專利名稱：超級(jí)活性的豬生長(zhǎng)激素釋放激素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)缺陷的治療；生長(zhǎng)表現(xiàn)的改善；刺激動(dòng)物生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生，使其高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平；以及利用生長(zhǎng)激素釋放激素類似物的給藥來增強(qiáng)生長(zhǎng)。此外，本發(fā)明還涉及編碼所述生長(zhǎng)激素釋放激素類似物的核苷酸序列在肌肉組織中的應(yīng)用，特別是使用基因治療技術(shù)進(jìn)行的應(yīng)用，該核苷酸序列受調(diào)節(jié)于肌肉特異性啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素(GH)途徑由一系列相互依賴的基因組成，這些基因的產(chǎn)物為正常生長(zhǎng)所需。這些GH途徑基因包括(1)配基，如GH以及胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)；(2)轉(zhuǎn)錄因子，如prophet of pit1，或prop 1和pit 1；(3)激動(dòng)劑和拮抗劑，其例子分別如生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)和促生長(zhǎng)素抑制素；以及(4)受體，如GHRH受體(GHRH-R)以及GH受體(GH-R)。這些基因是在不同的器官和組織中表達(dá)的，包括下丘腦、腦垂體、肝臟以及骨胳。GH途徑的有效和可調(diào)表達(dá)對(duì)于最佳的線性生長(zhǎng)以及碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。GH的合成以及從前腦垂體中的分泌為GHRH所刺激并且被促生長(zhǎng)素抑制素所抑制，這兩者均為下丘腦激素。GH在控制人類和其他脊椎動(dòng)物軀體生長(zhǎng)中的重要作用以及調(diào)節(jié)GH從腦垂體中分泌的生理相關(guān)途徑為人所熟知。GH首先提高肝臟，及其它靶器官中IGF-I的產(chǎn)生。IGF-I和GH依次反饋?zhàn)饔糜谙虑鹉X以及腦垂體以抑制GHRH和GH的釋放。GH對(duì)于周圍組織具有直接和間接作用，其間接作用主要由IGF-I介導(dǎo)。
在兒童和成人中存在著廣泛的臨床癥狀，在該癥狀中線性生長(zhǎng)(青春期前患者)或者軀體組成受到損害，并且該癥狀可因GH或者GHRH治療而好轉(zhuǎn)。在所有情況下GHRH-GH-IGF-I軸均是功能性的，但出于各種可能的原因，不在最佳敏感度或者反應(yīng)性下發(fā)揮作用。
兒童GH缺陷的主要特征為體形矮小。GH軸不同點(diǎn)的遺傳缺陷可產(chǎn)生類似的表型(Parks et al.，1995)以及非GH-缺陷的矮小體形。非GH-缺陷具有不同的病因(1)遺傳疾病，特納綜合征(Jacobs etal.，1990；Skuse et al.，1999)，hypochondroplasis(Tanaka etal.，1998；Key and Gross，1996)以及克羅恩氏病(Savage et al.，1999)；以及(2)子宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(Albanese and Stanhope，1997；Azcona et al.，1998)；以及(3)慢性腎功能不全(Sohmiya et al.，1998；Benfield and Kohaut，1997)。GH軸未受損的病例(即，患者具有正常的激素、基因和受體)占生長(zhǎng)遲緩總病例數(shù)超過50％。在這些病例中，GHRH或者GH治療是有效的(Gesundheit and Alexander，1995)。
GH從腦垂體中分泌的減少導(dǎo)致骨骼肌重量在從25歲至衰老的老化過程中喪失。GHRH-GH-IGF-I軸在老化期間及老年中經(jīng)受著巨大的變化(D’Costa et al.，1993)，這些變化有GH產(chǎn)生速度以及GH半衰期的降低，IGF-I對(duì)GH和GHRH刺激物反應(yīng)的降低，導(dǎo)致骨骼肌重量的失去(sarcopenia)，骨質(zhì)疏松癥以及脂肪的增加和瘦肉的減少(Bartke，1998)。先前的研究已經(jīng)表明在相當(dāng)大量的正常老人中，血清中的GH以及IGF水平比其十幾歲時(shí)的水平降低了70-80％(Corpaset al.，1993；Iranmanesh et al.，1991)。已經(jīng)證明sarcopenia的發(fā)展可通過GH治療而消除。然而，在老年人中，該治療由于其費(fèi)用以及經(jīng)常的副作用而仍然是一種有爭(zhēng)議的療法。
重組蛋白的產(chǎn)生是治療這些疾病的一種有效工具。盡管GH替換療法被廣泛用于具有生長(zhǎng)缺陷的患者中并且產(chǎn)生了令人滿意的生長(zhǎng)，對(duì)被治療的兒童也具有積極的作用(Rosenbaum和Saigal，1996；Erling，1999)，但該療法具有一些不足，這包括不實(shí)際地要求GH的經(jīng)常給藥(Monti et al.，1997；Heptulla et al.，1997)以及不理想的次級(jí)效果(Blethen et al.，1996；Watkins，1996；Shalet et al.，1997；Allen et al.，1997)。
已經(jīng)確認(rèn)以成熟肽或者截短分子形式進(jìn)行顱外分泌的GHRH(如在胰島細(xì)胞腫瘤以及多種定位腫瘤中所見)通常具有生物活性并且甚至可產(chǎn)生肢端肥大癥(Esch et al.，1982；Thorner et al.，1984)。以重組GHRH對(duì)GH缺陷兒童或成人進(jìn)行的給藥提高了IGF-1水平，使GH分泌相對(duì)于GH劑量成比例增加，還激活了對(duì)于大劑量(bolusdose)GHRH的反應(yīng)(Bercu and Walker，1997)。因此，GHRH給藥更大程度上代表了一種提高低于正常的GH和IGF-1水平的生理替代方法。
盡管GHRH蛋白療法可產(chǎn)生并刺激正常的循環(huán)GH分泌而沒有實(shí)質(zhì)性的副作用，但GHRH在體內(nèi)短暫的半衰期要求經(jīng)常性的(每天一至三次)靜脈內(nèi)、皮下或者鼻腔內(nèi)(需要300倍高的劑量)給藥。因此，作為一種長(zhǎng)期治療，GHRH給藥是不切合實(shí)際的。但是，以加工后蛋白型(Tyr1-40或者Tyr1-Leu44)或者作為更短的截短分子而進(jìn)行顱外分泌的GHRH具有生物活性(Thorner et al.，1984)。重要地，血液供給中的低水平GHRH(100pg/ml)刺激GH分泌(Corpas et al.，1993)，并且使GHRH成為用于基因治療表達(dá)的優(yōu)秀候選者。直接質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移目前是許多存在的基因治療策略的基礎(chǔ)，并且從而不需要病毒基因或脂質(zhì)顆粒(Muramatsu et al.，1998；Aihara and Miyazaki，1998)。骨骼肌是一種優(yōu)選的靶組織，這是由于肌肉纖維壽命長(zhǎng)并且可被環(huán)狀DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，該質(zhì)?？稍诿庖呋钚运拗髦羞M(jìn)行超過一個(gè)月或者一年的表達(dá)(Davis et al.，1993；Tripathy et al.，1996)。先前的報(bào)道表明人類GHRH cDNA可通過一種可注射的肌源表達(dá)載體被傳遞入小鼠的肌肉，其中它在兩周的時(shí)間內(nèi)瞬時(shí)地刺激適度水平的GH分泌(Draghia-Akli et al.，1997)。
野生型GHRH在人和畜循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期相對(duì)較短。人(Frohmanet al.，1984)在血漿中培養(yǎng)60分鐘后，95％的GHRH(1-44)NH2被降解，而較短的(1-40)OH形式的激素在類似條件下培養(yǎng)60分鐘后，僅僅表現(xiàn)出77％的肽降解(Frohman et al.，1989)。在基因治療載體中插入編碼較短的GHRH類型(1-40)OH的cDNA可能產(chǎn)生在血清中具有較長(zhǎng)半衰期，并且提高效能的分子，并且該cDNA的插入將在經(jīng)質(zhì)粒注射的動(dòng)物中產(chǎn)生更高的GH釋放。另外，通過對(duì)蛋白酶敏感氨基酸進(jìn)行氨基酸替換可延長(zhǎng)hGHRH分子的血清半衰期。此外，通過使用超活性的類似物可獲得GHRH生物活性的增強(qiáng)，該類似物可提高其對(duì)特異性受體的結(jié)合親和性。
已經(jīng)發(fā)表了一些專利，其著眼于以新的GHRH類似物蛋白(U.S.Pat.Nos.5,847,066；5,846,936；5,792,747；5,776,901；5,696,089；5,486,505；5,137,872；5,084,442；5,036,045；5,023,322；4,839,344；4,410,512；RE33,699)或者GHRH的合成或者天然存在的肽片段(U.S.Pat.Nos.4,833,166；4,228,158；4,228,156；4,226,857；4,224,316；4,223,021；4,223,020；4,223,019)進(jìn)行給藥，以提高生長(zhǎng)激素的釋放。已經(jīng)報(bào)道了含有以下突變的GHRH類似物(美國(guó)專利號(hào)No.5,846,936)1位的Tyr變?yōu)镠is；2位的Ala變?yōu)閂al、Leu或其它氨基酸；8位的Asn變?yōu)镚ln、Ser或Thr；15位的Gly變?yōu)锳la或者Leu；27位的Met變?yōu)镹le或Leu；以及28位的Ser變?yōu)锳sn。本發(fā)明的類似物無需含有在美國(guó)專利號(hào)No.5,846,936中報(bào)道的，活性所必需的全部氨基酸替換。
盡管美國(guó)專利號(hào)No.5,756,264中的具體實(shí)施方案涉及到基因治療，其中治療基因被傳遞到肌源組織中，并且在說明書中提及的一個(gè)例子是生長(zhǎng)激素釋放激素，但兩個(gè)重要的差異將本發(fā)明同該系統(tǒng)區(qū)分開。首先，本發(fā)明涉及到一種生長(zhǎng)激素釋放激素的類似物，該類似物由于重要的修飾而區(qū)別于野生型，這些修飾提高了其作為GH促分泌物的功能對(duì)蛋白酶的敏感性降低，而穩(wěn)定性提高，其可以延長(zhǎng)進(jìn)行治療的能力；增強(qiáng)生物活性，其還可以提高進(jìn)行治療的能力。另外，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，使用了一種獨(dú)特的合成啟動(dòng)子，名為SPc5-12(Li et al.，1999)，該啟動(dòng)子含有來自骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白的近端血清反應(yīng)元件(SRE)、多個(gè)MEF-2位點(diǎn)、MEF-1位點(diǎn)和TEF-1結(jié)合位點(diǎn)，該啟動(dòng)子顯著地超越了天然肌源啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄能力。這種合成啟動(dòng)子的獨(dú)特性對(duì)于涉及到肌源啟動(dòng)子及其應(yīng)用(例如U.S.Pat.No.5,374,544)或者用于核酸序列肌源表達(dá)系統(tǒng)(例如U.S.Pat.No.5,298,422)的公開專利具有顯著的改善。
由此，本發(fā)明提出了一種含有提高引發(fā)生長(zhǎng)激素釋放能力的突變的類似物應(yīng)用。如在實(shí)施例中所闡述，所述的類似物成功地提高了生長(zhǎng)激素的釋放，盡管沒有現(xiàn)有技術(shù)中的類似物在8位上以Gln、Ser或者Thr進(jìn)行的替換。此外，本發(fā)明提供了基因治療技術(shù)，以向骨骼肌組織的優(yōu)選選擇中引入所述的類似物，這是由于肌肉纖維壽命長(zhǎng)并且可被環(huán)狀DNA質(zhì)粒所誘導(dǎo)，其中所述類似物的表達(dá)被一種合成的肌源啟動(dòng)子所調(diào)節(jié)。這對(duì)于現(xiàn)存技術(shù)是一種改進(jìn)，在現(xiàn)存技術(shù)中對(duì)于GHRH經(jīng)常性給藥的需求妨礙了其作為長(zhǎng)期治療的應(yīng)用。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的生長(zhǎng)激素釋放激素。
本發(fā)明的另外一些實(shí)施方案包括(1)一種用于治療同生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)的生長(zhǎng)激素關(guān)聯(lián)缺陷的方法；(2)一種用于治療同遺傳疾病相關(guān)的生長(zhǎng)激素關(guān)聯(lián)缺陷的方法；(3)一種用于改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的方法；(4)一種治療患有生長(zhǎng)缺陷疾病的動(dòng)物的方法；(5)一種提高某種動(dòng)物被用作食物的效率的方法；以及(6)一種治療動(dòng)物消瘦癥狀(wasting symptom)的方法，該癥狀與燒傷、外傷、AIDS或其它消耗性疾病相關(guān)；(7)一種刺激動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生，使其高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平；以及(8)一種增強(qiáng)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法。所有這些方法均包括向動(dòng)物體內(nèi)引入一種質(zhì)粒載體的步驟，其中所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離按順序可操作地連接。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子為一種合成肌源啟動(dòng)子，并且hGH 3’非翻譯區(qū)位于3’非翻譯區(qū)中。
在具體的實(shí)施方案中，所述載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或者陽離子脂類。在其它具體的實(shí)施方案中，所述的載體被引入肌源性細(xì)胞或者肌肉組織。在另一具體的實(shí)施方案中，所述的動(dòng)物為人類、寵物、勞作動(dòng)物或者食用動(dòng)物。
一個(gè)額外的實(shí)施方案為一種藥物組合物，該組合物用于刺激動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的釋放，該組合物在藥學(xué)可接受載體中含有SEQ ID NO1。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為編碼生長(zhǎng)激素釋放激素的核苷酸序列，該激素具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)額外的實(shí)施方案中有一種提高動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量的載體，所述的載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其適于功能性表達(dá)地可操作地連接。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中該啟動(dòng)子為一種合成的肌源性啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該3’非翻譯區(qū)為hGH 3’非翻譯區(qū)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該動(dòng)物選自人類、寵物、勞作動(dòng)物或者食用動(dòng)物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中該載體被引入到肌源性細(xì)胞中。在又一具體的實(shí)施方案中該載體被引入到所述動(dòng)物的肌肉組織中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該引入治療了一種同生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)的生長(zhǎng)激素關(guān)聯(lián)缺陷。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該缺陷疾病為所述動(dòng)物體內(nèi)遺傳材料變化的結(jié)果。在又一實(shí)施方案中，該引入導(dǎo)致所述動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的改善。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該引入提高了該動(dòng)物的作用，其中該動(dòng)物被用作食物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該引入治療了動(dòng)物同燒傷、外傷、AIDS或其它消耗性疾病相關(guān)的消瘦癥狀。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該引入導(dǎo)致了所述動(dòng)物生長(zhǎng)的提高。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該載體是以單獨(dú)給藥的方法而被引入所述動(dòng)物中的。在又一具體的實(shí)施方案中，該載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或者陽離子脂類。
在本發(fā)明的一個(gè)額外的實(shí)施方案中有一種治療動(dòng)物體內(nèi)同生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)的生長(zhǎng)激素關(guān)聯(lián)疾病的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量的載體，所述載體含有一種合成的肌源啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種hGH的3’非翻譯區(qū)，其為了功能性表達(dá)而可操作地連接。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，有一種刺激動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生，并使其高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量的載體，所述載體含有一種合成的肌源啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種hGH的3’非翻譯區(qū)，其適于功能性表達(dá)地可操作地連接。
通過閱讀以下的說明書并參考構(gòu)成其一部分的附圖或者本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的例子，其它以及進(jìn)一步的目的、特征以及優(yōu)點(diǎn)將是很明顯并且更為易于理解的。
附圖描述

圖1A到圖1C證明GHRH超活性類似物可提高GH促分泌活性和穩(wěn)定性。圖1A為豬野生型(1-40)OH氨基酸序列同類似物HV-GHRH的比較。圖1B所示為不同GHRH種類對(duì)豬GH在豬原代腦垂體培養(yǎng)物(primary pituitary culture)中釋放的影響。圖1C所示為HV-GHRH以及野生型豬GHRH在4至6小時(shí)培養(yǎng)期間所發(fā)生的穩(wěn)定性變化。
圖2A到圖2E所示為在以超活性類似物GHRH肌源表達(dá)載體進(jìn)行單獨(dú)注射2個(gè)月后的GHRH、GH和IGF-1血清水平的提高。圖2A所描述的是含有SPc5-12合成啟動(dòng)子以及GH的3’UTR的結(jié)構(gòu)體。作為一種突變蛋白的模型，HV-GHRH結(jié)構(gòu)體被使用，并且以豬野生型作為陽性參照，以及使用β-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)體作為陰性參照。圖2B所示為經(jīng)pSP-GHRH注射的豬與經(jīng)安慰劑注射的參照豬相比血清GHRH的相對(duì)水平。圖2C所示為經(jīng)pSP-GHRH注射的豬與參照豬相比血清GHRH的絕對(duì)水平，該值經(jīng)體重/血液體積的提高而校正。圖2D所示為GH水平在經(jīng)pSP-HV-GHRH注射的豬體內(nèi)的變化。圖2E所示為在以pSP-GHRH進(jìn)行直接肌內(nèi)注射后的血漿IGF-1水平。
圖3A到圖3C所示為肌源GHRH表達(dá)載體對(duì)豬生長(zhǎng)的影響。圖3A所示為經(jīng)pSP-GHRH或pSP-GHRH-HV注射2個(gè)月的豬的平均重量的變化。圖3B所示為經(jīng)pSP-GHRH注射的豬同參照相比的飼養(yǎng)效率水平。圖3C為注射45天后的經(jīng)pSP-HV-GHRH注射的豬與經(jīng)安慰劑注射的豬的比較。
圖4所示為以不同量pSP-GHRH-HV進(jìn)行的注射對(duì)10天大小豬的影響。
圖5所示為以不同量pSP-GHRH-HV進(jìn)行的注射對(duì)10天大小豬的IGF-1水平的影響。
圖6所示為對(duì)小豬進(jìn)行pSP-GHRH-HV質(zhì)粒注射的時(shí)間過程。
發(fā)明詳述本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易明白在此處披露的發(fā)明中，可以進(jìn)行多種替換和修飾而并不偏離本發(fā)明的范圍和精神。
此處所用的術(shù)語“動(dòng)物”指的是動(dòng)物界的任何物種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中該術(shù)語更加具體地指人類、寵物動(dòng)物(狗、貓、馬)、勞作動(dòng)物(馬、牛)以及食用動(dòng)物及其它本領(lǐng)域所熟知的動(dòng)物，該食用動(dòng)物包括生產(chǎn)食物的動(dòng)物(雞、牛、魚)或者其本身為食物(蛙、雞、魚、蟹、龍蝦、蝦、貽貝、扇貝、山羊、公豬、牛、羊羔、豬、鴕鳥、鴯鹋、鰻)。
此處所用的術(shù)語“消耗性疾病”被定義為這樣一些疾病，在這些疾病中患者失去體重(多數(shù)為肌肉質(zhì)量)，失去肌肉力量，骨骼可能失去礦物質(zhì)(難以察覺，其機(jī)制未知)，可能并發(fā)病毒/細(xì)菌感染或者具有某些基礎(chǔ)代謝失調(diào)。這樣疾病的一些例子為AIDS、結(jié)核病或者癌癥。
此處使用的術(shù)語“有效量”被定義為在宿主中產(chǎn)生作用所需的組合物的量，該作用可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的幾種終端來監(jiān)測(cè)。
此處所使用的術(shù)語“效率”被定義為動(dòng)物每日所食用食物的量同所述的動(dòng)物獲得的體重量之比。
此處所用的術(shù)語“生長(zhǎng)缺陷”被定義為任何健康狀態(tài)、醫(yī)學(xué)癥狀或疾病，在其中生長(zhǎng)低于正常。該缺陷可以是某種畸變的結(jié)果，該畸變直接影響生長(zhǎng)激素途徑(如GHRH-GH-IGF-I軸)、間接影響生長(zhǎng)激素途徑或完全不影響生長(zhǎng)激素途徑。
此處所用的術(shù)語“生長(zhǎng)激素”被定義為這樣一種激素，其涉及生長(zhǎng)并且作為一種化學(xué)信使在靶細(xì)胞上發(fā)揮作用。
此處所用的術(shù)語“生長(zhǎng)激釋放激素素”被定義為這樣一種激素，其輔助或刺激生長(zhǎng)激素的釋放。
此處所用的術(shù)語“生長(zhǎng)激素釋放激素類似物”被定義為這樣一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在該氨基酸序列的天然形式(不含合成的右旋或者環(huán)狀氨基酸)中含有氨基酸突變，但該突變?cè)谔烊磺闆r下并不存在于GHRH分子中，該蛋白質(zhì)仍然保持其增強(qiáng)生長(zhǎng)激素合成和分泌的功能。
此處使用的術(shù)語“肌源”具體指肌肉組織。
此處使用的術(shù)語“藥學(xué)可接受的”指的是某種化合物，其中以所述化合物進(jìn)行的給藥可被受體哺乳動(dòng)物所承受。
此處使用的術(shù)語“促分泌物”指的是某種天然或者合成分子，該分子增強(qiáng)一種下游調(diào)節(jié)的分子的合成和分泌(例如，GHRH為GH的一種促分泌物)。
此處使用的術(shù)語“治療有效量”指的是被用于給藥的化合物的量，該量具有生理意義。一種試劑，如果其存在導(dǎo)致受體動(dòng)物生理中的技術(shù)變化，那么它具有生理意義。例如，在生長(zhǎng)缺陷的治療中，一種提高生長(zhǎng)的組合物為治療有效的；在消耗性疾病中，一種降低消耗速度或提高生長(zhǎng)的組合物是治療有效的。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，足量的載體被用于提供編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列的治療有效水平的表達(dá)。
此處使用的術(shù)語“治療”被定義為對(duì)生長(zhǎng)缺陷疾病的至少一種癥狀進(jìn)行良性影響或者對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)進(jìn)行良性影響的舉措。技術(shù)人員了解術(shù)語“治療”并不一定表示治愈，盡管對(duì)某種或某些癥狀的治愈包括在術(shù)語治療的范圍之內(nèi)。
此處使用的術(shù)語“載體”指的是任何向細(xì)胞或者生物體傳送核酸的負(fù)載物。例子包括質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或者陽離子脂類。
此處使用的術(shù)語“消瘦癥狀”被定義為一種同消耗性疾病相關(guān)的癥狀。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為生長(zhǎng)激素釋放激素類似物，該類似物具有SEQ ID NO1的氨基酸序列以及編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括(1)一種用于治療同生長(zhǎng)激素途徑相聯(lián)系的生長(zhǎng)激素相關(guān)缺陷的方法；(2)一種用于治療同遺傳疾病相聯(lián)系的生長(zhǎng)激素相關(guān)缺陷的方法；(3)一種改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的方法；(4)一種治療患有生長(zhǎng)缺陷疾病的動(dòng)物的方法；(5)一種提高某種食用動(dòng)物的效率的方法；(6)一種治療動(dòng)物消瘦癥狀的方法，該癥狀與燒傷、外傷、AIDS或其它消耗性疾病相關(guān)；(7)一種用于刺激動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生，使其高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平的方法；以及(8)一種增強(qiáng)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法。所有這些方法均包括向動(dòng)物體內(nèi)引入一種質(zhì)粒載體的步驟，其中所述的載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離按順序可操作地連接。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這些方法導(dǎo)致生長(zhǎng)的提高、改善或增強(qiáng)，或者導(dǎo)致生長(zhǎng)激素生產(chǎn)的提高。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中有一種治療動(dòng)物體內(nèi)同生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)的生長(zhǎng)激素關(guān)聯(lián)疾病的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量的載體，所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解生長(zhǎng)激素途徑中的缺陷可能直接或者間接影響生長(zhǎng)，并且該被影響的環(huán)節(jié)可以位于GHRH作用或功能的上游或者下游。在一個(gè)GHRH作用或功能的下游環(huán)節(jié)受影響的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明GHRH類似物水平的提高克服了這一受影響的環(huán)節(jié)，該類似物最初以基因治療的形式給藥。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中有一種治療動(dòng)物同遺傳疾病相關(guān)的生長(zhǎng)激素關(guān)聯(lián)疾病的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量的載體，所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。該缺陷由遺傳疾病直接或者間接地導(dǎo)致，并且可能存在其它癥狀。這些遺傳疾病的例子包括，Creutzfeldt-Jakob病、Cohen綜合征、氨基喋呤-氨甲喋呤綜合征、Kabuki綜合征、Wolf-Hirschhorn綜合征、Russell-Silver綜合征、Miller-Dieker綜合征、朗格罕氏細(xì)胞組織細(xì)胞增多病綜合征、Roberts綜合征以及18q綜合征，但不限于此。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，有一種治療患有生長(zhǎng)激素缺陷疾病的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量載體的步驟，所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。該生長(zhǎng)缺陷疾病可能由一種基因缺陷或者生長(zhǎng)激素途徑的缺陷所導(dǎo)致。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，有一種改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入治療有效量的載體，所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。此處所用的術(shù)語“生長(zhǎng)表現(xiàn)”被定義為動(dòng)物生長(zhǎng)的狀態(tài)或者狀況。該生長(zhǎng)表現(xiàn)可能是遺傳疾病、生長(zhǎng)相關(guān)缺陷或者該動(dòng)物或其親本暴露于生長(zhǎng)影響劑的結(jié)果。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的方法包括提高動(dòng)物生長(zhǎng)的方法。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，有一種刺激動(dòng)物生長(zhǎng)激素產(chǎn)生，并使其高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)水平的方法，所述方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入有效量的載體，所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平包括患有生長(zhǎng)相關(guān)缺陷的動(dòng)物或者與同種群其它類似動(dòng)物，包括未患有生長(zhǎng)相關(guān)缺陷的那些動(dòng)物，具有類似生長(zhǎng)水平的動(dòng)物的基線的，固有的生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，有一種增強(qiáng)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入有效量的載體，所述載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。生長(zhǎng)被增強(qiáng)的該動(dòng)物可能患有或者未患有生長(zhǎng)缺陷。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中有一種載體，該載體含有一種啟動(dòng)于；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，其以適于功能性表達(dá)的距離可操作地連接。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，各種核苷酸序列均可用于編碼SEQ ID NO1。所使用的具體序列是在待修飾的具體序列上部分決定的并且實(shí)驗(yàn)條件由技術(shù)人員針對(duì)具體用途而決定。如本文所示，技術(shù)人員可使用GHRH cDNA序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變以在該序列中產(chǎn)生變化，使同時(shí)含有天然或者種屬特異性序列以及所需的蛋白酶抗性的氨基酸替換等等。此處所提供的例子是針對(duì)如何通過諸如定點(diǎn)誘變這樣的方法來改變核苷酸序列以獲得所需的序列。技術(shù)人員因此應(yīng)當(dāng)了解如何通過使用諸如SEQ ID NO8或者來自GenBank(見下文)的類似序列作為模板通過定點(diǎn)誘變或其它已知的方法來對(duì)其進(jìn)行改變以獲得編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1的氨基酸序列可以由能夠從GenBank中檢索序列、了解此處提供的用于進(jìn)行定點(diǎn)誘變的方法以及遺傳密碼表的技術(shù)人員容易地制造，因?yàn)楦髅艽a子的擺動(dòng)位置(第三)，該氨基酸序列由多個(gè)核苷酸序列所編碼，該密碼表的例子可見于任何標(biāo)準(zhǔn)的生化或者分子生物學(xué)教科書(例如，Biochemistry，3rded.，L.Stryer；W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1988))。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子為合成的肌源啟動(dòng)子并且hGH3’非翻譯區(qū)位于該3’非翻譯區(qū)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中使用了一種合成的啟動(dòng)子，名為SPc5-12(Li et al.，1999)(SEQ IDNO6)，該啟動(dòng)子含有來自骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白的近端血清反應(yīng)元件(SRE)、多個(gè)MEF-2位點(diǎn)、MEF-1位點(diǎn)和TEF-1結(jié)合位點(diǎn)，該啟動(dòng)子顯著地超越了天然肌源啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄能力。包括反式作用因子結(jié)合位點(diǎn)和增強(qiáng)子在內(nèi)的其它元件可根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案而使用。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，一種天然的肌源啟動(dòng)子被使用，并且技術(shù)人員知道如何從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得這樣的啟動(dòng)子序列，這些數(shù)據(jù)庫(kù)包括國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html)或者NCBI PubMed站點(diǎn)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)。技術(shù)人員知道這些萬維網(wǎng)站點(diǎn)可用于獲得本發(fā)明所涉及的序列或者相關(guān)文獻(xiàn)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該hGH 3’非翻譯區(qū)(SEQ ID NO7)在一種核酸載體，例如質(zhì)粒中被使用。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中有一種方法，該方法用于增加動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素，該方法使用一種含有編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列的載體。如在實(shí)施例中所述，人類GHRH cDNA(SEQ ID NO8)被用作定點(diǎn)誘變的模板以產(chǎn)生該序列的變化，以此獲得同時(shí)含有豬的天然序列以及所需的可以蛋白酶抗性的氨基酸替換等等。由此，這些例子提供了指導(dǎo)，該指導(dǎo)在此處涉及到如何通過諸如定點(diǎn)誘變這樣的方法來獲得所需的序列。技術(shù)人員因此應(yīng)當(dāng)知道如何通過使用諸如SEQ ID NO8或者來自GenBank(見上文)的類似序列作為模板，通過定點(diǎn)誘變或其它已知的方法來對(duì)其進(jìn)行改變，以獲得編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1的氨基酸序列可以由能夠從GenBank中檢索序列、了解此處提供的用于進(jìn)行定點(diǎn)誘變的方法以及遺傳密碼表的技術(shù)人員容易地制造，因?yàn)楦髅艽a子的擺動(dòng)位置(第三)，該氨基酸序列由多個(gè)核苷酸序列所編碼，該密碼表的例子可見于任何標(biāo)準(zhǔn)的生化或者分子生物學(xué)教科書(例如，Biochemistry，3rded.，L.Stryer；W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1988))。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或者陽離子脂類。在又一具體實(shí)施方案中，所述載體被引入肌源細(xì)胞或者肌肉組織。在又一具體實(shí)施方案中所述動(dòng)物為人類、寵物、勞作動(dòng)物或者食用動(dòng)物。
另一個(gè)實(shí)施方案為一種藥物組合物，該組合物用于刺激動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的釋放，該組合物在一種藥學(xué)可接受的載體中含有SEQ ID NO1。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是編碼生長(zhǎng)激素釋放激素的核苷酸序列，其中的生長(zhǎng)激素釋放激素具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
除經(jīng)過一種質(zhì)粒載體向動(dòng)物體內(nèi)引入所述結(jié)構(gòu)體的具體實(shí)施方案之外，本領(lǐng)域已知的用于向動(dòng)物或者其細(xì)胞進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)染的傳遞系統(tǒng)也可被使用。例如，可使用其它非病毒或病毒方法。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，一種用于非病毒形式DNA或RNA的靶向系統(tǒng)包括四個(gè)組分1)目的DNA或RNA；2)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面受體或抗原的部分(moiety)；3)DNA結(jié)合部分；4)實(shí)現(xiàn)該復(fù)合物從細(xì)胞表面向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的溶細(xì)胞部分。此外，脂質(zhì)體和陽離子脂類可被用于傳遞該醫(yī)療基因組合，以獲得相同的療效。可能的病毒載體包括衍生自病毒的表達(dá)載體，病毒的例子為腺病毒、痘病毒以及豬乳頭狀瘤病毒。另外，附加型載體也可使用。其它DNA載體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，衍生自各種細(xì)菌質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或者痘病毒的表達(dá)載體均可用于向靶器官、組織或者細(xì)胞群體傳遞核苷酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法可被用于構(gòu)建重組載體，該載體表達(dá)編碼生長(zhǎng)激素釋放激素類似物的基因。以非復(fù)制載體進(jìn)行的瞬時(shí)表達(dá)可持續(xù)一個(gè)月或更久，如果該載體系統(tǒng)的一部分為適當(dāng)?shù)膹?fù)制元件，該時(shí)間可更長(zhǎng)。
核酸1.載體術(shù)語“載體”用于指一種用于向一種細(xì)胞引入核取分子的載體核酸分子，該載體可在該細(xì)胞中復(fù)制，該載體中可插入核酸分子。核酸序列可以是“外源的”，這指的是該核酸對(duì)于被引入載體的，細(xì)胞是外來的，或者該序列與該細(xì)胞中的一個(gè)序列同源，但在該宿主細(xì)胞核酸中的位置沒有發(fā)現(xiàn)該序列。這些載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng)物病毒以及植物病毒)以及人工染色體(例如，YAC)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)配有較好的設(shè)備以通過標(biāo)準(zhǔn)重組工藝來構(gòu)建載體，這些工藝的描述見Maniatis et al.，1988和Ausubel et al.，1994，兩者均在此引為參考。
術(shù)語“表達(dá)載體”指的是一種載體，該載體含有一種核酸序列，該序列編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的一種基因產(chǎn)物的至少一部分。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該核酸序列編碼部分或全部的GHRH。在某些情況下，RNA分子隨后被翻譯成為蛋白質(zhì)、多肽或肽。在其它的情況下，例如在反義分子或者核糖體的產(chǎn)生中這些序列并不被翻譯。表達(dá)載體可含有多種“控制序列”，該術(shù)語指在特定的宿主生物體中，可操作連接的編碼序列可能的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的核酸序列。除控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達(dá)載體可能還含有發(fā)揮其它作用的核酸序列，其在下文中描述。
a.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子
“啟動(dòng)子”為一種控制序列，該序列是一種核酸序列的區(qū)域，在該區(qū)域中轉(zhuǎn)錄的起始和速度受到控制。啟動(dòng)子可能含有遺傳元件，調(diào)節(jié)蛋白和分子可在該元件上同RNA聚合酶以及其它轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合。短語“可操作地位于”、“可操作地連接”、“受控于”以及“受到轉(zhuǎn)錄控制”意指啟動(dòng)子相對(duì)于核酸序列處于正確的功能性位點(diǎn)和/或方向，這樣可以控制轉(zhuǎn)錄的起始和/或該序列的表達(dá)。啟動(dòng)子是否同“增強(qiáng)子”聯(lián)合使用均可，“增強(qiáng)子”指的是一種順式作用調(diào)節(jié)序列，該序列參與核酸序列轉(zhuǎn)錄的激活。
一種啟動(dòng)子可能同一種基因或者序列具有天然的聯(lián)系，這是由于該啟動(dòng)子可通過分離位于編碼部分和/或內(nèi)含子上游的5’非編碼序列而獲得。這樣的啟動(dòng)子可稱之為“內(nèi)源的”。類似地，一種增強(qiáng)子可能同一種位于該序列上游或下游的核酸序列具有天然的聯(lián)系。在替代的情況下，通過使編碼核酸片段處于一種重組或者異源啟動(dòng)子的控制之下，可以獲得特定的好處，該重組或者異源啟動(dòng)子指的是一種在正常情況下同某種核酸序列在其天然環(huán)境中并無聯(lián)系的啟動(dòng)子。一種重組或者外源啟動(dòng)子指的是一種在正常情況下，同在其天然環(huán)境中的某種核酸序列并無聯(lián)系的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子可包括其它基因的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子、分離自任何其它原核、病毒或者真核細(xì)胞的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子以及非“天然存在的”啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子，即，該啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的不同元件，和/或可改變表達(dá)的突變。除合成產(chǎn)生啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子的核酸序列之外，這些序列還可以使用重組克隆和/或包括PCRTM在內(nèi)的核酸擴(kuò)增技術(shù)來產(chǎn)生，這些序列的產(chǎn)生與在此披露的組合物相聯(lián)系(見，美國(guó)專利4,683,202,美國(guó)專利5.928.906，在此均引為參考)。此外，應(yīng)當(dāng)考慮到引導(dǎo)諸如線粒體、葉綠體等的非核細(xì)胞器中序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的控制序列也可使用。
自然地，使用一種在被選用于表達(dá)的細(xì)胞型、細(xì)胞器和生物體中有效地引導(dǎo)該DNA片段表達(dá)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子是很重要的。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般了解用于蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和細(xì)胞類型組合的使用，例見Sambrook et al.，(1989)，在此引為參考。所使用的啟動(dòng)子可以是組成型、組織特異性、可誘導(dǎo)和/或在適當(dāng)條件下可用于引導(dǎo)被引入DNA片段的高水平表達(dá)，例如，該啟動(dòng)子有利于重組蛋白和/或肽的大規(guī)模生產(chǎn)。該啟動(dòng)子可以是異源的或者內(nèi)源的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子為一種合成的肌源啟動(dòng)子，如在Liet al.(1999)中的描述。
組織特異性啟動(dòng)子或元件的鑒定以及其活性的特征分析對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。這樣的區(qū)域包括人類LIMK2基因(Nomoto etal.，1999)、促生長(zhǎng)素抑制素受體2基因(Kraus et al.，1998)，鼠科動(dòng)物附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre et al.，1999)、人類CD4(Zhao-Emonet et al.，1998)、小鼠α2(XI)膠原蛋白(Tsumaki，et al.，1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee et al.，1997)、胰島素樣生長(zhǎng)因子II(Wu et al.，1997)、人類血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(Almendro et al.，1996)。
b.起始信號(hào)和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)編碼序列的有效翻譯可能需要一種特異的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子或者鄰近的序列?？赡苄枰峁┌ˋTG起始信號(hào)在內(nèi)的外源翻譯控制信號(hào)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠方便地決定這一點(diǎn)并且提供必要的信號(hào)。眾所周知該起始密碼子必須處于所需編碼序列讀框的“框架內(nèi)”以保證插入全部翻譯。該外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是天然或者合成的。表達(dá)的效果可以由適當(dāng)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件的引入所增強(qiáng)。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件的使用被用于產(chǎn)生多基因或者多順反子信息。IRES元件能夠省略5’甲基化加帽依賴的翻譯核糖體掃描模式，并且在內(nèi)部位點(diǎn)起始翻譯(Pelletier and Sonenberg，1988)。來自細(xì)小核糖核酸病毒家族的兩個(gè)成員(脊髓灰質(zhì)炎和腦心肌炎)的IRES元件已經(jīng)被描述(Pelletier and Sonenberg，1988)，被描述的還有一種來自哺乳動(dòng)物信息的IRES(Macejak and Sarnow，1991)。IRES可被連接于異源開放讀框。多開放讀框可被一起轉(zhuǎn)錄，各框架之間由一個(gè)IRES分隔，這產(chǎn)生了多順反子信息。由于IRES元件的優(yōu)點(diǎn)，各開放讀框可進(jìn)入核糖體以進(jìn)行有效的翻譯。使用單獨(dú)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可有效表達(dá)多基因以轉(zhuǎn)錄一種單獨(dú)的信號(hào)(見美國(guó)專利5,925,565，在此引為參考)。
c.多克隆位點(diǎn)載體可含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)，該位點(diǎn)為一種核酸區(qū)域，該區(qū)域含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，這些位點(diǎn)均可聯(lián)系標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)而用于消化載體。(見Carbonelli et al.，1999，Levenson et al.，1998以及Cocea，1997，在此引為參考。)“限制性酶消化”指的是以一種酶進(jìn)行的對(duì)一種核酸分子的催化切割，該酶僅作用于核酸分子中的特定位點(diǎn)。多種這樣的限制性酶可從商業(yè)上獲得。這種酶的使用為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所廣泛了解。通常情況下，載體是使用一種限制性酶進(jìn)行線性化或片段化的，其在MCS內(nèi)進(jìn)行切割以使外源序列能同該載體連接?！斑B接”指在兩個(gè)核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，這兩個(gè)片段彼此可能鄰近或者并不鄰近。涉及到限制性酶以及連接反應(yīng)的技術(shù)為重組技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
d.剪接位點(diǎn)多數(shù)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子經(jīng)過RNA剪接以從原始轉(zhuǎn)錄本中除去內(nèi)含子。含有基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點(diǎn)以確保用于蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的適當(dāng)加工。(見Chandler et al.，1997，在此引為參考。)e.多腺苷酸化信號(hào)在表達(dá)中，多聚腺苷酸化信號(hào)在典型情況下，包括一如有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本適當(dāng)多聚腺苷酸化的多聚腺苷酸化信號(hào)。多聚腺苷酸化信號(hào)的特性對(duì)于成功實(shí)踐本發(fā)明據(jù)信并不是決定性的，并且/或者任何這樣的序列均可被使用。優(yōu)選的實(shí)施方案包括SV40多聚腺苷酸化信號(hào)和/或牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)于在多種靶細(xì)胞中良好地發(fā)揮功能是方便和/或已經(jīng)為人所知的。轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)同樣被考慮為表達(dá)彈夾的一個(gè)元件。這些元件發(fā)揮作用以增強(qiáng)信息水平和/或通過從彈夾到其它序列中而使閱讀最小化。
f.復(fù)制起點(diǎn)為在一種宿主細(xì)胞中增殖一種載體，它可含有一個(gè)或者多個(gè)復(fù)制位點(diǎn)的起點(diǎn)(通常稱為“ori”)，該起點(diǎn)為一種特異的核酸序列，復(fù)制起始于該點(diǎn)?；蛘?，如果該宿主細(xì)胞為酵母，則使用一種自主復(fù)制序列(ARS)。
g.可選擇和可篩選的標(biāo)記在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述細(xì)胞含有本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)體，通過在表達(dá)載體中包含入標(biāo)記，而可在體內(nèi)或者體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒別。這樣的標(biāo)記可使細(xì)胞獲得一種可鑒別的變化，該變化使含有該表達(dá)載體的細(xì)胞可被容易地鑒別。通常情況下，可選擇的標(biāo)記為賦予允許選擇的特性的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記為該標(biāo)記的存在考慮到其選擇的標(biāo)記，而陰性可選擇標(biāo)記為該標(biāo)記的存在防止其選擇的標(biāo)記。陽性可選擇標(biāo)記的一個(gè)例子為藥物抗性標(biāo)記。
通常情況下藥物選擇標(biāo)記的引入方便了克隆和轉(zhuǎn)化體的鑒別，例如，導(dǎo)致對(duì)新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin以及組氨醇的抗性的基因?yàn)橛杏玫目蛇x擇標(biāo)記。除賦予某一基于條件的補(bǔ)充可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)化體辨別的表型的標(biāo)記外，包括諸如GFP這樣的可篩選標(biāo)記在內(nèi)的其它類型的標(biāo)記也在考慮的范圍內(nèi)，GFP標(biāo)記的基礎(chǔ)為比色分析。或者可以利用諸如肝炎單一病毒胸苷激酶(tk)或者氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)這樣的篩選酶。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解如何使用免疫學(xué)標(biāo)記，該標(biāo)記可能同F(xiàn)ACS分析聯(lián)合使用。所使用的標(biāo)記據(jù)信并不重要，只要該標(biāo)記能夠同編碼一種基因產(chǎn)物的核酸同步表達(dá)便可?？蛇x擇標(biāo)記和可篩選標(biāo)記的進(jìn)一步的例子為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
2.宿主細(xì)胞此處所使用的術(shù)語“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用。所有這些術(shù)語還包括其子代，這些子代為任意和全部的后代?？梢哉J(rèn)為全部子代由于人為或者自然的突變而可能不盡相同。在對(duì)異源核酸序列進(jìn)行表達(dá)的情況下，“宿主細(xì)胞”指的是一種原核或者真核細(xì)胞，該術(shù)語包括任何可轉(zhuǎn)化的生物體，該生物體能夠復(fù)制一種載體和/或表達(dá)載體所編碼的異源基因。宿主細(xì)胞可以并且已經(jīng)被用作為載體的受體。宿主細(xì)胞可以被“轉(zhuǎn)染”或者“轉(zhuǎn)化”，該術(shù)語指的是一種外源核酸被轉(zhuǎn)移或者引入該宿主細(xì)胞的過程。被轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括該原初主體細(xì)胞及其后代。
宿主細(xì)胞可以來自原核或者真核生物，這取決于所需的結(jié)果為該載體的復(fù)制還是部分或者全部載體編碼的核酸序列的表達(dá)。數(shù)目眾多的細(xì)胞系或者細(xì)胞培養(yǎng)物均可用作宿主細(xì)胞，它們可從American TypeCulture Collection(ATCC)中獲得，ATCC為一個(gè)組織，該組織作為活培養(yǎng)物和遺傳材料的檔案館而發(fā)揮作用(www.atcc.org)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)載體主鏈和所需的結(jié)果而決定適當(dāng)?shù)妮d體。例如，可向一種原核宿主細(xì)胞引入質(zhì)?；蛘哒沉?，以進(jìn)行多種載體的復(fù)制。被用作進(jìn)行載體復(fù)制和/或表達(dá)的宿主細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞包括DH5α、JM109和KC8，以及一批商業(yè)化的細(xì)菌宿主如SURE感受態(tài)細(xì)胞和SOLOPACKGold細(xì)胞(STRATAGENE，La Jolla)。在替代情況下，諸如大腸桿菌LE392這樣的細(xì)菌細(xì)胞可被用作噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。
用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的真核宿主細(xì)胞的例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。來自于各種細(xì)胞類型和生物體的多種宿主細(xì)胞可以獲得并且對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。在類似的情況下，病毒載體可同真核或者原核宿主細(xì)胞聯(lián)合使用，特別是允許該載體的復(fù)制或者表達(dá)的細(xì)胞。
一些載體可使用控制序列，該控制序列使其可以在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解培養(yǎng)上述所有宿主細(xì)胞以對(duì)其進(jìn)行維持并且使載體進(jìn)行復(fù)制的條件。應(yīng)當(dāng)被了解的還有進(jìn)行載體大規(guī)模生產(chǎn)以及載體所編碼的核酸以及其關(guān)聯(lián)多肽、蛋白質(zhì)或肽的生產(chǎn)工藝和條件。
3.表達(dá)系統(tǒng)存在多種含有部分或者全部上述組合物的表達(dá)系統(tǒng)?；谠撕?或真核的系統(tǒng)可被用于本發(fā)明以產(chǎn)生核酸序列或其關(guān)聯(lián)多肽、蛋白質(zhì)和肽。許多這樣的系統(tǒng)已經(jīng)商業(yè)化并且被廣泛應(yīng)用。
昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生異源核酸片段的高水平蛋白表達(dá)，例如在美國(guó)專利No.5,871,986，4,879,236中的描述，這兩者在此引為參考，并且該系統(tǒng)可購(gòu)自INVITROGEN，名為MAXBAC2.0以及CLONETECH，名為BACPACK。
表達(dá)系統(tǒng)的其它例子包括STRATAGENE的COMPLETE CONTROL誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)涉及到一種合成的蛻皮激素-誘導(dǎo)型受體，其它例子還包括其pET表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)為一種大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)例子來自INVITROGEN，該系統(tǒng)攜帶有T-REXTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)，該系統(tǒng)為一種哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子。INVITROGEN還提供了一種酵母表達(dá)系統(tǒng)，稱為Pichia methanolica表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)用于重組蛋白在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母Pichia methanolica中的高水平表達(dá)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解如何表達(dá)一種諸如表達(dá)結(jié)構(gòu)體這樣的載體，以產(chǎn)生核酸序列或及其關(guān)聯(lián)多肽、蛋白質(zhì)或肽。
誘變?cè)趹?yīng)用的情況下，誘變可通過多種標(biāo)準(zhǔn)誘變程序而完成。突變是一種過程，通過該過程在生物體的量或者結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生變化。突變可涉及到某種單一的基因、基因群或者整個(gè)染色體的核苷酸序列的修飾。單基因的變化可以是點(diǎn)突變的結(jié)果，該點(diǎn)突變涉及到一個(gè)DNA序列中的一個(gè)單一核苷酸堿基的刪除、添加或替換，或者單基因的變化可以是一些變化的結(jié)果，這些變化涉及到大量的核苷酸的插入或刪除。
突變可作為一些事件的結(jié)果而自發(fā)產(chǎn)生，這些事件如在DNA的復(fù)制中的保真性錯(cuò)誤或者可轉(zhuǎn)座遺傳因子(轉(zhuǎn)座子)在基因組中的移動(dòng)。突變還可通過暴露于化學(xué)或者物理誘變劑而被誘導(dǎo)。這樣的突變誘導(dǎo)劑包括離子化輻射、紫外線以及多種的化學(xué)品的組合，如烷基化試劑以及多環(huán)芳香族烴，所有這些均可直接或間接地(通常隨一些代謝的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行)同核酸相互作用。通過這樣的環(huán)境試劑所誘導(dǎo)的DNA損害在受影響的DNA被復(fù)制或者修復(fù)的情況下，可能導(dǎo)致堿基序列的修飾，并由此而導(dǎo)致突變。突變還可通過使用特定的靶向方法進(jìn)行定點(diǎn)。
定點(diǎn)誘變結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變?yōu)閷?duì)蛋白-配基相互作用進(jìn)行分析和改造的重要工具(Wells，1996，Braisted et al.，1996)。該技術(shù)通過向被選中的DNA中引入一種或者多種核苷酸序列變化而提供了序列變體的制備和測(cè)試。
位點(diǎn)特異性誘變使用特異性的寡核苷酸序列，該序列編碼所需的突變以及足量的毗鄰未修飾核苷酸的DNA序列。通過這一途徑提供了具有足以在所穿過的缺失接頭兩側(cè)形成雙鏈體的大小和復(fù)雜度的引物序列。長(zhǎng)約17到25個(gè)核苷酸的引物是優(yōu)選的，在該序列的接頭兩側(cè)約有5到10個(gè)殘基被變動(dòng)。
該工藝在典型的情況下使用噬菌體載體，該載體以單鏈和雙鏈形式存在。可用于定點(diǎn)誘變的載體包括諸如M13噬菌體這樣的載體。這些噬菌體載體可從商業(yè)上獲得并且其應(yīng)用一般為該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在常規(guī)情況下，雙鏈的質(zhì)粒也可用于定點(diǎn)誘變，這消除了將目的基因從噬菌體中轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒中的步驟。
通常情況下首先獲得一種單鏈的載體，或熔化一種雙鏈載體的兩條鏈，該載體的序列中包括編碼所需蛋白或者遺傳因子的DNA序列。經(jīng)合成制備的帶有所需突變序列的寡核苷酸引物隨即同該單鏈DNA制品進(jìn)行退火，選擇雜交條件時(shí)應(yīng)考慮到不匹配程度。對(duì)該雜交產(chǎn)物使用DNA聚合酶，如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)，以完成攜帶突變鏈的合成。由此而形成了一種異雙鏈體，其中一條鏈編碼原始的未突變序列，另一條鏈攜帶有所需的突變。該異雙鏈體載體隨后被用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞，選擇含有攜帶突變序列的重組載體的克隆。
功能性意義的綜合信息以及蛋白的一個(gè)給定殘基的信息內(nèi)容在最佳情況下可通過飽和突變獲得，在該突變中所有19個(gè)氨基酸替換均經(jīng)過測(cè)試。這一方法的缺點(diǎn)為多殘基飽和突變的后勤工作令人生畏(Warren et al.，1996；Brown et al.，1996；Zeng et al.，1996；Burton and Barbas，1994；Yelton et al.，1995；Jackson et al.，1995；Short et al.，1995；Wong et al.，1996；Hilton et al.，1996)。必須對(duì)成百甚至上千的位點(diǎn)特異性突變進(jìn)行研究。但是，經(jīng)過改進(jìn)的技術(shù)使突變體的產(chǎn)生和篩選更加直接?！皐alk-through”誘變的描述又見美國(guó)專利5,798,208和5,830,650。
定點(diǎn)誘變的其他方法披露于美國(guó)專利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,336,878；5,389,514；5,635,377以及5,789,166。
體外掃描誘變隨機(jī)誘變可使用錯(cuò)誤傾向PCR(error prone PCR)進(jìn)行引入(Cadwell and Joyce，1992)。誘變速度可通過在多個(gè)含模板溶液的試管中進(jìn)行PCR而提高。
一種特別有用的誘變工藝為丙氨酸掃描誘變，在該工藝中一批殘基被丙氨酸單獨(dú)地替換，以測(cè)定失去側(cè)鏈相互作用的影響，同時(shí)使蛋白構(gòu)象中大范圍干擾的危險(xiǎn)達(dá)到最小(Cunningham et al.，1989)。
在最近幾年，使用微量蛋白來測(cè)定配基結(jié)合的平衡常數(shù)的技術(shù)已被開發(fā)出來(Blackburn et al.，1991；美國(guó)專利5,221,605和5,238,808)。以少量材料進(jìn)行功能性分析的能力可被用于開發(fā)高效的，用于抗體飽和誘變的體外方法。本發(fā)明者通過將PCR誘變同體外轉(zhuǎn)錄/翻譯結(jié)合使用而省卻了克隆步驟，以進(jìn)行蛋白質(zhì)突變體的高通量生產(chǎn)。在此，PCR產(chǎn)物被直接用作進(jìn)行突變單鏈抗體體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的模板。由于該方法中產(chǎn)生并分析了所有19種氨基酸高效率的替換，在大量的目的殘基上進(jìn)行飽和誘變?nèi)缃癯蔀榭赡?，該過程可被描述作體外掃描飽和誘變(Burks et al.，1997)。
體外掃描飽和誘變提供了一種用于獲得大量結(jié)構(gòu)功能信息的快捷方法，這些信息包括(i)調(diào)控配基結(jié)合特異性的殘基的鑒別，(ii)配基結(jié)合的更好理解，其基于在一個(gè)給定位置上維系活性氨基酸和導(dǎo)致失去活性的氨基酸的鑒別，(iii)對(duì)活性位點(diǎn)或者蛋白亞結(jié)構(gòu)域的整體彈性的評(píng)估，(iv)對(duì)導(dǎo)致結(jié)合增強(qiáng)的氨基酸替換的鑒定。
劑量和配方本發(fā)明的組合物(活性組分；如SEQ ID NO1或者編碼該序列的核苷酸或者含有編碼SEQ ID NO1的核苷酸的載體)可經(jīng)制劑化并且進(jìn)行給藥以治療多種生長(zhǎng)缺陷狀態(tài)，該給藥通過任何可使活性成分與動(dòng)物體內(nèi)試劑作用位點(diǎn)相接觸的手段進(jìn)行。本發(fā)明的組合物被定義為一種含有編碼本發(fā)明化合物的核苷酸的載體，該化合物為一種此處所描述的氨基酸序列類似物。以足量的所述組合物進(jìn)行給藥以產(chǎn)生所述化合物的醫(yī)療有效量。技術(shù)人員了解，足量的載體被用于提供醫(yī)療有效水平的編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列表達(dá)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員了解，術(shù)語“經(jīng)過給藥”和“被引入”可互換使用。
該組合物可通過任何同藥物聯(lián)合使用的常規(guī)方法進(jìn)行給藥，在該藥中該組合物可作為單獨(dú)的醫(yī)療活性成分或者存在于多種醫(yī)療活性成分的組合中。這些組合物可被單獨(dú)進(jìn)行給藥，但在一般情況下同一種藥學(xué)載體一起進(jìn)行給藥，該載體基于所選給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐進(jìn)行選擇。這樣的藥學(xué)組合物可被用于人類或者獸醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)的醫(yī)療或者診斷目的。例如，它們可用于生長(zhǎng)相關(guān)失調(diào)的治療，如垂體功能減退性矮小和由于生長(zhǎng)激素產(chǎn)生異常所導(dǎo)致的糖尿病。進(jìn)一步，它們還可為肉類的生產(chǎn)而用于刺激動(dòng)物的生長(zhǎng)或者增強(qiáng)動(dòng)物的飼養(yǎng)效率，增強(qiáng)奶產(chǎn)量以及刺激蛋產(chǎn)量。
給藥的劑量應(yīng)為活性組分的醫(yī)療有效量，并且理所應(yīng)當(dāng)?shù)貞?yīng)根據(jù)已知的因素進(jìn)行改變，如特定活性成分的藥效特征及其給藥模式和路線；動(dòng)物的種類；受體的年齡；受體的性別；受體的健康情況；受體的體重；癥狀的性質(zhì)和程度；同時(shí)進(jìn)行治療的種類；治療的頻率；以及所需的效果。用于給藥的本發(fā)明載體的適當(dāng)劑量應(yīng)根據(jù)各個(gè)受治療者以及待治療的癥狀而略有變化。技術(shù)人員應(yīng)能夠根據(jù)已知的生長(zhǎng)激素循環(huán)水平，聯(lián)系正常的生長(zhǎng)以及該載體的生長(zhǎng)激素釋放活性來確定適當(dāng)?shù)膭┝?。正如該領(lǐng)域所已知，生長(zhǎng)相關(guān)失調(diào)的治療必須根據(jù)生長(zhǎng)激素產(chǎn)生的不足程度而在個(gè)體間加以變化。用以刺激牲畜中生長(zhǎng)活性的劑量應(yīng)明顯高于(每千克被治療者體重)用于在諸如人垂體性矮小這樣的生長(zhǎng)激素缺陷的情況下，恢復(fù)正常生長(zhǎng)的劑量。
由此，根據(jù)本發(fā)明提供了一種治療生長(zhǎng)相關(guān)失調(diào)的方法，該失調(diào)的特征在于生長(zhǎng)激素產(chǎn)生的缺乏，該方法包括以一定量的本發(fā)明的類似物進(jìn)行給藥，該量足以刺激生長(zhǎng)激素在正常生長(zhǎng)水平上的生產(chǎn)。在各個(gè)體中，生長(zhǎng)激素的水平變化很大，并且對(duì)于某一給定的個(gè)體，在一天期間，生長(zhǎng)激素的循環(huán)水平也有明顯變化。
所提供的還有一種通過以一定量的本發(fā)明的GHRH類似物進(jìn)行給藥來提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度的方法，該量足以刺激生長(zhǎng)激素在高于與正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平上生產(chǎn)。
基因療法給藥在適當(dāng)情況下，該基因治療載體可通過該領(lǐng)域已知的方法配制成為固體、半固體、液體或者氣體形式的制劑，用于它們各自途徑的給藥。該領(lǐng)域已知的方法可被用于在該組合物到達(dá)靶器官之前防止其釋放和吸收或用于確保該組合物的緩釋釋放。所應(yīng)用的應(yīng)為藥學(xué)上可接受的形式，該組合物不應(yīng)使本發(fā)明的組合物失效。在藥學(xué)劑量形式中，該組合物可單獨(dú)使用或同其它藥學(xué)活性化合物適當(dāng)聯(lián)合，組合使用。
因此，本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)過多種途徑被傳遞到動(dòng)物體內(nèi)的多種位點(diǎn)以獲得特定的效果(例見Rosenfeld et al.(1991)；Rosenfeldet al.(1991a)；Jaffe et al.，1992)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，盡管多種途徑可被用于給藥，一種特定的途徑與其他途徑相比，可提供更加直接并且更加有效的反應(yīng)。通過給藥可進(jìn)行局部或者全身的傳遞，該給藥包括制劑的應(yīng)用或者向體腔的滴注、氣溶膠的吸入或者吹入或者胃腸道外的引入，這包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜、皮下、真皮內(nèi)的引入，除此之外還有局部給藥。
該領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到不同的傳遞方法可被用于以一種載體向細(xì)胞進(jìn)行給藥。其例子包括(1)利用物理手段的方法，例如電穿孔(電學(xué))、基因槍(物理力)或者使用大體積的脂類(壓力)；(2)所述載體同另一種實(shí)體形成復(fù)合體的方法，該實(shí)體的例子如脂質(zhì)體或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子。
因此，本發(fā)明提供了一種將一種醫(yī)療基因轉(zhuǎn)移入一種宿主的方法，該方法包括以本發(fā)明的載體進(jìn)行給藥，該給藥過程使用任一種上述的給藥途徑或者該領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的適于某一特定的應(yīng)用的替代途徑進(jìn)行，在優(yōu)選的情況下該載體為一種組合物的一部分。根據(jù)本發(fā)明，載體至宿主細(xì)胞的有效基因轉(zhuǎn)移可以以療效的方式進(jìn)行監(jiān)測(cè)(例如，與被治療的特定疾病相關(guān)的一些癥狀的減輕)，或者，進(jìn)一步，可通過被轉(zhuǎn)移基因或者該基因在宿主中表達(dá)的證據(jù)來監(jiān)測(cè)(例如，使用與測(cè)序關(guān)聯(lián)的聚合酶鏈反應(yīng)、Northern或者Southern雜交或者轉(zhuǎn)錄分析來檢測(cè)宿主中的核酸，或者使用免疫印跡分析、抗體介導(dǎo)的檢測(cè)、mRNA或者蛋白質(zhì)半衰期研究或者具體化分析來檢測(cè)由被轉(zhuǎn)移核酸所編碼的蛋白質(zhì)或者多肽，或者由于該轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的水平或者功能上的影響)。
此處所描述的方法絕非面面俱到，并且對(duì)于普通的技術(shù)人員來說，適于具體應(yīng)用的其它方法是很明顯的。此外，可進(jìn)一步通過同已知的化合物進(jìn)行類比而估計(jì)出這些組合物的有效量來產(chǎn)生所需的效果。
進(jìn)一步，實(shí)際的劑量和用藥時(shí)間表可根據(jù)該組合物是否同其它藥物組合物進(jìn)行組合給藥，或根據(jù)個(gè)體間在藥動(dòng)學(xué)、藥性或者代謝上的差異來進(jìn)行變化。類似地，這些量在體外應(yīng)用中可根據(jù)使用的具體細(xì)胞系而變動(dòng)(例如，根據(jù)存在于細(xì)胞表面的載體受體的數(shù)量或者用于基因轉(zhuǎn)移的具體載體在該細(xì)胞系中復(fù)制的能力)。進(jìn)一步，被加入每個(gè)細(xì)胞中的載體量很可能應(yīng)隨著被插入該載體的醫(yī)療基因的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性，以及該序列的性質(zhì)而變化，并且該量為一種需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定的參數(shù)，并可由于一些非本發(fā)明方法所固有的參數(shù)而變化(例如，合成費(fèi)用)。該領(lǐng)域中的技術(shù)人員可很容易地根據(jù)具體情況的需要而進(jìn)行任何必要的調(diào)整。
以下的實(shí)施例通過例子的形式給出，并且并不期望以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1GHRH超活性類似物提高GH促分泌活性和穩(wěn)定性GHRH在人類(Frohman et al.，1984)以及豬的循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期相對(duì)較短，約為12分鐘。通過使用延長(zhǎng)其生物半衰期和/或提高其GH促分泌活性的GHRH類似物達(dá)到了對(duì)GH分泌的增強(qiáng)。通過定點(diǎn)誘變產(chǎn)生了GHRH突變體。Gly15為Ala15所替換以增加α-螺旋構(gòu)象以及兩親性結(jié)構(gòu)從而降低了胰蛋白酶樣酶對(duì)其的切割(Su et al.，1991)。具有Ala15替換的GHRH類似物對(duì)GHRH受體表現(xiàn)出4-5倍更強(qiáng)的親和性(Campell et al.，1991)。為降低Met氧化所造成的生物活性的損失，使用具有游離COOH未端分子約稍更穩(wěn)定形式(Kubiak et al.，1989)而進(jìn)行了以Met27和Ser28對(duì)Leu27和Asn28的替換。由此形成了命名為GHRH-15/27/28的三氨基酸替換突變體。二肽基肽酶IV為一種主要的血清GHRH降解酶(Walter et al.，1980；Martin et al.，1993)。通過獲取GHRH15/27/28并隨后以Ala2(GHRH-TI)替換Ile2或以Val2(GHRH-TV)替換，或通過以Tyr1和Ala2替換His1以及Val2(GHRH-HV(圖1A)；H1V2A15L27N28)而產(chǎn)生了二肽酶的不良底物。
實(shí)施例2DNA結(jié)構(gòu)體為檢測(cè)突變的豬GHRH cDNA序列的生物活性而對(duì)質(zhì)粒載體進(jìn)行了改造，該載體能夠通過一種新描述的合成肌肉啟動(dòng)子SPc5-12來控制骨骼肌特異基因的最高水平的表達(dá)，該啟動(dòng)子含有一種來自骨骼α-肌動(dòng)蛋白、多MEF-2位點(diǎn)、多MEF-1位點(diǎn)以及TEF-1結(jié)合位點(diǎn)的近血清效應(yīng)元件(Li et al.，1999)。通過該領(lǐng)域已知的方法向肌源GHRH表達(dá)載體引入一個(gè)228-bp的pGHRH片段，該片段編碼31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽以及完整的成熟豬GHRH肽(Tyr1-Gly40)和/或GHRH突變體，隨后為hGH cDNA的3’非翻譯區(qū)域。質(zhì)粒pSPc5-12在pSK-GHRH主鏈的SacI/BamHI位點(diǎn)(Draghia-Akli et al.，1997)中含有一個(gè)360bp的SPc5-12合成啟動(dòng)子的SacI/BamHI片段(Li et al.，1999)。
通過對(duì)人類GHRH cDNA(SEQ ID NO8)進(jìn)行定點(diǎn)突變而獲得了野生型和突變的豬GHRH cDNA，該突變使用試劑盒Altered Sites II在體外誘變系統(tǒng)中進(jìn)行(Promega；Madison，WI)。人類GHRH cDNA作為BamHI-HindIII片段被亞克隆入pALTER Promega載體的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)并根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行誘變。通過使用SEQ ID NO2的引物改變?nèi)祟惏被?4和38而從人類cDNA中獲得豬野生型cDNA5’-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGCAG-3’。
豬HV突變以SEQ ID NO3的引物制造5’-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3’。
豬15Ala突變以SEQ ID NO4的引物制造5’-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3’。
豬27Leu28Asn突變以SEQ ID NO5的引物制造5’-CTGCTCCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3’。
誘變之后所產(chǎn)生的克隆經(jīng)測(cè)序以確認(rèn)其正確性并且隨后通過該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法將其亞克隆入本實(shí)施例所描述的pSK-GHRH的BamHI/HindIII位點(diǎn)。
技術(shù)人員了解，其它的GHRH序列可代替SEQ ID NO8而被利用，這些序列包括來自Mus肌(SEQ ID NO9；GenBank登記號(hào)NM_010285)；Bos taurus(SEQ ID NO10；GenBank登記號(hào)AF168686或者SEQ ID NO11；GenBank登記號(hào)BTU29611)；Equus caballus(SEQ ID NO12；GenBank登記號(hào)AF097587)；Rattus norvegicus(SEQ ID NO13；GenBank登記號(hào)RNU10156)。
實(shí)施例3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在豬垂體前葉和雞原代成肌細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)均獲得了成功。然而，所有的圖展示了為豬垂體前葉培養(yǎng)物的數(shù)據(jù)。雞原代成肌細(xì)胞培養(yǎng)物如下獲得。采集雞胚組織，解剖外面的皮膚和軟骨并進(jìn)行機(jī)械分離。使細(xì)胞懸浮物通過干酪包布和拭鏡紙，并以1×108到2×108/100mm的密度鋪于塑料培養(yǎng)皿內(nèi)。懸浮物中存留的細(xì)胞群體以2×106到3×106個(gè)細(xì)胞/膠原包埋的100mm塑料皿的密度鋪平板并在37℃下，在5％CO2環(huán)境中保養(yǎng)。細(xì)胞隨后在轉(zhuǎn)染前以1.5×106/100mm平板的密度保溫24小時(shí)，培養(yǎng)在最低基本培養(yǎng)基(MEM)中進(jìn)行，該培養(yǎng)基補(bǔ)充以10％的熱失活馬血清(HIHS)、5％的雞胚抽提物(CEE)(Gibco BRL；Grand Island，NY)和慶大霉素。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見Draghia-Akli et al.，1997以及Bergsma et al.，1986。豬垂體前葉培養(yǎng)物基本根據(jù)描述獲得(Tanner et al.，1990)。簡(jiǎn)而言之，在酶解條件下解離垂體組織，鋪于塑料培養(yǎng)皿上足夠的時(shí)間使其附著。隨后漂洗細(xì)胞并在實(shí)驗(yàn)前暴露于培養(yǎng)基中。細(xì)節(jié)見Tanner et al.，(1990)。
每100mm平板以4mg質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺進(jìn)行。轉(zhuǎn)染之后，將培養(yǎng)基換成MEM以使細(xì)胞分化，該MEM含有2％HIHS以及2％CEE。分化后72小時(shí)收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。通過參照組平板的β-牛乳糖苷酶組織化學(xué)估測(cè)轉(zhuǎn)染效率為10％。收集前一天，將細(xì)胞在Hank’s平衡鹽溶液中(HBSS)進(jìn)行洗滌并將培養(yǎng)基換成0.1％牛血清白蛋白的MEM。條件化培養(yǎng)基的處理為，加入0.25體積的1％三氯乙酸和1mM苯甲磺酰氟，在-80℃下冷凍，凍干，在C-18Sep-柱中純化(Peninsula實(shí)驗(yàn)室，Belmont，CA)，再凍干并用于放射性免疫分析或者重懸浮于對(duì)原代豬垂體前葉培養(yǎng)物進(jìn)行條件化的培養(yǎng)基內(nèi)。
實(shí)施例4GHRH超活性類似物提高了GH促分泌活性和穩(wěn)定性按照實(shí)施例3以各種結(jié)構(gòu)體對(duì)骨骼成肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且對(duì)純化自條件化培養(yǎng)基細(xì)胞的GHRH部分進(jìn)行豬垂體前葉細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)激素分泌分析。如圖1B所示，24小時(shí)后收集并經(jīng)過豬特異性GH-放射免疫分析的培養(yǎng)基顯示，經(jīng)修飾的GHRH類型(GH15/27/28；GHRH-TI；GHRH-TV)相對(duì)于野生型pGHRH在GH分泌上適度地提高了20％到50％。四種突變體中只有一種，GHRH-HV，在GH促分泌活性上有較大的提高，其中DGH水平由基線值200ng/ml提高至1600ng/ml(圖1B)。
實(shí)施例5HV-GHRH分子的血漿培養(yǎng)從對(duì)照組的豬體內(nèi)收集混合豬血清并在-80℃下保存。通過肽合成制備化學(xué)合成的HV-GHRH。融化該豬血清并進(jìn)行離心，置于37℃下并進(jìn)行平衡。將GHRH突變體在100μg/ml的濃度下溶于血清樣品。加入GHRH突變體之后立即以及在15、30、60、120和240分鐘后取出1ml血漿并以1ml 1M的TFA進(jìn)行酸化。在C18親和SEP-Pak柱上對(duì)酸化的血漿進(jìn)行純化，將其凍干并以HPLC進(jìn)行分析，這些過程使用Walters600多系統(tǒng)傳遞系統(tǒng)、Walters智能樣品加工儀717型以及Walters分光檢測(cè)儀490(Walters Associates，Millipore Corp.，Milford，MA)。檢測(cè)在214nm下進(jìn)行。通過峰面積積分測(cè)量肽在這些時(shí)間點(diǎn)的降解百分比。
測(cè)定豬血漿中的野生型GHRH和類似物GHRH-HV的穩(wěn)定性，該測(cè)定通過對(duì)GHRH肽進(jìn)行培養(yǎng)，隨后進(jìn)行固相抽提以及HPLC分析而進(jìn)行。如圖1C中所示，在血漿中培養(yǎng)60分鐘后95％的野生型GHRH(1-44)NH2被降解。與之相比，對(duì)豬血清中GHRH的培養(yǎng)表明，至少75％的多肽在培養(yǎng)的4-6小時(shí)期間被保護(hù)不受酶的切割。由此，在相同的條件下，大部分的GHRH-HV保持完整，而野生型GHRH完全被降解，這表明GHRH-HV對(duì)血清蛋白酶的穩(wěn)定性有顯著的提高(圖1C)。
實(shí)施例6動(dòng)物研究三組閹豬被用于GHRH研究，每組包括5只3-4周大的雜種閹豬(Yorkshire，Landrace，Hampshire and Duroc)。這些動(dòng)物被單獨(dú)關(guān)養(yǎng)，可自由喝水并飼以其體重6％的食物(24％蛋白豬飼料，Producers Cooperative Association，Bryan，TX)。每隔一天在8:30AM對(duì)動(dòng)物們稱重，隨后加入飼料。動(dòng)物們的豢養(yǎng)根據(jù)NIH Guide，USDA和Animal Welfare Act指導(dǎo)原則進(jìn)行。
實(shí)施例7質(zhì)粒DNA在豬體內(nèi)的肌內(nèi)注射在PBS(pH7.4)中，將pSPc5-12-HV-GHRH、pSPc5-12-wt-GHRH和pSPc5-12bgal的不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒制備物稀釋至1mg/ml。這些動(dòng)物等同地被安排了這些處理的其中一種。以異氟烷對(duì)這些豬進(jìn)行麻醉(以濃度2-6％進(jìn)行誘導(dǎo)并且以濃度1-3％進(jìn)行維持)。通過外科程序植入頸部導(dǎo)管以在注射后的第3、7、14、21、28、45和65天從動(dòng)物體內(nèi)采血。當(dāng)麻醉時(shí)，將10mg的質(zhì)粒直接注射入豬的半肌腱。注射2分鐘后，將被注射肌肉至于卡鉗之間并進(jìn)行電穿孔，電穿孔使用的最佳條件為200V/cm，4次60毫秒的脈沖(Aihara et al.，1998)。注射65天后，處死動(dòng)物并且收集內(nèi)部器官和被注射的肌肉，對(duì)之稱重，在液氮中冷凍并保存于-80℃。尸體經(jīng)稱重和中子激活分析。測(cè)定其背部脂肪(back fat)。
實(shí)施例8pSPc-HV-GHRH的肌肉注射增加了豬的GHRH；兩個(gè)月后的GH和IGF-I血清水平對(duì)最佳的蛋白酶抗性pSPc-HV-GHRH載體促進(jìn)GHRH長(zhǎng)期表達(dá)和刺激GH和IGF-I分泌水平的能力進(jìn)行了測(cè)定。圖2A所示為pSPc-HV-GHRH、作為野生型參照的野生型結(jié)構(gòu)體pSP-wt-GHRH以及作為安慰劑參照組合成肌源啟動(dòng)子大腸桿菌β-牛乳糖苷酶表達(dá)載體pSP-bgal的簡(jiǎn)要圖譜。對(duì)3周大的公閹豬進(jìn)行麻醉，插入頸靜脈導(dǎo)管以在不對(duì)動(dòng)物造成不適的情況下采集血樣。將質(zhì)粒表達(dá)載體DNA(10mg的pGHRH-HV；pSP-GHRH；或者pSP-bgal的DNA)直接注射入半肌腱，隨后對(duì)其進(jìn)行電穿孔(見實(shí)施例7)。
實(shí)施例9豬GHRH、GH和IGF-I測(cè)定通過異源人類分析系統(tǒng)對(duì)豬的GHRH進(jìn)行了測(cè)量(Peninsula實(shí)驗(yàn)室，Belmont，CA)。該分析的敏感度為1pg/管。以特異的雙抗體程序RIA對(duì)血漿中的豬GH進(jìn)行了測(cè)定(賓夕法尼亞州立大學(xué))。該分析的敏感度為4pg/管。通過異源人類分析系統(tǒng)對(duì)豬的IGF-1進(jìn)行了測(cè)量(診斷系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室，Webster，TX)。使用微軟的Excel統(tǒng)計(jì)分析包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。圖中所示值為平均值±s.e.m.。具體的p值通過使用Students t test進(jìn)行比較而獲得。p＜0.05被設(shè)定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平。在以pSP-GHRH-HV進(jìn)行了半肌腱注射的豬體內(nèi)，GHRH水平在注射后7天有所增加(圖2B)，在14天比參照組水平高出150％(652.4±77pg/ml比419.6±13pg/ml)。60天后pSP-GHRH-HV表達(dá)活性達(dá)到穩(wěn)定，該水平約比注射安慰劑的參照值高出2-3倍。，經(jīng)過pSP-GHRH-HV注射的豬分泌的血清GHRH絕對(duì)值比經(jīng)安慰劑注射的參照值高出3倍(1426.49±10.47ng比266.84±25.45ng)(圖2C)，這些值根據(jù)第0天到第60天的體重增加而進(jìn)行過校正(血液體積占總體重的8％)。經(jīng)過野生型pSP-GHRH注射的動(dòng)物在進(jìn)行注射后45天，其GHRH水平僅開始表現(xiàn)出適度的增加，但在注射后60天增加了2倍(779.36ng)，該水平足以產(chǎn)生生物學(xué)效果，其中所述的注射在半肌腱中進(jìn)行。
幼體動(dòng)物具有很高水平的GH，該水平隨著年齡而逐漸降低。在注射后第7和第14天，血樣在24小時(shí)期間每15分鐘采集一次，對(duì)其進(jìn)行pGH水平分析，通過該水平推測(cè)pGH含量的總體變化。經(jīng)過pGHRH-HV注射的豬(圖2D)在注射后第7天(g變分HV＝+1.52，wt＝-0.73，比參照＝-3.2ng/ml)以及第14天(g變分HV＝+1.09，wt＝-4.42，比參照＝-6.88ng/ml)表現(xiàn)出GH含量明顯的提高。
GH系統(tǒng)水平提高的另一個(gè)跡象為IGF-I水平的提高。經(jīng)過pSP-GHRH-HV注射的豬血清IGF-I水平在注射后3天開始提高(圖2E)。在第21天，這些動(dòng)物的血清IGF-I水平平均提高了3倍，這一水平可維持60天以上(p＜0.03)。與之相比，經(jīng)野生型pSP-GHRH表達(dá)載體注射的豬在其循環(huán)IGF-1的水平上僅有40％的提高(p＝0.39)，如圖2E所示。
實(shí)施例10增強(qiáng)豬生長(zhǎng)的肌源GHRH表達(dá)載體在以肌源pSP-GHRH表達(dá)載體進(jìn)行肌內(nèi)注射后而被分泌入系統(tǒng)循環(huán)的豬GH在閹割的幼體公豬中增加了超過65天的生長(zhǎng)。還在體內(nèi)進(jìn)行了軀體組成的測(cè)定，該測(cè)定在注射后30和65天(光密度測(cè)定法，K40)或者在死后(器官，尸體、脂肪，直接解剖并隨后進(jìn)行中子激活)進(jìn)行。經(jīng)野生型pSP-GHRH注射的動(dòng)物比經(jīng)安慰劑注射的參照組平均重21.5％(37.125kg比29.375kg)，而經(jīng)pSP-GHRH-HV注射的豬比參照組平均重37.8％(41.775kg，p＝0.014)，如圖3A所示。與參照組相比，經(jīng)GHRH結(jié)構(gòu)體注射的豬的飼養(yǎng)效率也提高了20％(在pSP-GHRH-HV組，相對(duì)于每kg體重的增長(zhǎng)為0.267kg食物/日，在pSP-wt-GHRH組中該值為0.274kg，對(duì)比在經(jīng)pSP-bgal注射的豬中該值為0.334kg(圖3B))。通過光密度測(cè)定、K40鉀室(K40 potassiumchamber)和中子激活室(neutron activation chamber)進(jìn)行的軀體組成研究表明，在經(jīng)GHRH注射的動(dòng)物體內(nèi)所有身體組分均成比例地增加，沒有器官巨大、脂肪比例增加或者相關(guān)病理的跡象。圖3C所示為經(jīng)安慰劑注射的參照組豬和經(jīng)pSP-GHRH-HV注射的豬在45天后的照片。
表I所示的經(jīng)pSP-GHRH-HV注射的豬的代謝特征顯示了血清尿素水平的顯著減少，pSP-GHRH和pSP-GHRH-HV分別為(參照為9±0.9mg/dl，經(jīng)注射的豬為8.3±1mg/dl以及6.875±0.5mg/dl)(p＝0.006)，這表明了氨基酸代謝的降低。參照組和經(jīng)質(zhì)粒GHRH注射的豬血清葡萄糖水平接近(參照豬為99.2±4.8mg/dl，經(jīng)pSP-GHRH-HV注射的豬為104.8±6.9mg/dl而經(jīng)野生型pSP-GHRH注射的動(dòng)物為97.5±8mg/dl)(p＝0.263)。沒有發(fā)現(xiàn)其它的代謝變化。
表1經(jīng)GHRH注射的豬和參照體內(nèi)的代謝特征(值的單位為mg/ml)葡萄糖 尿素 肌酸酐 總蛋白參照 99.2±4.8 9±0.9 0.82±0.06 4.6±0.22pSP-wt-GHRH 97.5±8 8.3±1 0.83±0.056 4.76±0.35pSP-HV-GHRH 104.8±6.9 6.875±0.5 0.78±0.04 4.88±0.23實(shí)施例11以不同水平的pSP-HV-GHRH進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究pSP-HV-GHRH對(duì)于小豬生長(zhǎng)的影響，以pSP-HV-GHRH對(duì)出生后10天的幾組小豬進(jìn)行了注射(3mg，1mg，100μg)，每組由2只組成。如圖4所示，以100μg的質(zhì)粒進(jìn)行注射的組給出了最佳的生長(zhǎng)曲線，該組在50日齡后同參照組具有顯著的統(tǒng)計(jì)差異。以3mg質(zhì)粒進(jìn)行注射的組中的一只動(dòng)物產(chǎn)生了抗體并且表現(xiàn)明顯降低的生長(zhǎng)模式。
同樣，以所示的劑量的pSP-HV-GHRH對(duì)出生后10天的幾組小豬進(jìn)行了注射，每組由2只組成。IGF-I值在注射后10天開始提高，并且在注射后35天經(jīng)100μg質(zhì)粒注射的豬的IGF比參照組平均高出10.62倍。以1mg進(jìn)行注射的豬平均超出參照組7.94倍，以3mg進(jìn)行注射的豬平均比參照值高出1.16倍。
由此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，較低劑量的pSP-HV-GHRH被用于注射。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中使用了100μg(.1mg)的該質(zhì)粒。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，約200-300μg被用于注射。
實(shí)施例12以pSP-HV-GHRH進(jìn)行的年齡比較為最優(yōu)化用于進(jìn)行pSP-HV-GHRH注射的小豬的年齡，以2mg的pSP-HV-GHRH對(duì)幾組小豬進(jìn)行了注射，每組由2只組成。如圖6所示，在出生后14天接受注射的組給出了最佳的生長(zhǎng)曲線，該組與參照組相比在各時(shí)間點(diǎn)均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。出生后21天進(jìn)行注射的組產(chǎn)生了抗體并且表現(xiàn)明顯降低的生長(zhǎng)模式。如果治療的過早(即，＜約10-14日齡)有可能會(huì)有胰島素抗性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該治療在天然GH和IGF-I水平最低時(shí)最為有效(約10-14天大)，而在GHRH水平正常時(shí)其產(chǎn)生可能被抵消。
實(shí)施例13簡(jiǎn)述簡(jiǎn)而言之，注射的最佳時(shí)間點(diǎn)為出生后14天(在注射后40天比參照組平均重8磅(p＜0.04))。用于注射的優(yōu)選劑量為2-5ml體積中100μg質(zhì)粒(在注射后40天比參照組平均重6磅(p＜0.02))。母豬1(時(shí)間過程)和母豬3(劑量曲線)的后代的激素和生化常數(shù)正常(IGF-I、IGF-BP3、胰島素、尿素、葡萄糖、總蛋白、肌酸酐)并且與體重的增加相關(guān)，無不良副作用。來自前幾個(gè)實(shí)驗(yàn)的軀體組成研究表明，HV-GHRH決定了所有軀體組成的統(tǒng)一增加(軀體組成類似于參照組，但是更大)，而野生型GHRH決定了瘦肉的增加以及脂肪的減少。
在說明中提及的所有專利和出版物對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平是很明了的。所有的專利和出版物在此引為參考，如同各出版物個(gè)體被特別和單獨(dú)地表明被引為參考一樣。
引用的參考文獻(xiàn)美國(guó)專利文件美國(guó)專利No.5,847,066，發(fā)表于1998年12月8日，Coy et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,846,936，發(fā)表于1998年12月8日，F(xiàn)elix et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,792,747，發(fā)表于1998年8月11日，Schally et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,776,901，發(fā)表于1998年7月7日，Bowers et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,756,264，發(fā)表于1998年5月26日，Schwartz et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,696,089，發(fā)表于1997年12月9日，F(xiàn)elix et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,486,505，發(fā)表于1996年1月23日，Bowers et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,137,872，發(fā)表于1992年8月11日，Seely et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,084,442，發(fā)表于1992年1月28日，F(xiàn)elix et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,036,045，發(fā)表于1991年7月30日，Thorner et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.5,023,322，發(fā)表于1991年6月11日，Kovacs et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,839,344，發(fā)表于1989年6月13日，Bowers et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,410,512，發(fā)表于1983年10月18日，Bowers et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.RE33,699，發(fā)表于1991年9月24日，Drengler被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,833,166，發(fā)表于1989年5月23日，Grosvenor et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,228,158，發(fā)表于1980年10月14日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,228,156，發(fā)表于1980年10月14日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,226,857，發(fā)表于1980年10月7日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,224,316，發(fā)表于1980年9月23日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,223,021，發(fā)表于1980年9月16日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,223,020，發(fā)表于1980年9月16日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
美國(guó)專利No.4,223,019，發(fā)表于1980年9月16日，Momany et al.被列為發(fā)明者。
出版物Aihara，H.& Miyazaki，J.Nat.Biotechnol.16，867-87C(1998).Albanese，A.and R.Stanhope.1997.GH治療誘導(dǎo)了患有子宮內(nèi)生長(zhǎng)障礙的幼兒的Catch-up維持生長(zhǎng)7年的結(jié)果(GH treatment inducessustained catch-up growth in children with intrauterine growthretardation7-year results.)Horm.Res.48173-177.Allen，D.B.，A.C.Rundle，D.A.Graves，and S.L.Blethen.1997.用人生長(zhǎng)激素治療兒童白血病的危險(xiǎn)回顧與再分析(Risk of leukemia inchildren treated with human growth hormonereview andreanalysis.)J.Pediatr.131832-S36Azcona，C.，A.Albanese，P.Bareille，and R.Stanhope.1998.在患有子宮內(nèi)生長(zhǎng)障礙/R-S綜合征的生長(zhǎng)激素充足和不足的幼兒體內(nèi)的生長(zhǎng)激素治療。(Growth hormone treatment in growthhormone-sufficient and -insufficient children withintrauterine growth retardation/Rnssell-Silver syndrome.)Horm.Res.5022-27.
Bartke，A.1998.Growth hormone and aging.Endocrine 8103-108.
Benfield，M.R.and E.C.Kohaut.1997.生長(zhǎng)激素在經(jīng)腎移植的幼兒中是安全的(Growth hormone is safe in children after renaltransplantation.)J.Pediatr.131S28-S31Bercu，B.B.，R.F.Walker.1997.在生長(zhǎng)情況不同的幼兒體內(nèi)的生長(zhǎng)激素促分泌物(Growth hormone secretagogues in children withaltered growth.)Acta Paediatrica 86102-106.
Bergsma，D.J.，Grichnik，J.M.，Gossett，L.M.& Schwartz，R.J.Mol.Cell.Biol.6，2462-2475(1986).
Blethen，S.L.and A.C.Rundle.1996.用生長(zhǎng)激素治療幼兒滑動(dòng)的重要大腿松果體(Slipped capital femoral epiphysis in childrentreated with growth hormone.A summary of the NationalCooperative Growth Study experience.)Horm.Res.46113-116.
Campbell，R.M.，Y.Lee，J.Rivier，E.P.Heimer，A.M.Felix，andT.F.Mowles.1991.GRF類似物和片段受體結(jié)合、活性和結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。
(GRF analogs and fragmentscorrelation between receptor binding，activity and structure.)Peptides 12569-574.
Corpas，E.，S.M.Harman，and M.R.Blackman.1993.人類生長(zhǎng)激素和人類成熟衰老(Human growth hormone and human aging.)Endocrine Reviews 1420-39.
Corpas，E.，S.M.Harman，M.A.Pineyro，R.Roberson，and M.R.Blackman.1993.生長(zhǎng)激素(GH)釋放激素1-14的連續(xù)14天皮下滴注在老年人體內(nèi)增加了GH和胰島素樣生長(zhǎng)因子-I水平。(Continuous subcutaneous infusions of growth hormone(GH)releasing hormone 1-44 for14 days increase GH and insulin-like growth factor-I levels in old men.)Journal ofClinical Endocrinology & Metabolism 76134-138.
Davis，H.L.，Whalen，R.G.& Demeneix，B.A.Hum.Gene Ther.4，151-159(1993).
D′Costa，A.P.，R.L.Ingram，J.E.Lenham，and W.E.Sonntag.1993.在正常成熟衰老過程中的生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子1的調(diào)節(jié)和作用機(jī)制。(The regulation andmechanisms of action of growth hormone and insulin-like growth factor 1 during normal aging.)J.Reprod.Fert.-Supp.4687-98.
Draghia-Akli，R.，Li，X.G.，Schwartz，R.J.，et al.Nat.Biotechnol.15，1285-1289(1997).Eicher，E.M.and W.G.Beamer.1976.小鼠遺傳的發(fā)育不全矮小癥。染色體6上很少突變的特性。(Inherited ateliotic dwarfism in mice.Characteristics of the mutation，little，on chromosome 6.)J.Hered.6787-91.
Erling，A.1999.幼兒的健康相關(guān)生命質(zhì)量的評(píng)估方法學(xué)考慮(Methodological considerations in the assessment of health-related quality of life inchildren.)Acta Paediatrica Scandin.-Supp.428106-107.0803-5326.
Esch，F(xiàn).S.，P.Bohlen，N.C.Ling，P.E.Brazeau，W.B.Wehrenberg，M.O.Thorner，M.J.Cronin，and R.Guillemin.1982.來自人類胰腺腫瘤的具有生長(zhǎng)激素釋放活性的40殘基肽的性質(zhì)鑒定。(Characterization of a 40 residue peptide from a humanpancreatic tumor with growth hormone releasing activity.)Biochemical & BiophysicalResearch Communications 109152-158.
Frohman，M.A.，T.R.Downs，P.Chomczynski，and L.A.Frohman.1989.小鼠生長(zhǎng)激素釋放激素(GRH)的互補(bǔ)DNA的克隆和鑒定生長(zhǎng)激素缺乏的lit/lit小鼠體內(nèi)的提高的GRH信使RNA水平(Cloning and characterization ofmouse growth hormone-releasing hormone(GRH)complementary DNAincreased GRH messenger RNA levels in the growth hormone-deficient lit/lit mouse.)Mol.Endocrinol.31529-1536.
Frohman，L.A.，J.L.Thominet，C.B.Webb，M.L.Vance.，H.Uderman，J.Rivier，W.Vale，and M.O.Thomer.1984.男性體內(nèi)的人類胰腺腫瘤生長(zhǎng)激素釋放因子的代謝清除和血漿內(nèi)的消失(Metabolicclearance and plasma disappearance rates of human pancreatictumor growth hormone releasing factor in man.)J.Clin.Invest.731304-1311.
Gesundheit，N.and J.K.Alexander.1995.以重組激素和生長(zhǎng)因子進(jìn)行的內(nèi)分泌治療(Endocrine Therapy with Recombinant Hormonesand Growth Factors.)In Molecular EndocrinologyBasic Conceptsand Clinical Correlations.B.D.Weintraub，editor.RavenPress，Ltd，，New York.491-507.
Heptulla，R.A.，S.D.Boulware，S.Caprio，D.Silver，R.S.Sherwin，and W.V.Tamborlane.1997.在具有矮小身材的兒童進(jìn)行激素治療后的胰島素敏感度的降低和代償性的胰島素過量(Decreasedinsulin sensitivity and compensatory hyperinsulinemia afterhormone treatment in children with short stature.)J.Clin.Endocrinol.Metab.823234-3238.
Iranmanesh，A.，G.Lizarralde，and J.D.Veldhuis.1991.年齡和相對(duì)的多脂肪為生長(zhǎng)激素分泌爆發(fā)頻率和幅度以及健康人的內(nèi)源GH半衰期的負(fù)因子(Age and relative adiposity are specific negativedeterminants of the frequency and amplitude of growth hormone(GH)secretory bursts and the half-life of endogenous GH inhealthy men.)Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism731081-1088.
Jacobs，P.A.，P.R.Betts，A.E.Cockwell，J.A.Crolla，M，J.Mackenzie，D.O.Robinson，and S.A.Youings.1990.一系列患有特納綜合癥的患者的細(xì)胞遺傳和分子再評(píng)測(cè)(A cytogenetic andmolecular reappraisal of a series of patients with Turner′ssyndrome.)Ann.Hum.Genet.54209-223.
Jaffe，H.A.，C.Danel，G.Longenecker，M.Metzger，Y.Setoguchi，M.A.Rosenfeld，T.W.Gant，S.S.Thorgeirsson，L.D.Stratford-Perricaudet，M.Perricaudet，A.Pavirani，J.-P.Lecocq and R.G.Crystal.1992.腺病毒介導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和在正常大鼠肝臟中的表達(dá)(Adenovirus-mediated in vivo gene transferand expression in normal rat liver.)Nat Genet 1(5)372-8.
Key，L.L.J.and A.J.Gross.1996.患有軟骨發(fā)育不全的兒童的對(duì)生長(zhǎng)激素的反應(yīng)。(Response to growth hormone in children withchondrodysplasia.)J.Pediatr.128S14-S17Kubiak，T.M.，C.R.Kelly，and L.F.Krabill.1989.牛和豬血清中的一種牛生長(zhǎng)激素釋放因子類似物L(fēng)eu27-bGRF(1-29)NH2的體內(nèi)代謝降解。同血漿二肽酰肽酶活性的相關(guān)性。(In vitro metabolicdegradation of a bevine growth hormone-releasing factor analogLeu27-bGRF(1-29)NH2 in bovine and porcine plasma.Correlationwith plasma dipeptidylpeptidase activity.)Drug Metabolism &Disposition 17393-397.
Li，X.，Eastman，E.M.，Schwartz，R.J.，& Draghia-Akli，R.Nat.Biotechnol.17.3，241-245(1999).
Martin，R.A.，D.L.Cleary，D.M.Guido，H.A.Zurcher-Neely，andT.M.Kubiak.1993.
來自豬腎的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)切割在2位上經(jīng)Scr，Thr或Val修飾的牛生長(zhǎng)激素釋放因子(bGRF)的類似物。是否為DPP-IV的擴(kuò)展的底物特異性。(Dipeptidyl peptidase IV(DPP-IV)from pig kidneycleaves analogs of bovine growth hormone-releasing factor(bGRF)modified at position 2 with Ser，Thr or Val.Extended DPP-IVsubstrate specificity？)Biochimica et Biophysica Acta1164252-260.
Monti，L.D.，P.Brambilla，A.Caumo，F(xiàn).Magni，S.Omati，G.Nizzoli，B.di Natale，M.Galli-Kienle，C.Cobelli，G.Chiumello，and G.Pozza.1997.在患有特納綜合癥的女孩中進(jìn)行生長(zhǎng)激素治療后的葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)和胰島素清除(Glucose turnover and insulin clearanceafter growth hormone treatment in girls with Turner′ssyndrome.)Metabolism 461482-1488.
Muramatsu，T.，Nakamura，A.& Park，H.M.Int.J.Mol.Med.1，55-62(1998).
Parks，J.S.，R.W.Pfaffle，M.R.Brown，H.Abdul-Latif，and L.R.Meacham.1995.
生長(zhǎng)激素缺陷(Growth Hormone Deficiency.)In MolecularEndocrinologyBasic Concepts and Clinical Correlations.B.D.Weintraub，editor.Raven Press，Ltd.，New York.473-490.
Rosenbaum，P.L.and S.Saigal.1996.對(duì)兒童的健康相關(guān)生命質(zhì)量的測(cè)量概念性問題(Measuring health-related quality of life inpediatric populationsconceptual issues.)In Quality of lifeand pharmacoeconomics in clinical trials.B.Spilker，editor.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia.
Rosenfeld，M.A.，K Yoshimura，L.E.Stier，B.C.Trapnell，L.D.Stratford-Perricaudet，M.Perricaudet，W.Dalemans，S.Jallat，A.Mercenier，A.Pavirani，J.P.Lecocq，W.B.Guggino，R.G.Crystal.1991.人類囊性纖維化基因向呼吸道上皮組織的體內(nèi)轉(zhuǎn)移(Invivo transfer of the human cystic fibrosis gene to therespiratory epithelium.)Clinical Research 39(2)，311A.
Rosenfeld，M.A.，W Siegfried，K Yoshimura，K Yoneyama，MFukayama，LE Stier，PK Paakko，P Gilardi，LD Stratford-Perricaudet，M Perricaudet，S.Jallat，A.Pavirani，J.P.Lecocq；and R.G.Crystal.1991.重組外抗胰蛋白酶基因向肺上皮組織的腺病毒介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)移(Adenovirus-mediated transfer of a recombinantalpha 1-antitryps in gene to the lung epithelium in vivo.)Science252(5004)431-4.
Savage，M.O.，R.M.Beattie，C.Camacho-Hubner，J.A.Walker-Smith，and I.R.Sanderson.1999.克羅恩氏病中的生長(zhǎng)(Growth inCrohn′s disease.)Acta Paediatrica Scandin-Supp，42889-92.
Scanlon，M.F.，B.G.Issa，and C.Dieguez.1996.生長(zhǎng)激素分泌的調(diào)節(jié)(Regulation of Growth Hormone Secretion.)HormoneResearch 46149-154.
Shalet，S.M.，B.M.Brennan，and R.E.Reddingius.1997.生長(zhǎng)激素治療和惡性腫瘤(Growth hormone therapy and malignancy.)Horm.Res.48 Suppl 429-3229-32.
Skuse，D.H.，K.Elgar，and E.Morris.1999.特納綜合癥的生命質(zhì)量涉及到染色體組成遺傳學(xué)咨詢和操控的伏筆(Quality of life inTurner syndrome is related to chromosomal constitutionimplication for genetic counseling and management.)ActaPaediatrica Scandin.-Supp.428110-113.
Sohmiya，M.，K.Ishikawa，and Y.Kato.1998.在患有慢性腎性能不全的貧血患者中，持續(xù)用重組人GH皮下滴注可刺激促以細(xì)胞生成素的分泌(Stimulation of erythropoietin secretion by continuoussubcutaneous infusion of recombinant human GH in anemic patientswith chronic renal failure.)Eur.J.Endocrinol.138302-306.
Su，C.M.，L.R.Jensen，E.P.Heimer，A.M.Felix，Y.C.Pan，andT.F.Mowles.1991.豬血清中的生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)類似物的體外穩(wěn)定性(In vitro stability of growth hormone releasing factor(GRF)analogs in porcine plasma.)Hormone & Metabolic Research2315-21.
Tanaka，H.，T.Kubo，T.Yamate，T.Ono，S.Kanzaki，and Y.Seino.1998.生長(zhǎng)激素治療對(duì)患有軟骨發(fā)育不全的兒童的影響生長(zhǎng)模式，下丘腦垂體功能和基因型(Effect of growth hormone therapy inchildren with achondroplasiagrowth pattern，hypothalamic-pituitary function，and genotype.)Eur.J.Endocrinol.138275-280.
Tanner，J.W.，Davis，S.K.，McArthur，N.H.，F(xiàn)rench，J.T.& Welsh，T.H.，Jr.J.Endocrinol.125，109-115(1990).
Thorner，M.O.，L.A.Frohman，D.A.Leong，J.Thominet，T.Downs，P.Hellmann，J.Chitwood，J.M.Vaughan，and W.Vale.1984.外下丘腦生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)分泌是肢端肥大癥的一個(gè)罕見病因177名患者中的血漿GRF水平(Extrahypothalamic growth-hormone-releasing factor(GRF)secretion is a rare cause of acromegalyplasma GRF levels in 177 acromegalic patients.)Journal ofClinical Endocrinology & Metabolism 59846-849.Tripathy，S.K.，Svensson，E.C.，Black，H.B.，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10876-10880(1996).
Walter，R.，W.H.Simmons，and T.Yoshimoto.1980.脯氨酸特異的內(nèi)肽酶和外肽酶(Proline specific endo-and exopeptidases.)Mol.Cell Biochem.30111-127.
Watkins，S.L.1996.攝入生長(zhǎng)激素的患者中的骨骼疫病(Bone diseasein patients receiving growth hormone.)Kidney Int.Suppl.53S126-7S126-S127本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)很容易地贊同本專利發(fā)明很適合于達(dá)成目標(biāo)并獲得所提及的本文的內(nèi)在目的和利益。本文所述的生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放激素、類似物、質(zhì)粒、載體、藥物組合物、治療、方法、程序以及工藝在此代表了優(yōu)選的實(shí)施方案，它們意在示例而非對(duì)范圍進(jìn)行限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能想到對(duì)本文的變化和其它應(yīng)用，這些變化或者應(yīng)用包含于本發(fā)明的精神之內(nèi)或者由附上的權(quán)利要求所定義。
序列表SEQUENCE LISTING<110>Schwartz，RobertDraghia-Akli，Ruxandra<120>超活性的豬生長(zhǎng)激素釋放激素類似物<130>P01857CN0/09902845<140>PCT/US00/20127<141>2000-07-24<150>US 60/145,624<151>1999-07-26<160>13<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>40<212>PRT
<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(40)<223>合成的<400>1His Val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly20 25 30Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala35 40<210>2<211>48<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(48)<223>合成的
<400>2aggcagcagg gagagaggaa ccaagagcaa ggagcataat gactgcag 48<210>3<211>42<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(42)<223>合成的<400>3accctcagga tgcggcggca cgtagatgcc atcttcacca ac42<210>4<211>27<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>合成的<400>4cggaaggtgc tggcccagct gtccgcc 27<210>5<211>37<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(37)<223>合成的<400>5ctgctcccag gacatcctga acaggcagca gggagag 37<210>6<211>358<212>DNA
<213>啟動(dòng)子<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(358)<223>合成的<400>6gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgcct tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg60gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag120caggtgttgg cgctttaaaa ataactcccg ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg180acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc240ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg300ccggcggcgg cccacgagct acccggagga gcgggaggcg ccaagctcta gaactagt 358<210>7<211>649<212>DNA<213>3’UTR<220>
<221>3’UTR
<222>(1)..(649)<223>Homo sapiens<400>7atcggggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac60tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt120gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa180gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc240ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga300gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag360acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc420accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct480tctgatttta aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata ggctacctgc540catggcccaa ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg600gtccactcag tagatgcctg ttgaattcaa gcttatcgat accgtcgac649<210>8<211>262<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(262)<223>Homo Sapiens<400>8atggtgctct gggtgttctt ctttgtgatc ctcaccctca gcaacagctc ccactgctcc60ccacctcccc ctttgaccct caggatgcgg cggtatgcag atgccatctt caccaacagc120taccggaagg tgctgggcca gctgtccgcc cgcaagctgc tccaggacat catgagcagg180cagcagggag agagcaacca agagcgagga gcgaggagca agggcacggc tttaatgact240gcaggaattc gatatcaagc tt 262<210>9<211>632<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(632)<223>Mus肌
<400>9acccttatct ttccatcatt tctttttcta acagcaaaga tcacaatgac agaagtgaat60gatcagaatg taaaaatatt tgtgcaaaat tgcattaact gttctcacca tctaatcggg120gtacaacctc aaacacaacg gccataatga agaaaagcta cactggaagt tctagatgtc180atctggctcc cacaacatca cagagtccca cccaggagtg aaggatgctg ctctgggtgc240tctttgtgat cctcatcctc accagtggct cccactgctc actgcccccc tcacctccct300tcaggatgca gcgacacgta gatgccatct tcaccaccaa ctacaggaaa ctcctgagcc360agctgtatgc ccggaaagtg atccaggaca tcatgaacaa gcaaggggag aggatccagg420aacaaagggc caggctcagc cgccaggaag acagcatgtg gacagaggac aagcagatga480ccctggagag catcttgcag ggattcccaa ggatgaagcc ttcagcggac gcttgagccc540cccgagcccc aaacacaact gtaccctgtt acttctgctt cagctctgac cttttccgtc600ctctgtaaat acaataaaac ccccattctc at 632<210>10<211>391<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(391)<223>Bos taurus
<400>10ctcaccctca gcagcggctc ccacggttcc ctgccttccc agcctctcag gtaagcagtt60ctgagaagag aagcaagaga ggccctttga ggatgcagac tcgagctggt ccccagctgg120gtcctcaggc agcctccctt gctcatctct gggagggtgg cagactgagc cccagagagg180tcaccaccca gccctggttc cagccctctc tggggacgag cagggcaaga ggcgacagaa240agacctcaca gagaccaagt gagcacagtc ccctgggcct cccaccccac cctttgacct300ctgactcctt ctactaggat tccacggtac gcagatgcca tcttcactaa cagctaccgg360aaggttctgg gccagctgtc tgcccgcaac t 391<210>11<211>392<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(392)<223>Bos taurus<400>11ctcaccctca gcagcggctc ccacgggttc cctgccttcc caagcctctc aggtaagcag60ttctgagaag agaagcaaga gaggcccttt gaggatgcga ctcgagctgg tccccagctg120
ggtcctcagg cagcctccct tgctcatctc tgggagggtg gcagactgag ccccagagag180gtcaccaccc agccctggtt ccagccctct ctggggacga gcagggcaag aggcgacaga240aagacctcac agagaccaag tgagcacagt cccctgggcc tcccacccca ccctttgacc300tctgactcct tctactagga ttccacggta cgcagatgcc atcttcacta acagctaccg360gaaggttctg ggccagctgt ctgcccgcaa ct 392<210>12<211>88<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(88)<223>Equus caballus<400>12atgcagatgc catcttcacc aacaactacc ggaaggtgct gggccagctc tctgcccgca60agatcctcca ggacatcatg agcaggca 88<210>13<211>511
<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(511)<223>Rattus norvegicus<400>13ctgcggatgc cacggaacat cgagccaaat cccaggaaca cgctctgaac cccaggagct60gcacaccact ctattaggtc ccgcccagga gtgaaggatg ccactctggg tgttctttgt120gctcctcacc ctcaccagtg gctcccactg ctcactgccc ccctcacctc ccttcagggt180gcggcggcat gcagacgcca tcttcaccag cagctaccgg agaatcctgg gccaattata240tgcccgcaaa ctgctgcacg aaatcatgaa caggcagcaa ggggagagga accaggaaca300aagatccagg ttcaaccgcc atttggacag agtgtgggca gaggacaagc agatggccct360ggagagcatc ttgcagggat tcccaaggat gaagctttca gcggaggctt gagccctcgg420cccccaaaca tagctggacc ctgttacttc tacttcagtt ctgatcttct ccttcctctg480tgaatacaat aaagacccag ttctcatctg c 51權(quán)利要求
1.組合物形式的具有SEQ ID NO1氨基酸序列的生長(zhǎng)激素釋放激素。
2.一種藥物組合物，該組合物用于刺激動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的釋放，該組合物在一種藥學(xué)可接受的載體內(nèi)含有權(quán)利要求1的生長(zhǎng)激素釋放激素。
3.組合物形式的一種核苷酸序列，該序列編碼具有SEQ ID NO1氨基酸序列的生長(zhǎng)激素釋放激素。
4.一種載體，該載體含有一種啟動(dòng)子；一種編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一種3’非翻譯區(qū)，它們?yōu)楣δ苄缘谋磉_(dá)而可操作地連接。
5.權(quán)利要求4的載體，其所述的載體為一種合成的肌源啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求4的載體，其所述的3’非翻譯區(qū)為hGH的3’非翻譯區(qū)。
7.增加動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的方法，該方法包括向所述的動(dòng)物引入一種治療有效量的權(quán)利要求4的載體的步驟。
8.在一種動(dòng)物體內(nèi)治療與生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)聯(lián)的生長(zhǎng)激素相關(guān)的缺陷疾病的方法，該方法包括向所述動(dòng)物引入一種治療有效量的權(quán)利要求4載體的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其所述的缺陷疾病為所述動(dòng)物體內(nèi)遺傳材料的變化的結(jié)果。
10.用于改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的方法，該方法包括引入一種治療有效量的權(quán)利要求4載體的步驟。
11.提高動(dòng)物效率的方法，該方法包括引入一種治療有效量的權(quán)利要求4載體的步驟。
12.治療動(dòng)物消瘦癥狀的方法，其所述的消瘦癥狀同燒傷、外傷、AIDS或者其它消耗性疾病相關(guān)聯(lián)，該方法包括引入一種治療有效量的權(quán)利要求4載體的步驟。
13.增強(qiáng)動(dòng)物生長(zhǎng)的方法，該方法包括引入一種治療有效量的權(quán)利要求4載體的步驟。
14.治療與生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)聯(lián)的生長(zhǎng)激素相關(guān)的缺陷疾病的方法，該方法包括引入一種治療有效量的權(quán)利要求4載體的步驟。
15.權(quán)利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中該動(dòng)物選自人類、寵物動(dòng)物、食用動(dòng)物以及勞作動(dòng)物。
16.權(quán)利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中所述的載體被引入到一種肌源細(xì)胞中。
17.權(quán)利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中所述載體被引入到所述動(dòng)物的肌肉組織中。
18.權(quán)利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中所述的載體被在單次給藥中引入到所述動(dòng)物中。
19.權(quán)利要求4的載體，其所述的載體選自質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體以及陽離子脂類。
20.一種治療動(dòng)物中與生長(zhǎng)激素途徑相關(guān)聯(lián)的生長(zhǎng)激素相關(guān)的缺陷疾病的方法，該方法包括向動(dòng)物體內(nèi)引入一種治療有效量的載體的步驟，所述的載體含有一種合成的肌源啟動(dòng)子；編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及hGH的3’非翻譯區(qū)，它們?yōu)楣δ苄缘谋磉_(dá)而可操作地連接。
21.一種方法，該方法可在動(dòng)物體內(nèi)刺激生長(zhǎng)激素在高于于正常生長(zhǎng)相關(guān)的水平上產(chǎn)生，所述的方法包括向所述動(dòng)物體內(nèi)引入一種治療有效量的的載體的步驟，所述的載體含有一種合成的肌源啟動(dòng)子；編碼SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及hGH的3’非翻譯區(qū)，它們?yōu)楣δ苄缘谋磉_(dá)而可操作地連接。
全文摘要
由生長(zhǎng)激素(GR)，生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)缺乏所導(dǎo)致的不充分生長(zhǎng)，或遺傳疾病可通過利用新GHRH類似物的重組蛋白療法加以改善，其中的GHRH類似物具有(SEQ ID NO1的)序列。還包括(1)一種治療與生長(zhǎng)激素途徑有關(guān)的生長(zhǎng)激素相關(guān)缺陷疾病的方法；(2)一種治療與遺傳疾病有關(guān)的生長(zhǎng)激素相關(guān)缺陷疾病的方法；(3)一種改善動(dòng)物生長(zhǎng)表現(xiàn)的方法；(4)一種治療具有生長(zhǎng)缺陷疾病的動(dòng)物的方法；(5)一種增加用于食用的動(dòng)物效率的方法；和(6)一種提高動(dòng)物生長(zhǎng)的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1635898SQ00813372
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2000年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月26日
發(fā)明者R·J·施瓦茨, R·德拉希爾－阿克利 申請(qǐng)人:貝勒醫(yī)學(xué)院