專利名稱：透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物及其生產(chǎn)方法，特別是涉及一種非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物，其特征為，所述衍生物是具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽通過酰胺化反應(yīng)發(fā)生交聯(lián)后得到的產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(后文用縮寫“HA”代替)是一種生物聚合物材料。它的重復(fù)單元包括N-乙?；?D-葡糖胺和D-葡糖醛酸，且線性重復(fù)聯(lián)接。這種聚合材料大量地存在于眼睛中的玻璃狀液、滑液和結(jié)締組織等中。本說明書中，術(shù)語“HA”意思是透明質(zhì)酸和它的任何一種鹽類。本發(fā)明所指的透明質(zhì)酸鹽包括，但不僅限于，無機(jī)鹽，如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀等等；和有機(jī)鹽，如透明質(zhì)酸四丁銨鹽等。根據(jù)本發(fā)明，在透明質(zhì)酸鹽類中優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。
HA的衍生物已經(jīng)開發(fā)出很多用途，如防止外科手術(shù)后的組織粘連、面部皺紋的矯正、皮膚增長(zhǎng)(dermal augmentation)、組織工程及骨關(guān)節(jié)炎的粘性添加劑(osteoarthritic viscosupplement)等方面。HA衍生物根據(jù)其水溶性可以大致地分為水溶性衍生物和非水溶性衍生物。對(duì)于非水溶性衍生物而言，其生產(chǎn)方法可以大致地分為兩類一是HA與單官能團(tuán)的化合物反應(yīng)，并以HA的線性鏈與該化合物結(jié)合；另一種是HA與雙官能團(tuán)或多官能團(tuán)的化合物反應(yīng)以形成交聯(lián)的HA。
一些文獻(xiàn)曾經(jīng)報(bào)道過各種各樣采用雙官能團(tuán)化合物，如二乙烯基砜、二環(huán)氧化物、二鹵化物、甲醛等合成許多交聯(lián)的、非水溶性的HA衍生物的例子。
美國專利4,582,865號(hào)曾經(jīng)報(bào)道過選用二乙烯基砜來交聯(lián)HA。美國專利4,713,448號(hào)中使用甲醛以完成交聯(lián)反應(yīng)。PCT專利公開號(hào)WO86/00912中也報(bào)道過使用具有環(huán)氧基的化合物交聯(lián)各種具有羧基的多糖的例子。
有報(bào)道稱，如果HA的羧基在水溶液狀態(tài)下被EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽]活化，然后與含單個(gè)氨基的化合物反應(yīng)形成酰胺鍵，則HA衍生物的水溶性將有所下降(見美國專利4,937,270號(hào))。另一個(gè)例子中，HA被EDC活化后與各種多陰離子多糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)(見美國專利5,017,229號(hào))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，所述衍生物的特征為是具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與HA通過酰胺化反應(yīng)交聯(lián)而得到的產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明涉及HA的交聯(lián)酰胺衍生物及其生產(chǎn)方法。上述衍生物可以通過酰胺化反應(yīng)由具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的、不同分子量的高聚物或低聚物與各種分子量的HA交聯(lián)而獲得。上述高聚物或低聚物優(yōu)選多陽離子高聚物或低聚物。本發(fā)明制得的HA的交聯(lián)酰胺衍生物具有良好的粘彈性，因此它們的用途非常廣泛。本發(fā)明制得的HA的交聯(lián)酰胺衍生物也可以具有類似海綿或橡膠那樣的特性。
具體而言，本發(fā)明具有這樣的特征當(dāng)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的多陽離子高聚物或低聚物與具有羧酸酯基的HA反應(yīng)時(shí)，上述多陽離子高聚物或低聚物與上述HA將因氨基和羧基之間的靜電引力而彼此靠近，因此能得到更快的反應(yīng)速率和更高的反應(yīng)產(chǎn)率。因?yàn)榫哂袃蓚€(gè)或兩個(gè)以上的氨基的多陽離子高聚物或低聚物與HA不形成離子鍵而只能通過酰胺化反應(yīng)形成共價(jià)鍵，因此根據(jù)本發(fā)明得到的HA的交聯(lián)酰胺衍生物是一種抗活體內(nèi)各種生理?xiàng)l件，即高鹽濃度、低pH值等的生物材料。而那些可能被稱為是新生物材料的化合物具有不同于現(xiàn)有的使用EDC交聯(lián)而得到的非水溶性的HA衍生物的性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明制得的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物具有如下的特征該化合物不僅顯示了高粘彈性，具有生物學(xué)上可接受材料的極好特性，更是一類克服了現(xiàn)有的非水溶性HA衍生物易于在活體中分解和易于在如酸性等苛刻的條件下溶解等缺點(diǎn)的新型生物材料。
本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，所述化合物由具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的多陽離子高聚物或低聚物與HA通過酰胺化反應(yīng)彼此交聯(lián)得到。具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物的意思是每個(gè)高聚物或低聚物分子具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基。在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，其特征為，所述高聚物或低聚物具有可接受質(zhì)子的氨基，以便其在酸性或中性條件下具有正電荷；并且上述具有氨基的高聚物或低聚物與HA的羧基在羧基活性劑存在的條件下發(fā)生酰胺化反應(yīng)，以產(chǎn)生本發(fā)明的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，所述酰胺化反應(yīng)由高聚物或低聚物的氨基與HA的羧基之間的靜電引力的誘導(dǎo)而發(fā)生。在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，其特征為，反應(yīng)混合物中HA的羧基與多陽離子高聚物或低聚物的氨基的比率為從1∶0.01到100。在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，其特征為，具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與具有羧基的HA在羧基活性劑存在下發(fā)生酰胺化反應(yīng)以產(chǎn)生本發(fā)明的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物。在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物，其特征為，所述酰胺化反應(yīng)在酸性或中性條件下發(fā)生；所述高聚物或低聚物是通過對(duì)其氨基質(zhì)子化而帶正電荷的多陽離子高聚物或低聚物，因此多陽離子高聚物或低聚物的氨基與HA的羧基通過該兩個(gè)基團(tuán)之間的靜電引力的促進(jìn)而發(fā)生酰胺化反應(yīng)。
本發(fā)明也提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的生產(chǎn)方法，其特征為，該方法包括將具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與HA反應(yīng)的步驟。在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述高聚物或低聚物具有可接受質(zhì)子的氨基，以便其在酸性或中性條件具有正電荷，而使高聚物或低聚物的氨基與HA的羧基發(fā)生反應(yīng)。在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的生產(chǎn)方法，其特征為，反應(yīng)混合物中HA的羧基與高聚物或低聚物的氨基的比率為從1∶0.01到100。在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的生產(chǎn)方法，其特征為，所述酰胺化反應(yīng)在酸性或中性條件下發(fā)生；所述高聚物或低聚物是通過對(duì)其氨基質(zhì)子化而帶正電荷的多陽離子高聚物或低聚物，由此高聚物或低聚物的氨基與HA的羧基發(fā)生反應(yīng)。
上述具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物的例子有具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的天然材料、使用這些天然材料合成的合成材料及這些高聚物或低聚物的衍生物。上述高聚物的分子量?jī)?yōu)選從約3,000到10,000,000，而上述低聚物的分子量?jī)?yōu)選從約300到3,000。
在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明提供了非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的生產(chǎn)方法，其特征為，該方法包括了以下步驟將HA的水溶液與具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物的水溶液混合以誘導(dǎo)HA與高聚物或低聚物之間的靜電引力；使現(xiàn)有的、彼此接近的兩個(gè)官能團(tuán)，即HA的羧基與高聚物或低聚物的氨基發(fā)生反應(yīng)以生成非水溶性的生物材料；用水或酸溶液等洗滌反應(yīng)產(chǎn)物；分離精制材料并干燥所得的材料。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法具有簡(jiǎn)易反應(yīng)、簡(jiǎn)單的分離工序和不需要使用有毒的有機(jī)溶劑的特征。
加入酰胺化反應(yīng)中用于活化羧基的羧基活性劑的例子有碳化二亞胺類化合物。優(yōu)選的碳化二亞胺選自易溶于水的化合物，如EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽]、與EDC具有相似結(jié)構(gòu)的1-烷基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺類、ETC(1-乙基-3-(3-(三甲基氨溶)丙基)碳化二亞胺)和CMC(1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳化二亞胺)。
更優(yōu)選地，上述酰胺化反應(yīng)可視需要選擇性地加入助劑?？扇苡谒?、能形成活性酯的材料均可作為上述酰胺化反應(yīng)的助劑。助劑的例子可選自NHS(N-羥基丁二酰亞胺)、HOBt(1-羥基苯并三唑)，HOOBt(3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪)、HOAt(1-羥基-7-氮雜苯并三唑)及Sulfo-NHS(N-羥基磺基丁二酰亞胺)等。
與不使用助劑相比，使用助劑如NHS，可以減少副產(chǎn)物如N-酰基脲的生成，而兩種情況下所得到的HA的交聯(lián)酰胺衍生物的材料特性并無顯著差異。
為了活化羧基基團(tuán)，本發(fā)明優(yōu)選的例子中EDC的添加量為0.0001到100mg/ml，NHS的添加量為0到100mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選用于HA的交聯(lián)酰胺衍生物及其生產(chǎn)方法的HA的分子量在10,000至10,000,000的范圍內(nèi)；HA的濃度可以為0.01至100mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明，具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物的例子可選自殼聚糖、殼聚糖衍生物、脫?；腍A、脫?；腍A衍生物、具有兩個(gè)或兩個(gè)以上可反應(yīng)和可接受質(zhì)子的氨基的聚乙二醇或蛋白質(zhì)或多肽等化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選用于HA的交聯(lián)酰胺衍生物及其生產(chǎn)方法的、具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物是能在pH值為2至8的水溶液中實(shí)質(zhì)溶解的那些化合物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選用于酰胺化反應(yīng)的溶劑可以是水、緩沖水溶液等，但不僅限于這些。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選酰胺化反應(yīng)的溫度為0至40℃，更優(yōu)選地，可以為室溫。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選酰胺化反應(yīng)的pH值可以為2至8，更優(yōu)選地，可以為4到6。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選酰胺化反應(yīng)的時(shí)間為0.5到20小時(shí)，更優(yōu)選地，為2小時(shí)。
本發(fā)明的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物可被制成凝膠狀、膜狀、小球狀和網(wǎng)狀等。
對(duì)于本說明書中的每一個(gè)反應(yīng)，其產(chǎn)物可以根據(jù)公知技術(shù)中通常的方法從該反應(yīng)體系中分離和/或精制。分離和/或精制的示例可以從以下操作方法里選取常壓或真空蒸餾、重結(jié)晶、柱色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法、親和色譜法、薄層色譜法、相分離、溶劑萃取和洗滌等。精制操作可以在每一步或一系列反應(yīng)之后進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，用于酰胺衍生物合成所需的試劑和起始反應(yīng)物材料可以很容易地根據(jù)已知文獻(xiàn)所公開的方法或以上提及的方法來制備或從世界各地的許多生產(chǎn)商那里購買。


圖1為實(shí)施例3表2中樣品A的紅外圖譜。
圖2為實(shí)施例3表2中樣品B的紅外圖譜。
圖3為實(shí)施例3表2中樣品C的紅外圖譜。
圖4為實(shí)施例3表2中樣品D的紅外圖譜。
圖5為有關(guān)透明質(zhì)酸衍生物與殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的結(jié)構(gòu)和合成步驟的圖解表達(dá)式。
具體實(shí)施例方式
通過下文給出的實(shí)施例和僅用于說明的附圖和圖表，本發(fā)明將得到更完整的理解，但這些并非是對(duì)本發(fā)明的限定性說明。
實(shí)施例1與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物的制備制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液(分子量≥2,000,000)和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。將以上的透明質(zhì)酸鈉水溶液不斷攪拌，同時(shí)在該水溶液中加入以上的殼聚糖-鹽酸水溶液。在殼聚糖-鹽酸水溶液加完后，殼聚糖-透明質(zhì)酸鹽沉淀下來。兩種溶液混合完畢后溶液的pH值為4至5。根據(jù)表1所示的濃度，緩慢地向上述混合溶液中加入EDC和NHS并不斷攪拌。加完反應(yīng)物后，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行2小時(shí)。
表1

表1中未加入EDC和NHS的樣品，即殼聚糖和透明質(zhì)酸以離子鍵的形式結(jié)合并沉淀的樣品，可以在高鹽濃度或低pH值的條件下溶于水。向上述混合溶液中緩慢地加入1N的鹽酸水溶液直至該樣品(表1中A組樣品)完全溶解。對(duì)于100ml的上述混合溶液，這次加料需要約30分鐘的時(shí)間和約3ml的1N的鹽酸水溶液才能完全溶解樣品。其余樣品(添加過EDC和NHS，表1中B、C、D和E組樣品)在同樣條件下得到處理，并且未反應(yīng)的殼聚糖和HA將簡(jiǎn)單地以離子鍵結(jié)合、沉淀，并從通過酰胺化反應(yīng)得到的HA與殼聚糖交聯(lián)的酰胺衍生物里除去。將上述酸處理后仍未溶解的剩余部分用水充分地沖洗以使之完全除去未反應(yīng)的EDC或NHS和這些物質(zhì)的副產(chǎn)物。沖洗后再將這些剩余部分置于真空下，于25℃干燥。非水溶性的、HA與殼聚糖交聯(lián)的酰胺衍生物能夠通過以上步驟得到。反應(yīng)中EDC和NHS的添加量越大，則最終產(chǎn)物的產(chǎn)量也越高。以下的產(chǎn)物百分率即為從各組樣品中得到的HA與殼聚糖交聯(lián)的酰胺衍生物的產(chǎn)率B組為49％；C組為58％；D組為71％；E組為77％。
實(shí)施例2與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物的制備制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液(分子量≤2,000,000)和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。通過上述兩種材料之間的反應(yīng)得到非水溶性的、HA與殼聚糖交聯(lián)的酰胺衍生物，再按實(shí)施例1所描述的步驟精制產(chǎn)物。如同實(shí)施例1所描述的，反應(yīng)中EDC和NHS的添加量越大，則最終產(chǎn)物的產(chǎn)量也越高。以下的產(chǎn)物百分率即為從各組樣品中得到的HA與殼聚糖交聯(lián)的酰胺衍生物的產(chǎn)率B-1組為53％；C-1組為62％；D-1組為69％；E-1組為77％。
實(shí)施例3與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物的耐酸性和抗高鹽度的測(cè)試及形成酰胺的確定制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。將以上的透明質(zhì)酸鈉水溶液不斷攪拌，同時(shí)在該水溶液中加入以上的殼聚糖-鹽酸水溶液。在殼聚糖-鹽酸水溶液加完后，殼聚糖-透明質(zhì)酸鹽沉淀下來。兩種溶液混合完畢后溶液的pH值為4至5。根據(jù)下面表2所示的濃度，緩慢地向上述混合溶液中加入EDC和NHS并不斷攪拌。加完反應(yīng)物后，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行2小時(shí)。
假如上述產(chǎn)物不用酸處理而直接用水沖洗幾次后真空干燥精制，則由離子鍵連接的殼聚糖-HA絡(luò)合沉淀物仍然混合存在于最終產(chǎn)物中。如果在反應(yīng)物中加入EDC和NHS，經(jīng)過實(shí)施例1中所描述的酸處理和精制工序得到最終產(chǎn)物(表2樣品A、B和C)；而若在反應(yīng)物中未加入EDC和NHS，經(jīng)過精制工序但不用酸處理，則得到由離子鍵連接的殼聚糖-HA絡(luò)合沉淀物(表2樣品D)。兩者真空干燥后，分別分散于0.1N的鹽酸水溶液中，并使每個(gè)樣品濃度均為0.02％(重量體積比)，再測(cè)定各樣品完全溶解所需的時(shí)間，結(jié)果列于表2。
表2

為了觀察表2樣品在1N的鹽酸水溶液中的行為，將每個(gè)樣品分散于1N的鹽酸水溶液使之濃度為1％(重量體積比)，再將每個(gè)樣品溶液攪拌24小時(shí)，之后觀察現(xiàn)象并記錄結(jié)果于表3。
表3

為了檢測(cè)表2所列樣品耐高鹽濃度的性能，將表2中的樣品加入1N的氯化鈉水溶液中并不斷攪拌該溶液最終達(dá)到1％(重量百分比)的濃度。只有樣品D的沉淀物在30分鐘后完全溶解且形成透明溶液，其余樣品均保持各自的形態(tài)達(dá)10天以上。這個(gè)結(jié)果意味著樣品A、B和C并沒有通過離子鍵形成絡(luò)合物，而是通過殼聚糖和HA之間的共價(jià)鍵交聯(lián)在一起。
樣品A至D按實(shí)施例3所描述的程序制備和精制，再用真空干燥后，測(cè)其紅外光譜圖譜，列于圖1至4。樣品中一部分HA與已接受質(zhì)子的殼聚糖上的氨基形成鹽，其羧基上的羰基伸縮振動(dòng)造成了圖上1728.6cm-1左右的峰，圖譜顯示，該峰隨交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行而相對(duì)衰減(參考圖1至4)。圖上1557.5cm-1的峰由殼聚糖上已接受質(zhì)子的伯胺的變形所引起，圖譜顯示，該峰隨交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行而相對(duì)衰減，直至樣品A的圖譜時(shí)僅為一個(gè)肩峰(參考圖1至4)。這個(gè)結(jié)果表明形成離子鍵(鹽形式)的氨基和羧基的量均隨它們之間反應(yīng)的進(jìn)行而減少。這與圖上酰胺的羰基伸縮振動(dòng)峰1600.6cm-1隨交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行而相對(duì)增大的事實(shí)是相符合的(參考圖1至4)。因?yàn)楸娝苤S著交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，樣品中氫鍵數(shù)目將會(huì)增多，從而使得酰胺上羰基的伸縮振動(dòng)峰移往更低的波數(shù)，因此圖譜上該峰(1600.6cm-1)所在的波數(shù)低于普通酰胺峰的位置(大約1660cm-1，J.Bioactive & Compatible Polymers，9，429-447(1994))的事實(shí)是與根據(jù)本發(fā)明的材料如耐酸性和耐高鹽度性能測(cè)試所示已經(jīng)交聯(lián)的事實(shí)相吻合的。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，根據(jù)本發(fā)明，HA的這些衍生物已經(jīng)通過酰胺形式交聯(lián)在一起。圖譜中并未觀察到可能在副反應(yīng)中生成的酯(1745至1760cm-1)和羧酸酸酐(1800cm-1)的形成(Silverstein等，Spectrometric Identification ofOrganic Compounds，122至124頁，John Wiley and Sons，紐約(1981))。圖譜中也未觀察到在使用EDC時(shí)可能帶來的副產(chǎn)物N-?；?1700cm-1)的形成(見美國專利號(hào)5,527,893)。
總結(jié)以上圖譜的分析結(jié)果和以上耐酸性、耐高鹽度性能測(cè)試結(jié)果，圖5概略地顯示了HA與殼聚糖交聯(lián)的酰胺衍生物的結(jié)構(gòu)和它的合成步驟。
實(shí)施例4用脫?；腍A制備HA的交聯(lián)酰胺衍生物如果將HA溶液在高或低pH值條件下升高溫度，其將伴隨著鏈分解發(fā)生脫?；灾劣谛纬梢粋€(gè)真正的活性胺。該胺可以遵循如實(shí)施例1或2中的殼聚糖一樣的化學(xué)原理與羧酸基團(tuán)形成酰胺鍵。
為了脫去HA上的?；?，將HA與0.2至10N的氫氧化鈉水溶液在25至50℃下反應(yīng)1至30小時(shí)。用鹽酸中和來終止反應(yīng)，透析該溶液后，再將它冷凍干燥即可得到脫?；腍A。用Roth’s熒光測(cè)定法(見Anal.Chem.，1971，43，880至882頁；J.Chromatogr.，1973，83，353至356頁；Clin.Chem.Clin.Biochem.，1976，14，361至364頁)測(cè)定生成的氨基的量后，即可確定脫酰度，并作為反應(yīng)結(jié)果。脫酰度可以用以下的公式進(jìn)行計(jì)算。
脫酰度＝[生成的胺的濃度]/[HA重復(fù)單元的濃度]×100％根據(jù)HA每個(gè)重復(fù)單元只有一個(gè)羧基的假定，通過測(cè)定HA中羧基的量可得到HA的重復(fù)單元的濃度。羧基定量分析可以采用咔唑法(Anal.Biochem.，1962，4，330)。
作為上述反應(yīng)結(jié)果，脫酰度為1至40％。將上述方法得到的脫?；腍A進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。在脫?；腍A(10mg/ml)中加入EDC(2.4mg/ml)和NHS(2.9mg/ml)，反應(yīng)在25℃下持續(xù)2小時(shí)，再將形成的衍生物精制和真空干燥。形成的非水溶性凝膠產(chǎn)率為51％。作為以上形成的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的耐酸性和耐高鹽度性能的測(cè)試結(jié)果，上述HA酰胺衍生物在0.1N的鹽酸水溶液中能保持它的不溶解狀態(tài)達(dá)48小時(shí)以上，在1N的氯化鈉水溶液中可以長(zhǎng)達(dá)10天以上保持它的不溶解狀態(tài)。此處的測(cè)試方法和上述實(shí)施例3相同。
實(shí)施例5用脫?；腍A制備HA的交聯(lián)酰胺衍生物在脫?；腍A中，有很多像殼聚糖中一樣的、能與羧基發(fā)生反應(yīng)的氨基。因此可得到采用這些氨基并像實(shí)施例1中所描述的非水溶性的、HA酰胺衍生物。將脫酰基的HA的水溶液與透明質(zhì)酸鈉(分子量≥2,000,000)的水溶液混合后得到濃度均為0.5mg/ml的混合溶液，向混合溶液內(nèi)加入EDC(0.2mg/ml)與NHS(0.24mg/ml)并在25℃下反應(yīng)2小時(shí)。然后將產(chǎn)物精制和干燥。結(jié)果形成的非水溶性凝膠的產(chǎn)率為56％。作為以上形成的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的耐酸性和耐高鹽度性能的測(cè)試結(jié)果，上述HA酰胺衍生物在0.1N鹽酸水溶液中能保持它的不溶解狀態(tài)達(dá)48小時(shí)以上，在1N的氯化鈉水溶液中可以長(zhǎng)達(dá)10天以上保持它的不溶解狀態(tài)。此處的測(cè)試方法和上述實(shí)施例3相同。
實(shí)施例6生產(chǎn)與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的膜制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液(分子量≥2,000,000)和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。將上述透明質(zhì)酸鈉水溶液灌注到玻璃板上，再將EDC和NHS像表1中的B、C、D和E組一樣按不同濃度加入上述透明質(zhì)酸鈉水溶液。等它們混合均勻后，將上述殼聚糖-鹽酸水溶液加至板上以于板上生成白色薄膜。通過干燥上述白色薄膜可得到由與殼聚糖交聯(lián)的HA的酰胺衍生物制成的膜。以下的產(chǎn)物百分率即為從各組樣品中得到的與殼聚糖的HA交聯(lián)酰胺衍生物的產(chǎn)率B-2組為51％；C-2組為63％；D-2組為70％；E-2組為79％。
為了檢測(cè)如實(shí)施例3中所描述的耐高鹽度性能，在1N氯化鈉水溶液中加入上述得到的由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的膜并不斷攪拌，得到1％(重量體積比)濃度的溶液，性能測(cè)試結(jié)果表明，該膜可保持形態(tài)長(zhǎng)達(dá)十天以上。
實(shí)施例7生產(chǎn)由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的膜制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液(分子量≤2,000,000)和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。將上述透明質(zhì)酸鈉水溶液灌注到玻璃板上，再將EDC和NHS像表1中的B、C、D和E組一樣按不同濃度加入到上述透明質(zhì)酸鈉水溶液。等它們混合均勻后，將上述殼聚糖-鹽酸水溶液加至板上以于板上生成白色薄膜。通過干燥上述白色薄膜可得到由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的膜。以下的產(chǎn)物百分率即為從各組樣品中得到的與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物的產(chǎn)率B-3組為47％；C-3組為61％；D-3組為70％；E-3組為78％。
為了檢測(cè)如實(shí)施例三中所描述的耐高鹽度性能，在1N氯化鈉水溶液中加入上述得到的由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的膜并不斷攪拌，得到1％(重量體積比)濃度的溶液，性能測(cè)試結(jié)果表明，該膜可保持形態(tài)長(zhǎng)達(dá)十天以上。
實(shí)施例8生產(chǎn)由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的珠把根據(jù)上述實(shí)施例1得到的已干燥的HA酰胺衍生物磨成細(xì)粉末，然后均勻分散至水或生理鹽水等溶劑中，即可得到HA酰胺衍生物溶液，所述溶液可用于注射器擠出制備珠狀與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物。
實(shí)施例9生產(chǎn)由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的珠把根據(jù)上述實(shí)施例2得到的已干燥的HA酰胺衍生物磨成細(xì)粉末，然后均勻分散至水或生理鹽水等溶劑中，即可得到HA酰胺衍生物溶液，所述溶液可用于注射器擠出制備珠狀與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物。
實(shí)施例10制備由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的水合凝膠制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液(分子量≤2,000,000)和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。將以上的透明質(zhì)酸鈉水溶液不斷攪拌，同時(shí)在該水溶液中加入以上的殼聚糖-鹽酸水溶液。在上述混合溶液中加入EDC(0.2至1.2mg/ml)和NHS(0.24至1.44mg/ml)，再在25℃下反應(yīng)2小時(shí)并精制和真空干燥以上產(chǎn)物。干燥后，即得到HA酰胺衍生物(200至700mg)。稱量好上述干燥的產(chǎn)物后，將定量的HA酰胺衍生物浸入水中48小時(shí)，然后取出并擦去其外部的水，可通過測(cè)定其增重來確定單位重量的HA酰胺衍生物中所含的水分。使用流變儀可測(cè)定此含水凝膠的流變性質(zhì)。由此得到以下的測(cè)量值作為測(cè)試結(jié)果。
/[HA衍生物的質(zhì)量]＝1.5至3.0頻率0.01至0.1赫茲之間的儲(chǔ)能模量＝50至300千帕頻率0.01至0.1赫茲之間的損耗模量＝8至50千帕這些模量值與橡膠的模量值范圍較為相似。這個(gè)結(jié)果與本發(fā)明所制得的材料實(shí)質(zhì)上交聯(lián)的事實(shí)是相符合的，因此也表明，這種材料可以用作皮膚增長(zhǎng)的移植物。為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的是，高儲(chǔ)能模量意味著高彈性，而高損耗模量則意味著高粘度?？捎蒙鲜龇椒ㄖ苽渚哂懈哒硰椥缘腍A酰胺衍生物的水合凝膠形式。
實(shí)施例11制備由與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制成的水合凝膠制備1.25mg/ml的透明質(zhì)酸鈉水溶液(分子量≥2,000,000)和0.625mg/ml的殼聚糖-鹽酸水溶液。將以上的透明質(zhì)酸鈉水溶液不斷攪拌，同時(shí)在該水溶液中加入以上的殼聚糖-鹽酸水溶液。在上述混合溶液中加入EDC(0.2至1.2mg/ml)和NHS(0.24至1.44mg/ml)，再在25℃下反應(yīng)2小時(shí)并精制和真空干燥以上產(chǎn)物。干燥后，即得到HA酰胺衍生物(200至700mg)。稱量好上述干燥的產(chǎn)物后，將定量的HA酰胺衍生物浸入水中48小時(shí)以產(chǎn)生水合凝膠形式的HA酰胺衍生物。擦去上述以水合凝膠形式存在的HA酰胺衍生物外部的水。為確定單位重量的HA酰胺衍生物中所含的水分，可測(cè)定其增重。使用流變儀可測(cè)定此含水凝膠的流變性質(zhì)。由此得到以下的測(cè)量值作為測(cè)試結(jié)果。
/[HA衍生物的質(zhì)量]＝1.2至3.0頻率0.01至0.1赫茲之間的儲(chǔ)能模量＝60至330千帕頻率0.01至0.1赫茲之間的損耗模量＝10至50千帕可用上述方法制備具有高粘彈性的HA酰胺衍生物的水合凝膠形式。
實(shí)施例12根據(jù)HA和殼聚糖的分子量及濃度與EDC和NHS的濃度來制備具有不同材料特性的交聯(lián)酰胺衍生物通過結(jié)合以下不同的參數(shù)，可制備具有不同材料特性的HA的交聯(lián)酰胺衍生物。
透明質(zhì)酸鈉的分子量低于300,000；300,000至3,000,000；高于3,000,000。
HA濃度(mg/ml)0.02、0.1、1.0、10和80。
以其溶液的粘度值描述的殼聚糖的分子量(使用Brookfield粘度計(jì)測(cè)定溶于1％乙酸溶液、濃度為1％的殼聚糖溶液的粘度)低分子量(20至200周每秒)；中等分子量(200至800周每秒)；高分子量(800至2000周每秒)。
殼聚糖濃度(mg/ml)0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、40和80。
EDC濃度(mg/ml)0.00096、0.0048、0.0096、0.024、0.048、0.24、0.48、2.4、3.84、4.8、19.2、38.4和76.8。
NHS濃度(mg/ml)0、0.000576、0.001 152、0.001728、0.00288、0.00576、0.00864、0.01152、0.0144、0.01728、0.0288、0.0432、0.0576、0.0864、0.144、0.288、0.432、0.576、0.864、1.44、2.304、2.88、4.32、4.608、5.76、6.912、8.64、11.52、23.04、34.56、46.08、69.12和92.16。
HA酰胺衍生物的水合凝膠形式可以像實(shí)施例10中所描述的那樣利用得到的與殼聚糖交聯(lián)的HA酰胺衍生物制得。使用流變儀可得到以下的測(cè)量值以作為對(duì)這種水合凝膠流變性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果。
/[HA衍生物的質(zhì)量]＝1.0至5.0頻率0.01至0.1赫茲之間的儲(chǔ)能模量＝20至410千帕頻率0.01至0.1赫茲之間的損耗模量＝2至60千帕工業(yè)實(shí)用性因?yàn)橛杀景l(fā)明而制得的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物具有優(yōu)異的粘彈性，因此它在許多方面具有應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)本發(fā)明，這種非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物可廣泛應(yīng)用于防止外科手術(shù)后的組織粘連、面部皺紋的矯正、皮膚增長(zhǎng)、組織工程及骨關(guān)節(jié)炎的粘性添加劑等等。
具體而言，本發(fā)明具有這樣的特征當(dāng)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的多陽離子高聚物或低聚物和上述HA反應(yīng)時(shí)，兩者因?yàn)榘被汪然g的靜電引力而彼此靠近，因而能得到更快的反應(yīng)速率和更高的反應(yīng)產(chǎn)率。因?yàn)榫哂袃蓚€(gè)或兩個(gè)以上氨基的多陽離子高聚物或低聚物和HA之間并非形成離子鍵而是通過酰胺化反應(yīng)形成共價(jià)鍵，因此本發(fā)明的HA的交聯(lián)酰胺衍生物是抗活體內(nèi)生理?xiàng)l件，即高鹽濃度、低pH值等條件的生物材料。而那些可以被稱為新生物材料的化合物具有不同于現(xiàn)有的使用EDC交聯(lián)而得到的非水溶性的HA衍生物的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明制得的非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物具有如下的特征該衍生物不僅顯示出高粘彈性，具有生物學(xué)上可接受材料的極好特性，更是一類克服了現(xiàn)有的非水溶性HA衍生物易于在活體中分解和易于在如酸性等苛刻的條件下溶解等缺點(diǎn)的新型生物材料。
更特別的是，本發(fā)明提供了生產(chǎn)非水溶性的、HA的交聯(lián)酰胺衍生物的方法，其特征為，該方法包括混合HA水溶液與具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物的水溶液以誘導(dǎo)HA和高聚物或低聚物之間的靜電引力；使現(xiàn)有的兩個(gè)互相接近的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，即HA上的羧酸鹽和高聚物或低聚物上的氨基反應(yīng)生成非水溶性的生物材料；用水和酸等溶劑沖洗；分離精制材料；和干燥產(chǎn)物。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)方法具有簡(jiǎn)易反應(yīng)、簡(jiǎn)便的分離操作和不需要使用毒性有機(jī)溶劑等特征。
鑒于上文已經(jīng)用重點(diǎn)突出的具體實(shí)施例詳細(xì)解釋了本發(fā)明，顯然，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，它們不同的變化和修改可能屬于本發(fā)明的范疇和本發(fā)明的技術(shù)原理范圍內(nèi)。因此，這些變化和修改屬于附加的專利權(quán)利要求范圍也是相當(dāng)合理的。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物的方法，該方法包括如下步驟將具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽在羧基活化劑的存在下，通過酰胺化反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的高聚物或低聚物上的氨基可接受質(zhì)子以便在酸性或中性條件下帶有正電荷，由此，在所述的高聚物或低聚物上的氨基與所述的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽上的羧基之間的靜電引力的促進(jìn)下發(fā)生酰胺化反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的酰胺化反應(yīng)在酸性或中性條件下進(jìn)行，所述的高聚物或低聚物是通過其氨基的質(zhì)子化而帶有正電荷的多陽離子高聚物或低聚物，因此多陽離子高聚物或低聚物上的氨基與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽上的羧基通過高聚物或低聚物上的氨基與透明質(zhì)酸上的羧基之間的靜電引力的促進(jìn)而發(fā)生酰胺化反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的高聚物或低聚物選自如下具有兩個(gè)或兩個(gè)以上可接受質(zhì)子并具有反應(yīng)性的氨基的物質(zhì)殼聚糖、殼聚糖衍生物、脫酰基透明質(zhì)酸或它的透明質(zhì)酸鹽、脫?；该髻|(zhì)酸衍生物、脫?；该髻|(zhì)酸鹽衍生物、聚乙二醇或蛋白質(zhì)或多肽。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中反應(yīng)混合物中，透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽上的羧基基團(tuán)與多陽離子聚合物或低聚物上的氨基基團(tuán)的比例在約1∶0.01至100的范圍內(nèi)。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽的分子量在約10,000至10,000,000的范圍內(nèi)，而透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽的濃度在約0.01mg/ml至100mg/ml的范圍內(nèi)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中羧基活化劑為碳化二亞胺類化合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的碳化二亞胺選自如下易溶于水的化合物，如EDC[(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺)鹽酸鹽]，而化合物如NHS(N-羥基丁二酰亞胺)則可作為助劑選擇性地加入到所述的酰胺化反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述碳化二亞胺選自如下易溶于水的化合物，如與EDC結(jié)構(gòu)相似的1-烷基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺、ETC(1-乙基-3-(3-(三甲基氨溶)丙基)碳化二亞胺)和CMC(1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳化二亞胺)，同時(shí)選擇性地將選自NHS(N-羥基丁二酰亞胺)、HOBt(1-羥基苯并三唑)，HOOBt(3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪)、HOAt(1-羥基-7-氮雜苯并三唑)及Sulfo-NHS(N-羥基磺基丁二酰亞胺)的化合物作為助劑加入到所述的酰胺化反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中加入到反應(yīng)中的所述EDC的量在約0.0001至100mg/ml的范圍內(nèi)，而加入到反應(yīng)中的所述NHS的量在約0到100mg/ml的范圍內(nèi)。
11.一種非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物，其特征在于，透明質(zhì)酸的酰胺衍生物是通過具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽之間的酰胺化反應(yīng)而得到的交聯(lián)化合物。
12.如權(quán)利要求11所述的非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物，其中所述高聚物或低聚物具有氨基，該氨基可接受質(zhì)子以便在酸性或中性條件下具有正電荷；具有氨基的高聚物或低聚物與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽上的羧基在羧基活化劑的存在下，發(fā)生酰胺化反應(yīng)；所述反應(yīng)由高聚物或低聚物上的氨基與透明質(zhì)酸的羧基之間的靜電引力誘導(dǎo)而發(fā)生。
13.如權(quán)利要求11或12所述的非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物，所述的高聚物或低聚物選自下列具有兩個(gè)或兩個(gè)以上可接受質(zhì)子并具有反應(yīng)性的氨基的物質(zhì)殼聚糖、殼聚糖衍生物、脫?；该髻|(zhì)酸或它的透明質(zhì)酸鹽、脫?；该髻|(zhì)酸衍生物、脫酰基透明質(zhì)酸鹽衍生物、聚乙二醇或蛋白質(zhì)或多肽。
14.如權(quán)利要求11或12所述的非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物，其中反應(yīng)混合物中，透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽上的羧基基團(tuán)與多陽離子高聚物或低聚物上的氨基基團(tuán)的比例在約1∶0.01至100的范圍內(nèi)。
15.通過權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
16.通過權(quán)利要求3所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
17.通過權(quán)利要求6所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
18.通過權(quán)利要求7所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
19.通過權(quán)利要求8所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
20.通過權(quán)利要求9所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
21.通過權(quán)利要求10所述的方法生產(chǎn)的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物。
22.如權(quán)利要求11所述的非水溶性的透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物，該衍生物具有凝膠、膜、珠狀、網(wǎng)狀或任何可能的特征形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物及其生產(chǎn)方法。此處的透明質(zhì)酸酰胺衍生物的特征為，是將具有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的高聚物或低聚物與透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸鹽通過酰胺化反應(yīng)發(fā)生交聯(lián)后得到的產(chǎn)物。本發(fā)明制得的這種非水溶性的、透明質(zhì)酸的交聯(lián)酰胺衍生物可廣泛應(yīng)用于防止外科手術(shù)后的組織粘連、面部皺紋的矯正、皮膚增長(zhǎng)、組織工程及骨關(guān)節(jié)炎的粘性添加劑等方面。
文檔編號(hào)A61L31/04GK1468262SQ01817098
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2001年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月10日
發(fā)明者文泰石, 李在永, 金塡勛, 韓圭范 申請(qǐng)人:Lg生命科學(xué)株式會(huì)社