0SMR基因的功能，結果發(fā)現與野生型WT 小鼠對比，0SMR基因敲除小鼠表現出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，并且 0SMR基因敲除小鼠的空腹血糖水平高于對照組WT小鼠，進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量 實驗發(fā)現0SMR基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟大體外觀，肝臟重 量及肝臟/體重比和病理染色，等均發(fā)現HFD組（High fat diet，高脂飲食）的0SMR-K0小 鼠脂肪肝病變嚴重，脂質蓄積增加顯著。這表明0SMR基因敲除會加劇脂肪肝、II型糖尿病 的發(fā)生，0SMR基因能夠改善脂肪肝、II型糖尿病。
[0008] -種0SMR基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病中的功能，具體體現在0SMR具有改善脂 肪肝和/或II型糖尿病的功能。
[0009] 針對0SMR的改善脂肪肝和/或II型糖尿病的功能，0SMR可在制備用于預防、緩解 和/或治療脂肪肝疾病的藥物方面應用。
[0010] 一種預防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物，包含0SMR。
[0011] 針對OSMR的改善脂肪肝和/或II型糖尿病的功能，OSMR可在制備用于預防、緩解 和/或治療II型糖尿病的藥物方面應用。
[0012] 一種預防、緩解和/或治療II型糖尿病的藥物，包含0SMR。
[0013] 本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果： (1)本發(fā)明發(fā)現0SMR基因的新功能，即0SMR基因具有能夠改善脂肪肝和/或II型糖尿 病疾病的作用。
[0014] (2)基于0SMR在改善脂肪肝和/或II型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預 防、緩解和/或治療脂肪肝和/或II型糖尿病的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是WT和0SMR-K0小鼠的體重、空腹血糖結果圖；A為小鼠體重結果圖，B為空 腹血糖水平統計圖（* Φ < 〇· 05 vs WT NC 組，# :p < 0· 01 vs WT NC 組，# :p < 0· 05 vs WT HFD 組，## :p < 0· 01 vs WT HFD 組）。
[0016] 圖2是WT和0SMR-K0小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結果圖；A為通過腹腔注射葡 萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積（area under the curve，AUC)比較圖（林：p < 0· 01 vs WT NC 組，# :p < 0· 05 vs WT HFD 組，## :p < 0· 01 vs WT HFD 組）。
[0017] 圖3是0SMR-K0和WT小鼠的肝臟大體外觀結果圖；A為肝臟大體結果圖，B為肝臟 重量、肝臟重量與小鼠本身體重比值統計柱狀圖（**:P<〇. 01 vs WT HFD組)。
[0018] 圖4是0SMR-K0和WT小鼠的肝臟組織脂質成分HE和油紅0染色圖。

【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0020] 實驗用動物及飼養(yǎng)： 實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6 (WT)小鼠和0SMR-K0小鼠，雄性，8周齡。 C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司；0SMR基因敲除小鼠（0SMR-K0,購自日本 RIKEN 公司，貨號：RBRC02711)。
[0021] 實驗動物飼料配方：高脂飼料（High fat diet, HFD)(購自北京華阜康生物科技 有限公司，貨號D12942):熱量百分比：蛋白質20%，碳水化合物20%，脂肪60% ;總的熱量質 量比5. 24kcal/g。低脂飼料（Normal chow,NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號 D12450B):熱量百分比：蛋白質20%，碳水化合物70%，脂肪10% ;總的熱量質量比3. 85kcal/ g°
[0022] 動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學心血管病研究所SPF級 動物房(許可證號：SYXK(鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，濕度40-70%， 小鼠自由飲水進食。
[0023] 實施例1小鼠脂肪肝、脂質成分II型糖尿病模型（diet induced obesity,DI0)獲 得 (1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和0SMR-K0小鼠，分別給與兩種特殊飼 料 D12942 高脂飼料（High fat diet，HFD)和 D12450B 低脂飼料（Normal chow，NC)飼養(yǎng)， 即WT NC組，K0 NC組，WT HFD組，K0 HFD組共4個組別。
[0024] (2)高脂飼料誘導操作流程： 采用WT和K0小鼠，建立DI0模型，進行表型相關分析，明確0SMR基因對脂肪肝、II型 糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和0SMR-K0小鼠，分別給與兩種特殊飼料 D12942高脂飼料和D12450B低脂飼料飼養(yǎng)，即WT NC組，K0 NC組，WT HFD組，K0 HFD組共 4個組別。每周均詳細記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測1次。實驗 第22周，進行腹腔注射葡萄糖實驗（IPGTT)，以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力。第24周 終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或0.C.T冰凍切片包埋劑 (Tissue Freezing Medium)包埋作為病理分析用，另一部分放入液氮中，后置于-80°C冰箱 保存。
[0025] 實施例2小鼠體重、血糖水平測定 (1)小鼠空腹體重、食量檢測，眶靜脈竇采血 1)體重檢測 ①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。
[0026] ②稱重：分別在第0周、4周、8周、12周、16周、20周、24周稱重，將一塑料小桶放 在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數據。飼料量檢測：待稱體重 操作完成后，給小鼠加飼料，并在動態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。
[0027] (2 )空腹血糖水平檢測實驗 將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始 實驗操作。
[0028] ①血糖儀準備：檢查血糖儀(美國強生公司，0NET0UCH)電池，按右側開關，將試紙 正確放入左側插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應代碼的數字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖 儀進入待測狀態(tài)。
[0029] ②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾 對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。
[0030] ③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0. l-o. 2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。
[0031] ④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示 讀數。
[0032] II型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化 結果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第8周開始體重明顯高于其NC飼料組， 給與0SMR-K0小鼠 24周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始HFD組的0SMR-K0小 鼠體重明顯高于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第24周（見圖1A);經空腹血糖檢測發(fā) 現在HFD組的小鼠從第12周、24周的空腹血糖水平明顯較相應NC對照組升高，且HFD組的 0SMR-K0小鼠空腹血糖水平也明顯高于WT小鼠空腹血糖水平(見圖1B)。表明0SMR基因敲 除后顯著促進了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝紊亂，表明0SMR在高脂誘導引起的II型糖 尿病中起到重要作用。
[0033] 實施例 3 葡萄糖耐量實驗（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT) 實驗第22周，進行腹腔注射葡萄糖實驗（IPGTT)，以評價小鼠機體對糖耐受能力。
[0034] ( 1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據10 μ L/g計算葡萄糖的注射體 積。
[0035] (2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經腹腔注射葡 萄糖液。
[0036] (3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾 巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注 射：從腹部一側進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時 針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側進入腹腔，注射完藥物后，緩 緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。
[0037] (4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并 記錄血糖數值和檢測時間。
[0038] 進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗（intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第22周，通過注射 1. Og/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和OSMR-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增 達到峰值，隨著時間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空 腹血糖水平（〇分鐘時血糖)，在2小時時恢復至空腹血糖水平，且0SMR-K0小鼠血糖水平從 0分鐘至2小時一直處于高于WT小鼠的血糖水平（圖2A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積 (area under the curve，AUC)，發(fā)現 WT 小鼠 HFD 組的 AUC 顯著高于 NC 組，OSMR-KO HFD 組 的AUC顯著大于WT HFD組的AUC (圖2B)，表明0SMR基因敲除顯著加劇糖代謝紊亂。
[0039] 實施例4肝臟大體外觀，肝臟組織脂質情況測定 (1)終末肝臟組織取材 1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。
[0040] 2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾 端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。
[0041] 3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表 面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速拍照，稱重。
[0042] 4)石蠟標本：切取部分肝臟置于10%中性福爾馬林中固定；冰凍標本：切取部分肝 臟，置于有0CT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。
[0043] (2)肝臟組織處理及病理染色相關實驗 1)肝臟脫水、透明、浸蠟 切取10%中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標記的包埋框內，在小流量流水沖 洗30分鐘以上。按照以下流程在機器上設置以下程序，①脫水：75%酒精（45分鐘）一75% 酒精（45分鐘）一85%酒精（45分鐘）一85%酒精（45分鐘）一95%酒精（45分鐘）一95%酒 精（45分鐘）一無水酒精（1小時）一無水酒精（1小時）；②透明：二甲苯（1小時）一二甲苯 (1小時）；③浸蠟（65°C):石蠟（1小時）一石蠟（1小時)。待組織沖洗完畢后，將包含組織 的包埋框裝進機器籃筐內，啟動上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋 組織，同時清洗機器備用。
[0044] 2)肝臟組織切片 使用切片機切片，切片厚度5 μ m。
[0045] 3 )肝臟組織蘇木精-伊紅（HE )染色 將肝臟組織石蠟切片放入65°C烘箱（30分鐘）一二甲苯中（5分鐘X3次）一100%酒 精（1分鐘）一90%酒精（1分鐘）一70%酒精（1分鐘）一蒸餾水洗一蘇木素（5分鐘）一自來 水洗去切片上的浮色一1%鹽酸酒精（1至3秒)一自來水洗數下一Scott促藍液(碳酸氫鈉 〇. 35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL) (1分鐘）一自來水洗數下一伊紅（1分鐘）一蒸餾水洗去 切片上的浮色一70%酒精一下一90%酒精一下一100%酒精（30秒X3次）一二甲苯（2分 鐘X3次）一在二甲苯未干時封片，拍照。
[0046] 4)肝臟組織油紅0染色 ①將冰凍肝臟組織切片在通風櫥中風干30分鐘，4%多聚甲醛固定10分鐘；置于雙蒸 水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。
[0047] ②以60%異丙醇處理1分鐘。
[0048] ③用油紅0(公司sigma，貨號00625,濃度0.5克/100mL 100%異丙醇)染色30分 鐘。
[0049] ④之后以60%異丙醇漂洗1分鐘X 3次，直至背景干凈。
[0050] ⑤用Mayer' s蘇木素染液（5滴）淡染細胞核。
[0051] ⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍，充分水洗，水洗至細胞核藍化。
[0052] ⑦用甘油明膠封片，拍照。
[0053] 肝臟大體外觀，肝臟組織脂質成分測定結果見圖3所示，通過大體取材拍照，觀察 到在HFD組的0SMR-K0小鼠的肝臟體積稍較HFD組的WT小鼠的肝臟大，且0SMR-K0小鼠肝 臟色澤泛黃，油脂較多(如圖3A)。在HFD組的0SMR-K0小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與 小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高，說明0SMR-K0小鼠脂肪肝明顯(如圖3B )。進一 步通過組織切片，進行HE和油紅0染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織的病理改變。通 過肝臟HE染色，可以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，WT小鼠和0SMR-K0小鼠肝臟組織均有較多 的脂肪沉積，可以看到肝細胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細胞形態(tài)已幾乎 完全破壞，尤其在0SMR-K0小鼠更顯著，而在NC組小鼠均肝細胞形態(tài)較為完整(如圖4上)。 通過肝臟油紅0染色來檢測肝組織中脂質，可以發(fā)現在HFD組的0SMR-K0小鼠的肝門靜脈 周圍呈大片紅色，有大量的脂質沉積，而在HFD組的WT小鼠的肝門靜脈周圍則有較少脂質 沉積，在NC飼料飼養(yǎng)的兩組小鼠脂質沉積最少，且無明顯差異(如圖4下)。
[0054] 上述結果顯示0SMR-K0小鼠在HFD的誘導下發(fā)生的II型糖尿病和脂肪肝病變顯著 加重。這些結果表明0SMR對于改善II型糖尿病和脂肪肝病變具有顯著的作用。本發(fā)明結 果說明0SMR基因在脂肪肝和/或II型糖尿病疾病模型中有著重要的保護作用。
[0055] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. OSMR在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝疾病藥物中的應用。
2. -種預防、緩解和/或治療脂肪肝疾病的藥物，其特征在于：包含0SMR。 3. 0SMR在制備預防、緩解和/或治療II型糖尿病藥物中的應用。
4. 一種預防、緩解和/或治療II型糖尿病的藥物，其特征在于：包含0SMR。
【文檔編號】A61P3/10GK104096219SQ201410322051
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權日:2014年7月8日
【發(fā)明者】李紅良, 張曉東, 汪濤, 杜成 申請人:武漢大學