工程菌及其在制備(r)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥領(lǐng)域，尤其設(shè)及工程菌及其在制備佩-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物是一類哲甲基戊二酷輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑藥物， 是目前臨床上應(yīng)用較廣泛的降血脂藥物。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA還原成3-甲基-3， 5-二哲基戊酸的反應(yīng)是膽固醇的生物合成途徑，他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶的 合成，來抑制體內(nèi)膽固醇的合成，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDkC)水平，對W膽固醇升 高為主的高血脂癥和冠屯、病有較好的療效。在結(jié)構(gòu)上，他汀類藥物通常由憎水性的剛性 平面結(jié)構(gòu)母核和具有雙手性中屯、的（3R，5S/R)-雙哲基己酸醋組成。其中，阿托伐他汀 (Atorvastatin)和瑞舒伐他?。≧osuvastatin)是全新第S代、全合成、高純化、高選擇性 的HMG-CoA還原酶抑制劑，多年來占據(jù)降血脂藥物的主要市場份額。（3R，5R) -6-氯基-3， 5-二哲基己酸叔了醋是合成阿托伐他汀的關(guān)鍵手性中間體，其可W通過已經(jīng)建立了一個 手性中屯、的（S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋脫面上氯基得到（時-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋，再通過幾基還原酶的作用得到。因此，開展對（(時-6-氯基-5-哲 基-3-幾基己酸叔了醋的合成改進，阿托伐他汀類藥物的制備方法研究均具有十分重要的 作用。
[000引 目前，報道的制備佩-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋的方法主要有；種， 兩種為化學酶法，其中之一是由美國Codexis公司開發(fā)出來，先采用兩步=酶[游離酶]全 生物催化法合成4-氯基-3-哲基了酸己醋，另外一種是膳水解酶不對稱水解4-氯基-3-哲 基了酸錠得到4-氯基-3-哲基了酸己醋，由法國的Diversa Co巧oration研發(fā)，兩者都是再 通過克萊森反應(yīng)與醋酸叔了醋縮合加長碳鏈來合成（時-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔 了醋，該過程中需要裡催化劑和無水無氧反應(yīng)，反應(yīng)條件較為苛刻，無法大面積推廣生產(chǎn)； 另一種是一步化學法，W (S) -6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋為底物，與化CN在堿性條 件下反應(yīng)生成（時-6-氯基-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋，但底物和產(chǎn)物在強堿性的反應(yīng) 條件下通常是不穩(wěn)定的。因此，與化學法相比，生物法反應(yīng)更溫和，費用相對低，過程更綠色 化，區(qū)域和立體選擇性好，更值得深入研究。
[0004]
【主權(quán)項】
1. 一種工程菌，包括宿主細胞和轉(zhuǎn)入宿主細胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因 為堿基序列如SEQ ID NO. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的工程菌在以（S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物制 備（R) -6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
3. -種（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的制備方法，其特征在于，包括： (1) 制備包含堿基序列如SEQ ID No. 3所示的鹵代醇脫鹵酶基因的工程菌； (2) 制備所述工程菌的靜息細胞懸液； (3) 將靜息細胞懸液與底物（R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、氰化物混合，反 應(yīng)制得（R)_6_氛基-5-羥基-3-幾基己酸叔丁醋。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)的溫度為18~40°C，反應(yīng)液 的pH值為7.0~9.0。
5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述靜息細胞懸液的制備方法包括：將 所述工程菌活化后，擴大培養(yǎng)至〇D_達到0. 6~1. 2,加入誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)，離心收集細 胞，用緩沖液重懸，獲得靜息細胞懸液。
6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)劑為IPTG ;誘導(dǎo)劑的濃度為 0? 1 ~0? 5mM〇
7. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為HEPES緩沖液。
8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖液在反應(yīng)液中的濃度為1~ 100mM〇
9. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述氰化物為NaCN。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種工程菌及其在制備(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用，該工程菌包括宿主細胞和轉(zhuǎn)入宿主細胞的目的基因，所述目的基因為堿基序列如SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因。本發(fā)明將SEQ ID N 0.3所示的鹵代醇脫鹵酶基因?qū)胨拗骷毎麡?gòu)建的工程菌可表達鹵代醇脫鹵酶HHDH，通過該酶的催化作用可實現(xiàn)將(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯。該反應(yīng)條件溫和，操作簡便，提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和純度。
【IPC分類】C12N1-21, C12P13-00, C12N15-60, C12R1-19
【公開號】CN104673733
【申請?zhí)枴緾N201510067574
【發(fā)明人】楊立榮, 王金玉, 陳少云, 吳堅平, 徐剛
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月10日