本發(fā)明公開了具有如下通式(i)所示的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物及其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物，其作為以spop為靶點的抑制劑，可以治療以spop為靶點的疾病，比如腎癌等。

背景技術(shù)：

腎細胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)，簡稱腎癌，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2-3％。根據(jù)病理類型不同，腎癌主要分為透明細胞癌，乳頭狀癌，嫌色細胞癌和集合管癌等，其中腎透明細胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma,ccrcc)是腎癌最常見的病理類型，約占腎癌總發(fā)病數(shù)的80％。腎癌中高達30％的是轉(zhuǎn)移瘤，而剩余的約有一半會逐漸發(fā)展成轉(zhuǎn)移瘤，全世界每年腎癌的死亡病例超過10萬例。

spop(speckle-typepozprotein)屬于math/btb蛋白家族，作為e3泛素連接酶cul-3的接頭分子，在調(diào)節(jié)底物蛋白質(zhì)的泛素化和降解中發(fā)揮重要作用，比如daxx,pdx1,pipkiib,src-3等。目前研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞中存在spop蛋白表達異常，表明spop在維持正常細胞的生長和發(fā)育起著重要作用。2009年劉江等揭示了spop在透明細胞癌細胞株中過量表達，引起人們以spop為治療靶點，應(yīng)用于靶向治療透明細胞癌的興趣。

缺氧誘導(dǎo)因子hif是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，具有相當(dāng)廣泛的靶基因譜，對多種癌細胞加速生長起到重要作用。劉江等發(fā)現(xiàn)過度活化的缺氧誘導(dǎo)因子hif可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控spop表達，并且使核蛋白spop在腎癌組織中過量表達并錯誤定位在細胞質(zhì)里。與核定位spop的促凋亡功能不同，胞質(zhì)型spop能加速細胞增殖。胞質(zhì)型spop能與腫瘤抑制因子pten，erk磷酸酶，daxx和gli2相結(jié)合，并通過泛素化通路使其降解，從而導(dǎo)致腎癌產(chǎn)生。敲除spop后能特異性殺死腎透明細胞癌，但對正常細胞影響較小。

spop作為潛在分子探針或藥物靶標(biāo)提供線索，同時也為腎癌診斷和治療提供新的理論依據(jù)。綜上所述，本領(lǐng)域尚需要開發(fā)具有spop抑制活性的化合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物及其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物。

本發(fā)明的另一個目的是提供根據(jù)本發(fā)明的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物及其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物在制備spop抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一個目的是提供根據(jù)本發(fā)明的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物及其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物在制備用于治療與spop相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備用于治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的是提供包含治療有效量的選自根據(jù)本發(fā)明的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物、其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物或者其混合物中的一種或多種作為活性成分的藥物組合物。

本發(fā)明的又一目的是提供一種治療與spop相關(guān)的疾病(腎癌等)的方法，所述方法包括向患者給藥治療有效量的選自根據(jù)本發(fā)明的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物、其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物或者其混合物中的一種或多種作為活性成分。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種如下通式(i)所示的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1',2'-f]嘧啶類化合物，或其藥學(xué)上可以接受的鹽或溶劑合物：

其中，

x和y各自獨立地為無，或具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的取代或未取代的亞烷基或亞烷基-o-；其中，所述的亞烷基為直鏈或支鏈的亞烷基；

r1為位于環(huán)上的一個或多個h或c1-c4烷基；

r2、r3各自獨立地選自下組：氫，鹵素，羥基，硝基，氨基，氰基，羰基，取代或未取代c2-c12烯基，取代或未取代c2-c12炔基，羧基，取代或未取代c1-c12烷氧基，取代或未取代c1-c12烷胺基，取代或未取代c3-c9環(huán)烷基，取代或未取代的c2-c9非雜芳基、取代或未取代的3～12元雜環(huán)，取代或未取代的c6-c12芳基，取代或未取代的c4-c12雜芳基；

m選自下組：nh、o或s；

其中，所述的取代指基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基所取代：鹵素，羥基，硝基，氨基，氰基，羰基，羧基，c1-c6烷基，c1-c6烷氧基，c1-c6烷胺基，羥基c1-c6烷基，氨基c1-c6烷基，羰基c1-c6烷基，c3-c9環(huán)烷基，c6-c12芳基，3～12元雜環(huán)、c4-c12雜芳基。

在另一優(yōu)選例中，x和y各自獨立地為無，或具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子的未取代的直鏈亞烷基；

r2、r3各自獨立地選自下組：氫，氟，氯，溴，碘，羥基，硝基，氰基，羰基，羧基，氨基，或取代或未取代的選自下組的基團：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異氧丙基、正丁氧基、叔丁氧基、n-(n,n-二甲基)取代基、n-(n,n-二乙基)取代基、n-(n,n-二丙基)取代基、n-(n,n-二丁基)取代基、n-(n-甲基-n-乙基)取代基、n-(n-甲基-n-丙基)取代基、n-(n-甲基-n-丁基)取代基、n-(n-乙基基-n-丙基)取代基、n-(n-乙基-n-丁基)取代基、n-(n-丙基-n-丁基)取代基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡咯基、四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉基、哌嗪基、苯基、萘基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、吲哚基、喹啉基、咪唑基，或苯并咪唑基。

在另一優(yōu)選例中，x和y各自獨立地為無，或具有1、2、3或4個碳原子的取代或未取代的亞烷基或亞烷基-o-；

r1選自氫，甲基，乙基，丙基，異丙基，環(huán)丙基，正丁基或者叔丁基；

r2選自下組：氫，氟，氯，溴，碘，羥基，乙炔基、硝基，氰基，羧基，甲氧基、乙氧基、丙氧基、環(huán)己基氧基，n-(n,n-二甲基)取代基，n-(n,n-二乙基)取代基，n-(n,n-二丙基)取代基，n-(n,n-二丁基)取代基，n-(n-甲基-n-乙基)取代基，n-(n-甲基-n-丙基)取代基，n-(n-甲基-n-丁基)取代基，n-(n-乙基-n-丙基)取代基，n-(n-乙基-n-丁基)取代基，n-(n-丙基-n-丁基)取代基，環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基，2,3或4-甲基環(huán)己基，2,3或4-乙基環(huán)己基，2,3或4-羥基環(huán)己基，2,3或4-羧基環(huán)己基，2,3或4-氰基環(huán)己基，2,3或4-氨基環(huán)己基，2或3-四氫呋喃基，2或3-四氫噻吩基，n,2或3-四氫吡咯基，2,3或4-四氫吡喃基，n,2,3或4-哌啶基，n,2或3-嗎啉基，n或2-哌嗪基，n,2或3-(n-甲基哌嗪基)，n,2或3-(n-芐基哌嗪基)苯基，2,3或4-甲基苯基、2,3或4-甲氧基苯基，2,3或4-氨基苯基，2,3或4-氰基苯基，2,3或4-羧基苯基，2,3或4-硝基苯基，2,3或4-羥基苯基，萘基，2或3-呋喃基，2或3-噻吩基，n,2或3-吡咯基，2,3或4-吡啶基、n,2或3-(n-嗎啉基)苯基、吲哚基。

在另一優(yōu)選例中，所述的x、y、r1、r2、r3和m各自獨立地為實施例中具體化合物所對應(yīng)的基團。

在另一優(yōu)選例中，所述的r1選自氫或甲基。

在另一優(yōu)選例中，所述的r1為甲基。

在另一優(yōu)選例中，所述的r1為位于環(huán)上的一個甲基。

在另一優(yōu)選例中，r2-x-為選自下組的基團：甲基、乙基、丙基、環(huán)己基、或n,2或3-(n-嗎啉基)苯基；

或x為具有1、2、3個碳原子的亞烷基，且r2為選自下組的基團：n-(n,n-二乙基)取代基，n,2或3-嗎啉基，苯基，2,3或4-甲基苯基、2,3或4-氟苯基、2,3或4-甲氧基苯基，2,3或4-羥基苯基，2或3-呋喃基，2或3-噻吩基，吲哚基。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的式(i)化合物，或其藥學(xué)上可以接受的鹽或溶劑合物的用途，用于制備spop靶點抑制劑，或用于制備治療和/或預(yù)防以spop為靶點的疾病。

在另一優(yōu)選例中，所述的式(i)化合物被用于抑制spop活性。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制為競爭性抑制。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的式(i)化合物，或其藥學(xué)上可以接受的鹽或溶劑合物的用途，用于抑制腎癌細胞的增殖活性。

在另一優(yōu)選例中，所述的疾病選自下組：腎癌、子宮內(nèi)膜癌、生殖細胞腫瘤。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括治療有效量的如本發(fā)明第一方面所述的化合物，和/或其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物作為活性成分，和藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的式(i)化合物的制備方法，所述方法包括步驟：

在惰性溶劑中，用式ia化合物和式ib化合物反應(yīng)，得到式i化合物。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

附圖1顯示細胞增殖實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對腎癌細胞a498的抑制活性；

附圖2顯示細胞增殖實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對6株腎癌細胞系和1株正常腎小管上皮細胞系的抑制活性；

附圖3顯示蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(westernblot)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對spop下游信號通路的抑制活性；

附圖4顯示免疫共沉淀實驗(co-ip)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物細胞內(nèi)競爭性抑制spop與底物相互作用；

附圖5顯示體內(nèi)泛素化實驗(invivoubiquitinationassay)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物細胞內(nèi)抑制spop對底物的泛素化作用；

附圖6顯示表面等離子共振實驗(spr)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物與spop蛋白相互作用；

附圖7顯示熒光偏振實驗(fp)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物與spop蛋白相互作用；

附圖8顯示正常裸鼠體重和器官重量及器官切片染色實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對正常裸鼠的體重及器官影響較小。

附圖9顯示化合物血漿內(nèi)代謝實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物具有良好的代謝穩(wěn)定性。

附圖10顯示體內(nèi)裸鼠成瘤實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對裸鼠皮下腫瘤生長的抑制作用。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，制備了一類具有式i所示結(jié)構(gòu)的化合物，并發(fā)現(xiàn)其具有spop抑制活性。且所述的化合物在極低濃度(ic50值可低至≤50nmol/l)下，即對spop活性產(chǎn)生抑制作用，抑制活性相當(dāng)優(yōu)異，因而可以用于治療與spop活性或表達量相關(guān)的疾病，如腎癌等。基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。

術(shù)語

如本文所用，術(shù)語“c1-6烷基”指具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基，或類似基團。形如“c1-c6”的表述意在包括具有1個、2個、3個、4個、5個、或6個碳原子的相應(yīng)基團，例如，“c1-6烷基”指具有1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子的烷基，“c2-9非雜芳基”指具有2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個碳原子的非雜芳基。

如本文所用，術(shù)語“c1-c6烷氧基”指形如“具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基-氧基”結(jié)構(gòu)的取代基，如乙氧基、丙氧基、丁氧基，或類似基團。

如本文所用，術(shù)語“c1-c6烷胺基”指形如“具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基-胺基”結(jié)構(gòu)的取代基，如乙胺基、丙胺基、二甲胺基，或類似基團。

術(shù)語“亞烷基”指如上文所述的烷基失去一個氫原子之后形成的基團，例如-ch2-、-ch2-ch2-，或類似基團。

術(shù)語“c2-c12烯基”指具有2-12個碳原子的烯烴失去一個氫原子形成的基團，包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基，或類似基團。

術(shù)語“c3-c9環(huán)烷基”指具有3-9個碳原子的環(huán)烷基，如環(huán)丙烷、環(huán)己烷等。

術(shù)語“c6-c12芳基”指具有6-12個碳原子，且骨架上不有雜原子的芳香取代基，如苯基，或類似基團。

術(shù)語“c4-c12雜芳基”指具有4-12個碳原子，且具有一個或多個選自o、s、n或p的雜原子的非飽和環(huán)系取代基，如吡啶基、噻吩基，或類似基團。

術(shù)語“3～12元雜環(huán)”指具有3-12元的環(huán)系上具有一個或多個選自o、s、n或p的雜原子的飽和環(huán)系取代基，如哌啶基，吡咯基，或類似基團。

術(shù)語“鹵素”指f、cl、br和i。

本發(fā)明中，術(shù)語“含有”、“包含”或“包括”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。

本發(fā)明中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”成分是指適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。

本發(fā)明中，術(shù)語“有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。

在本文中，除特別說明之處，術(shù)語“取代”指基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代：鹵素、未取代或鹵代的c1-c6烷基、未取代或鹵代的c2-c6?；?、未取代或鹵代的c1-c6烷基-羥基。

除非特別說明，本發(fā)明中，所有出現(xiàn)的化合物均意在包括所有可能的光學(xué)異構(gòu)體，如單一手性的化合物，或各種不同手性化合物的混合物(即外消旋體)。本發(fā)明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任選地為r構(gòu)型或s構(gòu)型，或r構(gòu)型和s構(gòu)型的混合物。

如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明化合物”指式i所示的化合物。該術(shù)語還包括及式i化合物的各種晶型形式、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明化合物與酸或堿所形成的適合用作藥物的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有機酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

式i化合物及其制備

本發(fā)明提供了一種如下通式(i)所示的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1',2'-f]嘧啶類化合物，或其藥學(xué)上可以接受的鹽或溶劑合物：

其中，各基團的定義如上文中所述。

優(yōu)選的所述化合物為選自下列化合物中的一種化合物：

藥物組合物和施用方法

由于本發(fā)明化合物具有優(yōu)異的對spop的抑制活性，因此本發(fā)明化合物及其各種晶型，藥學(xué)上可接受的無機或有機鹽，水合物或溶劑合物，以及含有本發(fā)明化合物為主要活性成分的藥物組合物可用于治療、預(yù)防以及緩解由與spop活性或表達量相關(guān)的疾病。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明化合物可用于治療以下疾?。耗I癌、透明細胞癌等等。

本發(fā)明的藥物組合物包含安全有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明化合物或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有1-2000mg本發(fā)明化合物/劑，更佳地，含有5-200mg本發(fā)明化合物/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個膠囊或藥片。

“藥學(xué)上可以接受的載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能和本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑()、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。

本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤內(nèi)、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、和局部給藥。

用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。

固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。

除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、嬌味劑和香料。

除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。

用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。

用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑?；钚猿煞衷跓o菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要的推進劑一起混合。

本發(fā)明化合物可以單獨給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合物聯(lián)合給藥。

使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明化合物適用于需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對于60kg體重的人而言，日給藥劑量通常為1～2000mg，優(yōu)選5～500mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

1.提供了一種如式i所示的化合物。

2.提供了一種結(jié)構(gòu)新穎的spop抑制劑及其制備和應(yīng)用，所述的抑制劑在極低濃度下即可抑制各類spop的活性。

3.提供了一類治療與spop活性相關(guān)疾病的藥物組合物。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。這些實施例僅是出于解釋說明的目的，而不是限制本發(fā)明的范圍和實質(zhì)。

以下實施例藥品的來源:dmem/hg培養(yǎng)基購自gibco，10％胎牛血清購自lifetechnology，青霉素，鏈霉素和噻唑藍購自上海生工生物工程有限公司，制備實施例中試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司和百靈威科技有限公司。spf級bald/cnull雌性裸鼠購至上海斯萊克實驗動物有限公司并在上海藥物所spf級動物房飼養(yǎng)，動物管理和使用遵循了中科院上海藥物所iacuc政策和指導(dǎo)原則。

制備實施例

本發(fā)明所述的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物及其藥學(xué)上可以接受的鹽或藥學(xué)上可以接受的溶劑合物可以通過如下路線制備：

下面以化合物n-(3-(4-嗎啉基)丙基)-1-(2-苯基乙基)-2-亞胺-10-甲基-5-酮基二吡啶[4,3-b:1’,2’-f]并嘧啶-3-甲酰胺為例簡要說明2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物的合成。

步驟1:將10.81g(100mmol)2-氨基-3-甲基吡啶和24.03g(150mmol)丙二酸二乙酯加入250ml茄型瓶，200℃反應(yīng)2h，反應(yīng)過程中有大量固體產(chǎn)物生成。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入200ml乙醇回流過夜，冷卻至室溫，過濾，得到13g產(chǎn)物，產(chǎn)率76％。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.79(dd,j＝7.2,1.6hz,1h),7.83(d,j＝6.9hz,1h),7.17(t,j＝7.0hz,1h),5.40(s,1h),2.42(s,3h).

步驟2:將200ml(氫化鈣除水)n,n-二甲基甲酰胺(dmf)加入500ml茄型瓶，冰浴冷卻，隨后緩慢滴加13ml(140mmol)三氯氧磷(p(o)cl3)，冰浴下繼續(xù)反應(yīng)1h，分批加入7.05g(40mmol)2-羥基-4-羥基-9-甲基吡啶[1,2-α]-吡啶胺，加完后冰浴反應(yīng)1h，室溫反應(yīng)2h，隨后95℃反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后加入200ml冰水中，反應(yīng)1h，過濾，固體用乙醇打漿，過濾，干燥，得到6.2g產(chǎn)物，產(chǎn)率70％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.43(s,1h),9.12(ddd,j＝7.0,1.6,0.8hz,1h),7.94(ddd,j＝7.1,1.7,0.9hz,1h),7.35(t,j＝7.0hz,1h),2.66(s,3h).

步驟3:將222.6mg(1mmol)2-氯-3-醛基-4-羰基-4h-9-甲基吡啶[1,2-α]嘧啶加入5ml無水乙醇中，滴加484.7mg(4mmol)苯乙胺，室溫反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，固體用乙醇充分洗滌，得到320.2mg淡黃色固體，產(chǎn)率78％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.69(s,1h),8.86(s,1h),8.79(d,j＝7.0hz,1h),7.47(d,j＝6.7hz,1h),7.43–7.05(m,10h),6.77(t,j＝7.0hz,1h),3.90–3.71(m,4h),2.91(t,j＝7.4hz,2h),2.86(t,j＝7.3hz,2h),2.47(s,3h).

步驟4：將1.44g(10mmol)n-(2-氨基丙基)嗎啉和1.36g(1.2mmol)氰基乙酸乙酯加入25ml茄形瓶中，反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醚洗滌三次，干燥，放入-20℃冰箱中，得到1.7g淡黃色固體，產(chǎn)率80％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.90(s,1h),3.78–3.75(m,4h),3.40(dd,j＝11.5,5.8hz,2h),3.35(s,2h),2.52–2.48(m,6h),1.72(ddd,j＝12.2,7.6,3.7hz,2h).

步驟5:將108mg(0.5mmol)9-甲基-2-(2-苯基乙胺基)-3-(2-苯乙基亞胺甲基)吡啶[1,2-a]并嘧啶-4-酮和103.5mg(0.55mmol)2-氰基-n-(3-(4-嗎啉基)丙基)乙酰胺加入2ml氯仿中，回流反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚，過濾，固體用無水乙醇重結(jié)晶，得到約60mg產(chǎn)物，產(chǎn)率32％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.88(d,j＝6.8hz,1h),7.65(dt,j＝6.9,1.4hz,1h),7.35–7.27(m,4h),7.24(d,j＝4.8hz,1h),7.01(t,j＝7.0hz,1h),4.62(s,2h),3.72(t,j＝4.7hz,4h),3.52(q,j＝6.2hz,2h),3.05(t,j＝8.1hz,2h),2.59(s,3h),2.49(d,j＝6.6hz,5h),1.82(q,j＝6.7hz,3h).

其他式i化合物可以通過類似的方法，使用相應(yīng)的原料進行制備。

2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類類化合物核磁數(shù)據(jù)列于下表。

以下為通式(i)所示的2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物抑制spop活性實驗。

實驗實施例一：細胞增殖實驗(mtt)對2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物抑制spop活性評價

腎癌細胞株a498用含有10％胎牛血清的培養(yǎng)液(dmem/hg培養(yǎng)基，100u青霉素，100u鏈霉素，10％胎牛血清)配成濃度為5×10⁴-1×10⁵個/ml細胞懸液。96孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種100μl細胞懸液，37℃和5％co2條件下培養(yǎng)過夜至貼壁生長，隨后加入濃度梯度表1中的化合物，繼續(xù)培養(yǎng)68h后，每孔加入10μl噻唑藍溶液(5mg/ml)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，完全吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加150μl二甲亞砜(dmso)，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。酶標(biāo)儀測定490nm波長的吸光值，記錄結(jié)果并計算細胞存活率。以化合物濃度為橫坐標(biāo)，細胞存活率為縱坐標(biāo)作圖，通過graphpadprism5.0軟件非線性回歸擬合曲線得到ic50值。2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物ic50值列于表1。從表1中可以看到，2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物可以抑制spop活性。

表12-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物ic50值

實驗實施例二：細胞增殖實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對6株腎癌細胞系和1株正常腎小管上皮細胞系的抑制活性

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

本實驗選用的腎癌細胞系包括a498、caki-2、ketr-3，769-p，os-rc-2和786-o，正常腎小管上皮細胞為hk-2細胞。細胞在含10％(vol/vol)胎牛血清，100u/ml青霉素和100ng/ml鏈霉素的dmem/hg培養(yǎng)基(a498、ketr-3)或mccoy’s5a培養(yǎng)基(caki-2)或rpmi1640培養(yǎng)基(786-o、769-p、os-rc-2)或dmem/f121:1培養(yǎng)基(hk-2)中培養(yǎng)。細胞增殖實驗實施方法如實驗實施例一。從附圖2中可以看出，spop-b-30和spop-b-8可以顯著抑制腎癌細胞的增殖活性，但對正常腎小管上皮細胞hk-2(非腫瘤細胞)抑制活性不明顯。

實驗實施例三：蛋白質(zhì)免疫印跡法實驗(westernblot)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物對spop下游信號通路的抑制活性

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

將2mla498細胞株重懸液(5×10⁴-1×10⁵個/ml)加入6孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)至細胞貼壁狀態(tài)。加入濃度梯度spop-b-30和spop-b-88，繼續(xù)培養(yǎng)10h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖液洗滌3次，加入150μlripa細胞裂解液和1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)，置冰上裂解30min。用細胞刮刮取裂解物至1.5ml離心管，4℃下15000g離心20min，上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，用bca法測定上清液蛋白濃度。取100μl上清液加入25μl5×上樣緩沖液，100℃加熱10min，12000g離心1min。根據(jù)測定濃度調(diào)整上樣量，進行聚丙烯酰胺變性電泳(sds-page)。分離的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(nc膜)，然后通過5％脫脂牛奶封閉，孵育一抗(兔源pten抗體)，tbst緩沖液洗滌，孵育二抗(辣根過氧化物酶hrp標(biāo)記的羊抗兔抗體)，tbst緩沖液洗滌，最后通過增強化學(xué)發(fā)光法(ecl)發(fā)光顯影步驟來檢測蛋白量。從附圖3中可以明顯的看出，隨著spop-b-30和spop-b-8濃度增加，spop底物pten和dusp7含量增加，下游信號通路活性分子akt和erk1/2磷酸化作用減弱，說明spop-b-30和spop-b-8可以抑制spop活性，進而增加抑癌底物蛋白pten和dusp7含量。

實驗實施例四：免疫共沉淀實驗(co-ip)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物細胞內(nèi)競爭性抑制spop與底物相互作用

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

在60mm培養(yǎng)皿中種植hek293細胞，密度約30％-50％。次日轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒myc-pten，flag-spop。轉(zhuǎn)染40h，各組加入對應(yīng)量小分子化合物，8h后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的pbs洗滌兩次。吸干殘余的pbs后在每皿細胞加入預(yù)冷的200μlripa細胞裂解液，用預(yù)冷的細胞刮將細胞從培養(yǎng)皿上刮下來，吸取懸液到ep管中，冰上放置10-30min。4℃條件下，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的ep管，bca法定量蛋白濃度。調(diào)平蛋白濃度后預(yù)留30μl總蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水煮5分鐘變性。每個樣品取20μl抗體偶聯(lián)的瓊脂糖beads懸液，用pbst洗滌三次，最后按體積進行1:1重懸。每個樣品中加30μlbeads重懸液，再加300μlripa裂解液，4℃旋轉(zhuǎn)孵育4h或過夜。4℃下5000g離心1分鐘，去上清。加入500μlpbst緩沖液，4℃旋轉(zhuǎn)洗滌10分鐘，4℃下5000g離心1分鐘，去上清。重復(fù)洗三次。最后一次離心去上清后，盡量吸干凈參與的上清，然后加入30μl2×蛋白上樣緩沖液，沸水中變性5分鐘。變性后的樣品室溫下8000g離心，吸取上清進行sds-page電泳，注意不要吸到beads。從附圖4可以明顯看出，spop-b-30和spop-b-88可以在細胞內(nèi)抑制spop與底物pten相互結(jié)合。

實驗實施例五：體內(nèi)泛素化實驗(invivoubiquitinationassay)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物細胞內(nèi)抑制spop對底物的泛素化作用

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

在60mm培養(yǎng)皿中種植hek293細胞，密度約30％-50％。次日將myc-pten，flag-spop以及ha-ub分別共轉(zhuǎn)染hek細胞。轉(zhuǎn)染后40h，各組加入對應(yīng)量小分子化合物，4h后加入10μmmg132的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置于冰盒上，用預(yù)冷的pbs洗一次后加入100μl預(yù)冷的變性裂解液(1％sds；0.5mmedta；1mmdtt；50mmtris,ph7.5)。快速用細胞刮將細胞從培養(yǎng)皿刮至1.5mlep管中，隨即在100℃變性5min。變性結(jié)束后將裂解液置于冰上冷卻，最后加入900μl的ripa裂解液進行稀釋。稀釋完后用超聲處理，超聲條件為：振幅10％，間歇10s開關(guān)，總超聲時間1分鐘。4℃下12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到新的ep管中。依據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)平樣品間蛋白濃度。預(yù)留100μl作為input，加蛋白上樣緩沖液100℃變性5min。其余裂解液用myc抗體偶聯(lián)的瓊脂糖beads進行免疫沉淀，最后的洗脫產(chǎn)物用ha抗體進行免疫印跡。附圖5結(jié)果可以明顯看出，spop-b-30和spop-b-88可以在細胞內(nèi)抑制spop對底物pten的泛素化作用。

實驗實施例六：表面等離子共振實驗(spr)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物與spop蛋白相互作用

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

新鮮純化的spop^math蛋白(純度＞95％，濃度5mg/ml)用10mm乙酸鈉溶液(ph4.5)稀釋至0.1mg/ml。通過biacoret200(ge公司)采用標(biāo)準(zhǔn)的氨基偶聯(lián)程序?qū)pop^math蛋白偶聯(lián)至cm5芯片上。實驗前cm5芯片用hbs-ep緩沖液平衡2h。spop-b-30和spop-b-88用hbs-ep緩沖液梯度稀釋，以30μl/min流速平衡60s，結(jié)合120s，接著沖洗120s。所得的相應(yīng)曲線通過bia數(shù)據(jù)分析軟件(ge公司)擬合，得到相應(yīng)kd值。從附圖6中可以明顯看出，spop-b-30和spop-b-88與spop^math蛋白有一定的結(jié)合作用。

實驗實施例七：熒光偏振實驗(fp)驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物與spop蛋白相互作用

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

熒光偏振(fluorescencepolarization,fp)實驗在多功能酶標(biāo)儀(perkinelmer公司)上完成。儀器型號為envisionmultilabelplatereader。實驗用異硫氰酸熒光素(fitc)標(biāo)記的多肽作為示蹤底物，序列為fitc-lacdevtsttsssta(吉爾生化公司合成)。在100μl羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(50mm，ph7.5)緩沖液中加入2μmspop^math、20nm多肽底物，濃度梯度spop-b-30和spop-b-88，4℃孵育1h，檢測其熒光偏振值。所用激發(fā)光和發(fā)射光分別為480nm和535nm。實驗重復(fù)三次，所用實驗數(shù)據(jù)采用graphpadprism5.0軟件分析。從附圖7中可以看出，spop-b-30和spop-b-88與與spop蛋白相互作用。

實驗實施例八：小鼠動物實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物毒性

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30和spop-b-88為例。

化合物體內(nèi)毒性實驗所用6至8周齡balb/c和icr小鼠分別購自上海斯萊克實驗動物有限公司(slac)和上海西普爾必凱實驗動物有限公司。隨機分組，每組3只。每天一次腹腔注射溶劑、80mg/kg，120mg/kg化合物，并稱量體重和檢查活動狀態(tài)。6-7天后眼眶采血，進行血液學(xué)分析和血漿生化檢測。小鼠麻醉猝死后取內(nèi)臟(心臟，肝臟、脾臟，肺和腎臟)進行he染色和病理切片檢測。附圖8可以看出，化合物注射濃度為80mg/kg為安全濃度。

實驗實施例九：小鼠動物實驗檢測2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物體內(nèi)代謝

實驗以2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物中的spop-b-30為例。

4-6周齡balb/c小鼠隨機分組，每組3只。化合物使用生理鹽水，0.5％2-苯乙醇，1.5％吐溫-80作為溶劑配制懸濁液進行腹腔注射，給化合物濃度為10mg/kg。分別在給化合物后0.25，0.5，1，2，4，6，10和24小時時間點進行尾靜脈采血，每只采血0.15ml。血樣采用edta抗凝，離心取上清進行l(wèi)c-ms/ms方法檢測血清中spop-b-30化合物含量。從附圖9中可以計算出血藥濃度最高出現(xiàn)在給藥0.5小時后，為1070ng/ml，半衰期為6.25小時。

實驗實施例十：小鼠動物實驗驗證2-亞胺-5-酮基-2,5-二氫-1-h-二吡啶并[3,4-c:1’,2’-f]嘧啶類化合物活性

a498細胞用dmem/hg+10％胎牛血清培養(yǎng)基在5％co2、37℃條件培養(yǎng)。收集胰酶消化后的a498細胞，用無胎牛血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，細胞數(shù)至10⁸細胞/毫升濃度。取-20℃保存的基質(zhì)膠(martrigel，bd公司)在4℃自然溶化，細胞懸液：基質(zhì)膠martrigel3:1(v/v)混合后即刻注射100μl(10⁷個細胞)至6周齡裸鼠右前肢腋窩皮下。觀察腫瘤生長狀況并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長度(a毫米)和寬度(b毫米)，按照v＝a*b²/2計算腫瘤體積，待腫瘤體積大約125mm³時進行分組，40只實驗裸鼠分4組，每組10只?；衔飐pop-b-30用溶劑(生理鹽水，0.5％2-苯乙醇，1.5％吐溫-80)至5mg/ml，spop-b-88用生理鹽水溶解至5mg/ml。每天按照0，40，60，80mg/kg量進行腹腔注射，并每3天進行一次體重稱量和腫瘤測量，進行相應(yīng)護理和記錄。觀察對照組和實驗組腫瘤生長情況，25天左右停止給藥，對裸鼠進行麻醉猝死并進行解剖，每組分別取2只裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟進行組織he染色觀察。同時分離出腫瘤進行稱重、拍照和液氮凍存，保存的腫瘤組織用于蛋白免疫印跡檢測組織pten量。

從附圖10中可以看出，給藥spop-b-30和spop-b-88的小鼠的腫瘤體積明顯小于只注射溶劑的小鼠，從腫瘤組織的的蛋白免疫印跡檢測中，同樣可以觀測到組織中spop含量明顯降低。動物實驗表明spop-b-30和spop-b-88可以通過抑制spop來減緩腫瘤的生長。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。