一種蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉殘留量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)物質(zhì)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種氰基硼氫化鈉殘留量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氰基硼氫化鈉是一種常用的絡(luò)合型氫化物，具有優(yōu)良的還原性，但同時也有一定 的毒性。在醫(yī)藥行業(yè)，氰基硼氫化鈉殘留造成的安全問題早已引起人們的關(guān)注，而且藥典中 出現(xiàn)了三種氰化物殘留的檢測方法。不過，現(xiàn)有方法對氰化物殘留的分析，要么只能做到定 性分析，要么需要劇毒物質(zhì)，如溴化氫，聯(lián)苯胺等，如藥典中的060氰化物檢查法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提出一種操作步驟簡單、快捷、成本低、 毒性小的蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉殘留量的檢測方法。
[0004] 所采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉殘留量的檢測方法，其是將該蛋白樣品或制 品進(jìn)行包括去除蛋白的預(yù)處理后，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和聚山梨酯20溶液的混合液 中形成混合體系，采用紫外可見分光光度計測定該混合體系的吸光度，最后用外標(biāo)法定出 該蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉的含量，所述外標(biāo)法的外標(biāo)物為氰基硼氫化鈉。
[0006] 優(yōu)選地，所述外標(biāo)法為校正曲線法。
[0007] 優(yōu)選地，所述校正曲線法包括氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液和所述混合液的配制， 然后取氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液分別加入所述混合液中形成梯度標(biāo)準(zhǔn)體系，采用紫外可 見分光光度計測定該梯度標(biāo)準(zhǔn)體系的吸光度，建立吸光度和濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0008] 優(yōu)選地，所述混合液是考馬斯亮藍(lán)G-250溶液與體積濃度為10%的聚山梨酯20的 混合液，兩者配比的體積比為10:1。
[0009 ]優(yōu)選地，所述混合體系的放置環(huán)境及時間為37 °C避光水浴保存30min。
[0010]優(yōu)選地，所述紫外可見分光光度計的檢測波長為595納米。
[0011]優(yōu)選地，所述去除蛋白為將蛋白樣品或制品進(jìn)行煮沸。
[0012] 優(yōu)選地，所述將該蛋白樣品或制品進(jìn)行包括去除蛋白的預(yù)處理為:取蛋白原液，抽 取到小燒杯中，調(diào)節(jié)pH于等電點附近;將調(diào)節(jié)好的樣品分裝于EP管中，再將EP管架于浮漂上 放入沸水中，進(jìn)行煮沸;沸水浴10_20min至明顯絮狀沉淀，lOOOOrpm離心10min，取上清液為 供試品溶液。
[0013] 優(yōu)選地，所述校正曲線法包括如下步驟：
[0014] S1.試液配制：
[0015] SI 1. lmol/L氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取0.0628g氰基硼氫化鈉，用lmol/L NaOH溶液溶解并稀釋到1.0ml，4°C保存；
[0016] S12.氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液:取lmol/L氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用純化水分別 ##S0.25mmol/L，0.20mmol/L，0.15mmol/L，0.10mmol/L，0.05mmol/L，0.025mmol/U·^^·;
[0017] S13.考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：取考馬斯亮藍(lán)G-25010mg置于100ml量瓶中，加入5ml 95 %乙醇溶解，再加入10ml磷酸，用純化水稀釋到100ml，濾紙過濾，4°C保存；
[0018] S14. 10%聚山梨酯20溶液：量取lml吐溫-20置于10ml量瓶中，純化水稀釋到 10ml，4°C保存；
[0019 ] S15.混合液:考馬斯亮藍(lán)溶液與10 %吐溫-20按10:1比例，混合；
[0020] S2.檢測
[0021 ] S21.標(biāo)準(zhǔn)曲線:取氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液各0.60ml置于1.5ml離心管中，分別 加入0.66ml混合液，混勻，37°C避光水浴30min，在波長595nm處測定吸光度；
[0022] S22.建立吸光度和濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0023]所述加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和聚山梨酯20溶液的混合液中形成混合體系，采 用紫外可見分光光度計測定該混合體系的吸光度為:取供試品溶液〇.60ml置于1.5ml離心 管中，加入0.66ml染色液，混勻，37°C避光水浴30minh，在波長595nm處測定吸光度。
[0024]優(yōu)選地，所述蛋白為聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子或重組人粒細(xì)胞集落 刺激因子。
[0025]本發(fā)明的有益效果在于：
[0026]本發(fā)明通過考馬斯亮藍(lán)G-250和聚山梨酯20溶液為反應(yīng)體系建立了采用紫外可見 分光光度法測定微量氰基硼氫化鈉的方法。此方法簡單、快捷、成本低，毒性小，可用于其它 相關(guān)原液或樣品中氰基硼氫化鈉殘留檢測提供參考，如在檢測聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞刺 激因子中氰基硼氫化鈉殘留量的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明不同條件(煮沸/不煮沸）、不同日期的條件下，不同濃度與響應(yīng)吸光 度之間的關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述。
[0029] 本發(fā)明的一種蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉殘留量的檢測方法，其是將該蛋白 樣品或制品進(jìn)行包括去除蛋白的預(yù)處理后，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和聚山梨酯20溶液 的混合液中形成混合體系，采用紫外可見分光光度計測定該混合體系的吸光度，最后用外 標(biāo)法定出該蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉的含量，所述外標(biāo)法的外標(biāo)物為氰基硼氫化 鈉。
[0030] 也就是在針對蛋白樣品或制品中氰基硼氫化鈉殘留量的檢測方法上，發(fā)明人的核 心發(fā)明構(gòu)思在于，首先利用考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和聚山梨酯20溶液的混合為反應(yīng)體系，然 后采用紫外可見分光光度法測定上述混合體系的吸光度，最后利用外標(biāo)法定量。
[0031] 所述外標(biāo)法在本技術(shù)領(lǐng)域里的定義為：以待測成分的對照品作為對照物質(zhì)，相對 比較以求得供試品含量。
[0032]外標(biāo)法在操作和計算上可分為校正曲線法和用校正因子求算法。校正曲線法是用 已知不同含量的標(biāo)樣系列等量進(jìn)樣分析，然后做出響應(yīng)信號與含量之間的關(guān)系曲線，也就 是校正曲線。校正因子求算法是將標(biāo)樣多次分析后得到響應(yīng)信號與其含量求出它的絕對校 正因子，再根據(jù)公式求出待測樣品中的含量。
[0033]本發(fā)明優(yōu)選校正曲線法。
[0034]該校正曲線法包括氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液和所述混合液的配制，然后取氰基 硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液分別加入所述混合液中形成梯度標(biāo)準(zhǔn)體系，采用紫外可見分光光度 計測定該梯度標(biāo)準(zhǔn)體系的吸光度，建立吸光度和濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0035]本發(fā)明所述的蛋白優(yōu)選為聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF) 或重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)，當(dāng)然也可以為其他種蛋白，從而可用于其它相關(guān) 原液或樣品中氰基硼氫化鈉殘留檢測提供參考。由于聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因 子(PEG-rhG-CSF)是通過氰基硼氫化鈉作選擇性催化劑，使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 (rhG-CSF)和聚乙二醇反應(yīng)生產(chǎn)的。因此，本領(lǐng)域較為常見的是，聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞 集落刺激因子樣品或制品中常有氰基硼氫化鈉的殘留；因此檢測聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞 集落刺激因子樣品或制品中氰基硼氫化鈉的殘留量具有技術(shù)需要和現(xiàn)實意義，從而更為優(yōu) 選地，所述的蛋白為聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)。
[0036] 本發(fā)明所述的氰基硼氫化鈉的分子式為NaBH3CN;本發(fā)明的聚山梨酯20又名吐溫-20(TWEEN-20)〇
[0037] 根據(jù)上述的發(fā)明構(gòu)思及技術(shù)方案，以下提供本發(fā)明的一種具體的主要分析步驟：
[0038] 1.試液配制：
[0039] 1.1 lmol/L氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取0.0628g氰基硼氫化鈉，用lmol/L NaOH溶液溶解并稀釋到1.0ml，4°C保存。
[0040] 1.2氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液:取lmol/L氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液用純化水分別 稀釋為0.251111]1〇1/1^，0.201111]1〇1/1^，0.151111]1〇1/1^，0.101111]1〇1/1^，0.051111]1〇1/1^，0.0251111]1〇1/1^溶液。 [0041 ] 1.3考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：取考馬斯亮藍(lán)G-25010mg置于100ml量瓶中，加入5ml 95 %乙醇溶解，再加入10ml磷酸，用純化水稀釋到100ml，濾紙過濾，4°C保存。
[0042] 1.410%吐溫-20溶液:量取lml吐溫-20置于10ml量瓶中，純化水稀釋到10ml，4°C 保存。
[0043] 1.5混合液(又稱染色液）：考馬斯亮藍(lán)溶液與10 %吐溫-20按10:1比例，混合。
[0044] 2.供試品（即待檢測的蛋白樣品或制品)預(yù)處理
[0045]取蛋白樣品或制品，抽取到小燒杯中，調(diào)節(jié)pH于等電點附近(pH5.8);將調(diào)節(jié)好的 樣品分裝于EP管中，再將EP管架于浮漂上放入沸水中，進(jìn)行煮沸;沸水浴10-20min至明顯絮 狀沉淀，lOOOOrpm離心10min(可重復(fù)2-3次），取上清液為供試品溶液，備用。
[0046] 3.檢測
[0047] 3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線：取氰基硼氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液各0.60ml置于1.5ml離心管中，分別 加入0.66ml染色液，混勻，37 °C避光水浴30min，在波長595nm處測定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0048] 3.2供試品檢測:取供試品溶液0.60ml置于1.5ml離心管中，加入0.66ml染色液，混 勻，37 °C避光水浴30minh，在波長595nm處測定吸光度。
[0049] 上述中，步驟1(試液配制）與步驟2(供試品預(yù)處理）可以同時進(jìn)行，也可以不分順 序先后進(jìn)行，即可以實施步驟1后再實施步驟2,也可以在實施步驟2后再實施步驟1。步驟 3.1與步驟3.2可以同時進(jìn)行，也可以不分順序先后進(jìn)行，即可以實施步驟3.1后再實施步驟 3.2，也可以在實施步驟3.2后再實施步驟3.1。步驟3.1可以在步驟1.1和步驟1.2之后就可 以直接實施，步驟3.2可以在步驟1.3-1.5、步驟2之后實施，也可以在步驟2、步驟1.3-1.5之 后實施。
[0050] 需要說明的是，發(fā)明人只是提供了上述的一種具體的主要分析步驟，但具體的分 析步驟并不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在此具體的主要分析步驟中進(jìn)行一些等同或者 等效變化，如將梯度濃度的數(shù)量由6個縮減為5個，或者變更為7個等其他數(shù)量，或者在具體 的梯度濃度的具體濃度和濃度之間的梯度設(shè)置不同，或者其他將本發(fā)明人公開的具體的參 數(shù)數(shù)值變更為附近值的等效的變化，均應(yīng)當(dāng)視為本分析步驟的等效變