專利名稱：含有作為疫苗輔藥的磷酸鐵的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，特別地涉及含有輔藥的疫苗組合物的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及其中輔藥包括磷酸鐵的疫苗。
人們由現(xiàn)有技術(shù)知道疫苗組合物，它們含有在給予抗原時在質(zhì)的方面能增加和改變所誘發(fā)免疫反應(yīng)的輔藥。事實上，在疫苗工業(yè)中進行的研制導(dǎo)致使用由病毒或細菌得到的抗原，然而要使用越來越完善的純化方法，以及來自生物技術(shù)的抗原。這些抗原的優(yōu)點一般比過去使用的某些抗原更純些，但是，它們免疫作用往往要差些，因此需要使用輔藥。
已經(jīng)描述過許多輔藥皂苷、乳液、陽離子類脂物等。
但是，直到今天，在這些商品中通常使用唯一的輔藥是鋁基輔藥。然而，還應(yīng)希望有其它的輔藥。
在與輔藥相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)中，特別可以列舉專利US 5 895 653，它描述了呈膠體溶液形式的氫氧化鐵化合物作為輔藥，它的吸附能力與前面描述的呈凝膠形式的氫氧化鐵相比獲得了改善。
但是，如果說這樣一些輔藥是實際使用鋁基輔藥的替代品的話，它們并不可能總是有效替換它們，因此也希望擁有其它的化合物，其特性是這樣的，即它們同時對服用它們的生物具有良好的耐受性，它們可以在與醫(yī)藥工業(yè)要求相容的條件下生產(chǎn)，并且特別地，它們能夠增加或改變對疫苗抗原的免疫反應(yīng)，以便至少與實際使用的鋁基化合物同樣有效。
為此，本發(fā)明的目的是一種疫苗組合物，它含有至少一種疫苗抗原和至少一種輔藥，其特征在于這種輔藥包括磷酸鐵。
根據(jù)一個特別的特征，該磷酸鐵呈微粒懸浮液形式，其微粒尺寸是0.01-300μm，更特別地1-40μm，特別是尺寸約7μm的微粒的含量很大。
根據(jù)一種本發(fā)明的特別實施方式，使用鐵鹽和磷酸鹽溶液制備磷酸鐵。
一種這樣的制備方法能夠得到一種微白色的非結(jié)晶產(chǎn)物，因此保證給一般健康狀況好的人服用時所必需的任何安全條件。
在下面參照附圖所作的描述過程中體會到本發(fā)明的許多優(yōu)點，該


在實施例3描述的試驗時所得到的結(jié)果；圖1表示第一次免疫后得到的IgG1結(jié)果，而圖2表示第二次免疫后得到的結(jié)果；圖3表示第一次免疫后得到的IgG2a結(jié)果，而圖4表示第二次免疫后得到的結(jié)果。
在本發(fā)明意義上，疫苗組合物應(yīng)該理解是一種能給人或動物使用，以誘發(fā)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的組合物；這種免疫系統(tǒng)的反應(yīng)可能表現(xiàn)在產(chǎn)生抗體，或僅僅激活某些細胞，特別是抗原表達細胞、淋巴細胞T、淋巴細胞B。這種疫苗組合物可以是一種具有防疫目標或具有治療目標或兩者兼而有之的組合物。
在本發(fā)明意義上，抗原應(yīng)該理解是能用于疫苗的任何抗原，不管它涉及整個或亞單元抗原種，不管其性質(zhì)肽、蛋白質(zhì)、葡萄糖蛋白質(zhì)、多糖、糖脂、脂肽等?？赡苌婕安《尽⒓毦蚱渌目乖?；在稱之為DNA免疫作用的免疫技術(shù)的情況下，抗原術(shù)語還包括多核苷酸，其序列選擇是為了給人們希望觀察到人在服用這些多核苷酸時被表達的抗原編碼。還可能涉及一個抗原系統(tǒng)，特別在含有能防止多種疾病的抗原，并一般為稱為疫苗組合的多價疫苗組合物的情況下，或在含有防止單一疾病的多種不同抗原的組合物的情況下尤其如此，例如抗百日咳或流行性感冒的某些疫苗便是這種情況。
使用含有抗白喉、破傷風(fēng)和脊髓灰質(zhì)炎抗原的疫苗組合物尤其可以得到特別好的結(jié)果。
為了本發(fā)明，磷酸鐵是一種以無定形、結(jié)晶或假結(jié)晶磷酸鐵為基礎(chǔ)的惰性無機化合物。使用無定形磷酸鐵得到了非常滿意的試驗結(jié)果。
使用鐵鹽和磷酸鹽溶液制備這種化合物。作為鐵鹽，特別可以使用檸檬酸鐵，或特別有利地使用氯化鐵。
作為磷酸鹽，特別可以使用磷酸鈉。
將兩種原料組分同時或相繼混合可以制備磷酸鐵。其混合順序可以是把氯化鐵加到磷酸鈉中，或反之，把磷酸鈉加到氯化鐵中。加入速度可以非?？?，或相反地可以滴加。
為了得到適合于本發(fā)明需要的磷酸鐵，指出鐵鹽與磷酸鹽的比為2倍以上是令人滿意的。
或者，可以使用噴霧器制備磷酸鐵。在這種情況下，可以將磷酸鈉噴到氯化鐵溶液中，或相反地把氯化鐵噴到磷酸鈉中。
制備本發(fā)明的疫苗組合物時，可以在剛開始配制時，把磷酸鐵加到疫苗組合物中。磷酸鐵這時稀釋到一定的濃度，然后往其中添加有意義的抗原。
另外也可以把磷酸鐵添加到已經(jīng)含有部分疫苗組合物的真空冷凍干燥制劑中，在該組合物中含有有意義的抗原。
根據(jù)本發(fā)明，磷酸鐵是在疫苗組合物中，其量足以實施輔藥作用。
在使用單一輔藥的情況下，疫苗組合物的用藥劑量可以是0.2-1.4mg磷酸鐵。
在與其它輔藥聯(lián)用的情況下，現(xiàn)有的量可以根據(jù)所希望輔藥作用和現(xiàn)有其它輔藥的能力而減少。
家兔的局部和全身毒性試驗表明，對磷酸鐵的耐受性與氫氧化鋁的一樣。
下面的實施例說明了本發(fā)明的特別實施方式。
實施例1磷酸鐵和氫氧化鐵的制備將0.5M FeCl3·6H2O(由SIGMA以批號55H 1251提供的)混合到0.25MNa2HPO4·2H2O(由Merck以批號FA004911提供的)的溶液中制備磷酸鐵。2種產(chǎn)品按照下述比例混合往含有108.12g FeCl3·6H2O的800ml超濾H2O的溶液中加入含有44.5gNa2HPO4·2H2O的11超濾H2O。在室溫下進行混合。
使用攪拌棒攪拌15分鐘，然后進行離心，相繼用水洗滌沉淀。在每次洗滌后，借助用硝酸銀測定氯離子的方法檢測氯離子的存在。不再有氯離子時，即10次洗滌后，將沉淀置于水中，再在118□的壓力釜中1小時以保證無菌。
以這種方式得到的溶液是一種含有16g Fe/l的磷酸鐵溶液。
在室溫下，將0.5M檸檬酸鐵與2M NaOH混合制備氫氧化鐵。往100ml檸檬酸鐵溶液滴加NaOH，直至達到pH8。以與制備磷酸鐵的同樣方式，攪拌15分鐘，然后進行離心，相繼用水洗滌沉淀，并用硝酸銀測定氯離子。不再檢測到氯離子時，將沉淀置于水中，再在118℃的壓力釜中1小時以滅菌。這時得到的溶液是一種6.3g Fe/l的氫氧化鐵溶液。
實施例2制備疫苗組合物使用如前面指出制備的溶液、含有10.8g Al/l的氫氧化鋁的水懸浮液(由Reheis提供)以及濃度330絮凝劑單位或Lf/ml(即蛋白質(zhì)濃度0.9125g/l)的PTP制劑(純化破傷風(fēng)蛋白質(zhì))，制備下述組合物·僅PTP840μlH2O+120μl9％NaCl+100Lf/ml的240PTP，·PTP和AlOOH618μlH2O+222μl10.8g Al/l AlOOH+120μl9％NaCl+100Lf/ml的240PTP，·PTP和FePO4690μlH2O+150μL16g/1FePO4+120μL濃縮10倍的PBS緩沖溶液(即95mM Na2HPO4·2H2O)+100Lf/ml的240 PTP，·PTP和FeOOH458μlH2O+382μl6.3gFe/l FeOOH+120μl濃縮10倍的PBS緩沖溶液+100Lf/ml的240 PTP。
實施例3抗破傷風(fēng)抗體的測定取4組各為6只6周齡雌鼠OF1。
每組鼠使用實施例2制備的其中一種配方。
在麻醉下，采用在股四頭肌中肌肉內(nèi)的方法，第1天和第22天2次注射，每次50μl進行用藥。用藥量因此是2絮凝劑單位或Lf的PTP和在含有輔藥的配方情況下是0.2mg無機物(或者鋁，或者鐵)。
在第15天，從每支鼠后眼框竇取血約300μl。
在第36天，在麻醉下切斷頸動脈，使這些鼠放血。
基于相應(yīng)于回收血液的每份血漿，采用ELISA方法測量PTP的有效IgG1和IgG2a。
得到的結(jié)果示于圖1-4中，這些結(jié)果表明磷酸鐵是一種好的輔藥；涉及IgG1時，得到的結(jié)果明顯高于只用這種抗原時所得到的結(jié)果，雖然它們稍微低于用氫氧化鋁得到的結(jié)果；涉及IgG2a時，達到的比率也比用氫氧化鋁達到的結(jié)果高。
實施例4檢驗抗破傷風(fēng)活性通過一個試驗檢驗本發(fā)明組合物的抗破傷風(fēng)活性，該試驗在于用鼠評價這些組合物對采用皮下方法用藥的毒素致死劑量的活性。
將保護50％有毒素作用動物所需要的劑量(DE50)與以UI/ml表示的已校準參比疫苗的相比，可確定試驗組合物的活性。
將輔藥(0.6mg/劑)與水、30LfADP(白喉類毒素)和10LfATP(破傷風(fēng)類毒素)混合，然后添加20μg/劑量硫柳汞和鹽溶液(90g/l NaCl和5mM Na2HPO4·2H2O溶液)，得到試驗配方。
試驗的疫苗組合物含有或者氫氧化鋁，或者磷酸鐵，或者氫氧化鐵。
使用每個輔藥得到的結(jié)果匯集于下表中，表明磷酸鐵是一種好的輔藥，比在同樣條件下的氫氧化鐵好得多
權(quán)利要求
1.含有至少一種疫苗抗原和至少一種輔藥的疫苗組合物，其特征在于該輔藥包括磷酸鐵。
2.根據(jù)上述權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于磷酸鐵呈微粒懸浮液形式，其微粒尺寸是0.01μm-300μm。
3.根據(jù)上述權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于其微粒尺寸是1-40μm。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于其微粒尺寸的中心是在值7μm周圍。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于磷酸鐵是用鐵鹽和磷酸鹽溶液制備的。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于它至少含有破傷風(fēng)抗原。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于它至少含有白喉抗原。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的疫苗組合物，其特征在于它至少含有一種脊髓灰質(zhì)炎抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗組合物，它含有磷酸鐵作為輔藥。所述的磷酸鐵呈微粒懸浮液形式，其微粒尺寸是0.01μm－300μm。它可以是將鐵鹽與磷酸鹽溶液混合得到的。
文檔編號A61K39/05GK1791432SQ200480013365
公開日2006年6月21日 申請日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者E·索茲特 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司