一種檢測(cè)肟基乙酸酯類殺菌劑的elisa方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)肟基乙酸酯類殺菌劑的人工抗原合 成及ELISA檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肟基乙酸酯類殺菌劑屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的一類，殺菌譜廣，安全高效。 雖然這類農(nóng)藥毒性低，但因用量逐年增加，仍舊存在安全風(fēng)險(xiǎn)。因此國(guó)內(nèi)外仍然對(duì)其在食品 中的殘留進(jìn)行了監(jiān)控并制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，造成我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口壁壘，影響我國(guó)的出 口經(jīng)濟(jì)形勢(shì)。
[0003] 當(dāng)前，該類殺菌劑常用的氣相、液相等儀器檢測(cè)方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢查范 圍廣，且已有較為成熟的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，但是所需儀器昂貴、樣品前處理時(shí)間較長(zhǎng)，不適于現(xiàn)場(chǎng) 監(jiān)測(cè)。
[0004] 免疫檢測(cè)方法（immunoassay, IA)也具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并且可以克 服繁雜的前處理步驟，廣泛運(yùn)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是目前食品安全快速檢測(cè)的重要方法之一，在 食品安全檢測(cè)中發(fā)揮著越來越重要的作用。
[0005] 因此有必要開發(fā)一種免疫技術(shù)用于檢測(cè)肟基乙酸酯類的甲氧基丙烯酸酯類殺菌 劑。本發(fā)明主要選取醚菌酯和肟菌酯為代表，進(jìn)行ELISA方法的建立。
[0006] 肟基乙酸酯類殺菌劑的毒殺基為甲氧亞胺基乙酸甲酯，而（E)-2-(2-溴甲基苯 基）-2-甲氧亞氨基乙酸甲酯（OEBr)是一種常見的農(nóng)藥中間體（圖1，分子量< 1000)，結(jié) 構(gòu)中包含肟基乙酸酯類殺菌劑的活性官能團(tuán)，因此將其作為半抗原合成原料之一與巰基丙 酸（圖2)合成肟基乙酸酯類殺菌劑的人工半抗原（AR)。該半抗原仍是一種小分子物質(zhì)，沒 有免疫原性，須與大分子載體（蛋白）等偶聯(lián)得到人工抗原后，才可以作為動(dòng)物免疫原料， 制備多克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明根據(jù)以合成的與肟基乙酸酯類殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的人工半抗原 (0ESCH2CH2C00H)與牛血清蛋白和卵清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，分別制得免疫原和包被原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明需要解決的第一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種肟基乙酸酯類殺菌劑的人工抗 原的合成方法及測(cè)定方法。
[0009] 1.技術(shù)方案
[0010] (1)人工半抗原合成
[0011] 在50mL三口瓶中，加入5mLlequiv的巰基丙酸乙醇溶液，然后加入2equiv的 NaOH，放在有加熱功能的磁力攪拌器中攪拌反應(yīng)，直至溶解。加入Iequiv的OEBr乙醇溶液， 加熱回流反應(yīng)I. 5h后抽濾得到透明溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。然后用5mL5% NaHCO3 溶液溶解殘留物并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用正已烷萃取2次，每次5mL，棄去有機(jī)相。然后用濃 鹽酸調(diào)水相PH至3左右，和二氯甲烷進(jìn)行液液分配，反復(fù)3次，收集有機(jī)相。有機(jī)相過無水 Na2SO4，減壓濃縮近干，得黃色油狀物。
[0012] ⑵人工抗原的合成
[0013] a.免疫原（活化酯法）：將半抗原0· Immol和NHSO. Immol用1.0 mLDMF溶解。磁 力攪拌下，向上述溶液中逐滴加入1.0 mL的0.1 mmol DCC的DMF溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)lh，4°C 冰箱中攪拌過夜。次日，離心取上清液，在攪拌狀態(tài)下，將上清液逐滴加入到6. OmL，60mg BSA的pH8. O硼酸緩沖液中，約半小時(shí)加完，室溫磁力攪拌反應(yīng)lh，4°C攪拌反應(yīng)過夜，次日 取出，溶液轉(zhuǎn)入透析袋中，懸于大燒杯中，4°C，pH7. 4的PBS緩沖液透析3天，每4h換水一 次。凍干保存。
[0014] b.包被原（混合酸酐法）：稱取150mg OVA溶于IOmL的硼酸緩沖液中，80 μ mol 的半抗原溶解在ImL的DMF中，然后在該溶液中加入等當(dāng)量的三正丁胺和氯甲酸異丁酯，室 溫反應(yīng)lh，反應(yīng)液500 μ L加入到8mL的15mg/mL的OVA硼酸緩沖液中，磁力攪拌，反應(yīng)2h。 反應(yīng)完成后，轉(zhuǎn)入透析袋，先用蒸餾水透析1次，再換PH7. 4的PBS透析，整個(gè)透析過程持續(xù) 三天，每4小時(shí)換透析液一次。凍干保存。
[0015] (3)本發(fā)明同時(shí)對(duì)所制備的人工半抗原及抗原的鑒定方法進(jìn)行了公開說明，方法 包括TNBS顯色法、紅外光譜法、紫外光譜法、SDS-PAGE，具體包括下列步驟：
[0016] 1)人工半抗原的鑒定：稱取合成的半抗原的樣品，適當(dāng)稀釋成合適的檢測(cè)濃度， 進(jìn)行TLC(圖3)、紫外（圖4)、紅外圖譜掃描（圖5)、質(zhì)譜（圖6)和核磁（圖7)。讀取半 抗原的波峰與波谷的位置并分析半抗原的官能團(tuán)的紅外吸收情況、分子量及各官能團(tuán)的原 子組成。
[0017] 2)人工免疫原和包被原的鑒定：將BSA用蒸餾水配制成濃度為0、0.6、0.7、0.8、 0. 9、1.0 mg/mL的溶液，取ImL加入到ImL pHIO的碳酸鹽緩比色。根據(jù)吸光值和蛋白質(zhì)濃度 作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。斜率即BSA單位濃度的吸光值。
[0018] 將制備的半抗原用蒸饋水配制成濃度為0、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、L Omg/mL的溶液， 其余步驟同上，作出曲線，曲線斜率即為樣品單位濃度的吸光值。
[0019] a.氣基消耗率=(0D蛋白單位濃度-OD樣品單位濃度）/0D蛋白單位濃度
[0020] b. AR與載體蛋白克分子結(jié)合比=AR氨基消耗率X每分子載體蛋白氨基個(gè)數(shù)載體 蛋白的游離氨基大部分來自賴氨酸，每分子BSA和OVA賴氨酸個(gè)數(shù)以56和20計(jì)。
[0021] 同時(shí)，將制備的抗原進(jìn)行紫外（圖4)、紅外（圖8)、SDS-PAGE (圖9)，須保證所含 的BSA的濃度在同一水平，分析結(jié)構(gòu)與分子量。
[0022] 本方法合成的目的半抗原保留了肟基乙酸酯類殺菌劑毒殺基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有利于 后續(xù)的免疫分析的特異性，合成過程簡(jiǎn)便，適合大量生產(chǎn)。
[0023] 本方法合成的目的人工免疫原和包被原符合免疫要求，操作易實(shí)現(xiàn)，可以商品化。
[0024] (4)在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的第二項(xiàng)技術(shù)問題是用制備的免疫原免疫動(dòng)物，得到針對(duì) 肟基乙酸酯類殺菌劑的多克隆抗體，對(duì)該抗體的進(jìn)行鑒定并建立以醚菌酯和肟菌酯為代表 的肟基乙酸酯類殺菌劑的ELISA檢測(cè)方法。
[0025] 制備高效價(jià)和高特異性的多克隆抗體首先要有理想的免疫原，合適的動(dòng)物及可行 的免疫方法。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于肟基乙酸酯類殺菌劑的免疫分析技術(shù)少見報(bào)道，尚無快速檢測(cè) 方法的建立。本發(fā)明建立的肟基乙酸酯類殺菌劑ELISA檢測(cè)技術(shù)，靈敏度和特異性較好，費(fèi) 用低，儀器化要求低，前處理簡(jiǎn)便，有可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
[0026] 多克隆抗體制備的具體技術(shù)方案如下：
[0027] 1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性新西蘭大白兔，體重約2. 5kg ;
[0028] 2)免疫及采血：首免前7天，耳緣靜脈取血，分離陰性血清。首次免疫，將免疫原 (2mg/mL)與等體積的FCA進(jìn)行混合，充分乳化，形成油包水的狀態(tài)，背部皮下6點(diǎn)，后腿肌 肉2點(diǎn)免疫；間隔兩周，二次免疫，免疫原（lmg/mL)與等體積的FIA制備疫苗，背部皮下6 點(diǎn)，后腿肌肉2點(diǎn)免疫；從第三次免疫開始直到第七次，免疫原（lmg/mL)與等體積的FIA制 備疫苗，背部皮下6點(diǎn)，后腿肌肉2點(diǎn)免疫，以兩周為間隔期，進(jìn)行耳緣采血，分離血清，測(cè)效 價(jià)；末免，此時(shí)效價(jià)達(dá)到一定水平（3. 2 X IO4~6. 4X IO4)，將佐劑用生理鹽水替代，耳緣靜 脈注射,一周后,動(dòng)脈取血,分離血清。
[0029] 酶聯(lián)免疫檢測(cè)效價(jià)的具體步驟為：
[0030] 1)包被原包板：將Hapten-OVA用包被液稀釋至適當(dāng)濃度，每孔100 μ L加入96孔 酶標(biāo)板，蓋上保鮮膜，37°C孵育2h ;
[0031] 2)清洗酶標(biāo)板：迅速倒去孔中液體，用PBST洗滌2遍，每次洗3min ;
[0032] 3)封閉：每孔加入200 μ L封閉液，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱封閉2h ;接著用PBST洗 滌3遍后拍干；
[0033] 4)加入抗血清：按I : IO3~1 : 128 X IO3梯度稀釋抗血清，加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中， 每樣至少重復(fù)一次，每孔加100 μ L，37°C孵育半小時(shí)，倒空，洗滌3遍，每遍3分鐘，拍干。
[0034] 5)加二抗：將HRP酶標(biāo)山羊抗兔IgG稀釋1000倍，每孔加50 μ L37°C，30-60min， 倒凈，洗板3次，每次3分鐘，拍干；
[0035] 6)加入TMB顯色劑顯色：每孔100 μ L，置37°C避光放置10_15min。
[0036] 7)終止反應(yīng)：每孔加入100 μ L終止液結(jié)束反應(yīng)，應(yīng)在20min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。
[0037] 8)酶標(biāo)儀檢測(cè)：TMB反應(yīng)后酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀取OD45。。設(shè)空白及陰性對(duì)照，分別 為PBS溶液和免疫前采集的陰性兔血清。
[0038] (5)本發(fā)明的第三項(xiàng)技術(shù)問題是建立一種所述的肟基乙酸酯類殺