一種3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種3?氫化松苓酸氰乙酯類藥物及其應(yīng)用。該類藥物中含有以下結(jié)構(gòu)式的化合物：還包括藥學(xué)上可接受的鹽，3-氫化松苓酸氰乙酯及其衍生物藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的輔料或載體。3-氫化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR雙重抑制劑，本發(fā)明還涉及3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在促進(jìn)細(xì)胞自噬中的用途；以及在制備治療胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌等腫瘤、阿爾茨海默氏病等神經(jīng)退行性病變、糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物為臨床提供了一種新的用藥選擇。
【專利說(shuō)明】
一種3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物及其應(yīng)用，其作為PI3K/mT0R雙重抑制劑 對(duì)促進(jìn)細(xì)胞自噬能夠產(chǎn)生藥理作用，可將3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物用于制備治療胃癌等 癌癥、阿爾茨海默氏病類神經(jīng)退性行病變或糖尿病的藥物上。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-氫化松苓酸氰乙酯是以三氫化松苓酸B的原料進(jìn)行合成的酯類化合物，現(xiàn)有技 術(shù)的缺陷是三氫化松苓酸B的純化以及3-氫化松苓酸氰乙酯的分離純化工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的提供一種3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物及其應(yīng)用。
[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種3-氫化松苓酸氰乙酯類 藥物，該類藥物中含有以下結(jié)構(gòu)式的化合物：
[0006] 該類藥物還包括藥學(xué)上可接受的鹽，3-氫化松苓酸氰乙酯及其衍生物藥學(xué)上可接 受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
[0007] 其中，3-氫化松苓酸氰乙酯的合成方法為：
[0008] 1)在反應(yīng)瓶中加入等摩爾的3-氫化松苓酸B、溴乙腈、碳酸鉀，并加入適量乙腈作 為溶劑，在85 °C攪拌反應(yīng)2h，TCL檢測(cè)反應(yīng)完成后，旋干溶劑，加入水和乙酸乙酯，分離萃取 三次，回收乙酸乙酯，得固體物；
[0009] 2)將固體物固法上樣，200-300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚：乙酸乙酯=15: 1(體積比）為流動(dòng)相，得白色固體粉末為3-氫化松苓酸氰乙酯。其反應(yīng)式如下。
[0011] 本發(fā)明還涉及所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在促進(jìn)細(xì)胞自噬中的用途。
[0012] 本發(fā)明還涉及所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在促進(jìn)細(xì)胞自噬中的用途，其特 征在于:3-氫化松苓酸氰乙酯是PI3K/mT0R雙重抑制劑。
[0013]本發(fā)明還涉及所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療胃癌、肝癌、肺癌、前 列腺癌、鼻咽癌等腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還涉及所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療神經(jīng)退行性病變藥 物方面的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還涉及所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療阿爾茨海默氏病藥 物方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還涉及所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療糖尿病藥物方面的 應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為3-氫化松苓酸氰乙酯結(jié)構(gòu)鑒定氫譜圖。
[0018] 圖2為3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27的細(xì)胞凋亡的影響(n = 3，i± )，其中A:對(duì)照 組;B: 3-氫化松苓酸氰乙酯（1 ΟμΜ); C: 3-氫化松苓酸氰乙酯(20μΜ);D: 3-氫化松苓酸氰乙酯 (40μΜ)〇
[0019]圖3為透射電鏡檢測(cè)3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞自噬的影響，其中a:對(duì)照 組（X6000)，b/c:自噬泡（X6000)，d:自噬體亞顯微結(jié)構(gòu)（X 15000)。
[0020] 圖4為3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27的細(xì)胞自噬比例的影響(n = 3，[±j)，其中A: 對(duì)照組;B: 3-氫化松苓酸氰乙酯（ΙΟμΜ); C: 3-氫化松苓酸氰乙酯(20μΜ); D: 3-氫化松苓酸氰 乙酯（40μΜ)。
[0021] 圖5為3-氫化松苓酸氰乙酯和mTOR的分子對(duì)接結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖1-5、實(shí)施例及表格，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用 于說(shuō)明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要 求書(shū)所限定的范圍。
[0023] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0024] 1、實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞株HGC-27，人肝癌細(xì)胞株HepG2，人肺癌細(xì)胞株 A549，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2，人結(jié)腸 癌細(xì)胞株HT-29，正常胃粘膜細(xì)胞株GES-1，神經(jīng)細(xì)胞母細(xì)胞瘤SH-SY5Y，購(gòu)買于武漢大學(xué)中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室傳代保存細(xì)胞株。
[0025] 使用siRNA基因沉默方式產(chǎn)生人HT-29細(xì)胞株P(guān)TEN缺失型，該細(xì)胞通過(guò)實(shí)驗(yàn)室傳代 保存細(xì)胞株。
[0026] 2、實(shí)驗(yàn)所用試劑及儀器
[0027] 1)主要的實(shí)驗(yàn)試劑為:RPMI-1640培養(yǎng)基粉劑，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基粉 劑，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；無(wú)支原體新生胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品；3-(4,5)_二甲基噻唑-2-2，5_二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素， 華北制藥公司產(chǎn)品；HEPES，美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶，美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；二甲 基亞砜(DMS0)，美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒，凱基生物技術(shù)股份有限公 司產(chǎn)品;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;A0,凱 基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；十二烷基 磺酸鈉(SDS)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；（5 X ) SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，碧云天生物技術(shù)研究 所產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠迅速制膠試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；BCA法蛋白定量試劑 盒(加強(qiáng)型），碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；PVDF膜，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;ECL化學(xué)發(fā) 光檢測(cè)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;Western所用定影液及顯影液，武漢谷歌生物 科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞總蛋白提取總試劑，武漢谷歌生物科技有限公司產(chǎn)品；Twee-20,武 漢谷歌生物科技有限公司產(chǎn)品；p-PI3K-kinase p85arabbit抗體（Tyr508，sc-12929)， Santa Cruz公司產(chǎn)品；p21rabbit抗體（C-19，sc-397)，Santa Cruz公司產(chǎn)品；p-P70S6K rabbit抗體(Thr389)，美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品；Beclin-lrabbit抗體(D40C5)，美國(guó) Cell Signaling公司產(chǎn)品；Cyclin Dlrabbit抗體（92G2)，美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品； LC3A/B rabbit抗體（D3U4C)，美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品；p-mTOR rabbit抗體 (Ser4228)，美國(guó)Cell Signaling公司產(chǎn)品;β-Action-抗抗體，武漢博士得生物公司產(chǎn)品； 考馬斯亮藍(lán):南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，北京中杉金橋 公司產(chǎn)品；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG，北京中杉金橋公司產(chǎn)品；膠片，柯達(dá)公司產(chǎn)品；脫脂 奶粉，伊利集團(tuán)產(chǎn)品；四氧嘧啶，Sigma公司產(chǎn)品;鹽酸二甲雙胍，北京京豐制藥有限公司產(chǎn) 品；其他試劑均為市面所售的分析純級(jí)別。健康雄性SD大鼠和昆明小鼠，購(gòu)于三峽大學(xué)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)中心。
[0028] 2)主要的實(shí)驗(yàn)儀器為:96孔板和6孔板，購(gòu)于美國(guó)Corning公司；立式壓力蒸汽滅菌 鍋，購(gòu)于日本HIRAYAMA公司；超純水儀，購(gòu)于艾科浦科技公司；Olympus KX41型倒置顯微鏡， 購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；3111C02培養(yǎng)箱，購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司；電泳儀，購(gòu)于北京 市六一生物儀器公司；Stat Fax-2100型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購(gòu)于美國(guó)Awareness公司;超凈工 作臺(tái)，購(gòu)于蘇州凈化設(shè)備廠；電子天平，購(gòu)于上海民橋精密儀器有限公司；541f5D微型臺(tái)式高 速離心機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Eppendof公司；微量移液器，購(gòu)于德國(guó)Eppendof公司；-80°C的超低溫冰 箱，購(gòu)于青島海爾特種電器有限公司；脫色搖床STS-1型，購(gòu)于海門市其林貝爾儀器制造有 限公司;EPICS XL-4型流式細(xì)胞系統(tǒng)，購(gòu)于英國(guó)Beckman Coulte公司;H-7500透射電子顯微 鏡，購(gòu)于日本日立公司；ULTRACUTR超薄切片機(jī)，購(gòu)于德國(guó)奧地利萊卡公司；升恒溫顯影盒， 購(gòu)于福建三明市芝山照相器材公司；DB-3不銹鋼電熱板，購(gòu)于金壇市富華儀器有限公司；電 熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)于武漢精華科教儀器有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī) 療器械公司。
[0029] 3、所用試劑的配制：
[0030] 1)細(xì)胞所用普通試劑配制
[0031] RPMI-1640培養(yǎng)基:取購(gòu)買的1640粉末包裝一包，加入白色粉末HEPES 2g和分析純 的NaHC〇3 2g，用800mL高壓滅菌后的三蒸水溶解混勾，然后加入已配制好的5mL的100U/mL 青霉素和鏈霉素，輕輕搖勻，等到徹底溶解之后，再定容到l〇〇〇mL，使用0.22μπι的微孔濾膜， 進(jìn)行真空過(guò)濾除菌，然后分裝放在4°C冰箱保存，使用時(shí)再加入10%的新生胎牛血清。
[0032] DMEM培養(yǎng)基：取購(gòu)買的DMEM粉末包裝一包，加入白色粉末HETOS 2g和分析純的 NaHC03 1.7g，然后其配制分裝方法與RPMI-1640培養(yǎng)基配制操作步驟相同。
[0033] 磷酸緩沖溶液（PBS):使用電子天平準(zhǔn)確稱取NaCl 4.00g，KH2P〇4 0. 10g， Na2HP〇4l.45g，KCl 0.10g，然后用儲(chǔ)備的雙蒸水450mL進(jìn)行溶解，之后使用雙蒸水定容到 500ml，放入高壓滅菌鍋中，在121°C的高溫下滅菌30min，等到降溫冷卻之后，再放入4°C冰 箱保存使用。
[0034] 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液：電子天平準(zhǔn)確的稱取 0.25g的MTT粉劑，加入到50mL的roS中，充分溶解，直至液體呈清澈的黃色，無(wú)沉淀出現(xiàn)。使 用0.22μπι的微孔濾膜，進(jìn)行真空過(guò)濾除菌，分裝好后放入4°C冰箱避光保存。
[0035] 胰酶溶液(0.25 % ):先使用干凈的稱量紙稱取胰酶1.00g，加入已經(jīng)配制好的PBS 中溶解，定容到400mL，使用0.22μπι的濾膜，進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后分裝，放在-20°C保存。
[0036]檸檬酸鉛溶液:精確稱取0.133g的硝酸鉛，0.176g的二水檸檬酸鈉，加入到3mL的 雙蒸水中，用力振蕩混勻，直至生成乳白色的檸檬酸鉛懸濁液，再加入1N的氫氧化鈉0.8mL， 使溶液立刻透明，若不透明，應(yīng)重新配制，最后定容到5mL。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，應(yīng)盡量減少與 空氣的接觸。
[0037] A0溶液:準(zhǔn)確稱取0.5mg的A0粉末，在避光環(huán)境下加入500yL的roS溶解完全，配制 成初始濃度為lmg/mL的A0儲(chǔ)備液，錫箱紙包好于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0038] 2)Western blotting所用試劑配制
[0039] 30%的丙烯酰胺：使用干凈的稱量紙稱取29g的丙烯酰胺和lg的甲-雙叉丙烯酰 胺。加入75mL的雙蒸水混合，放在37 °C的水浴鍋中加熱溶解，再定容到100mL，使用0.22μπι孔 徑的濾膜過(guò)濾，放在棕色試劑瓶中冷藏避光保存。
[0040] 1.Omol/LTris-HCl(ρΗ6.8):稱取 12.1 lg的Tris溶解在大約45mL的雙蒸水中，用 45mL的lmol/LHCl調(diào)節(jié)pH到6.8，然后加雙蒸水稀釋定容到到10〇111匕進(jìn)行過(guò)濾以后放在41€ 冰箱里保存。
[0041 ] 1.5mol/LTris-HCl (pH8.8):稱取 18.15g的Tris溶解于大約45mL的雙蒸水中，用 45mL的lmol/L HC1調(diào)pH至8.8，加雙蒸水稀釋定容到100mL。進(jìn)行過(guò)濾以后放在4°C冰箱里保 存。注意的是，這兩種緩沖液都必須使用Tris堿來(lái)制備，再用HC1調(diào)節(jié)相應(yīng)的pH值。
[0042] 10%過(guò)硫酸銨以？）：電子天平稱取0.258的過(guò)硫酸銨溶在2.51^的雙蒸水中，每500 yL分裝一管，然后放在-20°c冷凍保存。
[0043] 10%十二烷基磺酸鈉（SDS):在90mL的雙蒸水中加入10g電泳型的SDS，然后在37°C 水浴鍋加熱溶解，再加入雙蒸水定容到100mL，分裝后放在室溫保存。
[0044] 5 X Tris-甘氨酸電泳緩沖液:稱取7.55g的Tris base和47g的甘氨酸，加雙蒸水 400mL徹底溶解好后，再加入25mL的10%SDS，最后將溶液定容到500mL。
[0045] 5 X TBS(pH8 · 0):稱取3 · 025g的tris base和21 · 925g的NaCl溶解在400mL的雙蒸水 中，待充分溶解之后，再用HC1調(diào)pH到8.0，最后定容到500mL。
[0046] 轉(zhuǎn)膜緩沖液:準(zhǔn)確稱取甘氨酸14.4g，tris 2.42g，加入700mL的雙蒸水徹底溶解， 然后緩慢加入無(wú)水甲醇200mL，混勻后再加雙蒸水定容到1000mL，封口保存，防止無(wú)水甲醇 揮發(fā)。
[0047] TBST:向配制的TBS溶液中加入0 · 05 %的Tween-20。
[0048]封閉液:使用TBST溶液配制5 %的脫脂奶粉，混合均勻。
[0049]考莫斯亮藍(lán)染色液:45mL的甲醇，45mL的雙蒸水，10mL的冰醋酸，混合均勻后，加入 〇. 25g的考馬斯克亮藍(lán)，充分溶解，放在棕色試劑瓶中保存。
[0050] 12 % 分離膠：雙蒸水 1 · 9mL，30 % 的丙烯酰胺3 · 5mL，3 · 42mL的 1 · 5M Tr i S-HC1， 0 · 09mL 的 10 % SDS，0 · 09mL 的 10 % AP，3 · 6yL 的 TEMED，總體積 9mL。
[0051 ] 10 % 分離膠：雙蒸水2 · 33mL，30 % 的丙烯酰胺3 · 07mL，3 · 42mL的 1 · 5M Tris-HCl， 0 · 09mL 的 10 % SDS，0 · 09mL 的 10 % AP，3 · 6yL 的 TEMED，總體積 9mL。
[0052] 6 % 分離膠：雙蒸水3 · 5mL，30 % 的丙烯酰胺 1 · 9mL，3 · 42mL的 1 · 5M Tr is-HCl， 0 · 09mL 的 10 % SDS，0 · 09mL 的 10 % AP，7 · 2μ1 的 TEMED，總體積 9mL。
[0053] 濃縮膠：雙蒸水4 · lmL，30 % 丙烯酰胺lmL，0 · 75mL的 1 · 0M Tris-HCl，60yL的 10 % SDS，60yL的 10 % AP，6yL的 TEMED，總體積 6mL。
[0054] 0.02%疊氮鈉:配制疊氮鈉需佩戴手套和口罩，稱取疊氮鈉溶于PBS溶液中，然后 放在4 °C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0055] 實(shí)施例1:
[0056] 3-氫化松苓酸氰乙酯，其系統(tǒng)命名為：（2R)-2-( (3S，10S，13R，14R，17R)-3-羥基- 4,4，10，13，14-五甲基-2,3,4,5,6,7，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1!1-環(huán)戊[&]菲- 17-基)-6-甲基庚-5-烯酸氰甲酯;其結(jié)構(gòu)式為：
[0058] 3-氫化松苓酸氰乙酯的合成方法為：
[0059] 1)在反應(yīng)瓶中加入等摩爾的3-氫化松苓酸B、溴乙腈、碳酸鉀，并加入適量乙腈作 為溶劑，在85 °C攪拌反應(yīng)2h，TCL檢測(cè)反應(yīng)完成后，旋干溶劑，加入水和乙酸乙酯，分離萃取 三次，回收乙酸乙酯，得固體物；
[0060] 2)將固體物固法上樣，200-300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚：乙酸乙酯=15: 1 (體積比）為流動(dòng)相，得白色固體粉末為3-氫化松苓酸氰乙酯。
[0061] 得到的3-氫化松苓酸氰乙酯結(jié)構(gòu)鑒定氫譜見(jiàn)圖1。
[0062] 1H-匪R(400MHz，CDC13)S:0.72(3H，s)，0.81(3H，s)，0.88(3H，s)，0.96(3H，s)， 1.02(3H，s)，1.06-1，38(6H，m)，l.58(3H，s)，l.68(3H，s),1.53~1.88(8H，m)1.9卜2.09 (9H，m)，2.38 (lH，m)，3.23(lH，dd，J = 4Hz，8Hz),4.71 (2H，m)，5.04(lH，m)。該化合物經(jīng)核 磁共振儀測(cè)試，在氫譜（1H-匪R)高場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)S0.72(3H，s)，0.81(3H，s)，0.88(3H，s)，0.96 (3H，s)，1.02(3H，s), 1.06-1，38(6H，m)，l .58(3H，s)，l .68(3H，s)的甲基質(zhì)子信號(hào)峰，分別 為3-氫化松苓酸氰乙酯中的七個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)。在高場(chǎng)區(qū)δ?.5~2.2出現(xiàn)一系列的質(zhì)子信 號(hào)，推測(cè)為母核三氫化松苓酸Β的質(zhì)子信號(hào)?；瘜W(xué)位移在δ2.38(1Η，π〇的質(zhì)子信號(hào)，推測(cè)為雙 鍵的質(zhì)子信號(hào)?；瘜W(xué)位移在4.71(2H，m)的質(zhì)子信號(hào)，推測(cè)為連接氰基的亞甲基的質(zhì)子信號(hào) 峰?；瘜W(xué)位移在S5.〇4(lH，m)的質(zhì)子信號(hào)，推測(cè)3-氫化松苓酸氰乙酯中羥基的特征質(zhì)子信號(hào) 峰。由核磁氫譜數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，氰乙基與三氫化松苓酸B的羧基以酯鍵的型式結(jié)合成3-氫化 松苓酸氰乙酯。
[0063] 3-氫化松苓酸氰乙酯儲(chǔ)備液的配制：使用稱量紙準(zhǔn)確稱取3-氫化松苓酸氰乙酯 1.5mg，用移液槍準(zhǔn)確加入DMSO漩渦震蕩30s，最終制成lOmM的3-氫化松苓酸氰乙酯初始濃 度。使用時(shí)，再用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋即可。
[0064] 實(shí)施例2:
[0065] 一、在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，將所得到的3-氫化松苓酸氰乙酯進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)，具體 方法如下：
[0066] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0067]人胃癌細(xì)胞株HGC-27，人肝癌細(xì)胞株HepG2，人肺癌細(xì)胞株A549，人乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231，人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2，分別用含有10 %胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，神經(jīng)細(xì)胞母細(xì)胞瘤SH-SY5Y，人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株，分別用含有 10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放在37 °C且5 % C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行開(kāi)放式單層 細(xì)胞培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為80%左右時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先棄去舊培養(yǎng) 液，然后用5mL的PBS洗兩遍，加入0.25 %的胰蛋白酶，放在37°C、5 %C02培養(yǎng)箱中孵育卜5分 鐘，在顯微鏡下看到細(xì)胞變圓時(shí)，用含血清培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，終止消化，然后將細(xì)胞懸液移 到對(duì)應(yīng)的離心管中，1300r/min下離心5分鐘，在無(wú)菌操作臺(tái)中棄去上清，用2mL含血清的培 養(yǎng)基均勻吹打離心管中的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，取1/3細(xì)胞于新培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)足培養(yǎng)基 至5mL，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0068] 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)
[0069]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，接種1 X 105-5 X 105個(gè)細(xì)胞至有培養(yǎng)基的24孔板中培 養(yǎng)孔，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30-50%。注：1)不同細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同，接種細(xì)胞的數(shù) 量，細(xì)胞密度需要依據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?2)每孔接種的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)盡量 相同，使細(xì)胞均勻分布。將siRNA進(jìn)行稀釋后，加入到培養(yǎng)基中，輕輕混勻，保證轉(zhuǎn)染濃度為 50nM。將培養(yǎng)板置于37°C的C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-96h。轉(zhuǎn)染完成后24-72小時(shí)均可進(jìn)行siRNA 沉默效果檢測(cè)?？捎肳estern-blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白的水平，反應(yīng)siRNA沉默效果。
[0070] 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株P(guān)TEN缺失型和PTEN野生型，分別用含有10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放在37攝氏度且5 %⑶2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其消化、重懸、傳 代步驟與其他人胃癌細(xì)胞株HGC-27，人肝癌細(xì)胞株Η印G2等細(xì)胞株的培養(yǎng)方法相同。
[0071] 3、流式細(xì)胞儀測(cè)定3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)細(xì)胞周期的變化
[0072] 因細(xì)胞周期的檢測(cè)對(duì)測(cè)定細(xì)胞的密度要求較高，密度過(guò)低時(shí)，流式細(xì)胞儀無(wú)法做 出檢測(cè)。因此，實(shí)驗(yàn)中需要使用50mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞，等到細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)覆 蓋程度達(dá)到80%以上，開(kāi)始加入3-氫化松苓酸氰乙酯處理胃癌細(xì)胞，設(shè)置濃度梯度為10、 20、40μΜ，并且設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組，要注意細(xì)胞對(duì)照組的密度應(yīng)控制在60 %左右，防止細(xì)胞在 培養(yǎng)后處理時(shí)出現(xiàn)老化現(xiàn)象，影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果。然后將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞放入5%C02,37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。時(shí)間終止時(shí)，使用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，并收集細(xì)胞于離 心管中用2000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，然后用roS輕輕吹散細(xì)胞，盡量減少細(xì)胞受到的機(jī)械 損傷。在相同轉(zhuǎn)速下離心，如此反復(fù)洗滌2次，調(diào)整每組細(xì)胞濃度在1 X 106個(gè)/mL為宜，加入 體積分?jǐn)?shù)為70 %的冷乙醇500yL進(jìn)行固定，過(guò)夜。然后2000轉(zhuǎn)下離心棄去固定液，加入試劑 盒中的RNaseA 100yL，移液槍混勻細(xì)胞，并在37 °C的水浴鍋中水浴30min，最后加入400yL的 PI均勻染色，放在4°C冰箱且在避光條件下反應(yīng)30min，即可使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)， 記錄激發(fā)波長(zhǎng)在488nm處的紅色焚光。
[0073] 4、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率
[0074] 細(xì)胞凋亡檢測(cè)前的細(xì)胞處理方法和加藥方式與細(xì)胞周期檢測(cè)中的相同。同樣要注 意細(xì)胞在加藥前的密度，防止對(duì)照組細(xì)胞處理時(shí)已經(jīng)發(fā)生老化現(xiàn)象。不同的步驟在于胰酶 消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞在2000r下離心5min，PBS洗滌2次后，必須調(diào)整每組的細(xì)胞濃度在1-5 X105個(gè)/mL范圍內(nèi)。然后用500yL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5yL混 勻后，接著加入5yL的Propidium Iodide(PI)混勻，PI本身就是一種核酸染液，它的作用在 于能使凋亡晚期和壞死的細(xì)胞均透過(guò)細(xì)胞膜而染上色，然而完整的細(xì)胞是不能著色的。然 后將處理好的樣品放置在室溫下，避光條件反應(yīng)5至15min，l小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī) 檢測(cè)，其結(jié)果均為有效數(shù)據(jù)。
[0075] 5、藥物作用細(xì)胞后的自噬檢測(cè)
[0076]流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞自噬比例
[0077] A0是實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中的熒光染料，能夠在發(fā)生自噬的細(xì)胞中，將自噬小體進(jìn)行染色。因 此，利用流式細(xì)胞儀就可定量檢測(cè)細(xì)胞發(fā)生自噬的比例。在大培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞直 至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期，加入不同濃度的3-氫化松苓酸氰乙酯并設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組，藥物處理細(xì) 胞24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，然后將初始濃度的A0(lmg/mL)用PBS溶液稀釋成0. lmg/ L的濃度后，加入10uL的A0溶液于各組細(xì)胞中（對(duì)照組除外），在常溫下避光反應(yīng)10-15min以 后，立刻用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)驗(yàn)過(guò)程重復(fù)3次。
[0078]透射電子顯微鏡觀察藥物作用后的細(xì)胞形態(tài)
[0079]在50mL的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%以上且生長(zhǎng)狀態(tài)良好 時(shí)，加入濃度為20μΜ的3-氫化松苓酸氰乙酯，在5 % C02，37 °C的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并 設(shè)置空白對(duì)照組。藥物作用24h后，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞，輕輕用移液槍將細(xì)胞吹打下 來(lái)，切勿對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，用800的轉(zhuǎn)速離心10min收集細(xì)胞。使用冷的PBS洗滌細(xì)胞2次 后，將離心的細(xì)胞用500yL的2.5%戊二醛一 1 %鋨酸固定細(xì)胞過(guò)夜，注意不可將細(xì)胞吹散， 要緩緩加入。過(guò)夜之后將細(xì)胞團(tuán)取出，用刀片切成芝麻大小進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首先用雙蒸水洗 滌切好的細(xì)胞團(tuán)2次，每次10_15min;再依次用50%、70%、80%、90%乙醇和無(wú)水乙醇各脫 水15min;最后使用100 %的丙酮進(jìn)行兩次脫水，而且保證每次lOmin。完成之后使用包埋劑 與丙酮1:1混合液浸透包埋樣本，將包埋樣本放置37°C烘箱24h，再放入隔水式電熱恒溫箱 48h，然后對(duì)包埋好的樣本進(jìn)行修片，并制備超薄切(注意，所切超薄切片需能著上色才可）， 之后再用檸檬酸鉛染液染色l〇_15min，即可用電鏡觀察超薄切片，并做好底片的序號(hào)記錄， 等待洗底片，掃描細(xì)胞結(jié)果圖。
[0080] 6、分子對(duì)接計(jì)算3-氫化松苓酸氰乙酯與mTOR的結(jié)合能力
[0081]分子對(duì)接是基于幾何互補(bǔ)、電性互補(bǔ)為原則，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助作用，模擬藥物 和受體的分子或靶點(diǎn)的相互作用。本分子對(duì)接是從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中選取mTOR晶體結(jié)構(gòu)A鏈 (4JT5_A )，去結(jié)晶水，加極性氫、電荷。以其中配體P2X為中心，建立18 AX18 A X 181的對(duì) 接盒子。配體分子建立在pH 7.4下的離子化狀態(tài)并做能量最小化處理。采用Glide SP方法 進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算3-氫化松苳酸氰乙酯與mTOR的結(jié)合能力。以Gscore的分值表示藥物與 受體或靶點(diǎn)的結(jié)合能力強(qiáng)弱，Gscore的值越負(fù)，表示兩者的結(jié)合能力越強(qiáng)，相互作用越強(qiáng)， 反之，則越弱。
[0082] 7、Western blotting檢測(cè)3-氫化松苳酸氰乙酯對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
[0083] 收集蛋白樣品
[0084] 將HGC-27細(xì)胞接種在75cm2的大細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，等到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好且細(xì)胞密 度高時(shí)，加入3-氫化松苓酸氰乙酯低、中、高劑量的藥物濃度處理細(xì)胞，24h后分別收集各組 細(xì)胞，每組細(xì)胞使用5mL的PBS洗滌，共2次，棄去洗滌液PBS后，每組加入100yL的細(xì)胞裂解液 (50mmol/L Tris-Hcl pH8·0、5mmol/LEDTA、1 % triton X-100、150mmol/LNaCl、lmmol PMSF)和lyL的磷酸酶抑制劑(防止磷酸化蛋白去磷酸化）?；靹蚝笤谥苽浔戏磸?fù)的凍融裂 解3次，每次15分鐘。12000的轉(zhuǎn)速離心10-15min，取其上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒做 出蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，再一一計(jì)算各樣品的總蛋白含量。最后將各組蛋白進(jìn)行計(jì)算，定量到同 一濃度，定量好的蛋白加入2 X蛋白上樣緩沖液，在沸水中煮沸5-7min，分裝到小型EP管中， 放入-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0085] 配膠
[0086] 首先將實(shí)驗(yàn)所用玻璃板用潔凈的紗布擦洗，并用雙蒸水沖洗2遍，晾干以后備用。 按照儀器的安裝說(shuō)明，將玻璃板安裝好，用雙蒸水進(jìn)行檢漏至無(wú)水漏出即可。按照電泳所需 蛋白分子量的大小，選擇適宜的凝膠濃度。按照試劑配方，配好分離膠置于干凈的燒杯中攪 拌均勻，然后用移液槍將液體緩緩灌入兩玻璃板之間，（注意不能灌入氣泡，若出現(xiàn)氣泡，則 用廢棄的進(jìn)樣針迅速趕出氣泡），分離膠灌入4mL后停止灌樣，立即用雙蒸水封膠。需緩緩加 水，直至與玻璃板的上側(cè)水平，切勿加水過(guò)急，使分離膠溢出。將分離膠放置在37 °C的烘箱 中，水平靜置30_45min。觀察膠與水的交界面是否出現(xiàn)一條折光線，有則表示分離膠已凝固 好，可倒掉封閉的水，再用濾紙吸干多余的水，最后灌入已配好且混勻的濃縮膠，插上梳子， 室溫下凝固lh后即可使用。
[0087] 上樣
[0088]濃縮膠凝固好后，可輕輕的拔出梳子，正確的將凝膠放入電泳槽中，倒入電泳緩沖 液，注意電泳液應(yīng)外側(cè)倒入2/3的體積，內(nèi)側(cè)應(yīng)倒?jié)M。等待30min后再上樣，時(shí)間放置越長(zhǎng)越 有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^察到的膠凝固時(shí)，其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)還沒(méi)有形成好。上樣前將 各蛋白樣品放置在室溫溶解，置于振蕩器上混合均勻或再次沸水水浴5min，然后使用微量 進(jìn)樣針等體積上樣到中間泳道，剩余的泳道則用相同體積的1 X Loading buffer進(jìn)行填充。 Marker泳道需在Marker上樣量的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充1 XLoading buffer至相同的體積。
[0089] 電泳
[0090]上樣結(jié)束后，按照接線規(guī)則連好電源的正負(fù)極，先設(shè)置濃縮電壓80v，等條帶電泳 到濃縮膠和分離膠的分界面時(shí)，將電壓調(diào)到120v進(jìn)行條帶分離，接著電泳lh左右，以Marker 為參照，電泳至所有的條帶均勻分開(kāi)后，即可停止電泳。若所需目標(biāo)蛋白分子量為小分子 量，則應(yīng)先用60v電壓電泳，再換至120v的電壓，若所需蛋白為大分子量蛋白，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 時(shí)，應(yīng)隔段時(shí)間更換冰塊，防止電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離膠溫度升高，出現(xiàn)融化現(xiàn)象。
[0091] 轉(zhuǎn)膜
[0092] 電泳結(jié)束后，將卸下的膠塊正面朝上，以Marker作為標(biāo)記切取所需的凝膠條帶，并 且事先按照所需凝膠大小對(duì)應(yīng)尺寸，剪取同樣大小的PVDF膜一張和濾紙兩張備用。凝膠條 帶放入新配制的轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，PVDF膜則依次在無(wú)水甲醇、雙蒸水、轉(zhuǎn)膜緩沖液中分別 浸泡10s、5min、10min，濾紙則在雙蒸水、轉(zhuǎn)膜緩沖液中分別浸泡5、10min。然后按照順序先 將凝膠條帶放在黑板上，再放濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙，凝膠蓋板白板。裝入電泳槽中，黑板 放電源負(fù)極，白板放電源正極，倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液。將電泳槽放入準(zhǔn)備好的冰水浴中，電泳儀 調(diào)至穩(wěn)定電流為200mA，電泳時(shí)間在30-90min為宜（大分子蛋白除外），使Marker條帶能夠完 全轉(zhuǎn)移到纖維素膜上，則轉(zhuǎn)膜完成，停止電泳?？蓪⒛z條帶置于考馬斯亮藍(lán)染液中，染色 lh后，洗滌條帶，觀察轉(zhuǎn)膜是否完全。
[0093] 封閉
[0094] 轉(zhuǎn)膜完成后，用鑷子輕輕夾取PVDF膜有Marker標(biāo)記的一端，先用TBST洗滌3次，每 次5min，然后將膜放在TBST配好的5%的脫脂牛奶中，搖床上低速搖勻孵育2-2.5h。
[0095]孵育一抗
[0096] 封閉結(jié)束后，先用TBST漂洗纖維素膜3次XIOmin，然后置于TBST稀釋好的一抗孵 育瓶中，在4°C冰箱中緩慢搖勻到過(guò)夜，第二天再取出放在室溫下?lián)u床輕搖lh。
[0097]孵育二抗
[0098] 一抗孵育完成后，鑷子輕輕夾取PVDF膜有Marker標(biāo)記的一端，用TBST洗滌3次，每 次5-10min，然后將PVDF膜放在TBST稀釋好的二抗溶液中，室溫輕搖1小時(shí)，計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)。
[0099] 洗滌
[0100]二抗孵育完畢后，接著用TBST洗滌纖維素膜，洗滌三次，每次lOmin。
[0101] 暗室曝光
[0102] 準(zhǔn)備好暗室曝光前所用的試劑盒儀器，先用鑷子將孵育完成的PVDF膜輕輕取出， 用慮紙將膜上多余的水吸干。PVDF膜平放置在暗匣中，滴加已經(jīng)配好的發(fā)光液(A液和B液按 1:1混合），并將多余的發(fā)光液用濾紙吸走。在暗室條件下等待PVDF膜出現(xiàn)綠色熒光，等待所 有熒光出現(xiàn)完為止。將PVDF膜蓋上準(zhǔn)備好的極薄的透明塑料膜，剪出大小相當(dāng)?shù)目逻_(dá)膠 片，蓋在膜上，立刻關(guān)閉暗匣，若熒光弱則多等待幾分鐘，若熒光強(qiáng)，則至多等待lmin。適應(yīng) 的時(shí)間適度曝光及其重要，曝光結(jié)束后，將膠片放在顯影液中顯影l(fā)_4min，再放入清水中來(lái) 回漂洗，最后放在定影液中定影WmiruPVDF膜需用水清洗后在陰涼處晾干。之后掃描膠片 即可，條帶可用凝膠圖像分析軟件Image J. Ink進(jìn)行定量分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
[0103] 8、3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的保護(hù)作用
[0104] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性
[0105] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以5X104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板，lOOyL/孔，貝占 壁生長(zhǎng)12h后，加入3-氫化松苓酸氰乙酯的不同濃度(80、40、20、10、5、2.5、1.25以1〇，每個(gè)濃 度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率，并計(jì)算藥物對(duì)應(yīng)的IC50值。
[0106] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用
[0107] SH-SY5Y細(xì)胞分為2組：空白組和模型組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以5 X 104 個(gè)/ml的濃度接種于96孔板，100μL孔，培養(yǎng)12h后棄去舊培養(yǎng)基，模型組加入不同濃度的 H2〇2 溶液，H2〇2 濃度為 1200μΜ，1100μΜ，1050μΜ，1000μΜ，950μΜ，900μΜ，800μΜ，750μΜ，700μΜ〇 空白組加入DMEM培養(yǎng)基，最后保證200μ!7孔，繼續(xù)培養(yǎng)12h，ΜΤΤ比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。選 取可導(dǎo)致40 %~50 % SH-SY5Y細(xì)胞死亡的Η202濃度處理細(xì)胞，建立氧化損傷模型。
[0108] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以5Χ104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板，培養(yǎng)12h后棄 去舊培養(yǎng)基，模型組加入11〇〇μΜ的H 2〇2溶液，空白組加入DMEM培養(yǎng)基，最后保證200yL/孔，繼 續(xù)培養(yǎng)12h，然后棄去舊培養(yǎng)基，設(shè)置空白組、模型組、陽(yáng)性組(50yg/mL的維拉帕米），加藥組 (3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)應(yīng)的濃度5μΜ、2μΜ、ΙμΜ)，保證每孔200uL。培養(yǎng)6小時(shí)以后，每孔加 1 OuL的MTT。4小時(shí)以后進(jìn)行測(cè)定。
[0109] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)AD大鼠的學(xué)習(xí)及記憶功能的影響(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）
[0110]阿爾茲海默病(AD)是一種起病隱襲且進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上 以進(jìn)行性記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間損害、執(zhí)行功能障礙及人格和行為改變?yōu)樘?征。接受Αβ海馬內(nèi)注射的大鼠是相對(duì)經(jīng)典的AD動(dòng)物模型，在體內(nèi)能較好的模擬AD的病理過(guò) 程，與其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖啾?，更為切?shí)的反應(yīng)AD的發(fā)病進(jìn)程。
[0111] 海馬內(nèi)Αβ?-40注射誘導(dǎo)AD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停焊鹘MSD大鼠均采用1 %戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注 射麻醉，AD模型組、3-氫化松苓酸氰乙酯藥物組均于雙側(cè)海馬CAI區(qū)緩慢勻速注射Αβ 1-401 yL(10mg/mL)，留針5min，對(duì)照組則注射等量生理鹽水，退針后縫合傷口。
[0112] 選取32只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。分別為對(duì)照組、AD模型組、3-氫化松苓酸 氰乙酯藥物組（180mg/kg)。手術(shù)后，加藥組每天灌胃一次，共計(jì)20天，對(duì)照組和AD模型組給 予等量生理鹽水。從第17天開(kāi)始，采用Morris水迷宮測(cè)試評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，共計(jì)4天。
[0113] 按照Morris水迷宮操作說(shuō)明評(píng)估測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。所應(yīng)用水迷宮參數(shù)指 標(biāo)為：圓形水池，直徑180cm，高55cm，內(nèi)壁黑色，設(shè)定水深30cm，距池壁35cm處放置圓臺(tái)（高 30cm，直徑10cm)。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天，實(shí)驗(yàn)前一天讓大鼠自由游泳2min，從第一天起每天上、下午 各訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)，入水點(diǎn)隨機(jī)選取，將大鼠面向池壁放入池中，記錄各組大鼠尋找平臺(tái)并 爬上平臺(tái)所用時(shí)間（即尋臺(tái)潛伏期），相鄰兩次訓(xùn)練時(shí)間間隔為lmin。若大鼠在2min內(nèi)未找 到平臺(tái)，人為引至平臺(tái)，記為Sminj天訓(xùn)練時(shí)間結(jié)束后，撤開(kāi)水下平臺(tái)，在同一地點(diǎn)將大鼠 放入池中，測(cè)在2min內(nèi)，大鼠在原平臺(tái)象限區(qū)域活動(dòng)時(shí)間，與總時(shí)間比值，記錄跨過(guò)原平臺(tái) 位置的次數(shù)。
[0114] 9、3-氫化松苓酸氰乙酯的降血糖作用
[0115] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HepG2細(xì)胞的降血糖作用
[0116]接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基的HepG2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁24h 后，同時(shí)向孔內(nèi)加入不同梯度濃度的胰島素。試驗(yàn)分組:胰島素藥物分為5個(gè)組，分別為胰島 素10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，另設(shè)空白對(duì)照組每組6個(gè)復(fù)孔。
[0117]各濃度胰島素作用于HepG2細(xì)胞24h后，棄舊培養(yǎng)基，用PBS緩慢清洗細(xì)胞三次，加 1640 (無(wú)血清)培養(yǎng)基刺激20min，棄培養(yǎng)基，用PBS緩慢清洗細(xì)胞三次，加含1 %胎牛血清培 養(yǎng)基(含各濃度胰島素)培養(yǎng)24h后，按葡萄糖試劑盒說(shuō)明分別對(duì)上清糖含量進(jìn)行測(cè)定。觀察 HepG2細(xì)胞的胰島素耐受濃度。
[0118] 接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁24h后，棄舊培養(yǎng) 基，用PBS緩慢清洗細(xì)胞三次，加1640(無(wú)血清)培養(yǎng)基刺激20min，棄培養(yǎng)基，用PBS緩慢清洗 細(xì)胞三次，加含1%胎牛血清培養(yǎng)基(含10-7M的胰島素和各濃度的藥物)3_氫化松苓酸氰乙 酯藥物濃度分別為80μΜ，40μΜ，20μΜ，ΙΟμΜ，5μΜ培養(yǎng)24h后，按葡萄糖試劑盒說(shuō)明分別對(duì)上清 糖含量進(jìn)行測(cè)定。
[0119] 3-氫化松苓酸氰乙酯的降血糖作用(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）
[0120] 糖尿病小鼠模型的建立:選用雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，高糖高脂飼料(飼料 組成：10%豬油、20%蔗糖、5%蛋黃、65%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)8周，禁食不禁水12h，以100mg/kg 腹腔注射2%四氧嘧啶水溶液，小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料，72h(禁食12h)后，小鼠眼眶后 靜脈叢取血并測(cè)定血糖值，選取空腹血糖(FBG) >11. IMm的小鼠作為糖尿病模型小鼠。
[0121] 選取正常小鼠8只作為正常對(duì)照組，同時(shí)選取造模成功的糖尿病小鼠32只，隨機(jī)均 分為4組，分為模型對(duì)照組，二甲雙胍陽(yáng)性藥對(duì)照組(200mg/kg)，
[0122] 3-氫化松苓酸氰乙酯低、高劑量組（120、240mg/kg)。陽(yáng)性藥、給藥組均每日灌胃給 藥1次，正常組和模型組給予等體積的0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)灌胃4周。實(shí)驗(yàn)期間，除正常對(duì) 照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，其余各組均以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。
[0123] 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0124] 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，數(shù)據(jù)都用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（7 ± s )的形 式表示。組間的差異用單因素方差進(jìn)行分析，與對(duì)照組比較P〈〇.05為兩者的數(shù)據(jù)差異有顯 著性結(jié)果，與對(duì)照組比較P〈〇.01為兩者的數(shù)據(jù)差異有極顯著性結(jié)果。
[0125] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0126] 1、3_氫化松苓酸氰乙酯對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0127] 使用 5 ~80μΜ 的 3-氫化松苓酸氰乙酯處理 HGC-27、HepG2、A549、MDA-MB-231、PC3、 CNE-2細(xì)胞24h后，MTT檢測(cè)3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)各細(xì)胞的抑制作用，并計(jì)算IC50值，結(jié)果 見(jiàn)表1和表2。
[0128] 表1 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用=
[0129]
[0130]表2 3-氫化松苓酸氰乙酯與紫杉醇對(duì)HGC-27細(xì)胞的抑制作用
[0132] 2、3_氫化松苓酸氰乙酯促進(jìn)細(xì)胞自噬而產(chǎn)生藥理作用
[0133] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27的細(xì)胞周期影響
[0134] 使用10(8)、20(〇、40(0)以1的3-氫化松苓酸氰乙酯處理邪(：-27細(xì)胞2411，并設(shè)置細(xì) 胞對(duì)照組(A)。經(jīng)過(guò)PI染色以后，檢測(cè)3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生的 影響。從流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量組的3-氫化松苓酸氰乙酯作用HGC-27 細(xì)胞后，對(duì)應(yīng)的G0/G1期的細(xì)胞分布分別為（47.5±4.7)%、（53.1±3.3)%、（58.6± 3.8) %，與細(xì)胞對(duì)照組(41.5±4.1) %比較，中劑量組的TAB使胃癌細(xì)胞顯著性的阻滯于G0/ G1期(P〈0.05)，高劑量組可極顯著性的阻滯細(xì)胞于G0/G1期(P〈0.01)。其分析結(jié)果如表3所 示，說(shuō)明3-氫化松苓酸氰乙酯使胃癌細(xì)胞HGC-27阻滯于G0/G1期，從而抑制胃癌細(xì)胞HGC-27 的生長(zhǎng)和增殖。
[0135] 表3 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞周期的影響(η = 3，Ι±.5〇
[0137] 注與對(duì)照組相比Ρ〈0.05; #與對(duì)照組相比Ρ〈0.01。
[0138] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞凋亡的影響
[0139] 使用10(8)、20(〇、4(^1(0)的3-氫化松苓酸氰乙酯處理邪(：-27細(xì)胞2411，并設(shè)置 細(xì)胞對(duì)照組(A)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞的凋亡影響，具體 見(jiàn)圖2;其中A:對(duì)照組;B: 3-氫化松苓酸氰乙酯（ΙΟμΜ);C: 3-氫化松苓酸氰乙酯(20μΜ);D: 3-氫化松苓酸氰乙酯(40μΜ)，實(shí)驗(yàn)中的4個(gè)象限分別是：左上(AV-，PI + );右上(AV+，PI + );左下 (AV-，PI-);右下(Αν^ΡΙ-ΚΑν*染色表示早期凋亡，PI+染色表示壞死。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-氫 化松苓酸氰乙酯沒(méi)有使胃癌HGC-27細(xì)胞發(fā)生早期凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞的比例隨藥物劑 量升高逐漸地增加。此結(jié)果說(shuō)明3-氫化松苓酸氰乙酯使胃癌HGC-27死亡的方式可能不是通 過(guò)細(xì)胞凋亡途徑。
[0140] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞自噬的影響
[0141]透射電鏡檢測(cè)3-氫化松苓酸氰乙酯作用后的細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，具體見(jiàn)圖3,其中a: 對(duì)照組（X 6000)b/c:自噬泡（X6000)d:自噬體亞顯微結(jié)構(gòu)（X 15000):
[0142] 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和3-氫化松苓酸氰乙酯加藥組(20μ Μ)，處理細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，固定、脫水、浸透、包埋、制備超薄切片，最后完成染色，透射 電鏡觀察超薄切片，拍照記錄結(jié)果。電鏡結(jié)果顯示對(duì)照組的細(xì)胞，細(xì)胞核大而完整，細(xì)胞器 排列整齊，沒(méi)有缺失，細(xì)胞膜的邊緣也清晰可見(jiàn)。反之，3-氫化松苓酸氰乙酯作用后的胃癌 細(xì)胞HGC-27，細(xì)胞核發(fā)生缺損或是缺失，大多數(shù)的細(xì)胞器都受損，大量的雙側(cè)膜狀態(tài)的自噬 泡、自噬體出現(xiàn)，而且自噬體中還含有殘留的消化物質(zhì)，更有大量的自噬空泡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明3-氫化松苓酸氰乙酯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC-27發(fā)生自噬。
[0143] A0染色法檢測(cè)細(xì)胞自噬比例，具體見(jiàn)圖4，3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HGC-27細(xì)胞自噬 比例的影響，其中A:對(duì)照組;B: 3-氫化松苓酸氰乙酯（1 ΟμΜ); C: 3-氫化松苓酸氰乙酯（20μ 1);0:3-氫化松苓酸氰乙酯(4(^1〇。
[0144] 發(fā)生自噬的小體可被Α0染色，然后使用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)其染色的細(xì)胞。因此，利 用Α0染色可定量檢出細(xì)胞自噬的比例。分別使用低、中、高劑量的3-氫化松苓酸氰乙酯處理 HGC-27細(xì)胞24h后收集細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10、20、40μΜ的 3_氫化松苓酸氰乙酯處理細(xì)胞后，ΙΟμΜ的3-氫化松苓酸氰乙酯沒(méi)有使自噬比例發(fā)生明顯改 變，而20、40μΜ的3-氫化松苓酸氰乙酯分別使細(xì)胞的自噬比例增加到3.49 ± 2.37 %，43.85 ± 7.09%，與細(xì)胞對(duì)照組(0.58 ± 0.56 % )比較，細(xì)胞自噬比例逐漸升高，而且高劑量組3-氫 化松苓酸氰乙酯(40μΜ)引起的自噬比例與空白組比較具有極顯著性的差異(Ρ〈0.01)。
[0145] 3-氫化松苓酸氰乙酯作用HGC-27細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)：
[0146] 使用濃度為10、20、40μΜ的3-氫化松苓酸氰乙酯處理HGC-27細(xì)胞，并且設(shè)置細(xì)胞 對(duì)照組，作用24h以后收集細(xì)胞提取總蛋白。Western blotting的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4,自的關(guān) 鍵調(diào)控蛋白Becl in-Ι的表達(dá)隨藥物濃度的升高發(fā)生明顯的增加，20、40μΜ的3-氫化松苓酸 氰乙酯使Beclin-Ι的表達(dá)出現(xiàn)極顯著的升高;LC3也是參與自噬發(fā)生的重要基因。檢測(cè)結(jié)果 顯示，LC31/LC3 Π 的比例發(fā)生顯著性的降低，說(shuō)明LC31隨3-氫化松苓酸氰乙酯濃度升高逐 漸向LC3 Π 轉(zhuǎn)化，且低、中、高劑量都具有極顯著的差異。Western blotting結(jié)果表明3-氫化 松苓酸氰乙酯引起自噬關(guān)鍵蛋白發(fā)生了改變。
[0147] 表4 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)自噬蛋白表達(dá)的影響
[0149]注:與空白組相比 *P〈0.05;**P〈0.01
[0150] 3、3_氫化松苓酸氰乙酯促進(jìn)細(xì)胞自噬的機(jī)制是：3-氫化松苓酸氰乙酯是PI3K/ mTOR雙重抑制劑。
[0151] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)PI3K/AKT/mT0R信號(hào)通路的影響
[0152] 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0153] 從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中選取mTOR晶體結(jié)構(gòu)A鏈(4JT5_A)，去結(jié)晶水，加極性氫、電荷。以其 中配體P2X為中心，建立18AX18AX18A的對(duì)接盒子。配體分子建立在pH 7.4下的離子化 狀態(tài)并做能量最小化處理。采用Glide SP方法進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接作用模式如下：
[0154] 配體位于 Gln2161，Ile2163，Thr2164，Ser2165，Pr〇2169，Leu2185，Lys2187， Leu2192，Asp2195，Met2199，Ile2237，Trp2239，Cys2243，Asp2244，Thr2245，Hid2247， Arg2251，Ser2342，Met2345，I le2356，Asp2357，Phe2358 等氨基酸殘基組成的活性口 袋中。 3-氫化松苓酸氰乙酯的羧基中羰基氧與Lys2187之間有氫鍵作用。與3-氫化松苓酸氰乙酯 對(duì)接的Gscore為-5.36。從以上的計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果來(lái)看，理論上闡明了 3-氫化松苓酸氰乙酯 與mTOR有很好的親和能力及相互作用。3-氫化松苓酸氰乙酯和mTOR的分子對(duì)接結(jié)果圖5。
[0155] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)PI3K/AKT/mT0R信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響：
[0156] 3-氫化松苓酸氰乙酯濃度為20μΜ處理HGC-27細(xì)胞，并設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組，作用24h后 收集細(xì)胞并提取總蛋白，進(jìn)行蛋白定量。Western blotting檢測(cè)了3-氫化松苳酸氰乙酯作 用細(xì)胞24h后，信號(hào)通路中P-PI3K、P-mT0R以及信號(hào)通路下游P-p70S6K蛋白的表達(dá)情況。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示，3-氫化松苓酸氰乙酯作用HGC-27細(xì)胞24h后，P-PI3K、P-mT0R、P-p70S6K蛋白表 達(dá)都出現(xiàn)了顯著性的下調(diào)，與空白組進(jìn)行對(duì)比有著極顯著性的差異。具體見(jiàn)表5。
[0157] 表5 3-氫化松苳酸氰乙酯對(duì)不同蛋白表達(dá)的影響=
[0159] 注:與空白組相比 *P〈0.05;**P〈0.01
[0160] 4、3_氫化松苓酸氰乙酯抑制mTOR具有抗癌作用，且對(duì)PTEN缺失型腫瘤效果好。
[0161] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)PTEN缺失型和野生型的HT-29細(xì)胞的抑制作用
[0162] PTEN作為一種抑瘤因子，在PI 3K/AKT/mT0R信號(hào)通路中起著關(guān)鍵的作用。PTEN的缺 失或者是丟失，都可以激活PI3K/AKT/mT0R信號(hào)途徑。在臨床實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組 織中出現(xiàn)大量PTEN缺失的現(xiàn)象，而健康人群中，PTEN都是呈陽(yáng)性表達(dá)，因此，PTEN與PI3K/ AKT/mTOR信號(hào)通路之間可能有密切關(guān)聯(lián)。
[0163] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PTEN野生型和PTEN缺失型HT-29細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)12h以 后，加入3-氫化松苓酸氰乙酯，藥物濃度為（80、40、20、10、5、2.5、1.25μΜ)，培養(yǎng)48h后，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率，計(jì)算藥物對(duì)應(yīng)的IC50值。結(jié)果顯示3-氫化松苓酸氰乙酯顯著抑制 PTEN缺失型HT-29細(xì)胞。具體見(jiàn)表6。
[0164] 表6 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)PTEN野生型和缺失型HT-29細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 (IC50)(n = 3，； ± 占）
[0166] 5、3_氫化松苓酸氰乙酯抑制mTOR具有治療阿爾茨海默氏病(AD)等神經(jīng)退性性病 變作用。
[0167] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的保護(hù)作用
[0168] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性：
[0169] 3-氫化松苓酸氰乙酯不同濃度（80、40、20、10、5、2.5、1.25以1〇作用于3!1-3￥5￥細(xì) 胞，培養(yǎng)48h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率，計(jì)算3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)應(yīng)的IC50值。結(jié)果顯 示藥物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性較小。具體見(jiàn)表7。
[0170] 表7 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)SH-SY5Y的細(xì)胞毒性(n = 3，i±&)
[0172] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用：
[0173] 使用H202不同濃度處理細(xì)胞，建立氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出在Η20 2 Ι100μΜ的 濃度下，神經(jīng)細(xì)胞的抑制率達(dá)到42.71 %。將SH-SY5Y細(xì)胞分組為空白組、模型組、陽(yáng)性組(50 yg/mL的維拉帕米），加藥組(藥物對(duì)應(yīng)的濃度5以1、2以1、1以1〇，保證每孔200此。培養(yǎng)6小時(shí)以 后，每孔加10uL的MTT3小時(shí)以后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示陽(yáng)性藥50yg/mL維拉帕米能顯著性的 提高雙氧水損傷后SH-SY5Y細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞 也有保護(hù)作用，3-氫化松苓酸氰乙酯濃度為5μΜ時(shí)，表現(xiàn)出極顯著的保護(hù)作用，2μΜ時(shí)有顯著 性的保護(hù)作用。具體見(jiàn)表8。
[0174] 表8 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用(η = 3,[土占）
[0176] 注與模型組相比Ρ<0.05 與模型組相比Ρ<0.01
[0177] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)AD大鼠的學(xué)習(xí)及記憶功能的影響(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）：
[0178] 測(cè)定各組大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中4天內(nèi)的尋臺(tái)潛伏期，具體見(jiàn)表9，表10，表 11。結(jié)果顯示所有大鼠的尋臺(tái)潛伏期都表現(xiàn)出縮短的趨勢(shì)，但是AD模型組大鼠的尋臺(tái)潛伏 期相比于對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，而3-氫化松苓酸氰乙酯（180mg/kg)藥物組的尋臺(tái)潛伏期要顯著 低于AD模型組。撤去平臺(tái)后記錄各組大鼠在原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間與總時(shí)間比值，以及跨平 臺(tái)的次數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AD模型組搜索時(shí)間比值顯著降低，搜索次數(shù)也顯著減 少;3-氫化松苓酸氰乙酯（180mg/kg)藥物組有模型組比較，搜索時(shí)間比值及搜索次數(shù)都出 現(xiàn)顯著提高，但沒(méi)有恢復(fù)正常值。眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Αβ海馬內(nèi)注射后可導(dǎo)致SD大鼠學(xué)習(xí) 及記憶功能受損，3-氫化松苓酸氰乙酯可較好地改善海馬內(nèi)注射Αβ所致的學(xué)習(xí)記憶功能受 損。
[0179] 表9Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組大鼠尋臺(tái)潛伏期的變化(π = 4，λ ±·?)
[0181] 注:與AD模型組相比 *Ρ〈0 · 05; **Ρ〈0 · 01;與對(duì)照組相比#Ρ〈0 · 05; ##Ρ〈0 · 01
[0182] 表10各組S D大鼠搜索時(shí)間所占比值的變化(η = 4，I ± )
[0184] 注:與AD模型組相比 *P〈0 · 05;，〈0 · 01;與對(duì)照組相比#P〈0 · 05; ##P〈0 · 01
[0185] 表11各組SD大鼠搜索次數(shù)的變化(n = 4，沒(méi)）
[0187] 注:與AD模型組相比 *P〈0 · 05; **P〈0 · 01;與對(duì)照組相比#P〈0 · 05; ##P〈0 · 01
[0188] 6、3_氫化松苓酸氰乙酯抑制mTOR具有治療糖尿病作用。
[0189] 3-氫化松苓酸氰乙酯的降血糖作用
[0190] 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HepG2細(xì)胞的降血糖作用，具體見(jiàn)表12。
[0191] 選取胰島素10-5M，10-6M，10-7M，10- 8M，10-9M，另設(shè)空白對(duì)照組，作用于HepG2細(xì)胞 24h后，棄舊培養(yǎng)基，用PBS緩慢清洗細(xì)胞三次，加1640 (無(wú)血清）培養(yǎng)基刺激20min，棄培養(yǎng) 基，用PBS緩慢清洗細(xì)胞三次，加含1 %胎牛血清培養(yǎng)基(含各濃度胰島素)培養(yǎng)24h后，按葡 萄糖試劑盒說(shuō)明分別對(duì)上清糖含量進(jìn)行測(cè)定。造模結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞的胰島素耐受濃度 在 10-7M〇
[0192]表12胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(11 = 5，：±瓦）
[0194] 使用同樣的方法培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，加含1%胎牛血清培養(yǎng)基(含10-7Μ的胰島素和各 濃度的3-氫化松苓酸氰乙酯），3-氫化松苓酸氰乙酯濃度分別為80μΜ，40μΜ，20μΜ，ΙΟμΜ，5μΜ 培養(yǎng)24h后，按葡萄糖試劑盒說(shuō)明分別對(duì)上清糖含量進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果顯示3-氫化松苓酸 氰乙酯在40μΜ濃度下極顯著降低葡萄糖含量，具體見(jiàn)表13。
[0195] 表13 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響(11 = 5，^土友）
[0197] 注與胰島素10-7組相比P〈0.05廣與胰島素10-7組相比P〈0.01
[0198] 3-氫化松苓酸氰乙酯的降血糖作用(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)），具體見(jiàn)表14。
[0199] 離心取血清，使用葡萄糖試劑盒測(cè)定空腹血糖值。與正常組相比，模型組小鼠血糖 顯著升高；與模型組小鼠比較，3-氫化松苓酸氰乙酯的低、高劑量組均顯著性的降低小鼠血 糖值。
[0200]表14 3-氫化松苓酸氰乙酯對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響(n = 8八±lS)
[0203] 注:與模型組相比aP〈0.05; bP〈0.01;與正常組相比CP〈0.05; dP〈0.01。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物，其特征在于，該類藥物中含有以下結(jié)構(gòu)式的化合 物：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物，其特征在于:該類類藥物還包括 藥學(xué)上可接受的鹽，3-氫化松苓酸氰乙酯及其衍生物藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接 受的輔料或載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物，其特征在于:3-氫化松苓酸氰乙 酯的合成方法為： 1) 在反應(yīng)瓶中加入等摩爾的3-氫化松苓酸B、溴乙腈、碳酸鉀，并加入適量乙腈作為溶 劑，在85 °C攪拌反應(yīng)2h，TCL檢測(cè)反應(yīng)完成后，旋干溶劑，加入水和乙酸乙酯，分離萃取三次， 回收乙酸乙酯，得固體物； 2) 將固體物固法上樣，200-300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚：乙酸乙酯= 15:1(體 積比）為流動(dòng)相，得白色固體粉末為3-氫化松苓酸氰乙酯。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在促進(jìn)細(xì)胞自噬中的 用途。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在促進(jìn)細(xì)胞自噬中的 用途，其特征在于:3-氫化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR雙重抑制劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療胃癌、肝 癌、肺癌、前列腺癌或鼻咽癌藥物方面的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療神經(jīng)退行 性病變藥物方面的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療阿爾茨海 默氏病藥物方面的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的3-氫化松苓酸氰乙酯類藥物在制備治療糖尿病藥 物方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK105949262SQ201610363662
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】汪鋆植, 張盼, 閆喜明, 黃年玉, 余海立, 佘欣欣, 鄧改改, 茍保靈, 賀海波, 李湜
【申請(qǐng)人】三峽大學(xué)