專利名稱：：用于溶酶體酶缺乏癥的組合物和其用途的制作方法
背景技術(shù)：
：溶酶體貯積癥(LSD)是大約50種遺傳代謝疾病的組群，所述疾病是由特定的溶酶體酶、受體靶、激活蛋白、膜蛋白或運(yùn)載體(transporter)的細(xì)胞缺乏造成的，所述缺乏導(dǎo)致溶酶體中酶底物的病原性累積，從而造成細(xì)胞和組織功能的損壞。Wilcox，W.R.，Lysosomalstoragedisorderstheneedforbetterpediatricrecognitionandcomprehensivecare.JPediatr.2004May；144(5Suppl)S3-14。在5,000個(gè)活產(chǎn)兒中，大約發(fā)生1例溶酶體貯積癥，且所述疾病展示相當(dāng)大的臨床和生物化學(xué)異質(zhì)性。盡管存在X連鎖的兩個(gè)實(shí)例MPSII和Fabry病，但大部分溶酶體貯積癥主要是作為常染色體隱性遺傳病癥遺傳的。溶酶體貯積癥的程度和嚴(yán)重度依賴于積累的底物的類型和量，但幾乎所有的病癥都是進(jìn)行性的。盡管一些病癥只影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)外的組織，但大多數(shù)病癥同時(shí)具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)和全身性表現(xiàn)。許多患有溶酶體貯積癥的患者死于嬰兒期或兒童期，且存活至成人期的患者通常具有減少的壽命和嚴(yán)重的死亡率(Wilcox，2004)。下面的表1是按受影響的溶酶體功能列出的一些溶酶體貯積癥的概述。高歇病是最普遍的溶酶體貯積癥，其由于在所有組織中缺乏葡糖腦苷脂酶(GC；EC3.2.1.45)造成。該酶的缺乏在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(包括肝臟、脾臟、肺和骨髓)的富脂巨噬細(xì)胞(lipidladenmacrophage)(稱為Gaucher細(xì)胞)中產(chǎn)生葡糖神經(jīng)酰胺的積累。高歇病被分為三種主要表型I型，非神經(jīng)病變型)；2型，急性神經(jīng)病變型和3型，亞急性神經(jīng)病變型。I型高歇病的疾病嚴(yán)重度是不同的，其中兒童和成人可以是無(wú)癥狀的或可具有嚴(yán)重地使人虛弱的癥狀，包括骨退化(skeletaldegeneration)、貧血、血小板減少和肝脾大。癥狀可存在于任何年齡階段，盡管在北歐猶太教徒人群(AshkenaziJewishpopulation)中I型高歇病更加普遍，但其在所有種族群體中都發(fā)生。2型(急性神經(jīng)病變型)高歇病是快速進(jìn)行性的，其中在6個(gè)月大小時(shí)，大部分2型的嬰兒具有腦干功能障礙，且在18-24個(gè)月齡時(shí)死于并發(fā)癥例如呼吸停止或吸入性肺炎。3型患者在比2型患者在較大年齡時(shí)發(fā)生神經(jīng)異常；大部分只發(fā)生精細(xì)的水平生掃視性眼球運(yùn)動(dòng)缺陷(subtlehorizontalsaccadiceyemovementdefect)。1型和3型高歇病患者中的全身性并發(fā)癥對(duì)酶治療法有反應(yīng)。表1受溶酶體功能影響的溶酶體貯積癥(Wilcox，W.R.，JPediatr.2004May；144(5Suppl)S3-14)受影響的溶酶體功能病癥糖胺聚糖的不完全新成MPSI-IX(胡爾勒病、Scheie、Hunter、代謝Sanfilippo、莫爾基奧病、Maroteaux-Lamy、Sly病，透明質(zhì)酸酶缺乏癥)糖蛋白的聚糖部分的不天冬氨酰葡糖胺尿癥完全降解(aspartylglucosaminuria)、巖藻糖苷貯積病、甘露糖苷過(guò)多癥、Schindler病、唾液酸貯積癥I型糖原的不完全降解蓬佩病(pompedisease)鞘脂組分的不完全降解法布里病、法伯病、高歇病(1-3型)、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥(泰-薩病、山德霍夫病、GM2激活物病)、克拉伯病、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、尼-皮病(A型或B型)。多肽的不完全降解致密性成骨不全癥膽固醇、膽固醇酯或其Leroidlipofuscinosis(具有不同缺乏的他復(fù)合酯的不完全降解多種類型，一些仍然未知)、膽固醇酯沉積或轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷病、C型尼-皮克病、沃爾曼病多種溶酶體酶的缺乏多種硫酸酯酶、半乳糖唾液酸沉積癥(galactosialidosis)、II、III型粘多糖癥轉(zhuǎn)運(yùn)和運(yùn)輸缺陷胱氨酸病、粘多糖病IV、唾液酸貯積癥、具有Marinesco-Sjgren綜合癥的乳糜微粒貯積癥、海-普二氏綜合癥(幾種形式)和Danon病未知的缺陷Geleophysicdysplasia、Marinesco-Sjgren綜合征FDA于1991首先批準(zhǔn)了高歇病的酶替代療法(ERT)。長(zhǎng)期的ERT確實(shí)改善了大多高歇病患者的器官巨大癥和血細(xì)胞計(jì)數(shù)。然而，目前的靜脈內(nèi)施用的GC酶制劑不改變2型患者的神經(jīng)退化或顯著地逆轉(zhuǎn)骨骼并發(fā)癥。為克服目前的用于高歇病的ERT的限制，我們提出使用新的技術(shù)，所述技術(shù)使用口服施用的包含由編碼人葡糖腦苷脂酶的序列組成的DNA的精微的酵母細(xì)胞壁顆粒，從而更有效地遞送正常的或修飾的GC酶至巨噬細(xì)胞。除了提高GC酶至所有組織的遞送，我們預(yù)期該創(chuàng)新的方法將使骨中的巨噬細(xì)胞更有效和特異地吸收遞送編碼正常的或修飾的GC的DNA的顆粒。該方法可導(dǎo)致不能被目前的ERT顯著地逆轉(zhuǎn)的骨并發(fā)癥的更大的好轉(zhuǎn)。提取的酵母細(xì)胞壁顆粒是可容易獲得的、可生物降解的、基本上為球形的直徑大約2-4μm的顆粒。提取的酵母細(xì)胞壁顆粒的制備在本領(lǐng)域是已知的，且描述于例如美國(guó)專利4,992,540、5,082,936、5,028,703、5,032,401、5,322,841、5,401,727、5,504,079、5,968,811、6,444,448B1、6,476,003B1、公開(kāi)的美國(guó)申請(qǐng)2003/0216346A1、2004/0014715A1和PCT公開(kāi)申請(qǐng)WO02/12348A2中。提取的酵母細(xì)胞壁顆粒的形式，稱作“完全葡聚糖顆?！?，已被建議作為遞送載體，但一直限制于通過(guò)活性組分從顆粒的簡(jiǎn)單擴(kuò)散進(jìn)行釋放或通過(guò)顆?；|(zhì)的生物降解釋放化學(xué)交聯(lián)至所述完整的葡聚糖顆粒的試劑。參見(jiàn)美國(guó)專利5,032,401和5,607,677。提取的酵母細(xì)胞壁顆粒，主要?dú)w因于其β-葡聚糖內(nèi)容物，被靶向吞噬細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞和淋巴組織的細(xì)胞。粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)在上皮和位于身體粘膜表面下的固有層中包含所有淋巴細(xì)胞。粘膜相關(guān)淋巴組織的主要位置是腸相關(guān)淋巴組織(GALT)和支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)。GI免疫系統(tǒng)的另一個(gè)重要組分是M或微褶細(xì)胞。M細(xì)胞是腸上皮中位于淋巴樣濾泡(lymphoidfollicle)上的特殊細(xì)胞類型，其內(nèi)吞多種蛋白和肽抗原。M細(xì)胞將這些蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至下層組織而不是降解其，在所述下層組織中其被該處的樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吸收。M細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用或吞噬作用吸收來(lái)自腸腔的分子和顆粒。然后將該物質(zhì)在小囊泡中轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)細(xì)胞的內(nèi)部至基底膜，在該處其被釋放入細(xì)胞外空間。該過(guò)程稱為胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用。在其基底面，M細(xì)胞的細(xì)胞膜圍繞下面的淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生大量皺折，所述淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞吸收從M細(xì)胞釋放的轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)并加工其以用于抗原呈遞。研究已顯示，派爾斑的M細(xì)胞進(jìn)行的酵母顆粒(直徑為3.4±0.8微米)的胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用費(fèi)時(shí)少于1小時(shí)(Beier，R.，&Gebert，A.，KineticsofparticleuptakeinthedomesofPeyer′spatches，AmJPhysiol.1998Jul；275(1Pt1)G130-7)。由于無(wú)上皮內(nèi)巨噬細(xì)胞的顯著吞噬作用，酵母顆粒向下遷移并在2.5-4小時(shí)內(nèi)穿過(guò)基底層，在該處其被快速地吞噬并轉(zhuǎn)運(yùn)出派爾斑的穹頂(dome)。已顯示人鼻咽淋巴樣組織(扁桃體和腺樣組織)中發(fā)現(xiàn)的M細(xì)胞參與導(dǎo)致呼吸道感染的病毒的采樣(sampling)。體外細(xì)胞模型的研究已顯示熒光標(biāo)記的小球體(Fluospheres，0.2μm)和殼聚糖微顆粒(0.2μm)的吸收vanderLubbenI.M.，等人，Transportofchitosanmicroparticlesformucosalvaccinedeliveryinahuman具有Marinesco-Sjgren綜合癥intestinalM-cellmodel，JDrugTarget，2002Sep；10(6)449-56。凝集素，荊豆凝集素1(Ulexeuropaeusagglutinin1)(UEA1，對(duì)于α-L-巖藻糖殘基是特異性的)已被用于將聚苯乙烯小球體(0.5μm)或聚合脂質(zhì)體靶向M細(xì)胞(0.2μm)(Clark，M.A.，等人，TargetingpolymerisedliposomevaccinecarrierstointestinalMcells，Vaccine.2001Oct12；20(1-2)208-17)。小鼠內(nèi)的體內(nèi)研究已報(bào)導(dǎo)了，聚-D，L-乳酸(PDLLA)小球體或明膠小球體(GM)可被巨噬細(xì)胞和M細(xì)胞有效地吸收。(Nakase，H.，等人，Biodegradablemicrospherestargetingmucosalimmune-regulatingcellsnewapproachfortreatmentofinflammatoryboweldisease，JGastroenterol.2003Mar；38Suppl1559-62)。然而，已報(bào)導(dǎo)合成的顆粒遞送載體(包括聚(DL-丙交酯共乙交酯)小球體和脂質(zhì)體的吸收是高度可變的，且由顆粒和M細(xì)胞兩者的物理性質(zhì)確定。Clark，M.A.，等人，ExploitingMcellsfordrugandvaccinedelivery，AdvDrugDelivRev.2001Aug23；50(1-2)81-106。相同的研究報(bào)導(dǎo)，可通過(guò)用試劑包括合適的選擇性地結(jié)合M細(xì)胞表面的凝集素、微生物粘附素和免疫球蛋白包被顆?；蛑|(zhì)體來(lái)增強(qiáng)遞送。也參見(jiàn)，F(xiàn)lorence，A.T.，Theoralabsorptionofmicro-andnanoparticulatesneitherexceptionalnorunusual，PharmRes.1997Mar；14(3)259-66。病原體模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別存在于微生物表面上的共同的結(jié)構(gòu)和分子基元且促成先天性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。甘露糖受體和β-葡聚糖受體部分地參與真菌病原體的識(shí)別。甘露糖受體(MR)，在巨噬細(xì)胞的亞型上表達(dá)的糖結(jié)合受體，被認(rèn)為是一種該P(yáng)RR。巨噬細(xì)胞具有甘露糖和甘露糖-6-磷酸的受體，所述受體可結(jié)合和內(nèi)化展示這些糖的分子。所述分子通過(guò)內(nèi)吞作用被內(nèi)化入前溶酶體內(nèi)體。已通過(guò)使用用甘露糖-6磷酸修飾的牛血清白蛋白并通過(guò)二硫鍵將其連接至寡脫氧核苷酸的修飾的3’末端，來(lái)使用該內(nèi)化作用增加寡核苷酸進(jìn)入巨噬細(xì)胞；參見(jiàn)Bonfils，E.，等人，Nucl.AcidsRes.199220，4621-4629。參見(jiàn)E.Bonfils，C.Mendes，A.C.Roche，M.Monsigny和P.Midoux，Bioconj.Chem.，3，277-284(1992)。巨噬細(xì)胞也表達(dá)β-葡聚糖受體，包括CR3(Ross，G.D.，J.A.Cain，B.L.Myones，S.L.Newman，和P.J.Lachmann.1987.Specificityofmembranecomplementreceptortypethree(CR3)forβ-glucans.ComplementInflamm.461)、dectin-1(Brown，G.D.andS.Gordon.2001.Immunerecognition.Anewreceptorforβ-glucans.Nature41336.)和乳糖苷神經(jīng)酰胺(ZimmermanJW，LindermuthJ，F(xiàn)ishPA，PalaceGP，StevensonTT，DeMongDE.Anovelcarbohydrate-glycosphinglipidinteractionbetweenabeta-(1-3)-glucanimmunomodulator，PGG-glucan，andlactosylceramideofhumanleukocytes.JBiolChem.1998Aug21273(34)22014-20.)。β-葡聚糖受體CR3主要在單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞中表達(dá)，而dectin-1主要在巨噬細(xì)胞的表面表達(dá)。在M細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高水平的乳糖苷神經(jīng)酰胺。小膠質(zhì)細(xì)胞也可表達(dá)β-葡聚糖受體(Muller，C.D.，等人Functionalbeta-glucanreceptorexpressionbyamicroglialcellline，ResImmunol.1994May；145(4)267-75)。存在結(jié)合甘露糖和β-葡聚糖受體對(duì)吞噬作用的累加效應(yīng)的證據(jù)。Giaimis等人報(bào)導(dǎo)了觀察報(bào)告，該觀察報(bào)告表明鼠類巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系和鼠類腹膜駐留型巨噬細(xì)胞對(duì)非受調(diào)理素作用加熱殺死的酵母(unopsonizedheat-killedyeast)(S.cerevisiae)的吞噬作用受甘露糖和β-葡聚糖受體兩者的介導(dǎo)。為獲得非受調(diào)理素作用加熱殺死的酵母的最大吞噬作用，需要甘露糖和β-葡聚糖受體的共表達(dá)(Giaimis，J.，等人，Bothmannoseandbeta-glucanreceptorsareinvolvedinphagocytosisofunopsonized，heat-killedSaccharomycescerevisiaebymurinemacrophages，JLeukocBiol.1993Dec；54(6)564-71)。發(fā)明概述可通過(guò)口服給藥，使用本發(fā)明的的組合物和方法，通過(guò)缺陷基因的靶向巨噬細(xì)胞的表達(dá)來(lái)治療溶酶體病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將表達(dá)溶酶體酶的基因DNA以陽(yáng)離子聚合物-DNA納米復(fù)合物的形式整合入酵母葡聚糖顆粒(YGP)和酵母葡聚糖-甘露聚糖顆粒(YGMP)中。通過(guò)糖受體對(duì)顆粒表面葡聚糖和甘露聚糖多糖的結(jié)合，這些YGP-DNA和YGMP-DNA微顆粒通過(guò)受體介導(dǎo)被組織、粘膜和腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)巨噬細(xì)胞吸收，從而具有全身性、經(jīng)粘膜和口服的生物利用度。當(dāng)吞噬時(shí)，顆粒被吞入內(nèi)體區(qū)室，在所述區(qū)室中陽(yáng)離子聚合物釋放DNA并使內(nèi)體膨脹，從而釋放DNA至細(xì)胞質(zhì)中。賦形劑至YGP-DNA和YGMP-DNA制劑的整合有助于內(nèi)體DNA釋放和細(xì)胞核吸收。表達(dá)缺陷的蛋白的DNA的遞送導(dǎo)致缺陷的蛋白的活性的補(bǔ)充，優(yōu)選地恢復(fù)，并且催化有毒的積累的貯存產(chǎn)物的降解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含提取的界定內(nèi)部空間的酵母細(xì)胞壁和包含β-葡聚糖，優(yōu)選地少于大約90％的重量的β-葡聚糖，更優(yōu)選地大約6至90％的重量的β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子和有效負(fù)載捕獲分子可溶于相同的溶劑系統(tǒng)，其中所述有效負(fù)載分子補(bǔ)充缺失的、缺陷的或被抑制的基因或基因產(chǎn)物的功能。一般地，有效負(fù)載分子選自核酸、肽、蛋白和其混合物，并以有效地補(bǔ)充缺陷的溶酶體酶的功能的量存在于組合物中。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述提取的酵母細(xì)胞壁還包含甘露聚糖，優(yōu)選地大于約為30％的重量的甘露聚糖，更優(yōu)選地為大約30至90％的重量的甘露聚糖。在其他實(shí)施方案中，和其他顆粒類型相比，YCP顆粒具有顯著更高的殼多糖+殼聚糖含量，優(yōu)選地超過(guò)重量的50％，更優(yōu)選地在大約50和75％的重量之間。在某些實(shí)施方案中，所述核酸選自寡核苷酸、反義構(gòu)建體、siRNA和酶RNA、重組DNA構(gòu)建體和其混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組DNA構(gòu)建體是包含有效地連接至編碼蛋白的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體。一般地，由開(kāi)放閱讀框架編碼的蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白、具有酶活性的蛋白、膜蛋白、DNA結(jié)合蛋白或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或其功能性等同物。優(yōu)選地，所述核酸包含補(bǔ)充不存在的、缺陷的或被抑制的基因的功能的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用組合物生產(chǎn)用于治療溶酶體酶缺乏的藥物組合物的用途。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，由所述開(kāi)放閱讀框架編碼的蛋白是在具有遺傳病癥特別是溶酶體貯積癥的受試者中產(chǎn)生治療效果的蛋白。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，由所述開(kāi)放閱讀框架編碼的蛋白是人葡糖腦苷脂酶或其功能性等同物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物用于生產(chǎn)用于治療溶酶體貯積癥的藥物。合適地，溶酶體貯積癥是糖胺聚糖的不完全代謝、糖蛋白的聚糖部分的不完全降解、糖原的不完全降解、鞘脂類組分的不完全降解、多肽的不完全降解、膽固醇、膽固醇酯或其他復(fù)合酯的不完全降解或轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷、多種溶酶體酶的缺乏、轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷或細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸缺陷。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溶酶體貯積癥是胡爾勒病、Scheie病、Hunter病、Sanfilippo病、莫爾基奧病、Maroteaux-Lamy病、Sly病、透明質(zhì)酸酶缺乏癥、天冬氨酰氨基葡糖尿(aspartylglucosaminuria)、巖藻糖苷貯積病、甘露糖苷過(guò)多癥、Schindler病、唾液酸貯積癥I型、蓬佩病、法布里病、法伯病、高歇病1型、高歇病2型、高歇病3型、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、GM2神經(jīng)節(jié)苷沉積病例如泰-薩病或山德霍夫病、GM2激活物病、克拉伯病、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、尼-皮病A型、尼-皮病B型、致密性成骨不全癥、ceroidlipofuscinosis、膽固醇酯沉積病、尼-皮病C型、沃爾曼病、多種硫酸酯酶病、半乳糖唾液酸沉積癥、粘多糖癥II型、粘多糖癥III型、胱氨酸病、粘多糖癥IV、唾液酸貯積癥、具有Marinesco-Sjgren綜合征、海-普二氏綜合征、切-東綜合征和Danon病的乳糜微粒滯留病、geleophysicdysplasia或Marinesco-Sjgren綜合征。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體是包含有效地連接至編碼蛋白，優(yōu)選地酶，更優(yōu)選地溶酶體酶或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體是包含有效地連接至編碼溶酶體酶激活物或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體。在某些實(shí)施方案中，所述溶酶體酶激活物選自saprosinA、saprosinB、saprosinC、saprosinD和其混合物。在其它實(shí)施方案中，溶酶體酶激活物是GM2激活物蛋白(GM2AP)、或其他溶酶體酶蛋白激活物。在其它實(shí)施方案中，有效負(fù)載分子是蛋白，優(yōu)選地是溶酶體酶或其功能性等同物。在其他實(shí)施方案中，有效負(fù)載分子是選自saprosinA、saprosinB、saprosinC、saprosinD、GM2激活物蛋白或其混合物的蛋白。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含所述組合物和藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物適合用于口服施用。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，配制組合物用于胃腸外施用，最優(yōu)選地皮下或肌內(nèi)施用。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，配制組合物用于粘膜施用。本發(fā)明也提供了在細(xì)胞中彌補(bǔ)酶或其他蛋白缺乏的方法，其包括提供有效量的第一組合物(所述組合物包含含有β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子的提取的酵母細(xì)胞壁，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺乏的蛋白或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體)和將缺乏這樣的蛋白或酶的細(xì)胞和所述第一組合物接觸的步驟?？稍隗w外或體內(nèi)進(jìn)行接觸所述細(xì)胞的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞通常通過(guò)吞噬作用內(nèi)化所述第一組合物。所述方法還可包括提供有效量的第二組合物(所述組合物包含含有β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子的提取的酵母細(xì)胞壁，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺乏的酶的激活物或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體)和將缺乏這些蛋白或酶的細(xì)胞和所述第二組合物接觸的步驟?？珊线m地被治療的細(xì)胞可以是巨噬細(xì)胞、派爾斑的M細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、朗氏細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、肺泡吞噬細(xì)胞、腹腹巨噬細(xì)胞、乳巨噬細(xì)胞(milkmacrophage)、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜伊紅粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、mesengialphagocyte或滑膜A細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中彌補(bǔ)蛋白或酶缺乏的方法，其包括提供有效量的第一遞送系統(tǒng)和將缺乏這樣的酶或蛋白的細(xì)胞和所述第一組合物接觸的步驟，所述第一遞送系統(tǒng)包含界定內(nèi)部空間的提取的酵母細(xì)胞壁，所述內(nèi)部空間包含大約6至90％的重量的β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺乏的酶或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體?？稍隗w外或體內(nèi)進(jìn)行接觸細(xì)胞的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一組合物一般通過(guò)吞噬作用被細(xì)胞內(nèi)化。所述方法還可包括提供有效量的第二組合物和將缺乏這些酶或蛋白的細(xì)胞和所述第二組合物接觸的步驟，所述第二組合物包含含有β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子的提取的酵母細(xì)胞壁，其中所述有效負(fù)載分子是以有效地補(bǔ)充缺乏的溶酶體酶的功能的量存在的具有缺乏的蛋白或酶的激活物的活性的蛋白。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療具有溶酶體貯積癥的受試者的方法，所述方法包括施用治療有效量的第一組合物的步驟，所述第一組合物包含含有β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子的提取的酵母細(xì)胞壁，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺陷溶酶體酶的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體，其中所述有效負(fù)載分子以有效地補(bǔ)充缺乏的溶酶體酶的功能的量存在。所述方法也可包括施用有效量的第二組合物的步驟，所述第二組合物包含含有β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子的提取的酵母細(xì)胞壁，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺乏的溶酶體酶的激活物的開(kāi)放閱讀框架的控制元件的表達(dá)載體?？蛇x擇地，經(jīng)腸胃外途徑(皮下、皮內(nèi)、或肌內(nèi)或粘膜(皮膚，吸入)給受試者施用組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)口服、皮下、肌內(nèi)或通過(guò)吸入給受試者施用所述第一組合物。最優(yōu)選地通過(guò)口服給受試者施用組合物。一般地，所述方法包括將吞噬細(xì)胞和第一組合物接觸以及將吞噬細(xì)胞和第二組合物接觸的步驟。在其他實(shí)施方案中，可通過(guò)給母親施用組合物或通過(guò)將有效量的組合物放入羊水中來(lái)給子宮內(nèi)的胎兒施用本發(fā)明的組合物。通過(guò)下列在附圖中舉例說(shuō)明的系統(tǒng)和方法的優(yōu)選的實(shí)施方案的更具體的描述將容易地理解微粒藥物遞送系統(tǒng)的上述特征和其他特征以及有利方面，在所述附圖中，附圖標(biāo)記在不同的視圖中表示相同部分。附圖概述圖1是酵母細(xì)胞壁的橫截面的示意圖100，從外到內(nèi)顯示，外纖維層110、外甘露糖蛋白層120、β-葡聚糖層130、β-葡聚糖-殼多糖層140、內(nèi)甘露糖蛋白層150、質(zhì)膜160和細(xì)胞質(zhì)170。圖2A是酵母細(xì)胞壁顆粒的結(jié)構(gòu)的示意圖；圖2B是顯示用伴刀豆球蛋白-A-FITC(con-A-異硫氰酸熒光素，SigmaChemical，St.Louis，MO)對(duì)酵母細(xì)胞壁顆粒的甘露聚糖組分進(jìn)行染色的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，其顯示基本上完全染色的細(xì)胞壁顆粒210；圖2C是YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2D是顯示YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖顆粒220的斑狀con-A-FITC染色的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像；圖2E是YGPβ葡聚糖顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2F是顯示不存在con-A-FITC染色的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像。圖3A是暴露于YGP顆粒的細(xì)胞(標(biāo)示細(xì)胞310)的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述YGP顆粒載有熒光標(biāo)記的pIRES質(zhì)粒和作為陽(yáng)離子捕獲聚合物的PEI和作為陽(yáng)離子去垢劑的CTAB，圖3B是顯示表示通過(guò)圖3B中標(biāo)示的相同細(xì)胞310內(nèi)化的熒光YGP顆粒的明亮染色的細(xì)胞的相同視野的彩色顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像。圖4A是暴露于熒光標(biāo)記的YGP顆粒的細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞410的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，圖4B是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞420的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pIRESDNA、陽(yáng)離子捕獲聚合物聚乙烯亞胺(PEI)和陽(yáng)離子去垢劑十六烷基三甲基銨溴化物(也稱作溴化十六烷基三甲銨或CTAB)的YGP顆粒(表達(dá)GFP)，圖4C是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞430的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pIRESDNA、陽(yáng)離子捕獲聚合物殼聚糖和陽(yáng)離子去垢劑CTAB的YGP顆粒(表達(dá)GFP。圖5A是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞510的組合光照和熒光的彩色顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖，所述細(xì)胞暴露于熒光標(biāo)記的YGP顆粒；圖5B是熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)研究結(jié)果的圖解說(shuō)明，所述研究顯示了代表來(lái)自已內(nèi)化熒光標(biāo)記的YGP顆粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的主峰520和代表來(lái)自無(wú)熒光標(biāo)記的YGP顆粒的細(xì)胞的信號(hào)的分布的次峰530；圖5C是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞540的光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含熒光標(biāo)記的DNA、陽(yáng)離子捕獲聚合物PEI和陽(yáng)離子去垢劑CTAB的YGP顆粒；圖5D是顯示相同標(biāo)示的細(xì)胞540的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖，圖5E是FACS研究結(jié)果的圖解說(shuō)明，其顯示代表來(lái)自已內(nèi)化具有熒光DNA有效負(fù)載的YGP顆粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的主峰610和代表來(lái)自無(wú)YGP顆粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的肩峰620；圖5F是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞710的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞和包含熒光反義RNA有效負(fù)載的YGP顆粒一起溫育；圖5G是顯示相同標(biāo)示的細(xì)胞710的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像；圖5H是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞810的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞和包含熒光反義siRNA、PEI和CTAB的YGP顆粒一起溫育，圖5I是顯示相同標(biāo)示的細(xì)胞810的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞包含內(nèi)化的具有熒光RNAi有效負(fù)載的YGP顆粒。圖6A-6G是顯示吸收包含pMFG-GC表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒和表達(dá)人葡糖腦苷脂酶(hGC)的J774鼠類巨噬細(xì)胞的彩色顯微照片的灰度圖像。將細(xì)胞暴露于YGP制劑或不對(duì)其進(jìn)行處理(對(duì)照)，培養(yǎng)細(xì)胞，并用福爾馬林固定粘附細(xì)胞。使用第一抗人GC抗體(兔子的抗血清)、合適的可檢測(cè)的第二抗體(山羊抗兔FITC綴合的抗血清)就免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行處理，通過(guò)熒光顯微鏡和照相進(jìn)行檢查。圖6A是J774細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞510的彩色透射光顯微照片的灰度圖像，所述細(xì)胞來(lái)自未處理的對(duì)照培養(yǎng)。圖6B是顯示缺少熒光標(biāo)記的細(xì)胞的J774細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的灰度圖像。圖6C是顯示細(xì)胞例如細(xì)胞912(包含熒光標(biāo)記的顆粒)的J774細(xì)胞(其暴露于熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞壁顆粒(YGP-F)的制劑)的組合光照和熒光的彩色顯微照片的灰度圖像。圖6D和6E分別是J774細(xì)胞的相同視野的彩色透射光顯微照片和彩色熒光照片的灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pMFG-GC表達(dá)載體(YGP:pMFG-GC:PEI:CTAB)的酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑，通過(guò)熒光標(biāo)記的細(xì)胞例如細(xì)胞914中的免疫反應(yīng)性顯示人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。圖6F和6G分別是J774細(xì)胞的相同視野的彩色透射光顯微照片和彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pMFG-GC表達(dá)載體(YGP-CN:pMFG-GC:CTAB)的酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑，通過(guò)熒光標(biāo)記的細(xì)胞例如細(xì)胞916中的免疫反應(yīng)性顯示人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。圖7A是暴露于熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞壁顆粒(YGMP-F)的制劑的J774細(xì)胞的彩色透射光和熒光顯微組合照片的灰度圖像，其顯示細(xì)胞例如細(xì)胞925(包含熒光標(biāo)記的顆粒)和其他細(xì)胞例如細(xì)胞926(缺乏熒光標(biāo)記的顆粒)。圖7B是J774細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pIRES表達(dá)載體(YGMP-pIRES)的酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑，該圖顯示由熒光標(biāo)記的細(xì)胞例如細(xì)胞927進(jìn)行的綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。圖7C是J774細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pMFG-GC表達(dá)載體(YGMP-MFG-GC)的酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑，通過(guò)熒光標(biāo)記的細(xì)胞例如細(xì)胞928中的免疫反應(yīng)性顯示人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。圖8是方法的優(yōu)選的實(shí)施方案的示意圖，所述方法是在體內(nèi)口服施用180后，通過(guò)巨噬細(xì)胞游走370將酵母β-葡聚糖顆粒(YGP)遞送至不同器官450、452、454、456、458。給受試者185口服施用180包含酵母β-葡聚糖顆粒(YGP)230的組合物182。酵母β-葡聚糖顆粒(YGP)230被小腸襯里中的M細(xì)胞355吸收并被轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)上皮350和被小腸巨噬細(xì)胞360吞噬。包含YGP的巨噬細(xì)胞游走370至器官和組織(包括骨450、肺452、肝454、大腦456和脾458)。在口服施用后大約72小時(shí)，在脾458中觀察到已吞噬YGP的脾巨噬細(xì)胞364(同時(shí)以示意圖和以彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)照灰度圖像顯示)。在口服施用后大約90小時(shí)，在骨450中觀察到已吞噬YGP的骨髓巨噬細(xì)胞362(同時(shí)以示意圖和以彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)照灰度圖像顯示)。圖9A和圖9B是使用包含loxP的取代載體產(chǎn)生更長(zhǎng)的生命期的高歇病小鼠模型的示意圖解，所述載體攜帶L444P、R463C和N370S點(diǎn)突變。圖10A-10D是從帶有熒光標(biāo)記的YGP顆粒的小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(圖10A和圖10C)和彩色熒光顯微照片(圖10B和圖10D)的灰度圖像。通過(guò)口服強(qiáng)飼法或皮下注射給小鼠(C57B1/6野生型和Gaucher突變小鼠)施用YGP-F和YGMP-F的等分(0.1ml)，顯示無(wú)熒光巨噬細(xì)胞920和熒光巨噬細(xì)胞922、924。圖11A-11D是從體內(nèi)處理的小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖，所述圖顯示包含pIRES表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒的吸收和綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。將所述分離的細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)膮R合度，用福爾馬林固定粘附細(xì)胞，使用熒光顯微鏡和照相進(jìn)行檢查。圖11A是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受PBS(對(duì)照處理)的口服強(qiáng)飼法，所述圖像顯示缺乏熒光巨噬細(xì)胞。圖11B是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pIRES制劑的皮下注射，所述圖像顯示熒光巨噬細(xì)胞930。圖11C是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pIRES制劑的口服給藥，所述圖像顯示熒光巨噬細(xì)胞931。圖11D是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pIRES制劑的口服給藥，所述圖像顯示熒光巨噬細(xì)胞932。圖12A-12M是從體內(nèi)處理的小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的顯微照片圖像，其顯示包含pMFG-GC表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒的吸收和人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。將所述分離的細(xì)胞培養(yǎng)至合適的匯合度，用福爾馬林固定粘附細(xì)胞。使用第一抗人GC抗體(兔抗血清)、合適的可檢測(cè)的第二抗體(山羊抗兔FITC綴合的血清)就免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行處理，使用熒光顯微鏡和照相進(jìn)行檢查。圖12A是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受PBS(對(duì)照處理)的口服強(qiáng)飼法，所述圖像顯示缺少表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞。圖12B和12C是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(12B)和彩色熒光顯微照片(12C)的圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的皮下注射，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞935。圖12D是從L444P-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片圖像，所述L444P-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的皮下注射，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞936。圖12E是從R463C-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片圖像，所述R463C-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的皮下注射，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞937。圖12F和12G是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(12F)和彩色熒光顯微照片(12G)的圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的口服給藥，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞938。圖12H和12I是從L444P-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(12H)和彩色熒光顯微照片(12I)的圖像，所述L444P-/-突變小鼠在體內(nèi)接受30天的0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的口服給藥處理，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞940。圖12J是從R463C-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述R463C-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的口服給藥，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞941。圖12K是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pMFG-GC制劑的口服給藥，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞942。圖12L是從L444P-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述L444P-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pMFG-GC制劑的口服給藥，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞943。圖12M是從R463C-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述R463C-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pMFG-GC制劑的口服給藥，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞944。圖13是來(lái)自研究的數(shù)據(jù)的圖解表示，所述研究顯示在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中在葡糖腦苷脂酶表達(dá)基因治療后，在CBE處理的R463CGaucher小鼠中看到的增加的存活率。根據(jù)下列本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案(如附圖中所舉例說(shuō)明的)中的更具體的描述可使本發(fā)明的上述和其他目的、特征和有利方面變得明顯，在所述附圖中，相同的附圖標(biāo)記在所有不同視圖中表示相同部分。所述附圖不必標(biāo)上標(biāo)度，而是強(qiáng)調(diào)舉例說(shuō)明本發(fā)明的原理。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包含提取的酵母細(xì)胞壁的組合物，所述酵母細(xì)胞壁包含β-葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子和有效負(fù)載捕獲分子可溶于相同的溶劑系統(tǒng)，其中所述有效負(fù)載分子補(bǔ)充缺乏的溶酶體酶的功能。本發(fā)明還提供了制備和使用所述組合物的方法。有利地，本發(fā)明的組合物和方法固有地直接靶向巨噬細(xì)胞和補(bǔ)充溶酶體蛋白例如巨噬細(xì)胞中的酶的缺乏。通過(guò)口服或粘膜或胃腸外途徑施用本發(fā)明的組合物以避免靜脈內(nèi)的酶或蛋白置換療法的有害效果。通過(guò)提供表達(dá)載體而不是編碼的蛋白本身來(lái)補(bǔ)充酶或蛋白的缺乏可以使抗原反應(yīng)減少至最低或避免抗原反應(yīng)。本發(fā)明的方法也可用于通過(guò)補(bǔ)充溶酶體酶激活物例如saprosinC來(lái)使內(nèi)源溶酶體酶的活性正常化。有利地，通過(guò)靶向巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞，本發(fā)明提供了將治療系統(tǒng)遞送至許多部位例如骨、腎、肺、胃腸道和大腦的方法。盡管不受特定理論束縛，但認(rèn)為巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞向某一位置的遷移部分地受一種或多種刺激因素例如炎癥、脂質(zhì)或其他生理性巨噬細(xì)胞引誘劑確定。在該模型下，據(jù)認(rèn)為任何特定組織中的攜帶本發(fā)明的組合物的吞噬細(xì)胞群體和其他組織中的相似群體處于動(dòng)態(tài)平衡之中。因此，任何特定組織中的攜帶所述組合物的吞噬細(xì)胞群體，以及所述缺乏的內(nèi)源性酶的補(bǔ)充可及時(shí)地響應(yīng)(至少部分地響應(yīng))生理學(xué)作用而波動(dòng)，所述生理學(xué)作用起著調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞的分布和活性的作用。一般地，本發(fā)明的組合物和方法提供了治療劑在體內(nèi)的簡(jiǎn)單、有效和有效率的遞送，優(yōu)選地通過(guò)口服施用遞送。所述組合物和可獲得的組合物相比，具有提高的穩(wěn)定性，和具有患者方便性(從而，患者的順從性)、更低的花費(fèi)和減少或降低的副作用的其他有利方面。定義“受試者”是指哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物?！安溉閯?dòng)物”是指哺乳綱的任何成員，包括但不限于，人、非人靈長(zhǎng)類例如黑猩猩和其他猿類和猴物種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、馬、綿羊、山羊和豬；家畜例如兔子、狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物例如大鼠、小鼠和豚鼠；等。非哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括，但不限于，鳥(niǎo)類等。術(shù)語(yǔ)“受試者”不指明具體的年齡或性別?！隘熜А笔侵赴Y狀的改善或疾病進(jìn)展的減緩；在溶酶體酶缺乏的情況下，“療效”是指缺乏的基因的功能或缺乏的基因產(chǎn)物的功能的可檢測(cè)的補(bǔ)充?！爸委熡行Я俊笔侵福?dāng)給患者施用以治療疾病時(shí)，足以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病進(jìn)行該治療的化合物的量。所述“治療有效量”依賴于化合物、被治療的疾病的狀況、被治療的疾病的嚴(yán)重度、受試者的年齡和相對(duì)健康、給藥途徑和形式、主治醫(yī)生或獸醫(yī)的判斷以及其他因素而變化。蛋白的“功能性等同物”是指結(jié)構(gòu)和所述蛋白不同但在相同的條件下和所述蛋白行使相同功能的分子、蛋白或非蛋白。溶酶體酶的“功能性等同物”是指結(jié)構(gòu)上和所述蛋白不同但在相同的條件下催化所述天然溶酶體酶的底物的相同反應(yīng)的分子、蛋白或非蛋白。有效負(fù)載捕獲分子所述有效負(fù)載捕獲分子優(yōu)選地是藥物可接受的賦形劑。有效負(fù)載分子和捕獲分子都可溶于溶劑系統(tǒng)；所述溶劑系統(tǒng)必須通過(guò)酵母細(xì)胞顆粒糖基質(zhì)被吸收，從而允許有效負(fù)載和捕獲聚合物的吸收。所述有效負(fù)載和捕獲分子優(yōu)選地溶于水。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲分子是可生物降解的。和給定的有效負(fù)載的捕獲反應(yīng)的作用機(jī)制決定了有效負(fù)載捕獲分子的選擇。為了具有靜電相互作用，需要具有和有效負(fù)載的電荷相反的電荷的有效負(fù)載捕獲分子。為進(jìn)行物理捕獲，有效負(fù)載捕獲分子適當(dāng)?shù)貐⑴c減少有效負(fù)載的擴(kuò)散的基質(zhì)的形成。在其它實(shí)施方案中，所述有效負(fù)載捕獲分子促成疏水結(jié)合特性，從而促成所述有效負(fù)載的保留。在其他實(shí)施方案中，所述有效負(fù)載捕獲分子選擇性地結(jié)合至有效負(fù)載，從而提供促成有效負(fù)載的保留的親和相互作用。一般地，聚電解質(zhì)可以是適合的有效負(fù)載捕獲分子。幾種合適的聚電解質(zhì)描述于美國(guó)專利6,133,229。所述聚電解質(zhì)可以是陽(yáng)離子聚電解質(zhì)或陰離子聚電解質(zhì)。也可使用兩性聚電解質(zhì)。陽(yáng)離子聚電解質(zhì)優(yōu)選地是具有沿所述分子鏈分布的陽(yáng)離子基團(tuán)的聚合物。在某些實(shí)施方案中陽(yáng)離子基團(tuán)可包括季銨衍生的部分，可排列在懸掛于鏈的側(cè)鏈基團(tuán)中或可被整合于其中。陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的實(shí)例包括乙烯基吡咯烷酮和四價(jià)甲基丙烯酸甲酯的共聚物例如獲自ISP的GAFQUAT.系列(755N，734，HS-100)；取代聚丙烯酰胺；聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺和取代衍生物；聚胺同聚物(GOLCHEMCL118)；聚胺共聚物(例如，表氯醇和單或二甲胺的縮合物)；聚二烯丙基二甲基氯化銨(polyDADMAC)；取代葡聚糖；修飾的瓜爾膠(用羥丙基氯化三銨取代的)；取代蛋白(例如，大豆蛋白質(zhì)和水解的膠原蛋白上的取代的quaternary基團(tuán))；聚氨基酸(例如，聚賴氨酸)；低分子量聚氨基化合物(例如，精胺和亞精胺)?？墒褂锰烊换蛉斯ぞ酆衔??？墒褂镁哂蠱W為150至5,000,000、優(yōu)選地5000至500,000、更優(yōu)選地5000至100,000的陽(yáng)離子聚電解質(zhì)。0.01至10％的量是優(yōu)選的，更優(yōu)選地0.1至2％w/v，特別是0.05至5％。陰離子聚電解質(zhì)優(yōu)選地是具有沿所述分子鏈分布的陰離子基團(tuán)的聚合物。陰離子基團(tuán)可包括羧酸、磺酸、硫酸或其他帶負(fù)電荷的可電離種類，可排列于懸掛于鏈上的基團(tuán)或直接結(jié)合至所述聚合物的主鏈?？墒褂锰烊坏幕蛉嗽斓木酆衔?。陰離子聚電解質(zhì)的實(shí)例包括甲基乙烯基醚和馬來(lái)酸酐的共聚物、甲基乙烯基醚和馬來(lái)酸的共聚物，(分別為GantrezAN-系列和S-系列，InternationalSpecialtyProducts，Wayne，NJ)；海藻酸和鹽；羧甲基纖維素和鹽；取代聚丙烯酰胺(例如用羧基取代的)；聚丙烯酸和鹽；聚苯乙烯磺酸和鹽；硫酸葡聚糖；取代糖類例如，蔗糖八硫酸酯；肝素?？墒褂镁哂?50至5,000,000，優(yōu)選地5000至500,000，更優(yōu)選地5000至100,000的MW的陰離子聚電解質(zhì)。0.01％至10％的量是優(yōu)選的，特別是0.05至5％，更特別地是0.1至2％w/v。生物聚合物，例如多糖，是優(yōu)選的捕獲聚合物。優(yōu)選地，將所述聚合物加工成平均分子量小于100,000道爾頓。優(yōu)選地衍生所述聚合物以提供陽(yáng)離子或陰離子特征。合適的多糖包括殼聚糖(脫乙?；臍ざ嗵?、海藻酸、葡聚糖，例如2-(二乙氨基)乙基醚葡聚糖(DEAE-葡聚糖)和硫酸葡聚糖、黃原膠、豆角膠(locustbeangum)和瓜爾膠。兩大類陽(yáng)離子分子適合用作具有帶負(fù)電荷的有效負(fù)載的捕獲分子例如核酸陽(yáng)離子聚合物和陽(yáng)離子脂質(zhì)。已顯示多種陽(yáng)離子聚合物在體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，范圍從蛋白[例如組蛋白(Fritz，J.D.，等人，(1996)Hum.GeneTher.7，1395-1404)和高泳動(dòng)族(HMG)蛋白(Mistry，A.R.，等人(1997)BioTechniques22，718-729)]和多肽[例如多聚賴氨酸(Wu，G.Y.和Wu，C.H.(1987)J.Biol.Chem.262，4429-4432，Wagner，E.，等人，(1991)BioconjugateChem.2，226-231、短合成肽(Gottschalk，S.，等人.，(1996)GeneTher.3，448-457；Wadhwa，M.S.，等人，(1997)BioconjugateChem.8，81-88)，和螺旋兩親性肽(Legendre，J.Y.，等人，(1997)BioconjugateChem.8，57-63；Wyman，T.B.，等人，(1997)Biochemistry36，3008-3017)]至合成的聚合物[例如聚乙烯亞胺(Boussif，O.，等人，(1996)GeneTher.3，1074-1080)、陽(yáng)離子樹(shù)狀分子(dendrimers)(Tang，M.X.，等人，(1996)BioconjugateChem.7，703-714；Haensler，J.等人，(1993)BioconjugateChem.4，372-379)和葡糖酰胺(glucaramide)聚合物(Goldman，C.K.，等人，(1997)Nat.Biotech.15，462-466)]。其他合適的陽(yáng)離子聚合物包括N-取代甘氨酸寡聚物(類肽)(Murphy，J.E.，等人，Acombinatorialapproachtothediscoveryofefficientcationicpeptoidreagentsforgenedelivery，ProcNatlAcadSci.USA，199895(4)1517-1522)、聚(2-甲基-丙烯酸2-[(2-二甲基氨基)-乙基)-甲基-氨基]-乙酯)，縮寫(xiě)為pDAMA，和聚(2-二甲基氨基乙基)-異丁烯酸酯(pDMAEMA)(Funhoff，A.M.，等人，2004Biomacromolecules，5，32-39)。在本領(lǐng)域已知陽(yáng)離子脂質(zhì)也適合用于轉(zhuǎn)染。Felgner，P.Ll，等人，Lipofectionahighlyefficient，lipid-mediatedDNA-transfectionprocedure.ProcNatlAcadSciUSA.198784(21)7413-7。合適的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、[N，N，N’，N’-四甲基-N，N’-二(2-羥基乙基)-2，3-二(油烯基氧基)-1，4-丁烷二碘化銨](PromegaMadison，WI，USA)，雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(PromegaMadison，WI，USA)，N-[1-(2，3-二油烯基氧基)]-N，N，N-三甲基丙烷甲基硫酸銨(DOTAP)，N-[1-(2，3-油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨、1，2-二豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨(DMRIE)、二豆蔻油烯基膦?；谆谆@(DMPTA)(seeFloch等人1997.Cationicphosphonolipidsasnon-viralvectorsforDNAtransfectioninhematopoieticcelllinesandCD34+cells.BloodCells，Molec.&Diseases2369-87)、1，2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1，3-苯二唑-4-基)，銨鹽(AvantiPolarLipids，Inc.Alabaster，AL，US)、1，2-二油烯基-3-三甲基丙烷氯化銨(AvantiPolarLipids，Inc.Alabaster，AL，US)，1，2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(AvantiPolarLipids，Inc.Alabaster，AL，US)和1，3-二油烯基氧基-2-(6-羧基spermyl)丙基酰胺(DOSPER)。適合作為陽(yáng)離子捕獲分子的聚胺描述于美國(guó)專利6,379,965和6,372,499。有效負(fù)載分子本發(fā)明的顆粒遞送系統(tǒng)用于體內(nèi)或體外遞送有效負(fù)載分子，所述分子包括，但不限于核酸例如寡核苷酸、反義構(gòu)建體、siRNA、酶RNA和重組DNA構(gòu)建體，包括表達(dá)載體。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒遞送系統(tǒng)用于在體內(nèi)或體外遞送有效負(fù)載分子例如氨基酸、肽和蛋白。“蛋白”是指鏈長(zhǎng)度足以產(chǎn)生更高水平的三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸的序列。這是和不具有該結(jié)構(gòu)的“肽”或其他小分子量藥物的區(qū)別。一般地，此處的蛋白可具有至少大約15-20kD、優(yōu)選地至少大約20kD的分子量。此處定義的范圍內(nèi)所包括的蛋白的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物蛋白，例如，生長(zhǎng)激素(GH)，包括人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素和GH超基因家族的其他成員；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC、因子IX組織因子和血管性血友病因子(yonWillebrandsfactor)；抗凝血因子例如C蛋白；心房鈉尿肽；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；bombazine；凝血酶；α腫瘤壞死因子、β腫瘤壞死因子；腦啡肽酶；RANTES(通常調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)和分泌的活性)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；原松弛素(prorelaxin)；小鼠促性腺激素關(guān)連肽；DNA酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；整聯(lián)蛋白；A或D蛋白；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子例如骨來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-β；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子例如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(大腦IGF-D；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；成骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子(decayacceleratingfactor)(DAF)；病毒抗原例如，AIDS包膜的部分；運(yùn)輸?shù)鞍祝粴w巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；免疫粘附素；抗體；和上面列出的多肽的任一種多肽的生物活性片段或變體。GH超基因家族的成員包括生長(zhǎng)激素、催乳素、胎盤(pán)催乳激素、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素7、白細(xì)胞介素9、白細(xì)胞介素10、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素12(p35亞基)、白細(xì)胞介素13、白細(xì)胞介素15、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、白血病抑制因子、α干擾素、β干擾素、γ-干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、心肌營(yíng)養(yǎng)蛋白-1和被鑒定為和分類為所述家族的成員的其他蛋白。蛋白有效負(fù)載分子優(yōu)選地是基本上純的和想要地基本上均一的(即不含污染性蛋白等)。“基本上純的”蛋白是指包含按重量計(jì)算(基于組合物的總重量)至少大約90％的蛋白，優(yōu)選地按重量計(jì)算至少大約95％的蛋白的組合物?！盎旧暇坏摹钡鞍资侵赴粗亓坑?jì)算(基于組合物的總重量)至少大約99％的蛋白的組合物。蛋白可來(lái)源于天然發(fā)生的來(lái)源或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生。蛋白包括由氨基酸置換或通過(guò)定向蛋白演化(Kurtzman，A.L.，等人，Advancesindirectedproteinevolutionbyrecursivegeneticrecombinationapplicationstotherapeuticproteins，CurrOpinBiotechnol.200112(4)361-70)產(chǎn)生的變體以及衍生物例如PEG化的蛋白。在某些實(shí)施方案中，蛋白是抗體。所述抗體可結(jié)合至例如上述分子的任一種分子。本發(fā)明包括的抗體的示例性分子靶包括CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受體家族的成員例如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體、細(xì)胞粘附分子例如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整聯(lián)蛋白，包括其α或β-亞單位(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長(zhǎng)因子例如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；C蛋白等。除了肽、多肽和核酸外，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)適合用于遞送更小的分子，優(yōu)選地用于遞送藥物活性劑，更優(yōu)選地治療性小分子。用于本發(fā)明的給藥系統(tǒng)的合適的小分子有效負(fù)載包括避孕藥例如二乙基己烯雌酚、17-β-雌二醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇等；黃體酮例如炔諾酮、norgestryl、雙醋炔諾醇、炔雌烯醇、乙酸甲羥孕酮、地美炔酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、諾孕酯、炔諾酮、炔孕酮、甲烯雌醇、異炔諾酮等；和殺精子化合物例如壬基苯氧基聚氧乙二醇、氯化芐乙氧銨(benzethoniumchloride)、氯茚醇等。優(yōu)選地，對(duì)于這些甾體有效負(fù)載，使用捕獲分子的混合物，所述混合物包含足夠量的去垢劑以溶解有效負(fù)載和聚合物以使所述有效負(fù)載保留在酵母細(xì)胞壁顆粒內(nèi)?？杀徽先氡景l(fā)明的給藥系統(tǒng)的其他活性劑包括胃腸治療劑例如氫氧化鋁、碳酸鈣、碳酸鎂、碳酸鈉等；非類固醇類抗生育劑；擬副交感神經(jīng)藥；精神治療藥物；抗精神病藥例如鹽酸氯丙嗪、氯扎平、美索達(dá)嗪、甲哌硫氮卓、利血平、甲硫達(dá)嗪等；抗焦慮藥例如甲氨二氮卓、地西泮、甲丙氨酯、羥基安定等；鼻科(rhinological)解充血藥；鎮(zhèn)靜催眠藥例如可待因、苯巴比妥、戊巴比妥鈉、司可巴比妥鈉等；其他類固醇例如睪丸酮和丙酸睪丸酮；磺胺類藥物；擬交感神經(jīng)藥；疫苗；維生素和營(yíng)養(yǎng)素例如必需氨基酸、必需脂肪(essentialfat)等；抗瘧藥例如4-氨基喹啉、8-氨基喹啉、乙胺嘧啶等；抗偏頭痛藥例如氯苯咪吲哚、芬特明等；抗震顫麻痹藥例如L-多巴；鎮(zhèn)痙劑例如阿托品、甲基溴化東莨菪堿等；鎮(zhèn)痙劑和抗膽堿能藥物例如膽汁療法、助消化劑、酶等；止咳劑例如右美沙芬、那可丁等；支氣管擴(kuò)張劑；心血管藥物例如抗高血壓化合物、蘿芙木生物堿、冠狀血管擴(kuò)張藥、硝酸甘油、有機(jī)硝酸鹽、戊四硝酯等；電解質(zhì)替代物例如氯化鉀；麥角生物堿例如具有和不具有咖啡因的麥角胺、氫化麥角生物堿、二氫麥角克堿甲磺酸鹽、二氫麥角柯寧堿甲磺酸鹽、雙氫麥角隱亭甲磺酸鹽和其組合；生物堿類例如硫酸阿托品、顛茄、氫溴酸東茛菪堿等；鎮(zhèn)痛藥；麻醉藥例如可待因、二氫可待因酮、哌替啶、嗎啡等；非麻醉藥例如水楊酸鹽、阿斯匹林、對(duì)乙酰氨基酚、d-丙氧酚等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)用于遞送抗生素例如頭孢菌素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素A、卡那霉素B、青霉素類、氨芐西林、鏈霉素A、抗霉素A、chloropamtheniol、甲硝唑、土霉素青霉素G、四環(huán)素類等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，身體的巨噬細(xì)胞使病原體失活的能力受抗生素例如四環(huán)素至所述巨噬細(xì)胞的遞送的增強(qiáng)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了系統(tǒng)，所述系統(tǒng)用于遞送抗癌藥物；抗驚厥劑例如美芬妥英、苯巴比妥、三甲雙酮；止吐藥例如硫乙拉嗪；抗組胺類例如chlorophinazine、茶苯海明、苯海拉明、奮乃靜、曲吡那敏等；抗炎劑例如激素藥劑、氫化可的松、潑尼松龍、潑尼松，非激素藥，別嘌呤醇、阿斯匹林、吲哚美辛、苯丁唑酮等；前列腺素；細(xì)胞毒藥物例如塞替派、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、美法倉(cāng)、氮芥、甲氨蝶呤等。疫苗在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)用于提供疫苗的口服遞送。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)用于遞送抗原，例如下列微生物的抗原，如淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhea)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、皰疹病毒(人，1型和2型)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis)、陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonasvaginalis)、陰道嗜血桿菌(Haemophilusvaginalis)、B組鏈球菌屬(Streptococcussp.)、人形支原體(Microplasmahominis)、杜克雷嗜血桿菌(Hemophilusducreyi)、股溝肉芽腫(Granulomainguinale)、腹股溝淋巴肉芽腫(Lymphopathiavenereum)、梅毒螺旋體(Treponemapallidum)、流產(chǎn)布魯氏桿菌.羊流產(chǎn)布氏桿菌(Brucellaabortus.Brucellamelitensis)、豬流產(chǎn)布氏桿菌(Brucellasuis)、犬布魯氏菌(Brucellacanis)、胎兒彎曲菌(Campylobacterfetus)、Campylobacterfetusintestinalis、波摩鈉鉤端螺旋體(Leptospirapomona)、單核細(xì)胞增多性李司特菌(Listeriamonocytogenes)、羊布(魯)氏菌(Brucellaovis)、馬皰疹病毒1、馬傳染性動(dòng)脈炎病毒、IBR-IBP病毒、BVD-MB病毒、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)、牛毛滴蟲(chóng)(Trichomonasfoetus)、鼠弓形體(Toxoplasmagondii)、大腸桿菌、馬駒放線桿菌(Actinobacillusequuli)、羊流產(chǎn)沙門(mén)氏菌(Salmonellaabortusovis)、馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌(Salmonellaabortusequi)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、馬棒狀桿菌(Corynebacteriumequi)、化膿棒狀桿菌(Corynebacteriumpyogenes)、放線桿菌病(Actinobaccilusseminis)、牛生殖器支原體(Mycoplasmabovigenitalium)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、分支犁頭霉(Absidiaramosa)、馬媾疫錐蟲(chóng)(Trypanosomaequiperdum)、駑巴貝蟲(chóng)(Babesiacaballi)、破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌(Clostridiumtetani)、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridiumbotulinum)等。在其他實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可用于遞送抵抗上述微生物的中和抗體。在其他實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可用于遞送酶例如核糖核酸酶、神經(jīng)氨酸酶、胰蛋白酶、糖原磷酸化酶、精子乳酸脫氫酶、精子透明質(zhì)酸酶、腺苷三磷酸酶、堿性磷酸酶、堿性磷酸酶酯酶、氨肽酶、胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶、頂體蛋白酶、二酯酶、谷氨酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、β葡糖磷酸酶、脂酶、ATP-酶α-peptateγ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、固醇-3-β-醇-脫氫酶、DPN-二-aprorase。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可遞送生物恐怖關(guān)鍵生物因子(criticalbiologicalagents)的抗原，包括A類試劑例如重型天花(天花)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)(炭疽)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)(鼠疫)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)毒素(肉毒桿菌中毒)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)(土拉菌病)、纖絲病毒(埃博拉出血熱、馬爾堡出血熱)、沙粒病毒(拉沙(拉沙熱)、Junin(阿根廷出血熱)和相關(guān)病毒)；B類因子例如貝氏考克斯菌(Coxiellaburnetti)(Q熱)、布魯氏菌種類(布魯氏菌病)、鼻疽假單胞菌(Burkholderiamallei)(鼻疽病)、α病毒(委內(nèi)瑞拉腦脊髓炎、東部和西部馬腦脊髓炎)、來(lái)自蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻籽)的蓖麻毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringen)的ε毒素；葡萄球菌腸毒素B、沙門(mén)氏菌(Salmonella)種類、志賀氏痢疾菌(Shigelladysenteriae)、大腸桿菌株系0157H7、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、小球隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)和C類因子例如尼帕病毒、漢坦病毒、蜱傳播的出血熱病毒、蜱傳播的腦炎病毒、黃熱病和多耐藥結(jié)核。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可用于遞送滅活的抗原毒素，例如變性毒素抗原，包括類毒素(滅活的但是抗原性毒素)和類毒素綴合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類毒素是滅活的微生物毒素。在其他實(shí)施方案中，所述類毒素是滅活的植物毒素。在其他實(shí)施方案中，所述類毒素是滅活的動(dòng)物毒素。在某些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可用于遞送類毒素例如百日咳類毒素、白喉?xiàng)U菌(Corynebacteriumdiphtheriae)類毒素、破傷風(fēng)類毒素、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)b型-破傷風(fēng)類毒素綴合物、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridiumbotulinum)D類毒素、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridiumbotulinum)E類毒素、由艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridiumdifficile)的毒素A產(chǎn)生的類毒素、霍亂弧菌(Vibriocholerae)類毒素、C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)類毒素、肖韋(氏)梭菌(Clostridiumchauvoei)類毒素、諾維(氏)梭菌(Clostridiumnovyi)(B型)類毒素、敗血梭狀芽胞桿菌(Clostridiumsepticum)類毒素、重組HIVtatIIIB類毒素、葡萄球菌類毒素、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)ApxI類毒素、胸膜肺炎放線桿菌ApxII類毒素、胸膜肺炎放線桿菌ApxIII類毒素、胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白(OMP)類毒素、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)彈性蛋白酶類毒素、蛇毒類毒素、篦麻毒素類毒素、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)類毒素、出血敗血性巴斯德(氏)菌(Pasteurellamultocida)類毒素、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)類毒素、出血敗血性巴斯德(氏)菌(Pasteurellamultocida)類毒素和支氣管敗血性博德特(氏)菌(Bordetellabronchiseptica)類毒素.從對(duì)應(yīng)的毒素制備類毒素的技術(shù)，例如用甲醛或鋁鹽進(jìn)行化學(xué)處理或γ輻照，在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。將毒素轉(zhuǎn)化成類毒素的重組方法也是已知的(Fromen-Romano，C.，等人，Transformationofanon-enzymatictoxinintoatoxoidbygeneticengineering，ProteinEngineering第10卷no.10pp.1213-1220，1997)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)可用于遞送重組類毒素。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)可用于遞送編碼重組類毒素的表達(dá)載體。為了產(chǎn)生基因疫苗以保護(hù)免受病原體感染，必須在所述核酸組合物中包含編碼可引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫原性蛋白的遺傳物質(zhì)。無(wú)論病原體是細(xì)胞內(nèi)感染(這對(duì)本發(fā)明特別有用)還是細(xì)胞外感染，不可能所有的病原體抗原都可引發(fā)保護(hù)性反應(yīng)。因?yàn)镈NA和RNA都是相對(duì)小的且可相對(duì)容易地產(chǎn)生，因此，本發(fā)明提供了使得能夠用多種病原體抗原進(jìn)行接種的其他有利方面。用于所述基因疫苗的核酸組合物可包括編碼許多病原體抗原的遺傳物質(zhì)。例如，幾種病毒基因可包含在單個(gè)構(gòu)建體中，從而提供多個(gè)靶。此外，在一些情況下，可在個(gè)體中被遞送至不同細(xì)胞的多個(gè)接種體可制備成在疫苗中共同包含完全的或更優(yōu)選的不完全的，例如幾乎完全成套的基因。例如，可使用兩個(gè)構(gòu)建體施用完全成套的病毒基因，所述構(gòu)建體各自包含在不同部位施用的不同的一半的基因組。因此，可激起抗各抗原的免疫反應(yīng)而無(wú)感染性病毒裝配的風(fēng)險(xiǎn)。這允許超過(guò)單一抗原靶的導(dǎo)入且可消除鑒定保護(hù)性抗原的需要。根據(jù)本發(fā)明，也提供了賦予抗特征在于過(guò)度增殖疾病的過(guò)度增殖的細(xì)胞的廣譜保護(hù)性免疫反應(yīng)的方法以及治療遭受過(guò)度增殖疾病的個(gè)體的方法。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“過(guò)度增殖疾病”是指特征在于細(xì)胞的過(guò)度增殖的疾病和病癥。過(guò)度增殖疾病的實(shí)例包括癌癥和牛皮癬的所有形式。已發(fā)現(xiàn)將包含核苷酸序列(所述序列編碼免疫原性“過(guò)度增殖細(xì)胞”相關(guān)蛋白)的核酸組合物導(dǎo)入個(gè)體的細(xì)胞導(dǎo)致在個(gè)體的已接種的細(xì)胞中產(chǎn)生所述蛋白。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“過(guò)度增殖相關(guān)蛋白”是指和過(guò)度增殖疾病相關(guān)的蛋白。為進(jìn)行抗過(guò)度增殖疾病的免疫，給個(gè)體施用包含編碼與過(guò)度增殖疾病相關(guān)的蛋白的核苷酸序列的核酸組合物。為了使過(guò)度增殖相關(guān)蛋白成為有效的免疫原性靶，其必須是專門(mén)地或以更高的水平(相對(duì)于正常細(xì)胞)在過(guò)度增殖的細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白。靶抗原包括這些蛋白、和其片段以及至少包含在這些蛋白中發(fā)現(xiàn)的表位的肽。在一些情況下，過(guò)度增殖相關(guān)蛋白是編碼蛋白的基因的突變產(chǎn)物。所述突變的基因編碼幾乎和正常蛋白相同(除了導(dǎo)致未在正常蛋白中發(fā)現(xiàn)的不同表位的其稍微不同的氨基酸序列外)的蛋白。這些靶蛋白包括由癌基因例如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF編碼的蛋白。除了作為靶抗原的癌基因產(chǎn)物外，用于抗癌治療和保護(hù)方案的靶蛋白包括在一些實(shí)施方案中也用作自身免疫疾病的靶抗原的由B細(xì)胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗體可變區(qū)和T細(xì)胞淋巴瘤的T細(xì)胞受體的可變區(qū)。其他腫瘤相關(guān)蛋白可用作靶蛋白，例如在腫瘤細(xì)胞中以更高水平被發(fā)現(xiàn)的蛋白，包括由單克隆抗體17-1A和葉酸結(jié)合蛋白識(shí)別的蛋白。盡管本發(fā)明可用于免疫個(gè)體以抗一種或幾種形式的癌癥，但本發(fā)明對(duì)于預(yù)防性免疫易于產(chǎn)生特定癌癥或已患過(guò)癌癥從而易于復(fù)發(fā)的個(gè)體特別有用。遺傳學(xué)和生物技術(shù)學(xué)以及流行病學(xué)的發(fā)展允許確定個(gè)體中癌癥發(fā)展的可能性和對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)。通過(guò)使用遺傳篩查和/或家族健康史，可能預(yù)測(cè)特定個(gè)體發(fā)生癌癥的幾種類型中的任一種的概率。類似地，已發(fā)生癌癥的個(gè)體和已被治療以除去癌癥的個(gè)體或處于好轉(zhuǎn)的個(gè)體對(duì)復(fù)發(fā)和再發(fā)特別易感。作為治療方案的部分，可對(duì)這些個(gè)體進(jìn)行抗癌的免疫以抵抗該復(fù)發(fā)，所述癌癥是其曾被診斷曾經(jīng)患過(guò)的癌癥。因此，當(dāng)知道個(gè)體曾患過(guò)某種類型的癌癥且處于復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，可對(duì)其進(jìn)行免疫以使其免疫系統(tǒng)準(zhǔn)備抵抗所述癌癥的任何將來(lái)的發(fā)生。本發(fā)明也提供了治療遭受過(guò)度增殖疾病的個(gè)體的方法。在該方法中，肽、蛋白、糖或核酸組合物和其組合的導(dǎo)入用作免疫療法，指導(dǎo)和促進(jìn)個(gè)體的免疫系統(tǒng)抵抗產(chǎn)生所述靶蛋白的過(guò)度增殖的細(xì)胞。本發(fā)明提供了通過(guò)提供抗靶的廣譜保護(hù)性免疫反應(yīng)治療遭受自身免疫性疾病和病癥的個(gè)體的方法，所述靶和自身免疫性相關(guān)，包括細(xì)胞受體和產(chǎn)生對(duì)抗“自身”的抗體的細(xì)胞。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、斯耶格倫綜合征、肉樣瘤病、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲狀腺炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎(reactivearthritis)、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、牛皮癬、血管炎、韋格納肉芽腫病、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病中的各疾病的特征在于結(jié)合內(nèi)源性抗原并啟動(dòng)和自身免疫性疾病相關(guān)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的T細(xì)胞受體?？筎細(xì)胞的可變區(qū)的疫苗接種可引發(fā)免疫反應(yīng)包括CTL以消除所述T細(xì)胞。在RA中，參與疾病的T細(xì)胞受體(TCR)的幾個(gè)特異性可變區(qū)已被表征。這些TCR包含Vβ-3、Vβ-14、Vβ-17和Vα-17。因此，使用由遞送或編碼這些蛋白中的至少一種蛋白的肽、蛋白、糖或核酸組合物和其組合組成的組合物的接種將引起靶向參與RA的T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。參見(jiàn)Howell，M.D.，等人，1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810921-10925；Paliard，X.，等人，1991Science253325-329；Williams，W.V.，等人，1992J.Clin.Invest.90326-333；其各自在此引用作為參考。在MS中，已表征了參與該疾病的TCR的幾個(gè)特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-7和Vα-10。因此，使用由遞送或編碼至少一種這些蛋白的肽、蛋白、糖或核酸組合物和其組合組成的組合物的接種將引起靶向參與MS的T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。參見(jiàn)Wucherpfennig，K.W.，等人，1990Science2481016-1019；Oksenberg，J.R.，等人，1990Nature345344-346；其各自在此引用作為參考。在硬皮病中，已表征了參與該疾病的TCR的幾個(gè)特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14和Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，使用由遞送或編碼至少一種這些蛋白的肽、蛋白、糖或核酸組合物和其組合組成的組合物的接種將引起靶向參與硬皮病的T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。為了治療遭受T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病(特別是對(duì)于所述TCR的可變區(qū)仍需表征的疾病)的受試者，可進(jìn)行滑膜活檢。可采集存在T細(xì)胞的樣品并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定這些TCR的可變區(qū)?？墒褂眠@些信息制備疫苗。B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病包括狼瘡(SLE)、格雷夫斯病、重癥肌無(wú)力、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、哮喘、冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽管纖維硬化和惡性貧血。這些疾病中的各種疾病的特征在于結(jié)合內(nèi)源性抗原并啟動(dòng)和自身免疫性疾病相關(guān)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抗體。抗這些抗體的可變區(qū)的免疫接種將引發(fā)包括CTL的免疫反應(yīng)以清除產(chǎn)生所述抗體的B細(xì)胞。為了治療遭受B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的受試者，必需鑒定參與自身免疫活性的抗體的可變區(qū)?？蛇M(jìn)行活組織檢查，可采集存在于炎癥部位的抗體樣本?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定這些抗體的可變區(qū)?？墒褂眠@些信息制備疫苗。在SLE的情況下，一種抗原據(jù)認(rèn)為是DNA。因此，在接受抗SLE的免疫的受試者中，可就抗DNA抗體篩查其血清和可制備包含編碼在所述血清中發(fā)現(xiàn)的該抗DNA抗體的可變區(qū)的核酸組合物的疫苗。TCR和抗體的可變區(qū)中的一般結(jié)構(gòu)特征都是熟知的。通?？砂凑帐熘姆椒òl(fā)現(xiàn)編碼特定TCR或抗體的DNA序列，所述方法是例如描述于Kabat，等人1987SequenceofProteinsofImmunologicalInterestU.S.DepartmentofHealthandHumanServices，BethesdaMd.中的方法，其在此引用作為參考。此外，用于從抗體克隆功能性可變區(qū)的一般方法可在Chaudhary，V.K.，等人，1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA871066中查到，其在此引用作為參考?；虔煼ㄔ趦?yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療遺傳病癥或具有遺傳成分的疾病的組合物和方法。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)用于治療遺傳病癥或具有遺傳成分的疾病的藥物產(chǎn)品的組合物。人類基因組計(jì)劃已增加了我們的關(guān)于疾病的遺傳基礎(chǔ)的知識(shí)。一般參見(jiàn)，http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/assist.shtml。環(huán)境和遺傳因素都在任何疾病的發(fā)展中具有作用。遺傳病是由個(gè)體的遺傳物質(zhì)(基因組)的異常導(dǎo)致的疾病。存在4種不同類型的遺傳病(1)單基因型，(2)多因子型，(3)染色體型，和(4)線粒體型。(1)單基因型(也稱為孟德?tīng)栃突騿位蛐?-該類型是由一個(gè)基因的DNA序列中發(fā)生的改變或突變?cè)斐傻??；蚓幋a蛋白，而蛋白質(zhì)執(zhí)行大多數(shù)任務(wù)，進(jìn)行大部分生命功能和甚至構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主體。當(dāng)基因突變以致其蛋白產(chǎn)物不再能進(jìn)行其正常功能時(shí)，可導(dǎo)致病癥。存在超過(guò)6,000種已知的單基因病癥，所述病癥在每200個(gè)出生中大約發(fā)生1例。一些實(shí)例是纖維囊泡癥、鐮狀細(xì)胞貧血、馬方綜合征、亨頓舞蹈病和遺傳性血色病。(2)多因子型(也稱為復(fù)雜型或多基因型)-該類型由環(huán)境因素和多個(gè)基因的突變的組合造成。例如，已在第6、11、13、14、15、17和22號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)影響乳腺癌易感性的不同基因。其更復(fù)雜的性質(zhì)使其比單基因或染色體型病癥更難以分析。最常見(jiàn)的慢性病癥的一些病癥是多因子病。實(shí)例包括心臟病、高血壓、阿耳茨海默病、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥和肥胖癥。多因子遺傳也和遺傳性狀例如指紋型、身高、眼睛顏色和膚色相關(guān)。(3)染色體型-染色體，由DNA和蛋白構(gòu)成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，位于各細(xì)胞的細(xì)胞核中。因?yàn)槿旧w是遺傳物質(zhì)的載體，所以染色體結(jié)構(gòu)的異常例如缺失或額外的拷貝或大的斷裂和再連接(易位)，可導(dǎo)致病癥?？赏ㄟ^(guò)顯微鏡檢查來(lái)檢測(cè)主要的染色體異常的一些類型。唐氏綜合征或21三體是當(dāng)人具有21號(hào)染色體的三個(gè)拷貝時(shí)發(fā)生的常見(jiàn)病癥。(4)線粒體型-該相對(duì)罕見(jiàn)類型的遺傳病是由線粒體的非染色體DNA的突變?cè)斐傻摹＞€粒體是小的圓形或棒狀細(xì)胞器，其參與細(xì)胞的呼吸作用且發(fā)現(xiàn)于植物和動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。各線粒體可包含5至10個(gè)環(huán)形DNA片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)用于施用至少一種包含補(bǔ)償基因的核酸。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)用于施用至少一種編碼缺失的基因產(chǎn)物的核酸，其中所述基因產(chǎn)物的表達(dá)用于治療遺傳病或病癥的遺傳成分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含想要的有效負(fù)載分子的本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)用于藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)，所述藥物產(chǎn)品用于治療遺傳病或病癥的遺傳成分。這些藥物產(chǎn)品適合通過(guò)口服、經(jīng)直腸、腸胃外(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下)、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、局部(例如粉劑、軟膏劑或滴劑)施用或以口腔或鼻腔噴霧的形式施用。優(yōu)選地通過(guò)口服、口腔和腸胃外途徑，更優(yōu)選地口服施用所述藥物產(chǎn)品。載有不同有效負(fù)載例如核酸、核酸表達(dá)載體或小分子治療劑的顆?？梢赃m當(dāng)?shù)谋壤诶缒z囊中混合并一起施用以進(jìn)行組合治療。在本發(fā)明的涉及基因療法的方面，所述核酸組合物包含補(bǔ)償基因成編碼治療性蛋白的基因。補(bǔ)償基因的實(shí)例包括編碼肌養(yǎng)蛋白的基因或功能性片段、補(bǔ)償遭受纖維囊泡癥的受試者中的缺乏的基因的基因、補(bǔ)償遭受ADA的受試者中的缺乏的基因的基因和編碼因子VIII的基因。編碼治療蛋白的基因的實(shí)例包括編碼促紅細(xì)胞生成素、干擾素、LDL受體、GM-CSF、IL-2、IL-4和TNF的基因。此外，可施用編碼特異性和毒性物質(zhì)結(jié)合的單鏈抗體組分的核酸組合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，以小基因的部分的形式提供肌養(yǎng)蛋白基因并將其用于治療遭受肌肉萎縮癥的個(gè)體。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供包含部分肌養(yǎng)蛋白的編碼序列的小基因。肌養(yǎng)蛋白異常負(fù)責(zé)輕度貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良(BMD)和重度杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)。在BMD中產(chǎn)生肌養(yǎng)蛋白，但其在大小和/或量方面是異常的。受試者是從輕度至中度虛弱。在DMD中，沒(méi)有蛋白產(chǎn)生且受試者在13歲前坐輪椅，通常在20歲前死亡。在一些受試者中，特別是遭受BMD的受試者中，由根據(jù)本發(fā)明遞送的小基因的表達(dá)產(chǎn)生的部分肌養(yǎng)蛋白可提供提高的肌肉功能。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療遺傳病癥和據(jù)認(rèn)為具有遺傳成分的疾病的組合物和方法，所述疾病是例如阿-斯二氏綜合征、阿瑟綜合征、軟骨發(fā)育不全、肢成骨不全、癖嗜、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、白化病、無(wú)瞼-巨口綜合征、Alagille綜合征、尿黑酸尿、α-1型抗胰蛋白酶缺乏癥、阿爾波特氏綜合征、阿耳茨海默氏病、哮喘、自身免疫性多腺體綜合征、雄激素不敏感綜合征、Angelman綜合征、共濟(jì)失調(diào)、共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、動(dòng)脈粥樣硬化、注意缺陷障礙癥(ADHD)、孤獨(dú)癥、禿發(fā)癥、巴藤病、貝-威二氏綜合征、貝斯特病、雙相性精神障礙、短指、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、慢性髓細(xì)胞樣白血病、夏-馬-圖三氏病(Charcot-Marie-Toothdisease)、克羅恩病、兔唇、科凱恩綜合征、CoffinLowry綜合征、結(jié)腸癌、先天性腎上腺增生癥(CAH)、科妮莉亞德蘭格綜合征、Costello綜合征、Cowden綜合征、CraniofrontonasalDysplasia、克-納二氏綜合征、克雅氏病(CJD)、纖維囊泡癥、耳聾、抑郁癥、糖尿病、骨畸形性發(fā)育不良(diastrophicdysplasia)、DiGeorge綜合征、唐氏綜合征、誦讀困難、進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、多博維茨綜合征、外胚層發(fā)育不良、埃-范二氏綜合征、Ehlers-Danlos、大皰性表皮松解癥(EB)、癲癇、特發(fā)性震顫、家族性高膽固醇血癥、家族性地中海熱、脆性X染色體綜合征、弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)、高歇病、青光眼、葡萄糖半乳糖吸收不良、戊二酸尿、回旋形萎縮、斯普林澤綜合征(velocardiofacialsyndrome)、戈蘭綜合征、Hailey-Hailey病、偏身肥大、血色病、血友病、遺傳性運(yùn)動(dòng)與感覺(jué)神經(jīng)病(HMSN)、遺傳非息肉病結(jié)腸直腸癌(HNPCC)、亨廷頓舞蹈病、具有超IgM的免疫缺陷、青少年型糖尿病、克萊恩費(fèi)爾特氏綜合征、Kabuki綜合征、利氏病(或綜合征)、長(zhǎng)QT綜合征、肺癌、惡性黑色素瘤、躁狂憂郁、馬方綜合征、門(mén)克斯綜合征、流產(chǎn)、粘多糖病、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤綜合征、多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)纖維瘤病、尼-皮二氏病、努南綜合征、肥胖癥、卵巢癌、p53腫瘤抑制基因、胰腺癌、帕金森病、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、彭德萊綜合征、腓肌萎縮、苯丙酮尿癥(PKU)、多囊性腎病、帕-魏二氏綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬變、前列腺癌、REAR綜合征、雷夫敘姆病、色素性視網(wǎng)膜炎、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤、Rett綜合征、圣菲利波綜合征、精神分裂癥、重度聯(lián)合免疫缺陷癥、鐮狀細(xì)胞性貧血、脊柱裂、脊髓性肌萎縮、脊髓小腦萎縮、SRY性別決定、成人猝死綜合征、丹吉爾病、泰-薩病、血小板減少-橈骨缺失綜合征、Townes-Brocks綜合征、結(jié)節(jié)性硬化癥、特納綜合征、烏謝爾綜合征、希-林二氏綜合征、瓦爾敦堡綜合征、韋弗綜合征、沃納綜合征、威廉斯綜合征、威爾遜病、著色性干皮病和澤韋格綜合征。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微粒遞送系統(tǒng)提供了用于治療遺傳病癥和據(jù)認(rèn)為具有遺傳成分的疾病的組合物和方法，所述疾病表現(xiàn)為代謝性疾病，例如蛋白相關(guān)性病癥，包括鐮狀紅細(xì)胞貧血和β地中海貧血、α地中海貧血、馬方綜合征、Ehlers-DanlosI型、Ehlers-DanlosII型、Ehlers-DanlosIII型、Ehlers-DanlosIV型常染色體顯性、Ehlers-DanlosIV型常染色體隱性、Ehlers-DanlosIV-D型、Ehlers-DanlosV型、Ehlers-DanlosVI型、Ehlers-DanlosVII型常染色體顯性、Ehlers-DanlosVII型常染色體隱性、Ehlers-DanlosVIII型、具有血小板功能障礙的Ehlers-Danlos、皮膚松弛癥、皮膚松弛癥隱性I型(CutisLaxarecessiveTypeI)、后頭角綜合征皮膚松弛癥(OccipitalHornSyndromeCutisLaxa)、X連鎖的、成骨不全I(xiàn)型、成骨不全I(xiàn)-C型、成骨不全靜息II/III型(OsteogenesisImperfectaSilentTypeII/III)、成骨不全I(xiàn)V型、成骨不全新生兒致死型(OsteogenesisImperfectaNeonatalLethalform)和成骨不全進(jìn)行性致畸形。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微粒遞送系統(tǒng)提供了用于治療凝血系統(tǒng)的遺傳病的組合物和方法，所述疾病是例如無(wú)纖維蛋白原血癥，纖維蛋白素原、因子I的完全喪失；異常纖維蛋白原血癥，功能障礙性纖維蛋白素原、因子I；因子II病癥；組織因子V缺乏癥；，不穩(wěn)定因子缺乏、因子VII缺乏、因子VIII缺乏癥(血友病A)、因子IX缺乏癥(血友病B)、因子X(jué)缺乏癥、因子X(jué)I缺乏癥、Rosenthal綜合征、血漿促凝血酶原激酶前體(PTA)缺乏癥、因子X(jué)II缺乏癥、先天性因子X(jué)II缺乏癥癥(Hagemanfactordeficiency)，因子X(jué)III缺乏，因子V和VIII組合缺乏癥、因子VIII和IX組合缺乏癥、因子IX和XI組合缺乏癥、蛋白C缺乏癥、蛋白S缺乏癥、血栓形成傾向、抗凝血酶III缺乏癥、巨血小板綜合征、血小板糖蛋白Ib缺乏癥、馮·威利布蘭德病、Fletcher因子缺乏癥和前激肽釋放酶缺乏癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微粒遞送系統(tǒng)提供了用于治療糖原貯積病的組合物和方法，所述疾病是例如O型、I型(馮吉爾克病)、Ib型、Ic型、II型(蓬佩病)、IIb型(Danon病)、I型II(科里病或福布斯病)、IV型(安德森病)、V型(麥卡德?tīng)柌?、VI型(埃爾病)、VII型(塔里病)、VIII型、IX型和XI型(Fanconi-Bickel綜合征)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療果糖、半乳糖和甘油代謝缺陷的組合物和方法，所述疾病是例如遺傳性果糖不耐癥、醛縮酶B缺乏癥；果糖尿癥、肝果糖激酶缺乏；經(jīng)典半乳糖血(癥)、半乳糖表異構(gòu)酶缺乏癥；半乳糖激酶缺乏癥；高甘油血癥和甘油激酶缺乏癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療膽固醇和脂蛋白代謝缺陷的組合物和方法，所述疾病是例如載脂蛋白(a)-Lp(a)，高脂蛋白血癥I型；高脂蛋白血癥Ib型；載脂蛋白C-II缺乏癥；高脂蛋白血癥Ic型、乳糜微粒血癥；家族性高膽固醇血癥、II型高脂蛋白血癥；高脂蛋白血癥II型、家族性高β-脂蛋白血癥；高脂蛋白血癥III型；載脂蛋白E缺乏癥；高脂蛋白血癥IV型；高脂蛋白血癥V型；家族性LCAT缺乏癥；沃爾曼?。恢鞍字溉狈ΠY；家族性高甘油三酯血癥；高脂血癥V型；高脂血癥VI型；家族性配體缺乏載脂蛋白B(familialligand-defectiveapo-B)；家族性高α脂蛋白血癥、低β脂蛋白血癥、載脂蛋白B-100缺乏癥；血β-脂蛋白缺乏癥、Kornzweig綜合征；和丹吉爾病、家族性高密度脂蛋白缺乏癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療粘多糖類和糖脂病癥的組合物和方法，所述疾病是例如I型H粘多糖貯積癥(胡爾勒綜合征)、I型S粘多糖貯積癥(Scheie綜合征)、I型H/S粘多糖貯積癥(胡爾勒/Scheie綜合征)、II型粘多糖貯積癥(Hunter’s綜合征)，III型粘多糖貯積癥(SanfilippoA型、SanfilippoB型、SanfilippoC型、SanfilippoD型)、IV型粘多糖貯積癥(莫爾基奧A型、莫爾基奧B型)、VI型粘多糖貯積癥(馬-蘭二氏綜合征)和VII型粘多糖貯積癥(Sly綜合征)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療鞘糖脂代謝的病癥的組合物和方法，所述疾病是例如GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥包括全身性GM1II型，幼態(tài)(juvenileform)；全身性GM1III型，成人態(tài)(adultform)；GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、Sandhoff-Jatzkewitz??；GM3神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、泰-薩病、Tay-SachsAB變種、高歇病、尼-皮病A、B、C1、C2和D型、Schindler病、法布里病、乳糖基?；拾贝歼^(guò)多癥、法伯病、克拉伯病、多種硫酸脂酶缺乏癥、Austin病、異染色性腦白質(zhì)障礙癥和硫脂沉積癥(sulfatidelipodosis)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療寡糖貯積病(oligosaccharidose)的組合物和方法，所述病癥是例如巖藻糖苷貯積病、粘脂貯積病VI、sialolipidosis、α甘露糖苷過(guò)多癥、β甘露糖苷過(guò)多癥、唾液酸沉積癥I型和II型、半乳糖唾液酸沉積癥、Goldberg綜合征和天冬氨酰氨基葡糖尿。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療溶酶體酶轉(zhuǎn)運(yùn)的病癥的組合物和方法，所述病癥是例如粘脂貯積病I，唾液酸沉積癥；粘脂貯積病II，I-細(xì)胞病；和粘脂貯積病III，假赫爾勒多種營(yíng)養(yǎng)不良。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療氨基酸和有機(jī)酸代謝缺陷的組合物和方法，所述病癥是例如苯丙酮尿癥；I型酪氨酸血癥、酪氨酸病；II型酪氨酸血癥、里-漢二氏綜合征；III型酪氨酸血癥；尿黑酸癥；高胱氨酸尿癥；組氨酸血癥；槭糖尿病(MSUD)；MSUDIb型，MSUDII型；甲基丙二酸尿癥；非酮高甘氨酸血癥I型(NKHI)和賴氨酸過(guò)多血癥。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療尿素循環(huán)缺陷癥的組合物和方法，所述疾病是例如血氨過(guò)多；氨甲酰磷酸合成酶I(CPS-I)缺乏癥；鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)缺乏癥；N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏；精氨基琥珀酸尿，精氨基琥珀酸裂解酶缺乏癥；高精氨酸血癥，精氨酸酶缺乏癥；瓜氨酸血癥，精氨琥珀酸合成酶缺乏癥和鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶缺乏癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的缺陷的組合物和方法，所述病癥是例如胱氨酸尿癥I型；胱氨酸尿癥III型；哈特奈撲病和血氨過(guò)多-高鳥(niǎo)氨酸血癥-同型瓜氨酸尿(HHH)綜合征。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療卟啉癥和膽紅素血癥的組合物和方法，所述疾病是例如先天性紅細(xì)胞生成性卟啉癥(CEP)；紅細(xì)胞生成性原卟啉癥(erythropoieticprotoporphyria)(EPP)；ALA脫水酶缺乏性卟啉癥(ADP)；急性間歇性血紫質(zhì)病(AIP)；遺傳性糞卟啉癥(HCP)；雜色斑駁卟啉癥(variegateporphyria)(VP)；遲發(fā)性皮膚卟啉(PCT)；肝紅細(xì)胞生成型卟啉癥(HEP)；吉爾伯特綜合征；克-納二氏綜合征，I和I型；杜賓-約翰遜綜合征和羅托爾綜合征。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療脂肪酸代謝錯(cuò)誤的組合物和方法，所述疾病是例如特長(zhǎng)鏈(very-long-chain)酰基-CoA脫氫酶缺乏癥(VLCAD)；長(zhǎng)鏈?；?CoA脫氫酶缺乏癥(LCAD)；中鏈?；?CoA脫氫酶缺乏癥(MCAD)；短鏈?；?CoA脫氫酶缺乏癥(SCAD；肉毒堿移位酶缺乏癥；肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶I(CPTI)缺乏癥和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶II(CPTII)缺乏癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療核苷酸代謝缺陷的組合物和方法，所述疾病是例如萊-萘二氏綜合征；嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，由于腺苷脫氨酶(ADA)的缺乏引起的；痛風(fēng)；腎結(jié)石，由于腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)的缺乏引起的；黃嘌呤尿，由于黃嘌呤氧化酶的缺乏引起的；乳清酸尿癥，I&I型以及鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療金屬代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的病癥的組合物和方法，所述疾病是例如威爾遜病、門(mén)克斯病、后頭角綜合征和hemochromatosis。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療過(guò)氧化物酶體的病癥的組合物和方法，所述病癥是例如澤韋格綜合征、X連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、新生兒腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥(NALD)、肢根斑點(diǎn)狀軟骨發(fā)育異常(RCDP)和嬰兒雷弗素姆氏病(IRD)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)提供了用于治療和缺損DNA修復(fù)相關(guān)的病癥的組合物和方法，所述疾病是例如共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(AT)、著色性干皮病(XP)、科凱恩綜合征、布盧姆綜合征和范可尼貧血。給藥途徑給藥途徑包括但不限于口服；口腔(buccal)、舌下、經(jīng)肺、透皮、透粘膜以及皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和肌內(nèi)注射。優(yōu)選的給藥途徑是口服；口腔、舌下、經(jīng)肺和透粘膜給藥。以治療有效量給受試者施用本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)?？蓡为?dú)地或作為藥物可接受的組合物的部分施用所述顆粒給藥系統(tǒng)。此外，可例如通過(guò)推注一次性地施用組合物或化合物，通過(guò)例如系列片劑，多次地，或例如使用控制釋放制劑在一段時(shí)間內(nèi)基本上均一地遞送來(lái)施用化合物或組合物。也要指出，所述化合物的劑量可隨時(shí)間發(fā)生變化?？墒褂昧⒓瘁尫胖苿?、控制釋放制劑或其組合來(lái)施用所述顆粒給藥系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“控制釋放”包括持續(xù)釋放、緩慢釋放和其組合?？梢耘俊⒆鳛閱我粏挝粍┝炕蜃鳛槎鄠€(gè)單一單位劑量制備、包裝或出售本發(fā)明的藥物組合物。如此處所用的，“單位劑量”是包含預(yù)先確定量的活性組分的藥物組合物的個(gè)別量。所述活性組分的量通常等于可給受試者施用的活性組分的劑量或該劑量的合適部分，例如該劑量的一半或三分之一。本發(fā)明的藥物組合物中的活性組分、藥物可接受媒介物和任何其他組分的相對(duì)量可以變化，依賴于接受治療的人的本體、體形大小和身體狀況和還依賴于施用組合物的途徑。作為例子，所述組合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性組分。本發(fā)明的藥物組合物的單位劑量通常包含大約100毫克至大約2克的活性組分，優(yōu)選地包含大約200毫克至大約1.0克的活性組分。此外，可單獨(dú)地、和具有不同的有效負(fù)載的微粒遞送系統(tǒng)或與其他藥物活性化合物一起施用本發(fā)明的顆粒給藥系統(tǒng)?？蛇x擇其他藥物活性化合物以治療和使用所述顆粒給藥系統(tǒng)治療的病癥一樣的病癥或不同的病癥。如果受試者將接受或正在接受多種藥物活性化合物，可同時(shí)或以任何順序相繼施用所述化合物。例如，在片劑的情況下，可在一個(gè)片劑或在分開(kāi)的片劑中存在所述活性化合物，所述片劑可同時(shí)施用或以任何順序相繼施用。此外，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，所述組合物可以具有不同的形式。例如，可通過(guò)片劑遞送一種或多種化合物，而通過(guò)注射或以糖漿的形式口服施用其它化合物。本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的藥物組合物和說(shuō)明材料的試劑盒。說(shuō)明材料包括用于告知本發(fā)明的藥物組合物在人中用于此處所示的目的中的一個(gè)目的的有用性的出版物、記錄、圖表或表述的任何其他媒介。所述說(shuō)明材料也可例如描述本發(fā)明的藥物組合物的合適劑量。本發(fā)明的試劑盒的說(shuō)明材料可附著至包含本發(fā)明的藥物組合物的容器或和裝有所述藥物組合物的容器一起運(yùn)輸?？蛇x擇地，所述說(shuō)明材料可和容器分開(kāi)運(yùn)輸，意在使說(shuō)明材料和藥物組合物可被接受者共同使用。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的藥物組合物和用于將所述組合物遞送至人的給藥裝置的試劑盒。作為例子，所述給藥裝置可以是可擠壓的噴藥瓶、定量噴藥瓶、氣溶劑噴霧裝置、噴霧器、干粉遞送裝置、自推進(jìn)溶劑/粉末分配裝置、注射器、注射針頭、棉塞或測(cè)量劑量的容器。所述試劑盒還可包含此處描述的說(shuō)明材料。例如，試劑盒可包含兩種分開(kāi)的藥物組合物，所述組合物分別包含含有顆粒給藥系統(tǒng)和藥物可接受的媒介物的第一組合物，和含有第二藥物活性化合物和藥物可接受的媒介物的組合物。所述試劑盒也包含用于分開(kāi)的組合物的容器，例如分開(kāi)的瓶或分開(kāi)的箔盒。容器的其他實(shí)例包括注射器、盒子、袋子等。一般地，試劑盒包含施用分開(kāi)的組分的指導(dǎo)。當(dāng)分開(kāi)的組分優(yōu)選地以不同的劑型施用(例如，口服和腸胃外)，以不同的劑量間隔施用時(shí)，或當(dāng)組合物的單個(gè)組分的滴定是開(kāi)處方的醫(yī)生想要的時(shí)，所述試劑盒形式是特別有利的。試劑盒的實(shí)例是泡眼包裝。泡眼包裝在包裝工業(yè)中是熟知的且被廣泛地用于包裝藥物單位劑型(片劑、膠囊劑等)。泡眼包裝通常由用優(yōu)選地透明塑料材料的薄片覆蓋的相對(duì)堅(jiān)硬的材料片構(gòu)成。在包裝過(guò)程中，在塑料薄片中形成凹槽(recesses)。該凹槽具有被包裝的片劑或膠囊的大小和形狀。然后將片劑或膠囊放入凹槽并用塑料薄片在相對(duì)凹槽形成的方向的薄片的一面密封相對(duì)堅(jiān)硬的材料片。結(jié)果，片劑或膠囊被封在塑料薄片和片之間的凹槽中。優(yōu)選地，片的強(qiáng)度大至可通過(guò)用手對(duì)凹槽施壓，從而在片中凹槽形成的地方產(chǎn)生開(kāi)口來(lái)從泡眼包裝中取出片劑或膠囊。然后通過(guò)所述開(kāi)口取出片劑或膠囊。在試劑盒上提供記憶輔助可以是想要的，例如以緊靠片劑或膠囊的數(shù)字形式提供，其中所述數(shù)字對(duì)應(yīng)于如此詳細(xì)說(shuō)明的片劑或膠囊應(yīng)當(dāng)服用的方案的天數(shù)。該記憶輔助的另一個(gè)實(shí)例是將日程，例如按照“第一周，星期一、星期二、......等......第二周，星期一、星期二”等表印在卡上。記憶輔助的其他變化將非常明顯?！叭談┝俊翱梢允窃诮o定的一天服用的單一片劑或膠囊或幾個(gè)丸劑或膠囊。同樣，顆粒給藥系統(tǒng)組合物的日劑量可為一個(gè)片劑或膠囊劑，而第二化合物的日劑量可為幾個(gè)片劑或膠囊劑，反之亦然。所述記憶輔助應(yīng)當(dāng)反應(yīng)這個(gè)且?guī)椭_的給藥。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了設(shè)計(jì)用于按其想要的使用順序依次分配日劑量的分配器。優(yōu)選地，所述分配器配備了記憶輔助器，從而進(jìn)一步有助于順從給藥方案。該記憶輔助器的實(shí)例是機(jī)械計(jì)數(shù)器，其顯示已分配的日劑量的次數(shù)。該記憶輔助器的另一個(gè)實(shí)例是電池供電的連接液晶讀出器的微芯片記憶器，或可聽(tīng)見(jiàn)的提醒信號(hào)，所述信號(hào)讀出例如已服用的最后日劑量和/或提醒人進(jìn)行下一次給藥的時(shí)間?？赏ㄟ^(guò)口服、直腸、腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下)、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、局部(例如，粉劑、軟膏劑或滴劑)途徑或以口腔或鼻腔噴霧的途徑給受試者施用任選地包含其他藥物活性化合物的顆粒給藥系統(tǒng)組合物。藥物組合物的腸胃外給藥法包括特征在于產(chǎn)生人組織的物理裂口并通過(guò)組織的裂口施用藥物組合物的任何給藥途徑。因此腸胃外給藥包括通過(guò)組合物的注射、通過(guò)外科切口施用組合物、通過(guò)組織穿透非外科傷口施用組合物等進(jìn)行的藥物組合物的給藥。特別地，腸胃外給藥包括皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)或胸骨內(nèi)注射和靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或腎滲析輸注技術(shù)。適合用于腸胃外注射的組合物包含活性組分和藥物可接受的媒介物，所述媒介物是例如生理可接受的無(wú)菌水或非水性溶液、分散液、混懸液或乳劑，或可包含無(wú)菌粉劑，所述粉劑可重構(gòu)形成無(wú)菌注射液或分散液。合適的水性和非水性媒介物、稀釋劑、溶劑或載體的實(shí)例包括水、等滲鹽水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合適的混合物、甘油三酯，包括植物油例如橄欖油、或可注射的有機(jī)酯類例如油酸乙酯?？赏ㄟ^(guò)例如使用包衣例如卵磷脂，在分散體的情況下通過(guò)保持所需顆粒的大小和/或通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。可以適合于推注給藥或連續(xù)給藥的形式制備、包裝或銷售這些制劑?？梢詥挝粍┬?，例如以在安瓿中，在裝有防腐劑的多劑量容器中，或在用于自動(dòng)注射或由醫(yī)生注射的一次性裝置中的形式制備、包裝或銷售注射劑。用于腸胃外給藥的制劑包括混懸劑、溶液、油或水媒介物中的乳劑、糊劑和可植入的持續(xù)釋放或可生物降解的制劑。這些制劑還可包含一種或多種額外的成分，包括懸浮劑、穩(wěn)定劑或分散劑。在用于腸胃外給藥的制劑的一個(gè)實(shí)施方案中，以干燥(即粉末或顆粒)的形式提供所述活性組分，所述干燥形式在腸胃外施用所述重構(gòu)的組合物之前用合適的媒介物(例如無(wú)菌無(wú)熱原水)進(jìn)行重構(gòu)?？梢詿o(wú)菌可注射的水性或油性混懸液或溶液的形式制備、包裝或銷售所述藥物組合物。該混懸液或溶液可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行配制，且可包含，除所述活性組分以外，其他組分例如此處描述的分散劑、濕潤(rùn)劑或懸浮劑?？墒褂脽o(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑例如水或1，3-丁二醇制備該無(wú)菌注射劑。其他可接受的稀釋劑和溶劑包括林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液和不揮發(fā)油例如合成的甘油一酯或甘油二酯。其他有用的可腸胃外施用的制劑包括這樣的制劑，所述制劑包含以微晶形式、存在于脂質(zhì)體制劑中的活性組分或作為可生物降解的聚合物系統(tǒng)的組分。用于持續(xù)釋放或植入的組合物可包含藥物可接受的聚合物或疏水性材料例如乳劑、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、微溶的聚合物或微溶的鹽。這些組合物也可包含佐劑例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和/或分散劑?？赏ㄟ^(guò)加入各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等來(lái)預(yù)防組合物的微生物污染。包含等滲劑例如糖、氯化鈉等也是想要的。可注射的藥物組合物的延長(zhǎng)的吸收可通過(guò)使用能夠延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁/或明膠來(lái)產(chǎn)生。劑型可包括固體或可注射植入物或貯庫(kù)(depot)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述埋埴劑包含所述顆粒給藥系統(tǒng)的等分和可生物降解的聚合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，合適的可生物降解的聚合物可選自聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚酐、聚(β-羥丁酸)、聚(原酸酯)和聚磷嗪。用于口服施用的固體劑型包括膠囊劑、片劑、粉劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，任選地將所述微粒遞送系統(tǒng)和至少一種慣用的惰性賦形劑(或媒介物)混合，所述賦形劑是例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣或(a)充填劑或增充劑(extender)，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或硅酸；(b)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或阿拉伯膠；(c)增濕劑例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、土豆或木薯淀粉、海藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、或碳酸鈉；(e)溶液阻滯劑，例如，石蠟；(f)吸收促進(jìn)劑，例如，季胺類化合物；(g)濕潤(rùn)劑，例如，鯨蠟醇或單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土或膨潤(rùn)土；和/或(i)潤(rùn)滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉或其混合物。在膠囊劑和片劑的情況下，劑型也可包含緩沖劑。包含顆粒給藥系統(tǒng)的片劑可通過(guò)例如對(duì)活性組分，任選地和一種或多種其他組分一起壓制或塑型來(lái)制備。壓制的片劑可通過(guò)將以自由流動(dòng)的形式例如粉末或顆粒制劑的形式存在的活性組分(任選地和一種或多種粘合劑、潤(rùn)滑劑、賦形劑、表面活性劑和分散劑混合)在合適的設(shè)備中壓制來(lái)制備。模制片可通過(guò)將活性組分、藥物可接受媒介物的混合物和至少足以潤(rùn)濕所述混合物的液體在合適的設(shè)備中塑型來(lái)制造。用于片劑生產(chǎn)的藥物可接受的賦形劑包括惰性稀釋劑、制粒劑和崩解劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑。已知的分散劑包括土豆淀粉和淀粉羥乙酸鈉。已知的表面活性劑包括十二烷基硫酸鈉。已知的稀釋劑包括碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、微晶纖維素、磷酸鈣、磷酸氫鈣和磷酸鈉。已知的制粒劑和崩解劑包括玉米淀粉和海藻酸。已知的粘合劑包括明膠、阿拉伯膠、預(yù)糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基甲基纖維素。已知的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、二氧化硅和滑石。片劑可不用包被，或可使用已知的方法包被以在人的胃腸道中獲得延緩的崩解，從而在例如小腸中的派爾斑區(qū)域中提供持續(xù)釋放和所述顆粒給藥系統(tǒng)的吸收。作為例子，材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可用于包被片劑。此外作為例子，可使用美國(guó)專利4,256,108、4,160,452和4,265,874中描述的方法包被片劑以形成受滲透壓控制而釋放的片劑。片劑還可包含甜味劑、增香劑(flavoringagent)、著色劑、防腐劑或這些添加劑的一些組合，以提供藥物上雅致和適口的制劑。可用包衣或殼例如腸溶包衣和本領(lǐng)域內(nèi)熟知的其他制備固體劑型例如片劑、錠劑、膠囊劑和粒劑。其也可包含遮光劑，也可是這樣的組合物，即其以延遲的方式釋放顆粒給藥系統(tǒng)?？墒褂玫穆裰步M合物的實(shí)例是聚合物物質(zhì)和蠟。活性化合物也可以微膠囊化的形式存在，如果合適，具有一種或多種上述賦形劑。相似類型的固體組合物也可在使用賦形劑如乳糖或奶糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的軟或硬填充膠囊中用作填充劑?？墒褂每缮斫到獾慕M合物，例如明膠制備包含顆粒給藥系統(tǒng)的硬膠囊。該硬膠囊包含顆粒給藥系統(tǒng)，且還可包含其他組分，包括例如，惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土。可使用生理可降解的組合物例如明膠制備包含所述顆粒給藥系統(tǒng)的軟膠囊。該軟膠囊包含顆粒給藥系統(tǒng)，可將所述顆粒給藥系統(tǒng)和水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。可使用已知技術(shù)制備口服組合物，所述組合物在人受試者的小腸或大腸中特異性地釋放口服施用的試劑。例如，用于遞送至胃腸系統(tǒng)(包括結(jié)腸)的制劑包括基于例如異丁烯酸共聚物例如聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)的腸溶衣包被的系統(tǒng)，所述腸溶衣只在pH6和以上可溶，這樣所述聚合物只有在進(jìn)入小腸時(shí)才開(kāi)始溶解。這些聚合物制劑分解的位置依賴于腸運(yùn)輸?shù)乃俾屎痛嬖诘木酆衔锏牧?。例如，相?duì)厚的聚合物包衣用于向近側(cè)結(jié)腸的遞送(Hardy等人，1987Aliment.Pharmacol.Therap.1273-280)。也可使用能夠提供位置特異性結(jié)腸遞送的聚合物，其中所述聚合物依賴于大腸的細(xì)菌群落以提供所述聚合物包衣的酶促降解從而釋放藥物。例如，偶氮類聚合物(美國(guó)專利4,663,308)、苷類(Friend等人，1984，J.Med.Chem.27261-268)和各種天然可獲得的和修飾的多糖(參見(jiàn)PCT申請(qǐng)PCT/GB89/00581)可用于這些制劑。脈沖釋放技術(shù)例如美國(guó)專利4,777,049中描述的技術(shù)也可用于施用所述顆粒給藥系統(tǒng)至胃腸道內(nèi)的特定位置。這些系統(tǒng)允許以預(yù)定的時(shí)間進(jìn)行遞送和可用于遞送顆粒給藥系統(tǒng)，任選地和其他添加劑一起遞送，所述添加劑可改變局部微環(huán)境以提高穩(wěn)定性和促進(jìn)吸收，而不用直接依賴于除了水的存在以外的外部條件提供體內(nèi)釋放。用于口服給藥的液體劑型包括藥物可接受的乳劑、溶液、混懸液、糖漿劑和酏劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含通常用于本領(lǐng)域的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、等滲鹽水、增溶劑和乳化劑，例如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油，特別是，杏仁油、花生油、椰子油、棉子油、花生油、玉米仁油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、MIGLYOLTM、甘油、分級(jí)分離的植物油、礦物油例如液體石蠟、四氫呋喃醇、聚乙二醇、去水山梨糖醇的脂肪酸酯或這些物質(zhì)的混合物等。除了這些惰性稀釋劑外，所述組合物也可包含添加劑，例如濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑、粘滑劑(demulcent)、防腐劑、緩沖劑、鹽、甜化劑、調(diào)味劑、著色劑和芳香劑。混懸液，除了活性化合物外，可包含懸浮劑，例如，乙氧基異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇或脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、氫化食用脂、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠、阿拉伯膠、瓊脂和纖維素衍生物例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、偏氫氧化鋁(aluminummetahydroxide)、膨潤(rùn)土或這些物質(zhì)的混合物等?？梢砸后w的形式或以無(wú)水產(chǎn)品的形式制備、包裝和銷售適合于口服施用的本發(fā)明的藥物組合物的液體劑型，所述無(wú)水產(chǎn)品在使用前用水或其他適合的媒介物進(jìn)行重構(gòu)。已知的分散劑或濕潤(rùn)劑包括天然發(fā)生的磷脂例如卵磷酯、氧化烯和脂肪酸、和長(zhǎng)鏈脂肪醇、和來(lái)源于脂肪酸和己糖醇的偏酯、和來(lái)源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，分別為聚氧乙烯硬脂酸酯、十七亞乙基氧鯨蠟醇、聚氧乙烯單油酸山梨醇酯、聚氧乙烯單油酸去水山梨醇酯)。已知的乳化劑包括卵磷脂和阿拉伯膠。已知的防腐劑包括甲基、乙基或正丙基-對(duì)-羥苯甲酸、抗壞血酸和山梨酸。已知的甜味劑包括，例如，甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。已知的含油懸浮液的增稠劑包括例如，蜂蠟、硬石蠟和鯨蠟醇。在其他實(shí)施方案中，藥物組合物可制備為營(yíng)養(yǎng)制品，即，以食物(例如，用于直接消費(fèi)的加工的產(chǎn)品)或食料(例如，用于在攝食前整合入食物的可食用組分)的形式存在，或可加入至食物或食料中。合適的食物的實(shí)例包括糖果例如棒棒糖、烘烤的食品例如餅干、面包、餅干和點(diǎn)心蛋糕、完全的濃湯或果泥和蔬菜、飲料和加工的肉產(chǎn)品。合適的食料(foodstuff)的實(shí)例包括磨碎的米粒和糖、香料和其他調(diào)味品和糖漿劑。此處描述的顆粒給藥系統(tǒng)優(yōu)選地不長(zhǎng)時(shí)間地暴露于高烹飪溫度，以使所述化合物降解減少到最小?？赏ㄟ^(guò)將顆粒給藥系統(tǒng)和合適的非刺激性賦形劑或媒介物例如可可脂、聚乙二醇或栓劑石蠟混合來(lái)制備用于直腸或陰道施用的化合物，所述賦形劑或媒介物在通常的室溫下是固體，但在體溫下是液體，從而在直腸或陰道腔中熔化并釋放顆粒給藥系統(tǒng)。這樣的組合物可以例如栓劑、保留灌腸劑和用于直腸或結(jié)腸灌洗的溶液的形式存在。栓劑制劑還可包含各種額外的組分，包括抗氧化劑和防腐劑?？赏ㄟ^(guò)將所述活性組分和藥物可接受的液體媒介物組合來(lái)制備用于直腸或結(jié)腸灌洗的保留灌腸劑或溶液。如在本領(lǐng)域已知的，可使用適合于人的直腸解剖學(xué)的裝置施用灌腸劑，和可將其包裝在所述裝置內(nèi)。灌腸劑還可包含各種額外的組分，包括抗氧化劑和防腐劑?？梢赃m合用于通過(guò)口腔進(jìn)行的肺部給藥的制劑形式制備、包裝或銷售本發(fā)明的藥物組合物?？墒褂冒瑹o(wú)水粉劑貯器(可導(dǎo)入推進(jìn)劑流以分散所述粉劑)的裝置或使用自動(dòng)推進(jìn)溶劑/粉劑分散容器(例如包含懸浮于密封的容器中的低沸點(diǎn)推進(jìn)劑中的顆粒給藥系統(tǒng)的裝置)方便地以無(wú)水粉劑形式施用這些組合物。無(wú)水粉劑組合物可包含固體細(xì)粉稀釋劑例如糖，且方便地以單位劑型提供。低沸點(diǎn)推進(jìn)劑通常包括具有在大氣壓下具有低于65的沸點(diǎn)的液體推進(jìn)劑。一般地所述推進(jìn)劑可組成所述組合物的50至99.9％(w/w)，活性組分可組成組合物的0.1至20％(w/w)。推進(jìn)劑還可包含其他組分例如液體非離子或固體陰離子表面活性劑或固體稀釋劑(優(yōu)選地具有和包含所述顆粒給藥系統(tǒng)的微粒相同量級(jí)的微粒大小)。用于肺部遞送的本發(fā)明的藥物組合物也可以懸浮液的滴劑的形式提供活性組分。這些制劑可以含水的或稀釋的醇懸浮液(任選地?zé)o菌的，包含所述顆粒給藥系統(tǒng))的形式制備、包裝或銷售，且可使用任何噴霧或霧化裝置方便地施用。這些制劑還可包含一種或多種其他組分，包括調(diào)味劑例如糖精鈉、揮發(fā)油、緩沖劑、表面活性劑或防腐劑例如甲基羥基苯甲酸酯。此處描述的用于肺部給藥的制劑也用于本發(fā)明的藥物組合物的鼻內(nèi)給藥。適合于鼻內(nèi)給藥的另一種制劑是包含所述藥物給藥系統(tǒng)的粗粉。以其中鼻吸藥(snuff)被吸收，即通過(guò)鼻道從置于靠近鼻孔的粉劑的容器快速吸入而吸收的方式施用該制劑。可以適合于口腔給藥的制劑制備、包裝或銷售本發(fā)明的藥物組合物。這些制劑可，例如，以使用常規(guī)方法制備的片劑或錠劑的形式存在，且可，例如，包含0.1至20％(w/w)顆粒給藥系統(tǒng)，其余部分包含口服可溶解的或可降解的組合物和，任選地，一種或多種此處描述的其他組分?？蛇x擇地，適合于口腔施用的制劑可包含粉劑或霧化的或粉化的包含所述顆粒給藥系統(tǒng)的溶液或懸浮液。抗體如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)包括能夠特異性地結(jié)合蛋白的完整分子和抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗體的Fc片段，可更快速地從循環(huán)中清除，且可比完整的抗體具有更少的非特異性組織結(jié)合。因此，這些片段是優(yōu)選的，F(xiàn)ab或其他免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物也是優(yōu)選的。此外，本發(fā)明的抗體包括嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體。可使用許多本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備抗體。下面簡(jiǎn)單地描述合適的技術(shù)。抗體可以是多克隆的或單克隆的。多克隆抗體對(duì)于初始發(fā)展可具有顯著的有利方面，包括生產(chǎn)的快速性和對(duì)于多個(gè)表位的特異性，從而確保強(qiáng)免疫熒光染色和抗原捕獲。單克隆抗體適合大規(guī)模生產(chǎn)；優(yōu)選的實(shí)施方案包括至少一種對(duì)于靶抗原的表位是特異性的單克隆抗體。因?yàn)槎嗫寺≈苿┎荒苋菀椎剡M(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)重復(fù)生產(chǎn)，所以另一個(gè)實(shí)施方案使用至少四種單克隆抗體的混合物。單鏈Fv(“scFv”或“sFv”)多肽是共價(jià)連接的VH:VL異二聚體，其可從包含直接連接的或通過(guò)編碼肽的連接體連接的VH和VL編碼序列的核酸表達(dá)。Huston，等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA，855879-5883(1988)。許多結(jié)構(gòu)用于將天然聚集但化學(xué)上分開(kāi)的來(lái)自抗體V區(qū)的輕多肽鏈和重多肽鏈轉(zhuǎn)化成能折疊成基本上和抗原結(jié)合位點(diǎn)相似的三維結(jié)構(gòu)的scFv分子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利6,512,097、5,091,513和5,132,405和4,956,778。在一類實(shí)施方案中，可使用重組設(shè)計(jì)方法產(chǎn)生用于將兩個(gè)天然結(jié)合的但化學(xué)上分開(kāi)的來(lái)自抗體可變區(qū)的重多肽鏈和輕多肽鏈轉(zhuǎn)化成能折疊成三維結(jié)構(gòu)的sFv分子的合適的化學(xué)結(jié)構(gòu)(連接體)，所述三維結(jié)構(gòu)基本上和天然抗體結(jié)構(gòu)相似。設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)包括確定橫跨一條鏈的C末端和另一條鏈的N末端之間的距離的合適長(zhǎng)度，其中一般從小親水性的不易卷曲或不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基形成連接體。已在本領(lǐng)域中描述了這些方法。參見(jiàn)，例如，屬于Huston等人的美國(guó)專利5,091,513和5,132,405；和屬于Ladner等人的美國(guó)專利4,946,778。在該方面，連接體設(shè)計(jì)的第一一般步驟包括鑒定被連接的可能位置。VH和VL多肽結(jié)構(gòu)域的各肽上的合適的連接位點(diǎn)包括導(dǎo)致來(lái)自多肽結(jié)構(gòu)域的殘基的最少丟失的位點(diǎn)，這使得連接體必需包含符合分子穩(wěn)定性所需的最少數(shù)目的殘基。成對(duì)的位置確定被連接的“缺口”。將一個(gè)結(jié)構(gòu)域的C末端連接至下一個(gè)結(jié)構(gòu)域的N末端的連接體通常包含親水性氨基酸，所述氨基酸在生理溶液中呈現(xiàn)未組織的構(gòu)型且優(yōu)選地不含具有可能干擾VH和VL鏈正確折疊的大側(cè)鏈基團(tuán)的殘基。因此，在本發(fā)明下的合適的連接體一般包含甘氨酸和絲氨酸殘基的交替排列的多肽鏈，且可包含插入的谷氨酸和賴氨酸殘基以增強(qiáng)穩(wěn)定性。可使用本領(lǐng)域已知的各種寡核苷酸合成技術(shù)容易地提供編碼這些連接體部分的核苷酸序列。可選擇地，人源化抗體片段可包含鼠類單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)和來(lái)源于人抗體的可變區(qū)片段(缺少抗原結(jié)合位點(diǎn))。用于產(chǎn)生嵌合的和進(jìn)一步基因工程改造的單克隆抗體的方法包括描述于Riechmann等人(Nature332323，1988)，Liu等人(PNAS843439，1987)，Larrick等人(BioTechnology7934，1989)，和WinterandHarris(TIPS14139，May，1993)中的方法。用于產(chǎn)生人抗體的一個(gè)方法包括用靶抗原免疫非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠，由此在所述動(dòng)物中產(chǎn)生抗所述靶抗原的抗體。已在非人動(dòng)物中發(fā)展了用于產(chǎn)生人抗體的方法。所述抗體可以部分是人的，或優(yōu)選的完全是人的?？墒褂靡褜?dǎo)入編碼一種或多種人免疫球蛋白鏈的遺傳物質(zhì)的非人動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)?？梢远喾N方法從遺傳上改變?cè)撧D(zhuǎn)基因小鼠。遺傳操作可導(dǎo)致人免疫球蛋白鏈在至少一些(優(yōu)選地幾乎所有)由免疫后的動(dòng)物產(chǎn)生的抗體中取代內(nèi)源免疫球蛋白鏈。此處提供通過(guò)靶抗原免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的抗體。已產(chǎn)生了在其中通過(guò)各種方法失活一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源免疫球蛋白基因的小鼠。已將人免疫球蛋白基因?qū)胄∈笠匀〈Щ畹男∈蠡颉Ｔ趧?dòng)物中產(chǎn)生的抗體整合由導(dǎo)入該動(dòng)物的人遺傳物質(zhì)編碼的人免疫球蛋白多肽鏈。用于生產(chǎn)的技術(shù)和這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途的實(shí)例描述于美國(guó)專利5,814,318、5,569,825和5,545,806，其在此引用作為參考?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)的方法，例如，通過(guò)使從完成免疫方案后的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物收獲的脾細(xì)胞永生化來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)的方法將所述脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，從而產(chǎn)生雜交瘤。用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系的方法包括用包含靶抗原的至少7個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的免疫原免疫該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；從所述免疫的動(dòng)物收獲脾細(xì)胞；將收獲的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系融合，從而產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞；和鑒定產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明包括這些雜交瘤細(xì)胞系，和從其產(chǎn)生的單克隆抗體。通過(guò)常規(guī)技術(shù)純化由所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在競(jìng)爭(zhēng)抗原組存在的情況下針對(duì)一組抗原從非免疫噬菌體展示抗體庫(kù)選擇來(lái)產(chǎn)生抗體片段(Stausbol-Grn，B.，等人，Denovoidentificationofcell-typespecificantibody-antigenpairsbyphagedisplaysubtraction.Isolationofahumansinglechainantibodyfragmentagainsthumankeratin14.EurJBiochem2001May；268(10)3099-107)。該方法可用于產(chǎn)生抗靶抗原的噬菌體抗體。所述方案總地來(lái)說(shuō)基于由Stausbol-Grn，B.，等人，2001描述的方案。簡(jiǎn)而言之，使用非免疫的半合成噬菌體展示抗體庫(kù)。該庫(kù)是通過(guò)重新克隆來(lái)自lox文庫(kù)的重鏈和輕鏈區(qū)域構(gòu)建的單鏈Fv(scFv)噬菌粒庫(kù)(Griffiths，A.D.，等人(1994)Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires.EMBOJ.13，3245-3260.)。大腸桿菌TG1(supEhsdD5Δ(lac-proAB)thiF′{traD36proAB+lacIqlacZΔM15])是琥珀突變抑制基因株系(supE)且用于噬菌體顆粒的繁殖。大腸桿菌HB2151(araΔ(lac-proAB)thiF′{proAB+lacIqlacZΔM15])是非抑制基因株系且用于表達(dá)可溶性scFv。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可擴(kuò)增和拯救人單鏈Fv(scFv)文庫(kù)，如所描述的(Gao，等人.，Makingchemistryselectablebylinkingittoinfectivity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第94卷，pp.11777-11782，October1997)。就抗懸浮在PBS(10mM磷酸鹽、150mMNaCl，pH7.4)中的靶抗原淘選文庫(kù)并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)選擇陽(yáng)性scFv-噬菌體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)提供編碼重組抗體，優(yōu)選地單鏈Fv抗體的表達(dá)載體提供抗體。實(shí)施例1圖1是酵母細(xì)胞壁的橫截面的示意圖100，從外向內(nèi)顯示，外纖維層110、外甘露糖蛋白層120、β-葡聚糖層130、β-葡聚糖層-殼多糖層140、內(nèi)甘露糖蛋白層150、質(zhì)膜160和細(xì)胞質(zhì)170。WGP微粒的制備之前從Alpha-BetaTechnology獲得完整葡聚糖微粒(WGP，LotWO282)。一般地，通過(guò)從酵母細(xì)胞壁提取和純化堿不溶性葡聚糖級(jí)分來(lái)制備完整葡聚糖微粒。用氫氧化物水溶液處理酵母細(xì)胞而不破壞酵母細(xì)胞壁，該處理降解細(xì)胞的蛋白和細(xì)胞內(nèi)部分，留下沒(méi)有顯著蛋白污染的葡聚糖壁組分，且具有基本上未改變的β(1-6)和β(1-3)連接的葡聚糖的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。在分批補(bǔ)料發(fā)酵的條件下將酵母細(xì)胞(釀酒酵母(S.cerevisae)株系R4)在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)至中期對(duì)數(shù)期(midlogphase)。在2000rpm下通過(guò)分批離心10分鐘收獲細(xì)胞(大約90g干細(xì)胞重/L)。然后在蒸餾水中洗滌細(xì)胞一次，之后重懸浮于1升1MNaOH中并加熱至90℃。在該溫度下強(qiáng)烈地?cái)嚢杓?xì)胞懸浮液1小時(shí)。在2000rpm下離心10分鐘回收包含細(xì)胞壁的不溶性材料。然后將該材料懸浮于1升1M的NaOH中并再次加熱至90℃。在該溫度下強(qiáng)烈地?cái)嚢杓?xì)胞懸浮液1小時(shí)。然后讓該懸浮液冷卻至室溫，再持續(xù)進(jìn)行提取16小時(shí)。在2000rpm下離心10分鐘回收該不溶性材料。最終在75℃下在1升用HCl調(diào)節(jié)至pH4.5的水中提取該材料1小時(shí)。通過(guò)離心回收該不溶性殘留物并用200毫升水洗滌3次，用200毫升異丙醇洗滌4次和用200毫升丙酮洗滌2次。將所得的漿放入玻璃托盤(pán)中并在減壓條件下在55℃下進(jìn)行干燥，產(chǎn)生7.7g精細(xì)白色粉末。可在美國(guó)專利4,810,646、4,992,540、5,028,703、5,607,677和5,741,495中找到完整葡聚糖微粒的更詳細(xì)描述和制備其的方法，其教導(dǎo)在此引用作為參考。例如，美國(guó)專利5,028,703公開(kāi)了可從發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞制備酵母WGP微粒。在SorvalRC2-B離心機(jī)中，在8000rpm下通過(guò)分批離心20分鐘收獲細(xì)胞。然后在蒸餾水中洗滌所述細(xì)胞2次以準(zhǔn)備將其用于完整葡聚糖的提取。第一步驟包括重懸浮細(xì)胞團(tuán)于1升4％w/vNaOH中并加熱至100℃。在該溫度下強(qiáng)烈地?cái)嚢杓?xì)胞懸浮液1小時(shí)。在2000rpm下離心15分鐘回收包含細(xì)胞壁的不溶性材料。然后將該材料懸浮于2升3％w/vNaOH中并加熱至75℃。在該溫度下強(qiáng)烈地?cái)嚢杓?xì)胞懸浮液3小時(shí)。然后讓?xiě)腋∫豪鋮s至室溫并繼續(xù)進(jìn)行提取16小時(shí)。在2000rpm下離心15分鐘回收不溶性材料。最后在75℃，在2升用HCl調(diào)節(jié)至pH4.5的3％w/v的NaOH中提取該材料1小時(shí)。離心回收不溶性殘留物并用200毫升水洗滌3次，用200毫升脫水乙醇洗滌1次和用200毫升脫水乙醚洗滌2次。將所得的漿放入培養(yǎng)皿并進(jìn)行干燥。YGMP微粒的制備將釀酒酵母(100gFleishmansBakers酵母)懸浮于1升1MNaOH中并加熱至55℃。在該溫度下混合細(xì)胞懸浮液1小時(shí)。通過(guò)在2000rpm下離心10分鐘回收包含細(xì)胞壁的不溶性材料。然后將該材料懸浮于1升水中并用HCl調(diào)節(jié)至pH4-5，然后在55℃下溫育1小時(shí)。離心回收不溶性殘留物并用1000毫升水洗滌1次，用200毫升脫水異丙醇洗滌4次和用200毫升丙酮洗滌2次。將所得的漿放入玻璃托盤(pán)中并在室溫下干燥，產(chǎn)生12.4g精細(xì)、淡灰白色的粉末。YGMP微粒的制備將釀酒酵母(75gSAF-Mannan)懸浮于1升水中并用1MNaOH調(diào)節(jié)至pH12-12.5，然后加熱至55℃。在該溫度下混合細(xì)胞懸浮液1小時(shí)。在2000rpm下離心10分鐘回收包含細(xì)胞壁的不溶性材料。然后將該材料懸浮于1升水中并用HCl調(diào)節(jié)至pH4-5，然后在55℃下溫育1小時(shí)。通過(guò)離心回收不溶性殘留物并用1000毫升水洗滌1次，用200毫升脫水異丙醇洗滌4次和用200毫升丙酮洗滌2次。將所得的漿放入玻璃托盤(pán)中并在室溫下進(jìn)行干燥，產(chǎn)生15.6g精細(xì)淡灰白色粉末。YCP微粒的制備在30℃下，在YPD中將來(lái)源于獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)的培養(yǎng)物的酵母細(xì)胞紅酵母菌株(Rhodotorulasp.)在需氧條件下培養(yǎng)至靜止期。可從ATCC獲得的紅酵母菌株培養(yǎng)物包括Nos.886、917、9336、18101、20254、20837和28983。在2000rpm下分批離心10分鐘收獲細(xì)胞(1L)。然后在蒸餾水中洗滌細(xì)胞一次，然后將其在75℃下重懸浮于用HCl調(diào)節(jié)至pH4.5的水中，進(jìn)行1小時(shí)。在2000rpm下離心10分鐘回收包含細(xì)胞壁的不溶性材料。然后將該材料懸浮于1升1MNaOH中并加熱至90℃，進(jìn)行1小時(shí)。然后讓所述懸浮液冷卻至室溫并繼續(xù)進(jìn)行提取16小時(shí)。在2000rpm下離心15分鐘回收不溶性殘留物并用1000毫升水洗滌2次，用200毫升異丙醇洗滌4次和用200毫升丙酮洗滌2次。將所得的漿放入玻璃托盤(pán)中并在室溫下干燥，產(chǎn)生2.7g精細(xì)淡棕色粉末。圖2A是酵母細(xì)胞壁顆粒的結(jié)構(gòu)圖解；圖2B是顯示酵母細(xì)胞壁顆粒的甘露聚糖組分的伴刀豆球蛋白-A-FITC(con-A-異硫氰酸熒光素，SigmaChemical，St.Louis，MO)染色的熒光顯微照片；圖2C是YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖微粒的結(jié)構(gòu)的圖解，圖2D是顯示YGMPβ葡聚糖-甘露聚糖微粒的點(diǎn)狀con-A-FITC染色的熒光顯微照片；圖2E是YGPβ葡聚糖微粒的結(jié)構(gòu)的圖解，圖2F是顯示缺乏YGPβ葡聚糖微粒的con-A-FITC染色的熒光顯微照片。伴刀豆球蛋白-A是選擇性地結(jié)合甘露糖的凝集素。通過(guò)熒光顯微鏡評(píng)估伴刀豆球蛋白-A-FITC的結(jié)合以觀察各種酵母細(xì)胞壁制劑的表面上的甘露聚糖的量和分布模式。以1×108個(gè)微粒/ml的密度制備面包酵母(FleishmansBakersyeast)、YGMP和YGP在PBS+1mMMgCl2+1mMCaCl2中的懸浮物。Con-A-FITC母液是PBS+1mMMgCl2+1mMCaCl2中的1mg/ml的伴刀豆球蛋白-A-FITC。在微量離心管中制備標(biāo)記混合物，所述混合物由下列物質(zhì)組成100μlPBS+1mMMgCl2+1mMCaCl22.5μl酵母細(xì)胞壁顆粒懸浮物2.5μlcon-A-FITC母液溶液。將裝有所述標(biāo)記混合物的微量離心管在黑暗處在室溫下溫育1小時(shí)。離心(在10,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集酵母細(xì)胞壁顆粒，然后用100μlPBS洗滌沉淀3次。將洗滌的酵母細(xì)胞壁顆粒重懸浮于100μlPBS中，然后轉(zhuǎn)移至96孔板中以用熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。示例性視野的照片顯示于圖2B、2D和2F。下面的表2概述了如上所述制備的WGP微粒、YGP微粒、YGMP微粒和YCP微粒的樣品的化學(xué)組分分析的結(jié)果。要注意，YGP微粒和YGMP微粒，和現(xiàn)有技術(shù)WGP微粒相比，具有更低的β葡聚糖含量，通常在大約6至大約90的重量百分比之間和更高的蛋白含量。YGMP微粒，和其他微粒類型相比，具有顯著更高的甘露聚糖含量，通常在大約6至大約90的重量百分比之間。YCP微粒，和其他微粒類型相比，具有顯著更高的殼多糖+殼聚糖含量，通常大約50至大約75的重量百分比。實(shí)施例2酵母細(xì)胞壁顆粒的流體動(dòng)力學(xué)體積酵母的流體動(dòng)力學(xué)體積確定為顆粒的有效負(fù)載容量的測(cè)量。在配衡的15ml離心管中稱量1g酵母細(xì)胞壁顆粒的等分以確定所述無(wú)水顆粒的重量。向管中加入水(12.5ml)，然后渦旋振蕩管以混合酵母細(xì)胞壁顆粒的懸浮液。讓顆粒膨脹并吸收水分，進(jìn)行30分鐘。在2000rpm下離心所述顆粒懸浮物10分鐘。移走水，稱取管重，計(jì)算吸收的水的重量。流體動(dòng)力學(xué)體積計(jì)算為吸收的水的重量與無(wú)水顆粒的重量的比率。表3提供了現(xiàn)有技術(shù)WGP的兩種制劑和本發(fā)明的YGP和YGMP的結(jié)果。WGP制劑2的更低的流體動(dòng)力學(xué)體積可歸因于該制劑中增加的破碎顆粒數(shù)目。至于其他顆粒，“更純”的YGP具有比YGMP更高的流體動(dòng)力學(xué)體積。一般地，將有效負(fù)載體積限制在＜66％的流體動(dòng)力學(xué)體積以確保通過(guò)酵母細(xì)胞壁顆粒的有效負(fù)載的定量吸收。按照該規(guī)則，每mgYGP顆粒可裝載≤5.5μl的有效負(fù)載，每mgYGMP顆?？裳b載≤4.4μl有效負(fù)載。實(shí)施例3YGP和YGMP的口服生物利用度制備熒光標(biāo)記的酵母葡聚糖微粒(YGP-F)和熒光標(biāo)記的酵母葡聚糖-甘露聚糖微粒(YGMP-F)以進(jìn)行吸收研究。起始材料是5mlYGP(5mg/ml于0.1M硼酸鹽緩沖液中，pH8)、5mlYGMP(5mg/ml于0.1M硼酸鹽緩沖液中，pH8)、新配制的20mg/ml的DMSO中的二氯三嗪基氨基熒光素(DTAF)和0.1M硼酸鹽緩沖液，pH8。以25mg的規(guī)模進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。將25mg微粒等分懸浮于5ml0.1M硼酸鹽緩沖液，pH8中并進(jìn)行超聲處理以將微粒團(tuán)塊分散成單個(gè)微粒。離心所述微粒并重懸浮于5ml0.1M硼酸鹽緩沖液，pH8中。向重懸浮的微粒中加入DTAF(0.5ml20mg/ml)并在37℃下溫育2天。在溫育結(jié)束時(shí)，加入5ml1MTris緩沖液，pH8.3并將混合物溫育30分鐘以淬滅DTAF。離心溫育的微粒并在PBS中進(jìn)行洗滌直至上清液不再具有熒光。將洗滌的微粒以5mg/ml重懸浮于PBS中。計(jì)數(shù)以1∶100稀釋的等分中的微粒數(shù)目。結(jié)果，在每mlYGP-F1.8×109個(gè)微粒的濃度和每mlYGMP-F2.1×109個(gè)微粒的濃度上產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光的酵母細(xì)胞壁顆粒。研究表面糖組分對(duì)酵母葡聚糖微粒的口服利用度的影響以確定是否可通過(guò)甘露糖受體和通過(guò)CR3/dectin-1β-葡聚糖受體靶向有效負(fù)載的吞噬性微粒吸收。靶向兩種受體中的任一受體或同時(shí)靶向兩種受體的能力可擴(kuò)大至巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞以外的靶細(xì)胞群體。在下面的表4中概述了處理組。初始材料包括FITC-標(biāo)記的酵母葡聚糖微粒(YGP-F)、FITC-標(biāo)記的酵母葡聚糖-甘露聚糖微粒(YGMP-F)、7只C57黑色小鼠的組和7只C57/B16小鼠的組。制備YGP-F(1mg/ml)和YGMP-F(3.7mg/ml)的劑量以遞送0.1mlPBS中的等量微粒，每天通過(guò)口服強(qiáng)飼法給來(lái)自各組的一只小鼠進(jìn)行施用，進(jìn)行5天。通過(guò)每天給來(lái)自各組的一只小鼠皮下注射0.1ml來(lái)施用相同的劑量，進(jìn)行5天。在第4天更換籠子并提供新的草墊。在第5天將各組的糞粒收集入15ml圓錐形管中并冷凍以便以后進(jìn)行處理。通過(guò)加入5m水和保持在4℃下進(jìn)行2小時(shí)來(lái)處理糞粒。使用Polytron勻漿器均質(zhì)化含水糞粒。將均質(zhì)化的糞便的稀釋物置于96孔微量板中并在熒光和透射白光條件下就熒光微粒的存在對(duì)其進(jìn)行顯微鏡檢查。進(jìn)一步稀釋具有熒光微粒的等分并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算每毫升中熒光粒的數(shù)目。在第7天殺死小鼠，從各動(dòng)物中取出脾臟并放入置于冰上的分開(kāi)的裝有PBS的管中。用剪力剪碎脾臟并擠壓通過(guò)70微米的篩子以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮物。獲取單細(xì)胞懸浮物的等分并將其固定在1％的PBS中的福爾馬林中以使用FACS定量熒光微粒標(biāo)記的細(xì)胞的級(jí)分。使用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記(優(yōu)選地鼠類Emr-1(F4/80))的抗巨噬細(xì)胞標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞懸浮物進(jìn)行染色，所述抗體染脾紅髓巨噬細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和朗氏細(xì)胞。以每60mm的培養(yǎng)皿107個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞懸浮液涂板在含有10％胎牛血清(JRHScientific)、青霉素-鏈霉素和谷氨酰胺(Gibco)的DMEM中并在5％CO2下在37℃下溫育24小時(shí)以使之附著。溫育后，洗去任何未附著的淋巴細(xì)胞。用胰蛋白酶酶解附著的脾巨噬細(xì)胞，固定所述細(xì)胞并使用熒光顯微鏡對(duì)具有熒光微粒的粘附細(xì)胞的級(jí)分評(píng)分。所述熒光微粒的施用能被良好地耐受。粘附的脾巨噬細(xì)胞的分析證明在所有熒光微粒處理的動(dòng)物中存在熒光酵母細(xì)胞壁顆粒。這些結(jié)果證明YGP-F和YGMP-F都具有口服生物利用度且可通過(guò)巨噬細(xì)胞全身性地分配。糞便的分析證明存在熒光微粒，表明口服吸收在所用的劑量水平上是不完全的。C57/B16小鼠能夠吸收口服施用的YGP-F和YGMP-F。糞便中熒光微粒的數(shù)目定量為吸收效率的估值。實(shí)施例4裝載殼聚糖的YGP微粒的制備制備具有陽(yáng)離子捕獲聚合物殼聚糖的YGP微粒。使用高分子量(HMW)的殼聚糖(～70,000Mw，SigmaChemicalSt.Louis，Mo)或低分子量(HMW)的殼聚糖(～10,000Mw，SigmaChemicalSt.Louis，Mo)在0.1M醋酸中制備1％w/v的殼聚糖溶液。在0.1M醋酸中制備1％w/vHMW和LMM殼聚糖溶液。向50ml尖底離心管中的2gYGP中加入4mlHMW或LMW殼聚糖溶液，混合直至光滑的糊劑形成。在室溫下溫育混合物1小時(shí)以使液體被吸收。向各管中加入NaOH(40ml，0.1M)，將所述管立即渦旋以沉淀YGP中的殼聚糖。將YGP:殼聚糖懸浮液通過(guò)18號(hào)規(guī)格注射針(18guageneedle)以產(chǎn)生YGP:殼聚糖微粒的精細(xì)懸浮物。通過(guò)離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集YGP:殼聚糖微粒，然后用去離子水洗滌沉淀直至上清液的pH為7-8。然后用兩倍于沉淀體積的異丙醇洗滌YGP:殼聚糖微粒4次，之后用兩倍于沉淀體積的丙酮洗滌2次。然后在通風(fēng)廚中在室溫下干燥YGP:殼聚糖微粒。該方法產(chǎn)生1.2gYGP:LMW殼聚糖微粒和1.4gYGP:HMW殼聚糖微粒。實(shí)施例5裝載CytoPureTM的YGP微粒的制備制備具有可生物降解的陽(yáng)離子捕獲聚合物CytoPureTM(其為商購(gòu)可獲得的專賣藥品，是種水溶性的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染劑(Qbiogene，Inc.，CA))的YGP微粒。在0.5ml去離子水中稀釋20μlCytoPureTM，然后加入至50ml尖底離心管中的0.5gYGP中，混合直至形成勻滑的糊劑。將所述混合物在4℃溫育15分鐘以使液體被吸收。向各管中加入25ml乙醇，將所述管立即渦旋以沉淀YGP內(nèi)的CytoPureTM。超聲處理YGP:CytoPureTM懸浮液以產(chǎn)生精細(xì)的YGP:CytoPureTM微粒懸浮液。通過(guò)離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集YGP:CytoPureTM微粒，然后用兩倍于沉淀體積的異丙醇洗滌沉淀4次，之后用兩倍于沉淀體積的丙酮洗滌2次。然后在通風(fēng)廚中在室溫下干燥YGP:CytoPureTM微粒。該方法產(chǎn)生0.45gYGP:CytoPureTM微粒。實(shí)施例6裝載聚乙烯亞胺的YGP微粒的制備用聚乙烯亞胺(PEI)作為陽(yáng)離子捕獲聚合物制備YGP微粒。將0.5ml的2％w/vPEI(～50,000Mw，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)水溶液的等分加至50ml尖底離心管中的0.5gYGP中，混合直至形成勻滑的糊劑。將所述混合物在室溫下溫育1小時(shí)以使液體被吸收。向各管中加入25ml乙醇，將所述管立即渦旋以沉淀YGP內(nèi)的PEI。將YGP:PEI懸浮液通過(guò)18號(hào)規(guī)格注射針以產(chǎn)生YGP:PEI微粒的精細(xì)懸浮液。通過(guò)離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集YGP:PEI微粒，然后用兩倍于沉淀體積的異丙醇洗滌沉淀4次，之后用兩倍于沉淀體積的丙酮洗滌2次。然后在通風(fēng)廚中在室溫下干燥YGP:PEI微粒。該方法產(chǎn)生0.48gYGP:PEI微粒。實(shí)施例7裝載藻酸鹽的YGP微粒的制備用藻酸鹽(F200或F200L，Multi-KemCorp.，Ridgefield，NJ)作為陰離子捕獲聚合物制備YGP微粒。向50ml尖底離心管中的1gYGP加入2ml的1％w/v的藻酸鹽水溶液，混合以形成勻滑的糊劑。在室溫下溫育所述混合物1小時(shí)以使液體被吸收。用40ml1％w/v的氯化鈣水溶液稀釋所述混合物。將YGP:藻酸鹽懸浮液通過(guò)18號(hào)規(guī)格注射針以產(chǎn)生精細(xì)的YGP:藻酸鹽微粒的懸浮液。通過(guò)離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集YGP:藻酸鹽微粒，然后用兩倍于沉淀體積的異丙醇洗滌YGP:藻酸鹽微粒4次，之后用兩倍于沉淀體積的丙酮洗滌2次。然后在通風(fēng)廚中在室溫下干燥YGP:藻酸鹽微粒。該方法產(chǎn)生0.95gYGP:F200藻酸鹽微粒和0.86gYGP:F200L藻酸鹽微粒。實(shí)施例8裝載聚L賴氨酸的YGP和YGMP微粒的制備用聚L賴氨酸(PLL)作為捕獲聚合物制備YGP和YGMP微粒。向50ml尖底離心管中的1gYGP或YGMP中加入4ml1％w/vPLL(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)水溶液。將混合物在55℃下溫育30分鐘以使液體被吸收。向各管中加10ml乙醇，勻漿(Polytron勻漿機(jī))所述管以產(chǎn)生YGP:PLL或YGMP:PLL的精細(xì)微粒懸浮物。通過(guò)離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集YGP:PLL或YGMP:PLL微粒，然后用兩倍于沉淀體積的異丙醇洗滌YGP:PLL或YGMP:PLL4次，之后用兩倍于沉淀體積的丙酮洗滌2次。然后在通風(fēng)廚中在室溫下干燥YGP:PLL或YGMP:PLL。該方法產(chǎn)生1.3gYGP:PLL微粒和1.1gYGMP:PLL微粒。顯微鏡評(píng)估顯示沒(méi)有游離的PLL凝聚體，只有YGP:PLL或YGMP:PLL微粒。實(shí)施例9裝載黃單胞菌多糖的YGP和YGMP的微粒的制備用黃單胞菌多糖作為陰離子捕獲聚合物制備YGP和YGMP微粒。將4ml1％w/v黃單胞菌多糖水溶液加熱至55℃以減少粘性，將其加入至50ml尖底離心管中的1gYGP或YGMP中。在55℃下溫育該混合物30分鐘。向各管中加入10ml乙醇，勻漿(Polytron勻漿機(jī))所述管以產(chǎn)生YGP:黃單胞菌多糖或YGMP:黃單胞菌多糖的精細(xì)微粒懸浮物。離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)收集YGP:黃單胞菌多糖或YGMP:黃單胞菌多糖微粒，然后用兩倍于沉淀體積的異丙醇洗滌YGP:黃單胞菌多糖或YGMP:黃單胞菌多糖微粒4次，之后用兩倍于沉淀體積的丙酮洗滌2次。然后在通風(fēng)廚中在室溫下干燥YGP:黃單胞菌多糖或YGMP:黃單胞菌多糖。該方法產(chǎn)生1.2gYGP:黃單胞菌多糖微粒和1.1gYGMP:黃單胞菌多糖微粒。顯微鏡評(píng)估顯示沒(méi)有游離的黃單胞菌多糖凝聚體，只有YGP:黃單胞菌多糖或YGMP:黃單胞菌多糖微粒。實(shí)施例10YGP:殼聚糖和YGP:藻酸鹽結(jié)合帶電荷的染料的能力的評(píng)估如上述的實(shí)施例7和9中所描述的，制備YGP:殼聚糖和YGP:藻酸鹽微粒。制備0.1％w/v臺(tái)盼藍(lán)水溶液(Benzamineblue；CI23850)(陰離子染料)和二甲苯腈藍(lán)(酸性藍(lán)，陽(yáng)離子染劑)。向微量離心管中的10mgYGP、YGP:殼聚糖或YGP:藻酸鹽中加入50μl0.1％w/v的染料水溶液，然后將所述混合物在室溫下溫育1小時(shí)。用去離子水洗滌沉淀直至上清液不再有色。估量沉淀的顏色；結(jié)果示于下面的表5。YGP內(nèi)的不溶性捕獲聚合物之間的靜電相互作用能夠結(jié)合帶相反電荷的低分子量模型染料有效負(fù)載。實(shí)施例11YGP:瓊脂糖通過(guò)物理俘獲來(lái)捕獲分子的用途制備YGP:瓊脂糖以評(píng)估作為將有效負(fù)載捕獲在YGP中的方法的物理俘獲。在TE中制備2％w/v的瓊脂糖溶液(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)，冷卻至50℃。將1mg/ml的TE中的鮭精DNA母液在50℃下稀釋成0.5mg/mlTE或1％瓊脂糖中的DNA。將500mgYGP的等分和500μlTE中的DNA或500μl瓊脂糖中的DNA在50℃下混合，將所述混合物在50℃下溫育1小時(shí)。然后在冰箱中冷卻該混合物1小時(shí)以固化瓊脂糖。1小時(shí)后，加入10mlTE，然后將混合物在冰箱中溫育過(guò)夜。離心該混合物，通過(guò)在260nm處的吸光率測(cè)量上清液中的DNA。和YGP:TE對(duì)照產(chǎn)生的＜1％的保留相比，YGP:瓊脂糖保留了大約＞80％的所用的DNA。這些結(jié)果表明瓊脂糖通過(guò)物理俘獲有效地將DNA捕獲在YGP內(nèi)。實(shí)施例12YGP:聚丙烯酰胺通過(guò)物理俘獲來(lái)捕獲分子的用途制備YGP:聚丙烯酰胺以評(píng)估作為將有效負(fù)載捕獲在YGP中的方法的物理俘獲。將1mg/ml的TE中的鮭精DNA的母液稀釋成0.5mg/ml的TE或30％聚丙烯酰胺/二(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)中的DNA。向各DNA混合物中加入TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙烯二胺)(1μlTEMED加至5mlDNA溶液中)，向1gYGP中加入2ml各溶液的等分?；旌纤卯a(chǎn)物以形成均勻的懸浮液并在室溫下溫育3小時(shí)。在3小時(shí)的溫育后，加入10mlTE并將所述混合物在冰箱中溫育過(guò)夜。然后離心混合物，通過(guò)在260nm處的吸光率測(cè)量上清液中的DNA。相對(duì)于YGP:TE對(duì)照產(chǎn)生的＜1％的保留，YGP:聚丙烯酰胺保留了大約＞95％的所用的DNA。這些結(jié)果表明聚丙烯酰胺是用于通過(guò)物理俘獲將DNA捕獲在YGP中的有效捕獲聚合物。實(shí)施例13用小分子四環(huán)素裝載YGP使用相對(duì)不溶的四環(huán)素鈣鹽將抗生素四環(huán)素(tet)裝載入YGP。所用的酵母細(xì)胞壁顆粒是如上所述制備的YGP、YGP:F200藻酸鹽和YGP:F200L藻酸鹽。母液是1MCaCl2和100mg/mlHCl四環(huán)素(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。表6中概述所建立的裝載混合物。在室溫下溫育所述混合物30分鐘，然后如所示，加入去離子水或1MCaCl2。在室溫下進(jìn)行60分鐘后，超聲處理混合物并在室溫下再溫育至少30分鐘。然后離心(在2,000rpm下進(jìn)行10分鐘)混合物并通過(guò)沉淀的黃色和初始上清液的黃色指示四環(huán)素的存在。根據(jù)355nm四環(huán)素吸收光譜的峰處的吸光率的損失來(lái)計(jì)算裝載入酵母細(xì)胞壁顆粒中的四環(huán)素量。和去離子水空白對(duì)照相比，稀釋在200μl去離子水中的4μl100mg/ml的HCL四環(huán)素在355nm具有0.538的吸光率。也通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量從負(fù)載的酵母細(xì)胞壁顆粒釋放入PBS或0.1MHCl的四環(huán)素。所述結(jié)果概述于上面的表6中。一般地，當(dāng)洗滌后，YGP:F200藻酸鹽和YGP:F200L藻酸鹽沉淀呈黃色時(shí)，YGP沉淀不為黃色，表明在捕獲聚合物不存在的情況下少量(即便有)四環(huán)素以氫氯化物或鈣鹽的形式裝載。相反地，四環(huán)素被有效地載入和被捕獲入YGP:F200藻酸鹽和YGP:F200L藻酸鹽制劑中，大約25-30％的使用的四環(huán)素負(fù)載以藻酸鈣鹽的形式被吸收。將捕獲的四環(huán)素從YGP:F200藻酸鹽和YGP:F200L藻酸鹽釋放入0.1MHCl中。在37℃下在PBS中進(jìn)行1小時(shí)，捕獲的四環(huán)素部分地保留在YGP:F200藻酸鹽和YGP:F200L藻酸鹽中，大約為0.1MHCl可提取的26.5-51.6％?？傊沫h(huán)素可容易地以藻酸鈣鹽復(fù)合物的形式被捕獲在YGP-藻酸鹽-鈣組合物中，但不能有效地載入或保留在單獨(dú)的YGP內(nèi)。以藻酸鈣復(fù)合物形式被捕獲在YGP:F200藻酸鹽或YGP:F200L藻酸鹽中的四環(huán)素在37℃下緩慢地釋放在PBS中且在酸性條件下基本上完全釋放。實(shí)施例14Tet和YGP:Tet增加J774巨噬細(xì)胞體外殺死微生物中的功效如上述實(shí)施例13中所描述的，制備YGP:藻酸鹽-tet。每ml母液中的YGP和YGP:藻酸鹽-tet的微粒的數(shù)目分別是9×107/ml和6×108/ml。如上面表7中所概述的，將1ml鼠類巨噬細(xì)胞J774(5×105/ml)和各種濃度的YGP、YGP:藻酸鹽-tet或四環(huán)素一起溫育。將所述J774細(xì)胞在培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清而無(wú)抗生素或谷氨酰胺的DMEM)中培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物和單獨(dú)的培養(yǎng)基、在培養(yǎng)基中稀釋的四環(huán)素或在培養(yǎng)基中稀釋的微粒在37℃下旋轉(zhuǎn)溫育1小時(shí)以允許所述微粒的吞噬。在96孔板中建立微生物殺死測(cè)定法。將培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中稀釋并溫育過(guò)夜以使tet代謝和從吞噬的YGP:藻酸鹽-tet微粒中釋放出來(lái)。如表6中所示，加入細(xì)菌攻擊，且將所述培養(yǎng)物在CO2培養(yǎng)箱中在37℃下溫育2小時(shí)以允許金黃色葡萄球菌(S.aureus)的吞噬和通過(guò)J774鼠類巨噬細(xì)胞將其殺死。在該溫育后，向各培養(yǎng)物中加入200μlLB液體培養(yǎng)基(Luria-BertaniBroth1.0％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl)以裂解巨噬細(xì)胞。在培養(yǎng)箱中在37℃下溫育培養(yǎng)物以允許存活的金黃色葡萄球菌過(guò)度生長(zhǎng)。根據(jù)pH的改變(由苯酚紅指示)監(jiān)控生長(zhǎng)。比較YGP、YGP:藻酸鹽-tet或四環(huán)素。在表7的最右兩欄提供了結(jié)果。大約7.5×106個(gè)YGP:藻酸鹽-tet微粒對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的作用和大約2.5μg/ml四環(huán)素HCl的作用大致相等。單獨(dú)的巨噬細(xì)胞比任一模式中用四環(huán)素處理的巨噬細(xì)胞效率相對(duì)較低，且和用單獨(dú)的空白YGP處理的巨噬細(xì)胞的功效大致相同。巨噬細(xì)胞和溶液中的游離的四環(huán)素組合的效率不比單獨(dú)的四環(huán)素高多少。用YGP:藻酸鹽-tet微粒處理的巨噬細(xì)胞顯示顯著的協(xié)同作用。一般地，所述結(jié)果證明四環(huán)素至J774巨噬細(xì)胞的吞噬體遞送增強(qiáng)了J774巨噬細(xì)胞殺死金黃色葡萄球菌的能力。實(shí)施例15蛋白至YGP內(nèi)的裝載使用胎牛血清的混合蛋白評(píng)估本發(fā)明的給藥系統(tǒng)保留、轉(zhuǎn)運(yùn)和遞送治療性肽或蛋白、疫苗抗原或其他肽或蛋白的效用。所用的酵母細(xì)胞壁顆粒是如上所述制備的YGP、YGP-PEI和YGP-殼聚糖。母液是45ng/μl的TE中的胎牛血清(FCS)(FetalBoyineSerum，JRHBiosciences，Lenexa，KS)、0.2％PEI(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)、0.05M磷酸緩沖液，pH7.2(P緩沖液)和0.05M磷酸緩沖液，pH7.2、1MNaCl(P+鹽緩沖液)。如表8中所示，向微量離心管中的1mgYGP、YGP-P或YGP-CN中加入4μlFCS，且將所得的混合物在室溫下溫育60分鐘以使液體被微粒吸收。溫育后，如表中所示加入200μl磷酸緩沖液或200μlPEI并將所得的混合物在室溫下溫育60分鐘。溫育后，加入0.5ml磷酸緩沖液，再進(jìn)行5分鐘溫育后，超聲處理管以產(chǎn)生單個(gè)的微粒。通過(guò)在10,000rpm下離心10分鐘沉淀所述微粒并將上清液轉(zhuǎn)移至新管。將0.5ml0.05M的磷酸鈉緩沖液，pH7.2+1MNaCl加入至沉淀，在進(jìn)行另外的5分鐘溫育后，在10,000rpm下將管離心10分鐘，然后將高鹽洗脫上清液轉(zhuǎn)移至新管。通過(guò)280nm處的吸光率測(cè)量上清液的蛋白含量。蛋白裝載結(jié)果顯示于表9中。無(wú)捕獲分子的YGP微粒只捕獲5％的提供的蛋白。首先裝載FCS蛋白，然后暴露于PEI的YGP微粒保留了47％的蛋白負(fù)載。在暴露于所述蛋白負(fù)載之前用捕獲聚合物例如PEI或殼聚糖預(yù)載的YGP微粒由此分別保留了68％和60％的所述蛋白負(fù)載。結(jié)果證明血清蛋白不能被有效地裝載和捕獲入無(wú)捕獲聚合物的YGP中。使用在暴露于有效負(fù)載蛋白之前預(yù)先裝載捕獲聚合物的YGP導(dǎo)致增加的蛋白捕獲?？蛇x擇地，通過(guò)首先裝載蛋白，然后加入可溶性捕獲聚合物以將所述蛋白螯合在微粒內(nèi)來(lái)將蛋白捕獲在YGP內(nèi)。實(shí)施例16將DNA裝載入YGP內(nèi)的各種方法的比較評(píng)估將鮭精DNA裝載入YGP、包含低分子量(LMW)殼聚糖的YGP或包含高分子(HMW)殼聚糖的YGP的幾種方法。a.毛細(xì)管裝載，然后乙醇沉淀通過(guò)40次通過(guò)18號(hào)規(guī)格注射針來(lái)剪切鮭精DNA(Sigma，St.Louis，MO)并將其在50mMTE(Tris-HCl，pH8，2mMEDTA)中稀釋至0.1mg/ml的濃度。確定DNA溶液的裝載體積并將其和100mg實(shí)施例2中的YGP、YGP:LMW殼聚糖或YGP:HMW殼聚糖在離心管中混合(重復(fù)兩份實(shí)驗(yàn))并溫育1小時(shí)。通過(guò)向各管中加入1.5ml乙醇對(duì)所述溫育的混合物進(jìn)行乙醇沉淀。在2,000rpm下離心10分鐘收集不溶性產(chǎn)物。向各管中加入10mlTE，在37℃下溫育1小時(shí)，在2,000rpm下離心10分鐘以沉淀不溶性YGP，且通過(guò)260nm處的吸光率確定上清液中的DNA含量。計(jì)算保留在YGP中的DNA的量。b.通過(guò)吸收裝載DNA將裝載體積的DNA溶液在離心管中和100mg實(shí)施例4a中的YGP、YGP:LMW殼聚糖或YGP:HMW殼聚糖的等分混合(重復(fù)兩份實(shí)驗(yàn))并溫育1小時(shí)。向各管加入10mlTE，在37℃下溫育1小時(shí)，在2,000rpm下離心10分鐘以沉淀不溶性YGP。通過(guò)260nm處的吸光率確定上清液中的DNA含量。計(jì)算保留在YGP中的DNA的量。c.通過(guò)CTAB捕獲裝載DNA將裝載體積的DNA溶液在離心管中和100mg實(shí)施例4中的YGP、YGP:LMW殼聚糖或YGP:HMW殼聚糖混合并溫育1小時(shí)。通過(guò)向各管中加入1.5ml2％的十六烷基三甲基銨溴化物(也稱作溴化十六烷基三甲銨或CTAB)溶液來(lái)沉淀溫育的混合物。向各管中加入10mlTE，將所述管在37℃下溫育1小時(shí)，在2,000rpm下離心10分鐘以沉淀不溶性YGP。通過(guò)260nm處的吸光率確定上清液中的DNA含量。計(jì)算保留在YGP中的DNA的量。所述結(jié)果示于下面的表10中。簡(jiǎn)單的DNA裝載或沉淀不能有效地將DNA裝載和捕獲入YGP。相反地，使用陽(yáng)離子捕獲聚合物殼聚糖導(dǎo)致可將DNA捕獲入YGP的殼聚糖-DNA復(fù)合物的形成。此外，陽(yáng)離子試劑CTAB可有效地用于將裝載的DNA捕獲入YGP中。實(shí)施例17DNA的裝載和捕獲通過(guò)將1ml的0.1M碳酸鹽緩沖液pH9.2中的1mg/ml鮭精DNA溶液和100μl1mg/ml的10mM碳酸緩沖液pH9.2中的DTAF的懸浮液混合來(lái)制備熒光鮭精DNA。在37℃下溫育過(guò)夜后，加入200μl1MTris-HClpH8.3并在室溫下溫育15分鐘。然后，加入100μl1MNaCl和3ml乙醇以乙醇沉淀所述DNA。在-20℃下貯存過(guò)夜后，在10,000rpm下離心15分鐘收集所述乙醇沉淀。用70％的乙醇洗滌乙醇沉淀直至上清液清澈，然后將其重懸浮于1mlTE中。在室溫下溫育YGP懸浮液30分鐘。溫育后，向一組三個(gè)管中(YGP、YGP-P、YGP-殼聚糖)加入0.45ml95％乙醇，向二組三個(gè)管中加入0.2ml2％PEI和向另一組三個(gè)管中加入0.2ml2％CTAB。在室溫下溫育30分鐘后，向一組PEI管中加入0.2ml2％CTAB并再進(jìn)行30分鐘的溫育。加入乙醇(1ml，95％)并將所述YGP在-20℃下貯存過(guò)夜。用70％的乙醇洗滌YGP懸浮液并重懸浮于0.5mlPBS中。通過(guò)熒光顯微鏡評(píng)價(jià)結(jié)果，所述結(jié)果顯示于表11中。如果只使用簡(jiǎn)單的乙醇沉淀而不用捕獲聚合物，則無(wú)顯著的熒光標(biāo)記的DNA捕獲發(fā)生，表明現(xiàn)有技術(shù)作為DNA遞送系統(tǒng)是無(wú)效的。熒光標(biāo)記的DNA顯然被陽(yáng)離子捕獲聚合物PEI或殼聚糖或YGP微粒內(nèi)的陽(yáng)離子去垢劑CTAP捕獲。當(dāng)使用捕獲聚合物和CTAB的組合，例如YGP:PEI:DNA:CTAB、YGP:殼聚糖:DNA:CTAB或YGP:DNA:PEI:CTAB時(shí)發(fā)生最佳的DNA捕獲。實(shí)施例18熒光標(biāo)記的質(zhì)粒DNA的裝載和捕獲制備包含pIRES質(zhì)粒的YGP以在J774細(xì)胞(鼠類巨噬細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系)中進(jìn)行編碼的EGFP的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。所用的陽(yáng)離子捕獲試劑包括陽(yáng)離子聚合物例如聚乙烯亞胺(PEI)、CytoPureTM(商購(gòu)可獲得的專賣的水溶性陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑)(Qbiogene，Inc.，CA)、殼聚糖和陽(yáng)離子去垢劑十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)。優(yōu)選的PEI是JetPEI，即商購(gòu)可獲得的線性聚乙烯亞胺陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染劑(Qbiogene，Inc.，CA)。pIRES-EGFP(Clonetech，CA)在MCS和EGFP(增強(qiáng)的綠色熒光蛋白)編碼區(qū)之間包含腦炎心肌炎病毒(ECMV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。這允許目的基因(克隆入MCS的)和EGFP基因都可從單個(gè)雙順?lè)醋觤RNA翻譯。pIRES-EGFP用于有效地選擇(通過(guò)流式細(xì)胞儀或其他方法)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)EGFP和另一種目的蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為最優(yōu)化表達(dá)高水平的目的蛋白的細(xì)胞的選擇，pIRES-EGFP使用部分缺陷的IRES序列(1)。該弱化的IRES導(dǎo)致，相對(duì)于所述克隆的基因的翻譯起始率，減少了在EGFP起始密碼子上的翻譯起始率。這使得能夠選擇其中mRNA，從而靶蛋白以高水平產(chǎn)生，從而補(bǔ)償EGFP的亞最優(yōu)翻譯率的細(xì)胞。該載體也可用于單獨(dú)地表達(dá)EGFP或獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系而不用費(fèi)時(shí)的藥物和克隆選擇。EGFP是已經(jīng)最優(yōu)化的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生更明亮的熒光和更高表達(dá)的野生型GFP的紅移變體。(最大激發(fā)＝488nm；最大發(fā)射＝509nm)EGFP編碼GFPmut1變體，該變體包含Phe-64至Leu和Ser-65至Thr的氨基酸置換。這些突變?cè)黾恿薌FP的亮度和溶解性，主要?dú)w因于提高的蛋白折疊性質(zhì)和生色團(tuán)形成的效率。EGFP也包含幾乎完全由優(yōu)選的人密碼子組成的開(kāi)放閱讀框架。相對(duì)于野生型GFP，這導(dǎo)致在真核細(xì)胞中更有效的翻譯，從而導(dǎo)致更高的表達(dá)水平。制備的溶液是0.72μg/μlpIRESEGFP質(zhì)粒DNA水溶液、0.2％w/v的TE中的PEI(Sigma)、2μlCytoPure(Qbiogene)+48μl0.15MNaCl、2μlJetPEI(Qbiogene)+48μlTE、0.2％TE中的精脒、2％(含水)CTAB和磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。通過(guò)將1ml的0.1M碳酸鹽緩沖液pH9.2中的1mg/mlpIRESDNA溶液和100μl10mM碳酸鹽緩沖液pH9.2中的1mg/mlDTAF懸浮液混合來(lái)制備熒光pIRES質(zhì)粒DNA。在37℃下溫育過(guò)夜后，加入200μl1MTris-HClpH8.3并在室溫下溫育15分鐘。然后加入100μl1MNaCl和3ml乙醇以進(jìn)行乙醇沉淀DNA。在-20℃下貯存過(guò)夜后，在10,000rpm下離心15分鐘收集乙醇沉淀。用70％乙醇洗滌乙醇沉淀直至上清液清澈，然后將其重懸浮于1mlTE中。在室溫下溫育YGP懸浮液30分鐘。溫育后，向一組三只管(YGP、YGP-P、YGP-殼聚糖)中加入0.45ml95％的乙醇，向兩組三只管中加入0.2ml2％PEI和向另一組三只管中加入0.2ml2％CTAB。在室溫下溫育30分鐘后，向一組PEI管中加入0.2ml2％CTAB并再進(jìn)行溫育30分鐘。加入乙醇(1ml，95％)，將YGP在-20℃下貯存過(guò)夜。用70％的乙醇洗滌所述YGP懸浮液并重懸浮于0.5mlPBS中。如實(shí)施例14中所述，以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將J774鼠類巨噬細(xì)胞涂板在6孔板中并溫育過(guò)夜。如表12中所概述的進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以每細(xì)胞10個(gè)微粒的比例向培養(yǎng)物中加入微粒，然后渦旋所述板以分配微粒。將所述細(xì)胞溫育4小時(shí)。在溫育期結(jié)束時(shí)，移走培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞并將其固定在0.4％的PBS中的福爾馬林中。通過(guò)熒光顯微鏡評(píng)估包含熒光DNA的微粒和用包含熒光DNA的微粒溫育的J774細(xì)胞，且結(jié)果概述于表13和顯示于圖3A和3B。圖3A是暴露于YGP微粒的細(xì)胞(標(biāo)示的細(xì)胞310)的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述YGP微粒載有熒光標(biāo)記的pIRES質(zhì)粒和作為陽(yáng)離子捕獲聚合物的PEI和作為陽(yáng)離子去垢劑的CTAB，圖3B是顯示明亮染色的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述明亮染色代表由圖3B中標(biāo)示的相同細(xì)胞310內(nèi)化的包含熒光質(zhì)粒DNA的熒光YGP微粒。實(shí)施例19和YGP:pIRES一起溫育的J774鼠類巨噬細(xì)胞進(jìn)行的EGFP的表達(dá)在該實(shí)施方案中，未對(duì)pIRES質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，相反地由pIRES編碼的綠色熒光蛋白(GFP)的功能性表達(dá)用作裝載的酵母細(xì)胞壁顆粒的吸收、pIRESDNA的細(xì)胞內(nèi)釋放的證據(jù)，熒光的產(chǎn)生表明GFP表達(dá)。如下面的表14中所概述的制備YGP:pIRES制劑。從1mg/ml母液的去離子水中的稀釋物中制備DNA。向YGP中加入所示量的DNA溶液并溫育至少30分鐘以使液體被吸收。加入標(biāo)示的量的0.2％的TE中的PEI或0.2％的醋酸緩沖液中的殼聚糖，在超聲產(chǎn)生單個(gè)微粒之前讓所述混合物溫育5分鐘。在進(jìn)一步溫育至少30分鐘后，加入標(biāo)示量的2％CTAB。再溫育5分鐘后，通過(guò)渦旋混合管并再溫育至少30分鐘。加入標(biāo)示量的95％的乙醇。然后混合各管并在-20℃下貯存過(guò)夜。然后離心YGP:pIRES配制的微粒，在70％的乙醇中洗滌2次，在10,000rpm下離心5分鐘進(jìn)行收集，重懸浮于0.5ml無(wú)菌PBS，超聲處理以產(chǎn)生單個(gè)微粒。計(jì)算每ml微粒的數(shù)目并將各制劑在-20℃下貯存。如實(shí)施例14中所描述的，以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將J774鼠類巨噬細(xì)胞涂板在6孔板中并溫育過(guò)夜。如上面的表13中所概述的進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以每細(xì)胞10個(gè)微粒的比率向培養(yǎng)基中加入微粒，旋轉(zhuǎn)所述板以分配微粒。每天喂食細(xì)胞并溫育2天。在溫育期結(jié)束時(shí)，移走培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞并在0.4％的PBS中的福爾馬林中進(jìn)行固定。所述結(jié)果概述于表4中和顯示于圖4A-C中。使用熒光顯微鏡檢查細(xì)胞。89％的J774細(xì)胞吸收YGP-F微粒(表13，孔1B，圖4A)。在小孔1E(FIG.4B)和1F(FIG.4C)中EGFP表達(dá)在＞80％的J774細(xì)胞中是很明顯的，如吞噬泡(vacuole)中的點(diǎn)狀熒光所顯示的。圖4A是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞410的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于熒光標(biāo)記的YGP微粒，圖4B是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞420的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞從由具有陽(yáng)性捕獲聚合物聚乙烯亞胺(PEI)和陽(yáng)離子去垢劑十六烷基三甲基銨溴化物(也稱為溴化十六烷基三甲銨或CTAB)遞送的pIRESDNA表達(dá)GFP，圖4C是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞430的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞從由具有陽(yáng)離子捕獲聚合物殼聚糖和陽(yáng)離子去垢劑CTAB的YGP遞送的pIRESDNA表達(dá)GFP。實(shí)施例20使用YGP-陰離子捕獲聚合物技術(shù)將熒光DNA、寡核苷酸和siRNA寡核苷酸遞送至J774細(xì)胞使用下列材料YGP:熒光鮭精DNA:PEI:CTAB微粒、YGP:熒光寡核苷酸:PEI:CTAB微粒和YGP:熒光siRNA:PEI:CTAB。所述熒光寡核苷酸是由SigmaGenosys用熒光素殘基附著至5’末端合成的18聚體5’熒光素-TTGGTCATCCATGGCTCT3’SEQIDNO1。所述熒光素siRNA是用熒光素殘基附著至5’末端合成的21聚體非沉默對(duì)照siRNA(Qiagen，Valencia，CA，CatalogNo.1022079)5’熒光素-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3’SEQIDNO2.如實(shí)施例14中所描述的，以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將J774鼠類巨噬細(xì)胞涂板在6孔板中并溫育過(guò)夜。如表15中所概述的進(jìn)行轉(zhuǎn)染。向培養(yǎng)基中加入對(duì)照和裝載有核酸的微粒并旋轉(zhuǎn)所述板以分配微粒。每天喂食細(xì)胞并溫育24小時(shí)。在溫育期結(jié)束時(shí)，移走培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞并將其固定在0.4％的PBS中的福爾馬林中。在圖5A-I中舉例說(shuō)明結(jié)果。使用熒光顯微鏡和FACS檢查細(xì)胞。92％的J774細(xì)胞吸收YGP-F微粒(表14，孔1B，圖5A)。如點(diǎn)狀內(nèi)體熒光和彌散的細(xì)胞質(zhì)熒光所顯示的，熒光寡核苷酸(SEQIDNO1)的遞送在＞80％的J774細(xì)胞中是明顯的。如點(diǎn)狀內(nèi)體熒光和彌散的細(xì)胞質(zhì)熒光所顯示的，熒光非沉默siRNA(SEQIDNO2)的遞送在＞80％的J774細(xì)胞中是明顯的。圖5A是暴露于熒光標(biāo)記的YGP微粒的細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞510的組合光照和熒光的彩色顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像；圖5B是熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)研究的結(jié)果的圖解說(shuō)明，該圖顯示代表來(lái)自已內(nèi)化熒光標(biāo)記的YGP微粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的主峰520和代表來(lái)自不含熒光標(biāo)記的YGP微粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的次峰530；圖5C是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞540的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含熒光標(biāo)記的DNA、陽(yáng)離子捕獲聚合物PEI和陽(yáng)離子去垢劑CTAB的YGP微粒；圖5D是顯示相同的標(biāo)示細(xì)胞540的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，圖5E是FACS研究的結(jié)果的圖解說(shuō)明，該圖顯示代表來(lái)自已內(nèi)化具有熒光標(biāo)記的DNA有效負(fù)載的YGP微粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的主峰610和代表來(lái)自不含YGP微粒的細(xì)胞的信號(hào)分布的肩峰620；圖5F是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞710的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞和包含熒光標(biāo)記的反義RNA、PEI和CTAB的YGP微粒一起溫育；圖5G顯示相同的標(biāo)示細(xì)胞710的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞包含內(nèi)化的具有熒光反義RNA有效負(fù)載的YGP微粒；圖5H是細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞810的彩色光照顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞和包含熒光標(biāo)記的siRNA、PEI和CTAB的YGP微粒一起溫育，圖5I是顯示相同的標(biāo)示的細(xì)胞810的細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比(負(fù))灰度圖像，所述細(xì)胞包含內(nèi)化的具有熒光RNAi有效負(fù)載的YGP微粒?？傊褂藐?yáng)離子捕獲聚合物將熒光DNA、寡核苷酸或siRNA有效負(fù)載裝載入YGP有效地將所述有效負(fù)載遞送入J774細(xì)胞。在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)室24小時(shí)內(nèi)，有效負(fù)載從內(nèi)體區(qū)室釋放出來(lái)。實(shí)施例21YGP-DNA制劑有效地遞送表達(dá)hGC的質(zhì)粒DNA(pMFG-GC)至鼠類巨噬細(xì)胞系J774。使用上面的實(shí)施例18中所述的方法遞送表達(dá)hGC的質(zhì)粒DNA(pMFG-GC)至鼠類巨噬細(xì)胞系J774中且證明所述基因產(chǎn)物(人葡糖腦苷脂酶)的表達(dá)。如上所述制備所用的組合物并將其列于下面的表16中。此外，如上所述制備包含酵母細(xì)胞壁顆粒(包含pIRES)的制劑。所用的pMFG-GC類型已在以前進(jìn)行了描述(Fabrega，S.，等人，Humanglucocerebrosidaseheterologousexpressionofactivesitemutantsinmurinenullcells.Glycobiology.2000Nov；10(11)1217-24)。該載體包含插入在MFG主鏈的NcoI和BamHI位點(diǎn)之間的人GCcDNA。保留病毒的剪接供體(SD)位點(diǎn)和剪接受體(SA)位點(diǎn)的MFG載體使用莫洛尼鼠白血病病毒5’長(zhǎng)末端重復(fù)(5’LTR)產(chǎn)生負(fù)責(zé)所述插入的序列的表達(dá)的剪接的mRNA。將人GCcDNA克隆入MFG載體，使起始密碼子精確地位于刪除的env基因的起始密碼子位置。當(dāng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞平均展示4倍于對(duì)照巨噬細(xì)胞的酶活性。將培養(yǎng)物中的粘附細(xì)胞培養(yǎng)在塑料多孔板中的DMEM(Gibco)+10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(Gibco)組織培養(yǎng)基中。在適當(dāng)?shù)膮R合度時(shí)，移走培養(yǎng)基，用PBS短暫地洗滌細(xì)胞，然后進(jìn)行固定(用0.5-1％的福爾馬林或多聚甲醛溶液)。在移走固定劑后，用PBS短暫地洗滌細(xì)胞，然后在室溫下在0.1％牛血清白蛋白/0.05％Tween20中溫育1小時(shí)。在移走0.1％牛血清白蛋白/0.05％Tween20溶液后，然后在4℃下用PBS/0.05％Tween20中的針對(duì)人葡糖腦苷脂酶的兔抗血清(1/1000-1/5000的工作稀釋度；Ginns等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.第79卷5607-5610，September1982)溫育細(xì)胞過(guò)夜。在過(guò)夜溫育后，從細(xì)胞中移走抗體溶液，在溫和地?fù)u動(dòng)下，用PBS/0.05％Tween20洗滌所述細(xì)胞5次，進(jìn)行3分鐘。然后將所述細(xì)胞和山羊抗兔FITC綴合的抗血清(MolecularProbesF2765，熒光素山羊抗兔IgG(H+L)，2mg/mL；1/100-1/500的工作稀釋度)在室溫下一起溫育1-2小時(shí)。在溫和地?fù)u動(dòng)下，用PBS/0.05％Tween20再次洗滌細(xì)胞5次，進(jìn)行3分鐘。在移走最后的洗滌溶液后，向各孔中加入PBS并將細(xì)胞板在黑暗處在4℃下貯存直至進(jìn)行熒光顯微鏡分析。所述方案概述于表17。圖6A-6G是顯示包含pMFG-GC表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒的吸收和人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)的J774鼠巨噬細(xì)胞的彩色顯微照片的灰度圖像。將細(xì)胞暴露于YGP制劑或不對(duì)其進(jìn)行處理(對(duì)照)，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)粘附細(xì)胞進(jìn)行福爾馬林固定。使用第一抗人GC抗體(兔抗血清)、合適的可檢測(cè)的第二抗體(山羊抗兔FITC綴合的抗血清)就免疫細(xì)胞化學(xué)處理固定的細(xì)胞，用熒光顯微鏡和照相進(jìn)行檢查。圖6A是來(lái)自未處理的對(duì)照培養(yǎng)物的J774細(xì)胞例如標(biāo)示的細(xì)胞510的彩色透射光顯微照片的灰度圖像。圖6B是顯示缺乏熒光標(biāo)記的細(xì)胞的J774細(xì)胞的相同視野的彩色熒光顯微照片的灰度圖像。圖6C是顯示包含熒光標(biāo)記的微粒的細(xì)胞例如細(xì)胞912的J774細(xì)胞的彩色光照和熒光的組合顯微照片的灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞壁顆粒(YGP-F)的制劑。圖6D和6E分別是J774細(xì)胞的相同視野的彩色透射光顯微照片和彩色熒光顯微照片的灰度圖象，所述細(xì)胞暴露于包含pMFG-GC表達(dá)載體(YGP:pMFG-GC:PEI:CTAB)的酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑，該圖通過(guò)熒光標(biāo)記的細(xì)胞例如細(xì)胞914中的免疫反應(yīng)性顯示人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。圖6F和6G分別是J774細(xì)胞的相同視野的彩色透射光顯微照片和彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述細(xì)胞暴露于包含pMFG-GC表達(dá)載體(YGP-CN:pMFG-GC:CTAB)的酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑，該圖通過(guò)熒光標(biāo)記的細(xì)胞例如細(xì)胞916中的免疫反應(yīng)性顯示人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。這些研究的一般結(jié)果可概述如下。鼠巨噬細(xì)胞系J774的細(xì)胞有效地(＞90％)吞噬YGP-F微粒。所用的人抗葡糖腦苷脂酶抗體選擇性地染重組人蛋白，但不和內(nèi)源小鼠蛋白交叉反應(yīng)。在超過(guò)50％的在體外用YGPpMFG-GCCTP制劑處理的J774細(xì)胞中可通過(guò)免疫反應(yīng)性檢測(cè)到人葡糖腦苷脂酶的表達(dá)。YGP:MFG-GC:PEI:CTAB和YGP-CN:pMFG-GC:CTAB制劑對(duì)遞送質(zhì)粒DNA和在J774細(xì)胞中誘導(dǎo)可檢測(cè)的人葡糖腦苷脂酶的表達(dá)都是有效的。人葡糖腦苷脂酶在內(nèi)體和溶酶體區(qū)室中被正常地加工且可被檢測(cè)。YGP:CTP制劑在遞送pMFG-GC中的人葡糖腦苷脂酶基因和在J774巨噬細(xì)胞中促進(jìn)人葡糖腦苷脂酶的表達(dá)方面是有效的。實(shí)施例22YGP和YGMP熒光微粒在野生型和Gaucher’s小鼠中的口服生物利用度。圖8是在體內(nèi)口服施用180后，通過(guò)巨噬細(xì)胞游走370至各種器官450、452、454、456、458來(lái)遞送酵母β-葡聚糖微粒(YGP)230的方法的優(yōu)選實(shí)施方案的示意圖。給受試者185口服施用包含酵母β-葡聚糖微粒(YGP)230的組合物182。所述酵母β-葡聚糖微粒(YGP)230被小腸襯里中的M細(xì)胞355吸收并被轉(zhuǎn)移穿過(guò)上皮350，然后被腸巨噬細(xì)胞360吞噬。包含YGP的巨噬細(xì)胞游走370至器官和組織，包括骨450、肺452、肝454、大腦456和脾458。口服給藥后大約72小時(shí)，在脾458中觀察到已吞噬YGP的脾巨噬細(xì)胞364(示意性地顯示和以彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比灰度圖像顯示)?？诜o藥后大約90小時(shí)，在骨450中觀察到已吞噬YGP的骨髓巨噬細(xì)胞362(示意性地顯示和以彩色熒光顯微照片的反轉(zhuǎn)對(duì)比灰度圖像顯示)。使用熒光標(biāo)記的酵母細(xì)胞壁顆粒研究細(xì)胞表面糖組分對(duì)酵母葡聚糖微粒的口服生物利用度的作用，如上所述制備YGP-F(FITC-標(biāo)記的酵母葡聚糖微粒)和YGMP-F(FITC-標(biāo)記的酵母葡糖甘露聚糖微粒)。通過(guò)口服強(qiáng)飼法和皮下注射給小鼠(C57B1/6野生型和Gaucher模型小鼠)施用YGP-F和YGMP-F的等分(0.1ml)，進(jìn)行5天。固定來(lái)自各動(dòng)物的大腦、肝臟、骨髓、小腸和脾的切片并通過(guò)熒光顯微鏡檢查以確定熒光酵母細(xì)胞壁顆粒被吸收的程度。將脾臟的等分置于冰上并進(jìn)行加工以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。以每12孔板大約106個(gè)細(xì)胞將脾細(xì)胞涂板并溫育24小時(shí)以使其附著。在洗去未結(jié)合的細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡，根據(jù)內(nèi)化的熒光微粒就粘附細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)對(duì)小孔進(jìn)行評(píng)分。也顯示酵母細(xì)胞壁顆粒對(duì)于體內(nèi)遞送(口服和腸胃外途徑)pMFG-GC構(gòu)建體中的人葡糖腦苷脂酶基因，在脾巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生人葡糖腦苷脂酶的表達(dá)方面是有用的和有效的。如上所述制備制劑，所述制劑將表達(dá)人GC的MFG-GC質(zhì)粒DNA整合至以陽(yáng)離子聚合物-DNA納米復(fù)合物的形式存在的酵母葡聚糖微粒(YGP)和酵母葡聚糖-甘露聚糖微粒(YGMP)中。數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)口服或胃腸外施用時(shí)，這些YGP-DNA和YGMP-DNA微粒通過(guò)受體介導(dǎo)的至組織、粘膜和腸道淋巴組織(GALT)巨噬細(xì)胞內(nèi)的吸收變得具有生物利用度。當(dāng)全身性施用裝載DNA的微粒時(shí)，通過(guò)糖受體對(duì)微粒表面的葡聚糖和甘露聚糖多糖的結(jié)合發(fā)生直接的受體介導(dǎo)的至組織巨噬細(xì)胞的吸收。在被細(xì)胞吞噬后，所述微粒被吞入內(nèi)體，在所述內(nèi)體中陽(yáng)離子聚合物釋放DNA，使內(nèi)體膨脹并將所述DNA釋放入細(xì)胞質(zhì)，在所述細(xì)胞質(zhì)中其遷移至細(xì)胞核。通過(guò)細(xì)胞機(jī)制加工所述釋放的DNA以產(chǎn)生正常的人GC酶。使用兩種高歇病的小鼠模型。通過(guò)每天用100mg/kg的牛菜醇β環(huán)氧化物(CBE，7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚烷-2，3，4，5-四醇)腹膜內(nèi)注射C57/B1小鼠(進(jìn)行3周)來(lái)產(chǎn)生第一Gaucher小鼠。用CBE處理3個(gè)月大小的C57/B1小鼠3周，分別在全身性組織和大腦中產(chǎn)生大約50％和500％的葡糖神經(jīng)酰胺的量的增加。在CBE處理的小鼠中，β-葡糖苷酶的活性急劇降低，但其他水解酶(α-甘露糖苷酶、β-己糖胺酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶和β-葡糖醛酸酶)的水平和對(duì)照小鼠的水平?jīng)]有顯著差別。在3個(gè)月大小的處理的小鼠中沒(méi)有發(fā)生重量或行為上的差異。相反地，每天用100mg/kgCBE腹膜內(nèi)處理(進(jìn)行3周)的1天大小的嬰兒C57/B1小鼠和對(duì)照相比在生長(zhǎng)方面具有顯著差異。對(duì)于大腦、肝臟和腎臟，表示為總體重的百分比沒(méi)有變化，但脾的重量為對(duì)照的60％。CBE處理的嬰兒小鼠表現(xiàn)尾部弓形，可能的高幅度動(dòng)作性震顫(highamplitudeactiontremor)和最小的驚恐反應(yīng)(minimalstartleresponse)，但正常的游泳和向右反應(yīng)(rightingresponse)，所有這些暗示著CNS灰質(zhì)受累。在肝組織和大腦中分別存在50％和300％的葡糖腦苷脂的增加。和處理的3個(gè)月大小的小鼠相似，所述處理的嬰兒小鼠具有顯著減少的β-葡糖苷酶活性。然而，盡管α-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶和正常接近，但己糖胺酶和甘露糖苷酶的活性提高。這些小鼠已提供了研究高歇病的發(fā)病機(jī)理的可能性，但CBE注射的短期效應(yīng)使這些小鼠對(duì)于研究酶和基因替代療法的長(zhǎng)期作用用處不大。使用高歇病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中，在鼠類葡糖腦苷脂酶中產(chǎn)生氨基酸置換，這使內(nèi)源GC表達(dá)顯著地減少至低于正常同窩出生鼠中的所述酶活性的一半水平。使用4-甲基umbellerferyl-吡喃型葡糖苷(4MUGP)(熒光標(biāo)記的底物)進(jìn)行小鼠樣品中的葡糖腦苷脂酶活性的分析。通過(guò)PCR誘變將類似于在受到更溫和地影響的高歇病患者中發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變的點(diǎn)突變導(dǎo)入鼠葡糖腦苷脂酶的基因組克隆。將該修飾的克隆插入合適的載體并通過(guò)電穿孔將其轉(zhuǎn)染入RW4鼠胚胎干(ES)細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將在葡糖腦苷脂酶基因的一個(gè)等位基因中包含被正確靶向的突變的ES克隆注射入來(lái)自C57BL/6小鼠的胚泡，然后將所述胚泡轉(zhuǎn)移至代孕小鼠。將來(lái)自這些注射的雄性后代和C57BL/6雌性小鼠測(cè)交(test-bred)，通過(guò)PCR和Southern分析篩選后代以分析所述突變的葡糖腦苷脂酶等位基因的遺傳。人Gaucher表型的長(zhǎng)壽鼠類模型可以用于發(fā)展新的治療策略。以前，通過(guò)葡糖腦苷脂酶基因的被靶向的破壞產(chǎn)生作為2型高歇病的鼠類模型的基因敲除小鼠。這些純合的受影響的小鼠不具有葡糖腦苷脂酶活性，在巨噬細(xì)胞中貯存脂質(zhì)，具有鱗癬性皮膚(icthyoticskin)和在出生后24小時(shí)內(nèi)死亡。溶酶體中的貯積材料的超微結(jié)構(gòu)和人患者的非常相似。其他研究使用單一插入誘變方法導(dǎo)入和兩個(gè)已知的人表型相關(guān)的突變。這些插入性RecNciI突變小鼠具有低的酶活性和積累的葡糖神經(jīng)酰胺，但是L444P小鼠具有更高的酶活性。然而，該插入突變RecNciI和L444P小鼠都在48小時(shí)內(nèi)死亡。L444P、R463C和N370S突變包含在患者中最常發(fā)現(xiàn)的突變中的三種突變。L444P突變?cè)诰哂猩窠?jīng)異常的患者中以更高的頻率被發(fā)現(xiàn)。在圖9A和圖B中示意性地舉例說(shuō)明了使用置換載體產(chǎn)生更長(zhǎng)壽的攜帶L444P、R463C和N370S點(diǎn)突變的高歇病小鼠模型，所述置換載體包含loxP。構(gòu)建使用陽(yáng)性/陰性選擇的置換靶向載體，所述載體包含被插入鼠metaxin(MX)和葡糖腦苷脂酶(GC)之間的基因間區(qū)域的、側(cè)翼連接loxP序列的新霉素抗性(NeoR)盒。通過(guò)PCR誘變將L444P突變導(dǎo)入鼠葡糖腦苷脂酶的基因組克隆。在該方法中，將外顯子10的起始處的正常的鼠GC序列從TGACTTGGA(SEQIDNO3)改變成TGACCCGGA(SEQIDNO4)，從而導(dǎo)致脯氨酸對(duì)亮氨酸的氨基酸置換和引入NciI限制性位點(diǎn)。通過(guò)限制性降解和直接的序列分析確認(rèn)構(gòu)建體中該序列的改變。最終的構(gòu)建體包含4.0kb5’GC同源臂(homologousarm)和1.4kb3’MX同源臂。如圖9A中所示，將白喉毒素A(DTA)盒作為負(fù)選擇標(biāo)記置于下游。在線性化后，通過(guò)電穿孔將該構(gòu)建體導(dǎo)入RW4鼠胚胎干(ES)細(xì)胞并如前面所描述的，將所述ES細(xì)胞在具有G418的培養(yǎng)物中接受藥物選擇。通過(guò)Southern印跡法和PCR分析鑒定抗G418的個(gè)體克隆中正確的基因靶向事件。將來(lái)自ES克隆的細(xì)胞注射入來(lái)自C57BL/6小鼠的胚泡，然后將其轉(zhuǎn)移至代孕小鼠，所述ES克隆在葡糖腦苷脂酶基因的一個(gè)等位基因中包含被正確靶向的L444P突變。將來(lái)自這些注射的具有超過(guò)30％的斑駁毛色的雄性后代和C57BL/6雌性測(cè)交，通過(guò)PCR和Southern分析就突變的L444P葡糖腦苷脂酶等位基因的遺傳對(duì)后代進(jìn)行篩選。當(dāng)傳遞L444P突變時(shí)，通過(guò)Southern分析中的外顯子9探針顯示的DNA片段和725bp的所述外顯子9的PCR擴(kuò)增片段(正向引物5’CTACCATCTTGGCCACTTCAG(SEQIDNO5)；反向引物5’GCACAGGAGCGAACTCTTTCC，SEQIDNO6)都用Ncil進(jìn)行切割。鑒定兩個(gè)包含L444P突變的等位基因的小鼠品系，通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增的包含被導(dǎo)入至外顯子9中的突變的DNA直接測(cè)序確定所述DNA序列。將對(duì)于L444P突變葡糖腦苷脂酶基因是雜合的小鼠交配，并通過(guò)Southern印跡法和PCR分析鑒定純合的突變后代。此外，將雜合L444P小鼠和攜帶CREDNA重組酶的轉(zhuǎn)基因的小鼠交配，導(dǎo)致NeoR標(biāo)記的切除，只留下34bploxP序列。如所預(yù)期的，被靶向的L444P突變以孟德?tīng)柗绞竭z傳。使用4-甲基umbellerferyl-吡喃型葡糖苷(4MUGP)(熒光標(biāo)記的底物)測(cè)定小鼠尾部樣品中的葡糖腦苷脂酶的活性，證明在純合的突變小鼠中，葡糖腦苷脂酶活性是正常同窩出生小鼠中的酶活性的大約35％。圖10A-10D是從用熒光標(biāo)記的YGP微粒喂養(yǎng)的小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(圖10A和圖10C)和彩色熒光顯微照片(圖10B和圖10D)的灰度圖像。通過(guò)口服強(qiáng)飼法或皮下注射給小鼠(C57B1/6野生型和Gaucher突變小鼠)施用0.1ml的YGP-F和YGMP-F等分，顯示無(wú)熒光巨噬細(xì)胞920和熒光巨噬細(xì)胞922、924。固定來(lái)自各動(dòng)物的大腦、肝臟、骨髓、小腸和脾的切片并通過(guò)熒光顯微鏡檢查以確定熒光酵母細(xì)胞壁顆粒被吸收的程度。將脾臟的等分置于冰上并進(jìn)行加工以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。以每12孔板大約106個(gè)細(xì)胞將脾細(xì)胞涂板并溫育24小時(shí)以使之附著。在洗去未結(jié)合的細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡，根據(jù)內(nèi)化的熒光微粒就粘附細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)對(duì)小孔進(jìn)行評(píng)分。所述處理通常可被良好地耐受。粘附的脾巨噬細(xì)胞的熒光顯微鏡分析證明在所有處理的動(dòng)物中存在熒光酵母細(xì)胞壁顆粒。這些結(jié)果證明YGP-F和YGMP-F都具有口服生物利用度且通過(guò)巨噬細(xì)胞進(jìn)行全身性分配。糞便的分析表明存在熒光微粒，這表明口服吸收不完全。野生型小鼠和Gaucher模型小鼠都能夠吸收口服施用的酵母細(xì)胞壁顆粒。制劑的體內(nèi)口服和皮下施用在鼠脾巨噬細(xì)胞中有效產(chǎn)生綠色熒光蛋白的表達(dá)，所述制劑包含含有pIRES表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒。圖11A-11D是從體內(nèi)處理的小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖，所述圖顯示包含pIRES表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒的吸收和綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。將所述分離的細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)膮R合度，用福爾馬林固定粘附細(xì)胞，使用熒光顯微鏡和照相進(jìn)行檢查。圖11A是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受PBS(對(duì)照處理)的口服強(qiáng)飼法，所述圖像顯示缺乏熒光巨噬細(xì)胞。圖11B是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pIRES制劑的皮下注射，該圖像顯示表達(dá)熒光GFP的巨噬細(xì)胞930。圖11C從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pIRES制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)熒光GFP的巨噬細(xì)胞931。圖11D是從野生型小鼠分離的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pIRES制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)熒光GFP的巨噬細(xì)胞932。包含酵母細(xì)胞壁顆粒的制劑的體內(nèi)口服和皮下給藥在鼠脾巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生人葡糖腦苷脂酶的表達(dá)方面是有效的，所述酵母細(xì)胞壁顆粒包含如上所述制備的pMFG-GC表達(dá)載體。圖12A-12M是從體內(nèi)處理的小鼠中分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的顯微照片的圖像，該圖顯示包含pMFG-GC表達(dá)載體的酵母細(xì)胞壁顆粒的吸收和人葡糖腦苷脂酶(hGC)的表達(dá)。將所述分離的細(xì)胞培養(yǎng)至合適的匯合度，用福爾馬林固定粘附細(xì)胞。使用第一抗人GC抗體(兔抗血清)、合適的可檢測(cè)的第二抗體(山羊抗兔FTTC綴合的抗血清)就免疫細(xì)胞化學(xué)處理固定的細(xì)胞，使用熒光顯微鏡和照相進(jìn)行檢查。圖12A是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的灰度圖像，所述野生型小鼠接受PBS(對(duì)照處理)的體內(nèi)口服強(qiáng)飼法，該圖顯示缺乏表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞。圖12B和12C是從野生型小鼠分離的免疫染色脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(12B)和彩色熒光顯微照片(12C)的圖像，所述小鼠接受0.1ml的每劑量提供100ng的質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的體內(nèi)皮下注射，該圖顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞935。圖12D是從L444P-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述L444P-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的皮下注射，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞936。圖12E是從R463C-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述R463C-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的皮下注射，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞937。圖12F和12G是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(12F)和彩色熒光顯微照片(12G)的圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞938。圖12H和12I是從L444P-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色透射光顯微照片(12H)和彩色熒光顯微照片(12I)的圖像，所述L444P-/-突變小鼠在體內(nèi)接受30天的0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的口服劑量處理，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞940。圖12J是從R463C-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述R463C-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞941。圖12K是從野生型小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述野生型小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pMFG-GC制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞942。圖12L是從L444P-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述L444P-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pMFG-GC制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞943。圖12M是從R463C-/-突變小鼠分離的免疫染色的脾巨噬細(xì)胞的彩色熒光顯微照片的圖像，所述R463C-/-突變小鼠在體內(nèi)接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGMP-pMFG-GC制劑的口服劑量，所述圖像顯示表達(dá)hGC的熒光免疫染色的巨噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞944。實(shí)施例23YGP和YGMP微粒的口服給藥在野生型和Gaucher’s小鼠中的全身性效應(yīng)。這些長(zhǎng)壽命的點(diǎn)突變小鼠的可獲得性提供了檢測(cè)口服給藥的基因療法在糾正在高歇病中觀察到的全身性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥中的功效的方法，所述小鼠具有和具有相同突變的Gaucher患者相似的生物化學(xué)和表型異常?？赏ㄟ^(guò)使用葡糖苷酶抑制劑牛菜醇β環(huán)氧化物(CBE，7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚烷-2，3，4，5-四醇)的短期腹膜內(nèi)(IP)處理惡化和加速Gaucher小鼠中疾病的臨床表現(xiàn)。如前面在嵌合小鼠模型中所描述的，可給Gaucher小鼠施用葡糖腦苷脂酶抑制劑例如CBE和溶血?jiǎng)┤绫诫乱赃M(jìn)一步減弱殘留的突變酶降解脂質(zhì)的能力，從而導(dǎo)致增加的脂質(zhì)貯存和更嚴(yán)重的以及更早期的臨床表現(xiàn)。通過(guò)口服或皮下給藥的體內(nèi)處理導(dǎo)致在野生型小鼠和Gaucher模型小鼠中的脾巨噬細(xì)胞都吸收基于YGP和YGMP兩者的制劑。該處理導(dǎo)致重組hGC在分離的脾巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，如通過(guò)hGC免疫交叉反應(yīng)材料的可檢測(cè)的增加所測(cè)量的。該處理還導(dǎo)致處理的Gaucher模型小鼠中的Gaucher樣癥狀的可見(jiàn)的改善，表明使用本發(fā)明的制劑的全身性治療具有想要的治療結(jié)果。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)、器官大小和葡糖腦苷脂酶活性將L444P突變小鼠和野生型小鼠以及雜合子進(jìn)行比較。測(cè)量C57/BL6(野生型)、轉(zhuǎn)基因雜合子和純合突變動(dòng)物的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)，如下面表18中所顯示的，平均計(jì)數(shù)相似。測(cè)量野生型(wt)、雜合子(het)和純合子突變動(dòng)物(每組4只)大腦、肝臟和脾的大小。表19提供了平均器官重量。如使用4-甲基umbelliferyl-B-D-吡喃型葡糖苷(4MU-Glu)所測(cè)定的，發(fā)現(xiàn)在L444P突變小鼠中檢測(cè)的所有組織的葡糖腦苷脂酶活性不足。未處理的L444PGaucher小鼠的組織中的葡糖腦苷脂酶活性顯著低于對(duì)照的活性脾(10％)、肝(28％)、肺(8％)、骨髓(11％)和大腦(65％)。使用YGP制劑(2只小鼠)和YGMP制劑(3只小鼠)的處理補(bǔ)充肝葡糖腦苷脂酶的酶活性，其中未處理的L444PGaucher小鼠(n＝7)、接受口服葡糖腦苷脂酶基因治療的L444PGaucher小鼠(n＝5)和野生型小鼠(n＝6)中的平均葡糖腦苷脂酶的酶活性分別是野生型小鼠葡糖腦苷脂酶特異性活性的12％、29％和100％。在比較YGP和YGMP組合物的作用的初步研究中，給L444PGaucher小鼠口服施用YGP-pMFG-GC制劑(0.1ml的每劑提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的日口服劑量進(jìn)行14天，和每周5劑，進(jìn)行56天)，和未處理的L444PGaucher小鼠的組織中的活性相比，在肺和大腦中產(chǎn)生葡糖腦苷脂酶活性(針對(duì)野生型小鼠的對(duì)應(yīng)組織中的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化)的增加，在脾中產(chǎn)生更少的增加，如下面表20中所示的。給L444PGaucher小鼠口服施用YGMP-pMFG-GC制劑，如表20中所示，和在用YGP-pMFG-GC制劑處理后觀察到的增加相比，產(chǎn)生了葡糖腦苷脂酶活性的略微更大的增加。所述增加也顯示葡糖腦苷脂酶活性的增加的不同組織依賴性模式。下面的表21顯示，和接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的日口服劑量(進(jìn)行14天和每周5劑進(jìn)行56天)的L444PGaucher小鼠的平均葡糖腦苷脂酶活性相比，在未處理的L444P小鼠和野生型小鼠(C57B1/6)的脾、肝、肺和腦組織中確定的平均葡糖腦苷脂酶活性的結(jié)果，將所述結(jié)果對(duì)野生型小鼠的對(duì)應(yīng)組織中的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。給R463C突變小鼠口服施用YGMP-pMFG-GC制劑也產(chǎn)生如下面表22中所示的葡糖腦苷脂酶活性的增加的組織依賴性模式。處理在脾的葡糖腦苷脂酶活性中產(chǎn)生很小的變化，在肺中產(chǎn)生葡糖腦苷脂酶活性的顯著增加，在肝中產(chǎn)生中等的增加。表21顯示，和接受0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的日口服劑量(進(jìn)行14天和每周5劑進(jìn)行56天)的R463CGaucher小鼠的平均葡糖腦苷脂酶活性相比，在未處理的R463C小鼠和野生型小鼠(C57B1/6)的脾、肝和肺組織中確定的平均葡糖腦苷脂酶活性的結(jié)果，將所述結(jié)果對(duì)野生型小鼠的對(duì)應(yīng)組織中的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在接受一段時(shí)間的牛菜醇β環(huán)氧化物(100mg/kg/天腹膜內(nèi)施用，進(jìn)行14天)后，一些小鼠變成了具有嚴(yán)重癥狀的R463CGaucher小鼠。在接受牛菜醇β環(huán)氧化物(100mg/kg/天腹膜內(nèi)施用，進(jìn)行14天)后，野生型(wt)小鼠和R463CGaucher小鼠之間在表型和臨床進(jìn)程中產(chǎn)生較大差異。在Gaucher小鼠中，在用牛菜醇β環(huán)氧化物處理14天后，在7天的恢復(fù)后，仍保持嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)和病狀。在接受一段時(shí)間的牛菜醇β環(huán)氧化物(100mg/kg/天腹膜內(nèi)施用，進(jìn)行2周)后，L444PGaucher小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的癥狀。已接受牛菜醇β環(huán)氧化物(100mg/kg/天腹膜內(nèi)施用，進(jìn)行14天)，然后進(jìn)行至少70天的口服施用0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的L444PGaucher小鼠，病情沒(méi)有未接受所述YGP-pMFG-GC制劑處理的小鼠嚴(yán)重。R463CGaucher小鼠在接受一段時(shí)間的牛菜醇β環(huán)氧化物(100mg/kg/天腹膜內(nèi)施用，進(jìn)行16天)后，癥狀變得更嚴(yán)重。已接受牛菜醇β環(huán)氧化物(100mg/kg/天腹膜內(nèi)施用，進(jìn)行16天)，然后進(jìn)行至少70天的口服施用0.1ml的每劑量提供100ng質(zhì)粒DNA的YGP-pMFG-GC制劑的R463CGaucher小鼠，在臨床上比不接受所述YGP-pMFG-GC制劑處理的所述小鼠更健康。處理增加了R463CGaucher小鼠的存活率。圖13是來(lái)自研究的數(shù)據(jù)的圖形表示法，該圖顯示在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，在葡糖腦苷脂酶基因療法后，在CBE處理的R463CGaucher小鼠中看到增加的存活率。除非另有說(shuō)明，權(quán)利要求不應(yīng)當(dāng)被理解為限制于描述的順序或因素。因此，落在下列權(quán)利要求和與其等價(jià)的聲明的范圍和精神之內(nèi)的所有實(shí)施方案都聲明為本發(fā)明。序列表<110>UniversityofMassachusettsGinns，EdwardI.Ostroff，GaryR.<120>用于溶酶體酶缺乏癥的組合物和其用途<130>080035-0009<160>14<170>PatentInversion3.2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸<220><221>熒光素<222>(1)..(1)<400>1ttggtcatccatggctct18<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<220><221>熒光素<222>(1)..(1)<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>脫氧胸苷<400>2uucuccgaacgugucacgutt21<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>3tgacttgga9<210>4<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>4tgacccgga9<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>5ctaccatcttggccacttcag21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>6gcacaggagcgaactctttcc21<210>7<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>7gaacctcctttac13<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>8gagcctcctgtac13<210>9<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>9tgacttgga9<210>10<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>10tgacccgga9<210>11<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>11aaccggtaa9<210>12<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>12aactggtaa9<210>13<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>13ccagatcttcg11<210>14<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成寡核苷酸<400>14ccagctcttcg1權(quán)利要求1.一種組合物，其包含提取的界定內(nèi)部空間和包含大約6％至大約90％的重量的β-葡聚糖的酵母細(xì)胞壁；有效負(fù)載捕獲分子和以有效地補(bǔ)充缺陷的溶酶體酶功能的量存在的選自核酸、肽、蛋白和其混合物的有效負(fù)載分子；其中所述有效負(fù)載分子和有效負(fù)載捕獲分子可溶于相同的溶劑系統(tǒng)，且其中所述有效負(fù)載捕獲分子穩(wěn)定所述有效負(fù)載分子和所述提取的酵母細(xì)胞壁的結(jié)合。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述有效負(fù)載捕獲分子選自殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚L-賴氨酸、藻酸鹽、黃單胞菌多糖、十六烷基三甲基銨溴化物和其混合物。3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述提取的酵母細(xì)胞壁還包含超過(guò)30％重量的甘露聚糖。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述提取的酵母細(xì)胞壁包含超過(guò)50％重量的殼多糖。5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述核酸選自寡核苷酸、反義構(gòu)建體、siRNA、酶RNA、重組DNA構(gòu)建體和其混合物。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述重組DNA構(gòu)建體是包含有效地連接至編碼蛋白的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述由開(kāi)放閱讀框編碼的蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白、具有酶活性的蛋白、膜蛋白、DNA結(jié)合蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或其功能性等同物。8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述核酸包括補(bǔ)充不存在的、缺陷的或被抑制的基因的功能的核苷酸序列。9.權(quán)利要求6的組合物，其中所述蛋白是人葡糖腦苷脂酶或其功能性等同物。10.權(quán)利要求5的組合物，其中所述重組DNA構(gòu)建體是表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含有效地連接至編碼溶酶體酶、溶酶體酶的功能性等同物、溶酶體酶激活蛋白或溶酶體酶激活蛋白的功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件。11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述溶酶體酶激活蛋白選自saprosinA、saprosinB、saprosinC、saprosinD和其混合物。12.權(quán)利要求1的組合物，其中所述蛋白是溶酶體酶或其功能性等同物。13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述蛋白選自saprosinA、saprosinB、saprosinC、saprosinD、GM2激活蛋白和其混合物。14.包含權(quán)利要求1的組合物和藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。15.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的組合物在生產(chǎn)用于治療溶酶體貯積癥的藥物中的用途。16.權(quán)利要求15的用途，其中所述溶酶體貯積癥是糖胺聚糖的不完全代謝、糖蛋白的聚糖部分的不完全降解、糖原的不完全降解、鞘脂組分的不完全降解、多肽的不完全降解、膽固醇、膽固醇酯或其他復(fù)合脂的不完全降解或轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷、多種溶酶體酶的缺陷、轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷或細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸缺陷。17.權(quán)利要求15的用途，其中所述溶酶體貯積癥是胡爾勒病、Scheie病、Hunter病、Sanfilippo病、莫爾基奧病、Maroteaux-Lamy病、Sly病、透明質(zhì)酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡糖胺尿、巖藻糖苷貯積病、甘露糖苷過(guò)多癥、Schindler病、唾液酸貯積癥I型、蓬佩病、法布里病、法伯病、高歇病1型、高歇病2型、高歇病3型、GM1神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥例如泰-薩病或山德霍夫病、GM2激活物疾病、克拉伯病、異染色性腦白質(zhì)障礙癥、尼-皮病A型、尼-皮病B型、致密性成骨不全癥、ceroidlipofuscinosis、膽固醇酯沉積病、尼-皮病C型、沃爾曼病、多種硫酸酯酶病、半乳糖唾液酸沉積癥、粘多糖癥II型、粘多糖癥III型、胱氨酸病、粘多糖癥IV型、唾液酸貯積癥、具有Marinesco-Sjgren綜合征、赫-普綜合征、切-東綜合征和Danon病的乳糜微粒滯留病、geleophysicdysplasia或Marinesco-Sjgren綜合征。18.制備組合物的方法，其包括步驟提供界定內(nèi)部空間并包含大約6％至90％重量的β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁；將所述提取的酵母細(xì)胞壁和有效地補(bǔ)充缺陷的溶酶體酶的功能的量的選自核酸、肽、蛋白和其混合物的有效負(fù)載分子接觸；將所述提取的酵母細(xì)胞壁和有效負(fù)載捕獲分子接觸，其中所述有效負(fù)載分子和有效負(fù)載捕獲分子可溶于相同的溶劑系統(tǒng)且其中所述有效負(fù)載捕獲分子穩(wěn)定所述有效負(fù)載分子和所述提取的酵母細(xì)胞壁的結(jié)合。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述有效負(fù)載捕獲分子選自殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚L-賴氨酸、藻酸鹽、黃單胞菌多糖、十六烷基三甲基銨溴化物和其混合物。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述提取的酵母細(xì)胞壁還包含超過(guò)30％重量的甘露聚糖。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述提取的酵母細(xì)胞壁包含超過(guò)50％重量的殼多糖。22.權(quán)利要求18的方法，其中所述核酸選自寡核苷酸、反義構(gòu)建體、siRNA、酶RNA、重組DNA構(gòu)建體和其混合物。23.權(quán)利要求18的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建體是包含有效地連接至編碼蛋白的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體。24.權(quán)利要求18的方法，其中所述由開(kāi)放閱讀框編碼的蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白、具有酶活性的蛋白、膜蛋白、DNA結(jié)合蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白或其功能性等同物。25.權(quán)利要求18的方法，其中所述核酸包含補(bǔ)充不存在的、缺陷的或被抑制的基因的功能的核苷酸序列。26.在細(xì)胞中補(bǔ)充酶缺陷的方法，其包括步驟提供有效量的第一遞送系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含含有大約6％至大約90％重量的β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺陷的酶或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體；和將具有該酶缺陷的細(xì)胞和所述第一遞送系統(tǒng)接觸。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述酶的缺陷是溶酶體酶的缺陷。28.權(quán)利要求26的方法，其中所述由開(kāi)放閱讀框編碼的酶是人葡糖腦苷脂酶或其功能性等同物。29.權(quán)利要求26的方法，其中所述接觸的步驟在體外進(jìn)行。30.權(quán)利要求26的方法，其中所述接觸的步驟在體內(nèi)進(jìn)行。31.權(quán)利要求26的方法，還包括通過(guò)細(xì)胞吞噬所述第一組合物的步驟。32.權(quán)利要求26的方法，還包括步驟提供有效量的第二遞送系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含含有β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺陷的酶的激活物或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體；和將具有該酶缺陷的細(xì)胞和所述第二遞送系統(tǒng)接觸。33.權(quán)利要求26的方法，還包括通過(guò)所述細(xì)胞吞噬所述第二遞送系統(tǒng)的步驟。34.權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞是巨噬細(xì)胞、派爾斑的M細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、朗氏細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、肺泡吞噬細(xì)胞、腹膜巨噬細(xì)胞、乳巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、mesengial細(xì)胞或滑膜A細(xì)胞。35.治療受試者的方法，所述受試者具有由于蛋白的缺陷引起的溶酶體貯積癥，所述方法包括步驟施用有效量的第一組合物，所述組合物包含含有β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺陷的蛋白或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體；和將吞噬細(xì)胞和所述第一組合物接觸。36.權(quán)利要求35的方法，其中給所述受試者口服、皮下、肌內(nèi)或通過(guò)吸入施用所述第一組合物。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述受試者是胎兒，且通過(guò)給母親施用所述組合物或通過(guò)將有效量的所述組合物置于羊水中來(lái)在子宮內(nèi)給胎兒施用所述組合物。38.權(quán)利要求35的方法，其還包括步驟施用有效量的第二組合物，所述組合物包含含有β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼激活蛋白或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體；和將吞噬細(xì)胞和所述第二組合物接觸。39.治療具有溶酶體蛋白缺乏的受試者的方法，其包括步驟施用有效量的第一組合物，其中所述第一組合物包含含有β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是包含有效地連接至編碼缺陷蛋白或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體；和施用有效量的第二組合物，其中所述第二組合物包含含有β-葡聚糖的提取的酵母細(xì)胞壁、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子，其中所述有效負(fù)載分子是激活蛋白、其功能性等同物或包含有效地連接至編碼激活蛋白或其功能性等同物的開(kāi)放閱讀框的控制元件的表達(dá)載體。40.權(quán)利要求39的方法，其中給所述受試者口服、皮下、肌內(nèi)或通過(guò)吸入施用所述第一組合物。41.權(quán)利要求39的方法，還包括將吞噬細(xì)胞和所述第一組合物接觸和將吞噬細(xì)胞和所述第二組合物接觸的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了包含含有β－葡聚糖、有效負(fù)載捕獲分子和有效負(fù)載分子的提取的酵母細(xì)胞壁的組合物，其中所述有效負(fù)載分子和有效負(fù)載捕獲分子可溶于相同的溶劑系統(tǒng)，其中所述有效負(fù)載分子補(bǔ)充缺陷的溶酶體酶的功能。本發(fā)明還提供制備和使用所述組合物的方法。文檔編號(hào)A61K9/50GK101052383SQ200580037576公開(kāi)日2007年10月10日申請(qǐng)日期2005年9月19日優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日發(fā)明者E·I·吉恩斯,G·R·奧斯特羅夫申請(qǐng)人:馬薩諸塞大學(xué)