專利名稱：對流體進行生物修飾的裝置及方法
背景技術：
本發(fā)明涉及一種對流體進行生物修飾裝置和方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種可補充、增加或替代器官功能的一種人工裝置。在特定情況下，該人工裝置含有肝微器官培養(yǎng)體。在更特定的情況下，該人工裝置含有一種可存活的腎微器官組件。在更特定的情況下，該人工裝置含有常用于血液透析的一種透析部件。腎微器官培養(yǎng)體與透析部件一同可作為腎臟代用品來發(fā)揮生理學作用。
此外，本發(fā)明還涉及一種裝置和方法，通過使用同時含有肝微器官培養(yǎng)體和腎微器官培養(yǎng)體的單個人工裝置來補充、增加或替代肝與腎的功能。
此外，本發(fā)明還涉及一種裝置和方法，通過使用含有比率約為6∶1地肝微器官培養(yǎng)體及腎微器官培養(yǎng)體的單個人工裝置來補充、增加或替代肝與腎的功能。
此外，本發(fā)明還涉及一種含有肝與腎的組合微器官培養(yǎng)體以及一種透析部件的人工裝置。
此外，本發(fā)明還涉及一種制備可存活組織的方法，該組織無需進行前期培養(yǎng)即可保存在人工裝置中，用于補充、增加或替代器官的功能，也可在此后移植到宿主內。
有多種體內器官，如肝臟和腎臟，可對血液等體液進行修飾。腎臟是一種多功能器官，它能夠以尿素形式排泄含氮廢物、排泄過量的無機鹽，并能夠主動分泌促紅細胞生成素和其它物質，例如，但不局限于，凝乳酶和組織纖維蛋白溶酶原激活質。肝臟能夠從血液中去除毒性物質，并能夠行使多種生化功能，例如，但不局限于，將氨解毒成尿素、膽紅素代謝、糖原儲存、脂類合成、藥物代謝、白蛋白分泌和凝血因子分泌。肝臟與腎臟的功能密切相關，有多種代謝副產(chǎn)物和毒素由肝臟經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)流至腎臟，繼而被分泌到尿中。因此，肝臟和腎臟都是不可缺少的器官，這兩種器官的協(xié)同作用至關重要。肝衰竭或腎衰竭病人若未能立即治療，其死亡的可能性非常大。
有多種因素可導致肝衰竭，其中包括，例如，暴露于毒性物質、肝炎和遺傳缺陷(Kasai，et al.，Artif.Organs，18348-54，1994)。如今在急性肝衰竭患者中有70％因未能得到治療而死亡(Kasai，etal.，Artif.Organs，18348-54，1994)。此外，有10-30％的患者因等待供體肝器官而死亡(LePage，et al.，Am.J.Crit.Care，3224-7，1994；Sussman，et al.Artif.Organs，18390-6，1994；and Uchino& Matsushita，Asaio J.，4074-7，1994)。
能夠在肝衰竭期間暫時行使肝臟功能的床邊生命維持裝置稱為體外肝臟裝置——ELD。有多種原因說明該裝置的開發(fā)和商品化會帶來明顯的巨大利益(Fox et al，Am.J.Gastroenterol.，881876-81，1993)。在美國，ELD每年使大約2000名爆發(fā)性肝功能衰竭(FH)患者受益(Hoofnagle，et al.，Hepatology，21240-52，1995)。該裝置還可作為等待供體器官的患者在肝移植前的過渡裝置使用。
此外，可考慮使用能維持數(shù)周功能的ELD來恢復患者自身肝臟的正常功能。由于受損的肝臟中不可能所有肝細胞都被破壞，因而為肝臟提供2-3周的充分支持會使受損肝臟中幸存的肝細胞重新恢復。在患有致死性肝疾病的動物模型中，肝臟的重新恢復只需不到12個肝細胞(Sandgren et al.，Cell，66245-56，1991)。90-95％肝臟壞死的患者只需幾天的支持即可重新獲得足以獨立生存的功能(Sussman et al.Artif.Organs，19390-6，1994)。
為了提供這種ELD，已努力開發(fā)出幾種純機械的非生物性血液處理裝置。從最基本的形式來看，這些裝置的目的是利用孔徑較小的膜來選擇性去除毒素，同時添加營養(yǎng)物質。HemocleanseTM開發(fā)出的非生物性裝置是其中最先進的裝置之一，最近已得到FDA的認證。在利用該HemocleanseTM裝置進行的隨機受控臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，代謝物的去除很有限，同時對血液的氨含量沒有明顯影響(Hughes et al.，Int.J.Artif.Org.，17657-662，1994)。很明顯，肝臟的功能異常復雜，目前還不可能只用機械的或化學的裝置來替代。
目前可使用的其它ELDs以生物材料為出發(fā)點。舉例來說，有一種經(jīng)過大多數(shù)臨床試驗的裝置稱為ELAD(體外肝臟輔助裝置)，該裝置用轉化的無限增殖人細胞系作為肝細胞樣細胞的來源(Sussman et al.Artif.Organs，19390-6，1994)。該裝置的初次試驗符合“未批準醫(yī)療裝置的急救備用”或“研究裝置免責條例”的情況。其效率未經(jīng)測定，但除了可通過藥物治療來加以控制的凝血現(xiàn)象之外，未發(fā)現(xiàn)嚴重的不良副作用。無限增殖人細胞系可作為細胞的消耗來源，所以其應用非常方便，但它并不是最理想的，其原因主要有兩個。第一，在臨床實踐中使用無限增殖細胞系會帶來明顯的安全及控制問題。第二，并不認為無限增殖細胞具有最初肝細胞的所有正常生理特性，尤其是在大規(guī)模的擴增之后(Sussman et a1.Artif.Organs，1990-6，1994)。
獲得用于ELD的肝細胞源的另一種常規(guī)方法是由完整的肝臟分離出肝細胞或肝組織。此前常利用酶，如膠原酶，來分離肝臟細胞，但這些酶會破壞肝臟的正常顯微結構。也有嘗試使用肝臟碎片的方法，但未將碎片的形狀設計成最適于維護組織的適當表面積/體積比(Lie etal.，Res Exp Med(Berl)185483-94，1985)。
目前，培養(yǎng)哺乳動物肝細胞的方法在提供條件使細胞聚集成與完整機體中真實組織的三維空間形式類似的組織能力方面仍受到限制。由于類似的原因，傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法會限制培養(yǎng)組織對高度功能特異性狀態(tài)或對哺乳動物細胞分化以及具有研究及藥學意義的特定生物活性分子的分泌至關重要的不同狀態(tài)的表現(xiàn)能力。與微生物不同的是，高等生物，如哺乳動物，的細胞可自身形成高度有序的多細胞組織。盡管這種自組裝的確切機制仍不清楚，但從目前的情況來看，細胞發(fā)展成組織依賴于細胞相互間或相對于另一錨定基的取向和(或)諸如激素等特定物質的存在與否?？偟膩碚f，目前用于器官輔助裝置的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法都無法既使細胞在體外發(fā)揮正常功能，同時又可維持關鍵性的細胞/細胞/基質相互作用和適當微環(huán)境以極好地模擬體內器官的組織結構與功能。本發(fā)明則提供一種方法，用于在ELD內使用器官組織，其中包括肝組織，這對于現(xiàn)有技術而言是一個重大的進步。
這種使用器官組織，其中包括但不局限于肝組織，的方法依賴于在微器官培養(yǎng)之前或之后的冷凍保存技術。適當冷凍保存液的成分可包括，但不局限于，美國專利5,879,875所授的蜜三糖或海藻糖，該專利在此全面引用作為參考。
在肝臟中，不同的細胞群體和基質成分呈獨特的并置排列，與血管結構協(xié)調一致，構成一種精密的生物生態(tài)系統(tǒng)。因此不同于普通的肝細胞培養(yǎng)物，后者甚至連最低限度的肝臟功能都不可能實現(xiàn)。如前所述，高等生物，如哺乳動物，的細胞可自身形成高度有序的多細胞組織。細胞與非細胞基底(基質)間存在物理性接觸，例如表皮細胞與其基底層之間的物理接觸。細胞相互間還存在功能性接觸，包括細胞間的電通訊或化學通訊。舉例來說，心肌細胞可通過電脈沖與其它心肌細胞聯(lián)絡。此外，許多細胞可通過化學信息，如激素，與其它細胞聯(lián)絡，這些信息可局部擴散(旁分泌信號發(fā)放和自分泌信號發(fā)放)，或可通過血管系統(tǒng)被運送到更遠的部位(內分泌信號發(fā)放)。細胞間旁分泌信號發(fā)放的實例有不同消化道細胞(稱為腸內分泌細胞)產(chǎn)生的信息，如幽門D細胞可分泌生長抑素，該激素可轉而抑制附近的幽門促胃液素(D)細胞釋放促胃液素。這種顯微結構對在基本培養(yǎng)基，如不含外源血清或生長因子的培養(yǎng)基，中維持器官的組織外植塊極為重要，因為在這種基本培養(yǎng)基中可通過微器官內部特定細胞相互作用產(chǎn)生的旁分泌及自分泌因子來維持肝組織。
這種微器官培養(yǎng)體的制備方法在美國專利5,888,720和美國專利申請08/482,364中均有所描述，在此引入作為參考。在微器官培養(yǎng)體的制備方法中，構成外植塊的細胞群體分離自肝臟，其分離方式可保持細胞間的天然親和性，例如，可按器官本身的情況維持不同的細胞層。舉例來說，在皮膚微器官培養(yǎng)體中，表皮的角化細胞仍與基質相聯(lián)系，同時保留正常的組織結構，包括毛囊和腺體。這種基本結構是所有器官所共有的，例如含有上皮部分和基質部分的器官。此外，這種聯(lián)系能夠促進細胞間通訊。這對分化細胞來說尤其重要，此時“誘導”的定義是，一種(誘發(fā))組織或細胞與另一種(應答)組織或細胞間的相互作用，其結果是應答細胞的分化方向發(fā)生改變。此外，在胚細胞和成體細胞間可產(chǎn)生相互的誘導作用，這種作用除能夠誘導分化外，還可建立并維持形態(tài)發(fā)生的模式(Gurdon，Cell，68185-199，1992)。
此外，按美國專利申請08/482,364制備的微器官培養(yǎng)體可保持正常的肝組織結構，甚至在經(jīng)過長時間的培養(yǎng)后也是如此。這些培養(yǎng)體可在統(tǒng)一的受控條件下加以維持，并且與體內組織非常相似，因此可作為體外功能性肝細胞的唯一持續(xù)來源。
現(xiàn)有技術中的器官輔助裝置或相關裝置都不使用微器官培養(yǎng)體或冷凍微器官培養(yǎng)體來對流體進行生物修飾。
美國約有200,000人患有急性腎衰竭(ARF)。該群體的死亡率約為50％。其治療僅限于支持性醫(yī)護、透析和移植。甚至對這些人經(jīng)常進行連續(xù)透析也不能滿足要求。據(jù)National Kidney Foundation估計，約有53,000個美國人在等待移植器官來救命；每天有10人在等待中死亡。
保健行業(yè)的另一個重要需求是補充或替代腎透析。遺憾的是，目前透析方法作為腎衰竭的解決方法，不但臨床應用困難，而且價格昂貴。因而嘗試用一種較為簡單的過濾系統(tǒng)來進行透析，以代替異常復雜并且使用受到限制的機械器官。
美國約有250,000人接受透析治療，其費用達數(shù)十億美元。ESRD人數(shù)每年增加7％-9％；到2010年，此類患者將超過350,000人。為每個接受透析的患者提供護理的平均費用為45,000美元/年。
盡管接受移植器官的患者可具有更靈活的生活方式，并且可保持更佳的狀態(tài)，但如上文所述，等待腎移植器官的患者約有50,000人。去年，這些等待的人中只有約1/5接受了器官移植。
用血液透析作為處理方法有幾個固有的缺點。第一，它需要使用昂貴的儀器和熟練的醫(yī)療輔助人員來操作該儀器。第二，由于門診病人一般要每周進行幾次處理，因而其費用昂貴，且患者不能遠離治療設施。此外，被治療的患者必須在此期間保持嚴格的飲食，這樣就通常會由于不能遵守而導致醫(yī)療危險。每次處理要持續(xù)數(shù)小時，而且要通過靜脈穿刺來與血液透析機相聯(lián)接。所以一些長期血液透析患者會在臂部最容易穿刺的靜脈出現(xiàn)靜脈萎陷。
對腎功能缺乏患者而言，盡管腎移植本身具有一些固有的缺點，但仍被認為是優(yōu)選的治療方法。許多醫(yī)療中心都將其作為常規(guī)方法使用，但該方法仍會帶來與腹內手術相關的所有風險。此外，為了防止器官排異，往往要利用免疫抑制性藥物對接受移植的患者進行長期處理，這種做法會使他們受感染的風險增加。最大的問題在于，可用來移植的腎臟長期短缺，而供體器官與適當受者相匹配的難度很大。甚至在移植成功的情況下，受者也只有一個腎臟。用諸如本發(fā)明的裝置來補充移植腎臟的功能的方法可減輕移植腎臟的負荷，從而延長其移植后的存活時間。
為了解決供體腎長期短缺的問題，人們在開發(fā)人性化基因工程豬以充當器官供體方面付出了相當大的努力。遺憾的是，盡管它在技術上可行，但最近發(fā)現(xiàn)的豬內源性逆轉錄病毒(pervs)使人們對異種移植方法的合理性產(chǎn)生了相當?shù)膽岩伞Ｊ褂冒幢景l(fā)明所述經(jīng)物理方法分離自患者的微器官培養(yǎng)體的技術是可行的，它有助于在人體內安全使用這些改造的豬器官。
因而人們普遍認為，需要一種不存在上述限制的裝置和方法來補充、增加或替代肝臟的功能、腎臟的功能，或二者兼顧，這將會帶來極大的利益。這種裝置和方法能夠使患者在等待移植的同時享受更高的生活質量，還能使患者在接受新器官后的平均壽命延長，在某些情況下還會使患者自身的器官在該裝置支持下得以恢復。
美國專利5,888,720講述了一種用來繁殖非胚胎性動物細胞群體的體外微器官培養(yǎng)系統(tǒng)及其制備方法，該系統(tǒng)將上皮細胞和基質細胞一同置于營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這些細胞可存活24小時以上。更優(yōu)選地，此專利涉及一種體外微器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將包括一種上皮組織和一種基質組織在內的群體共同培養(yǎng)，并且經(jīng)組織學方法測定仍可保持基質組織與上皮組織的形式，同時經(jīng)DNA合成方法測定在無血清的情況下至少可存活48小時。最優(yōu)選地，此專利涉及一種體外微器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將上皮細胞和基質細胞共同培養(yǎng)，這些細胞經(jīng)組織學方法測定仍可保持基質組織與上皮組織的形式，同時經(jīng)DNA合成方法測定在無血清的情況下至少可存活7天。據(jù)美國專利5,888,720所述，這些微器官培養(yǎng)體無需在內部使用合成的支持結構，并且不使用層狀支持結構。
美國專利5,888,720還指出，微器官培養(yǎng)體的第一條邊不大于第二條邊，而且小于第三條邊，其中第一條邊的測量方向基本與獲得微器官培養(yǎng)體的原器官的外表面平行。該專利還指出，置于營養(yǎng)培養(yǎng)基上的非胚胎性動物細胞來自一種具有活體組織結構的器官，該器官含有上皮組織和毗連的基質組織，其中上皮組織的第一表面相當于器官的外表面，第二表面則與基質相接觸。這種微器官培養(yǎng)體可來源于，例如但不局限于，肺、十二指腸、食管、腸、結腸、肝和胰等器官。
根據(jù)美國專利5,888,720，微器官培養(yǎng)體的表面積/體積指數(shù)被定義為“Aleph”，其中Aleph＝1/x+1/a＞1.5mm-1，x為組織厚度，a為組織寬度，單位均為毫米。該專利指出，微器官培養(yǎng)體的第一條邊不大于第二條邊，而且小于第三條邊，其中第一條邊不大于0.45mm。在確定表面積/體積指數(shù)時不考慮第三條邊，這是因為第三條邊的變化會使體積和表面積按比例改變。因此，在確定Aleph時，a和x應該是組織片最短的兩條邊。
該表面積/體積指數(shù)構成本發(fā)明獨特的一方面，因為它能夠使營養(yǎng)物質通過擴散均衡地到達組織中的所有細胞。使營養(yǎng)物質擴散到三維微器官培養(yǎng)體的每個細胞的要求是Aleph至少約為1.5mm-1。
此外，據(jù)美國專利5,888,720所述，細胞群體的聚集方式要能夠維持一個細胞與另一個細胞的天然親和力，從而保持上皮組織和基質組織的活體結構。舉例來說，在皮膚微器官培養(yǎng)體中，表皮的角化細胞仍與基質相聯(lián)系，同時保留正常的組織結構，其中包括毛囊。這種聯(lián)系能夠促進細胞間通訊。在動物細胞間存在多種類型的通訊方式。這對分化細胞來說尤其重要，此時“誘導”的定義是，一種(誘發(fā))組織或細胞與另一種(應答)組織或細胞間的相互作用，其結果是應答細胞的分化方向發(fā)生改變。此外，在胚胎細胞和成體細胞間可相互產(chǎn)生誘導作用，這種作用除能夠誘導分化外，還可建立并維持形態(tài)發(fā)生的模式(Gurdon，(1992)Cell 68185-199)。
根據(jù)美國專利5,888,720，按本發(fā)明實施例1所述制備的微器官培養(yǎng)體含有以某種方式聚集的細胞群體，該細胞群體含有基質層和上皮層，從而可保持天然的組織結構。此專利講述了由動物制備微器官培養(yǎng)體的方法，該方法包括分離成人的皮膚、小鼠、豚鼠和大鼠的皮膚，并在培養(yǎng)基上培育長達21天。但將培養(yǎng)體維持21天以上以及由其它動物獲得這些培養(yǎng)體的情況亦處在該專利所述發(fā)明的范圍之內。此外還講述了來源于皮膚和其它器官，如哺乳動物的胰、肝、腎、十二指腸及食管，的微器官培養(yǎng)體。類似地，利用美國專利5,888,720所述的方法可制備出來源于諸如腸和結腸等食管的上皮微器官培養(yǎng)體，還可制備出來源于哺乳動物角膜、腎、乳房組織以及多種腸衍生組織的上皮微器官培養(yǎng)體。
美國專利5,888,720還指出，這些微器官培養(yǎng)體可維持在不含血清的Dulbecco’s Minimal Essential等簡單培養(yǎng)基中，同時經(jīng)組織學方法測定仍保持基質和上皮組織的形式，并且經(jīng)DNA合成方法測定仍保持細胞存活能力。培養(yǎng)基和培養(yǎng)體可裝在氧壓基本不超過大氣中氧分壓的一種培養(yǎng)小室中。此外，培養(yǎng)體可在不含血清和任何其它生物流體的培養(yǎng)基中生長，并且可長時間保持，如48小時-21天。
據(jù)美國專利5,888,720所述，微器官培養(yǎng)體可保持在任何適當?shù)呐囵B(yǎng)小室中，如24孔或96孔微量滴定板，并且可保持在37℃和5％CO2的條件下?？蓪⑴囵B(yǎng)物進行振蕩以促進通氣，振蕩速度為，例如，12rpm。
此外，美國專利5,888,720還講述了具有上述特性的微器官培養(yǎng)體的制備方法。發(fā)明概述
本發(fā)明提供一種對流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；以及(b)至少一種器官的微器官培養(yǎng)體的集合，用來對流體進行生物修飾，該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中可保持器官單位(如肝腺泡)的活體器官構造(器官結構)，微器官培養(yǎng)體的集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點有，生物流體的人口和出口采用管道形式，并且該裝置安裝在患者體外。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，生物流體的人口和出口采用半透膜形式，并且該裝置以可體內移植裝置的形式安裝在患者體內。
優(yōu)選的可選器官包括肝臟和(或)腎臟。同樣優(yōu)選地，微器官培養(yǎng)體的集合可含有至少來自一種器官的細胞，從而可維持細胞間的相互接觸。最優(yōu)選地，各微器官培養(yǎng)體集合的Aleph均至少約為2.6mm- 1。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，微器官培養(yǎng)體基本上都被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片基本都處在所述小室內。優(yōu)選地，該薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。同樣優(yōu)選地，可將方向基本平行的多層薄片裝在小室中，從而使流體能夠在薄片間自由流動。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案提供一種對受試者的流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；(b)對流體進行生物修飾的微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中可保持器官單位的活體器官構造，微器官培養(yǎng)體的集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸；(c)具有第一和第二末端的第一管道，第一末端用來聯(lián)接受試者以接收流體，第二末端用來聯(lián)接入口；以及(d)具有第一和第二末端的第二管道，第一末端用來聯(lián)接出口，第二末端用來聯(lián)接受試者以使生物修飾后的流體返回受試者。
本發(fā)明的其它一些實施方案提供一種對來自受試者的流體進行生物修飾的方法，該方法包括，用來自受試者的流體對含有微器官培養(yǎng)體集合的一種小室進行灌注，以使微器官培養(yǎng)體的集合能夠對該流體進行生物修飾，其中，集合的各微器官培養(yǎng)體均含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官構造。
本發(fā)明的其它一些實施方案提供一種制備連續(xù)平面器官的方法。該方法包括(a)獲得一種器官的單個微器官培養(yǎng)體的集合，使該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體可保持器官單位的活體器官構造；以及(b)將來源于該器官的一種細胞懸浮液添加(如平鋪)在微器官培養(yǎng)體上，并將細胞懸浮液與微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由衍生于微器官培養(yǎng)體的細胞與懸浮細胞的混合物形成連續(xù)平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的一項優(yōu)選實施方案，可在連續(xù)肝平面器官內提供肝微器官培養(yǎng)體的集合，該平面器官的制備方法是將肝細胞和(或)內皮細胞或其它類型的細胞與肝微器官培養(yǎng)體的集合共培養(yǎng)，從而由微器官培養(yǎng)體細胞與所選細胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
本發(fā)明的其它一些實施方案提供一種制備連續(xù)肝平面器官的方法。該方法包括(a)獲得單個肝微器官培養(yǎng)體的集合，使該集合的每種微器官培養(yǎng)體均含有肝細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中保持腺泡體的活體肝臟結構；以及(b)將肝細胞和(或)內皮細胞或其它類型的細胞的懸浮液添加(如平鋪)在微器官培養(yǎng)體上，并將細胞懸浮液與肝微器官培養(yǎng)體的集合共培養(yǎng)，從而由衍生于微器官培養(yǎng)體的細胞與所選細胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
一方面，本發(fā)明提供一種裝置，用于在器官功能受損的情況下為受試者提供一種或多種器官功能，該裝置包括一種小室，其中含有多個微器官培養(yǎng)體，從而使微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸，其中，多個微器官培養(yǎng)體的每個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而能夠在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時能夠使各微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
另一方面，本發(fā)明提供一種方法，用于在器官功能受損的情況下為受試者提供一種或多種器官功能，該方法包括(a)提供一種含有多個微器官培養(yǎng)體的小室，其中單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離其最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而能夠在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時能夠使各微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及(b)在小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成流體交通，使血液能夠由受試者流經(jīng)小室并由小室流回受試者，從而使微器官培養(yǎng)體在所述受試者的血液流經(jīng)所述小室時至少能夠與其中的一部分相接觸。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點有，本發(fā)明的小室可安裝在體外。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，本發(fā)明的小室采用可體內移植的形式。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，本發(fā)明還包括那些用來補充、增加或替代器官功能的系統(tǒng)，作為代用品時，這些系統(tǒng)依賴于微器官培養(yǎng)體，并且是其功能的組成部分。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，本發(fā)明還包括那些以微器官培養(yǎng)體作為其功能的組成部分的用來補充、增加或替代器官功能的方法。
本發(fā)明的其它特點還有，被補充、增加或替代的器官功能為肝器官的功能。
本發(fā)明的其它特點還有，被補充、增加或替代的器官功能為腎器官的功能。
本發(fā)明的其它特點還有，被補充、增加或替代的器官功能為腎臟與肝臟的器官功能。
本發(fā)明的其它特點還有，被補充、增加或替代的器官功能包括將小分子排泄至體外的透析功能。
本發(fā)明的其它特點還有，血液可通過一個或多個與小室和受試者的循環(huán)系統(tǒng)相連的管道進出該小室。
本發(fā)明的其它特點還有，血液可通過由能夠促進新血管形成的生物相容性膜構成的小室外壁進出該小室。在新血管形成前，血液通過擴散進出該小室。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，內部的生物相容性半透膜中另含有MCs，因而小室中來自血液的血漿可擴散到膜內并與MCs相接觸，同時MCs的分泌物可擴散到小室內的血液中，繼而返回受試者的循環(huán)系統(tǒng)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，所述生物相容性膜為聚碳酸酯。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實施方案的其它特點還有，將來自細胞懸浮液的細胞與多種微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)以形成連續(xù)平面器官。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實施方案的其它特點還有，來自細胞懸浮液的細胞為肝臟衍生細胞。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實施方案的其它特點還有，來自細胞懸浮液的細胞為腎臟衍生細胞。
本發(fā)明的下述優(yōu)選實施方案的其它特點還有，微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入小室前融解。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，利用冷凍保存的器官的一部分來制備微器官培養(yǎng)體。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，利用冷凍保存的肝臟的一部分來制備肝微器官培養(yǎng)體。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，利用冷凍保存的腎臟的一部分來制備腎微器官培養(yǎng)體。
本發(fā)明的其它一些實施方案提供一種制備冷凍微器官培養(yǎng)體的方法，該方法包括(a)至少將器官的一部分冷凍保存；(b)將冷凍保存的器官切成片，同時保持所得切片的冷凍保存狀態(tài)；(c)在使用前將冷凍保存器官的冷凍保存切片融解；以及(d)用融解的切片作為微器官。這種冷凍微器官可在融解后加到裝置中，或可在融解后進行體外培養(yǎng)，然后再加到裝置中。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點有，將器官冷凍保存在一種溶液中，該溶液至少有一種組分選自DMEM、DMSO、甘油、海藻糖、蜜三糖、一種抗生素、一種抗霉菌素和葡萄糖。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，將器官冷凍保存的溫度以及將器官切片的溫度為-180-0℃。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，來自器官的一部分的切片厚度約為200-400微米。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，在融解并用作微器官前，冷凍切片可再保存一段時間，也可立即融解并使用。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特點還有，用融解的切片作為微器官的實施方法是(i)提供一種小室；(ii)將多個融解的切片置于該小室內；(iii)至少將受試者的部分血液引入該小室，以使多個融解的切片至少與受試者的部分血液相接觸，其中多個融解切片的單個融解切片內位置最深的細胞離該單個融解切片的最近端表面至少約100或150微米，但又不超過約225微米，從而可在各融解切片中保持活體組織的結構，同時使多個融解切片的各融解切片內位置最深的細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及(iv)至少將一部分與融解切片接觸過的受試者血液重新引入受試者。
本發(fā)明提供一種裝置和方法，用于在肝臟功能受損、腎臟功能受損或兩種功能均受損的情況下來補充、增加或替代這些功能，從而成功解決了目前已知裝置的缺點。此外，本發(fā)明有助于解決供體移植器官長期短缺的問題，并可能減少組織排異以及移植器官傳遞疾病的問題。此外，本發(fā)明提供的方法可維持組織的結構，并且無需在使用前用人工培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，因而可提高器官輔助裝置中的細胞集結效率，尤其會減少細胞在制備過程中承受的壓力。附圖簡述
本發(fā)明將利用附圖來加以說明，這些附圖只作為實例。應該強調的是，在細節(jié)上參考特定附圖時，提供的細節(jié)只作為例子來對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行說明性論述。提供這些細節(jié)的原因是，相信它們能夠對本發(fā)明的原理和概念性問題進行最有效和最易于理解地描述。因此，除了為基本了解本發(fā)明而必需的一些描述之外，未對本發(fā)明的構造細節(jié)做更詳細地描述，附圖的描述會使該領域的技術人員清楚地了解本發(fā)明在實踐中會有幾種具體的表現(xiàn)形式。
附圖中


圖1A-1D為用來容納代謝活性微器官培養(yǎng)體的典型生物反應器的示意圖2A和2B為微器官培養(yǎng)體的免疫隔離室示意圖3A-3C為本發(fā)明的另一種生物反應器的示意圖4為使用圖1或圖3所示生物反應器的裝置的示范性操作電路示意圖5顯示幾種微器官培養(yǎng)體的細胞增殖測定結果；
圖6顯示小鼠肝細胞在微器官培養(yǎng)體中產(chǎn)生白蛋白的測定結果；
圖7顯示小鼠肝微器官培養(yǎng)體中氨向尿素的轉化；
圖8顯示人類肝微器官培養(yǎng)體可長期地將大量氨轉化成尿素；
圖9顯示人類肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性；
圖10顯示冷凍保存的肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時仍具有功能；
圖11顯示冷凍保存的人類肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時重新恢復了功能；
圖12顯示封裝在藻酸鹽片中的小鼠肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性；
圖13顯示培育在100％胎牛血清中的小鼠肝微器官培養(yǎng)體仍具有功能；
圖14A和14B顯示封裝在藻酸鹽片中冷凍后再融解的大鼠肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性；
圖15顯示可安全地將本發(fā)明的一例裝置與正常大鼠相連接；以及
圖16顯示小鼠肝微器官培養(yǎng)體的最佳厚度為450微米。
圖17顯示可為患者提供器官功能、同時進行血液透析的另一種附加系統(tǒng)的橫斷面圖。
圖18為腎MCs的氨產(chǎn)量隨時間的作圖，圖中對包含及不含谷氨酰胺/Hepes的培養(yǎng)基進行了比較。
圖19的曲線圖顯示本發(fā)明的腎MCs在低pCO2及高pCO2條件下的尿素產(chǎn)量和氨產(chǎn)量。氨產(chǎn)量不受CO2濃度的影響，而尿素產(chǎn)量取決于CO2濃度。T4時間為4小時。
圖20A顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長的腎MCs培養(yǎng)體的HCO3-濃度隨時間的作圖。對照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20B顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長的腎MCs培養(yǎng)體的pH隨時間的作圖。對照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20C顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長的腎MCs培養(yǎng)體的氧分壓隨時間的作圖。對照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20D顯示在含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長的腎MCs培養(yǎng)體的二氧化碳分壓隨時間的作圖。對照為含有培養(yǎng)基或正常血但不含MCs的基本裝置。
圖20E顯示在含有正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本裝置中生長的腎MCs培養(yǎng)體的pH隨時間的作圖。
圖21A顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的葡糖濃度隨時間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21B顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的HCO3-濃度隨時間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21C顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的pH隨時間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21D顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的氧分壓隨時間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖21E顯示基本裝置中肝MCs與腎MCs混合培養(yǎng)物(比率6∶1)的二氧化碳分壓隨時間的作圖。所用培養(yǎng)基為正常大鼠與肝切除大鼠的混合血。
圖22顯示經(jīng)MCs處理的肝切除動物與利用不含MCs的相同裝置處理的類似動物相比的存活百分率隨時間的作圖。處理使平均存活時間增加了10小時。
圖23顯示灌注到本發(fā)明所述裝置之前和之后的肝微器官的RT-PCR結果。選擇用于白蛋白及凝血因子IX和X的mRNA的特異性引物對來證明這些肝標記物的轉錄。第1-4泳道顯示由白蛋白mRNA的特異性引物產(chǎn)生的718bp條帶。第6-9泳道顯示由凝血因子IX mRNA的特異性引物產(chǎn)生的821bp條帶。第11-14泳道顯示由凝血因子X mRNA的特異性引物產(chǎn)生的1158bp條帶。第5和第10泳道為分子量標記。第1、6和11泳道的樣品來自灌注前的第175號動物，第2、7和12泳道的樣品來自灌注后4小時的同一動物。第3、8和13泳道的樣品來自灌注前的第176B號動物，第4、9和14泳道的樣品來自灌注后4小時的同一動物。
圖24顯示在培養(yǎng)基中生長的肝MCs介質的利多卡因濃度隨時間的作圖。濃度的下降表明該藥物隨時間的代謝。
圖25A顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的氧分壓隨時間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進行灌注。用于處理無肝大鼠時，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖25B顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的二氧化碳分壓隨時間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進行灌注。用于處理無肝大鼠時，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖25C顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的碳酸氫根離子濃度隨時間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進行灌注。用于處理無肝大鼠時，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖25D顯示大鼠肝MCs與豬肝MCs的葡糖濃度隨時間的變化。所用MCs是用指定培養(yǎng)基或血清進行灌注。用于處理無肝大鼠時，豬肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
圖26A顯示由測量活性線粒體脫氫酶的MTT(3-[4，5-二甲噻唑-2-基]2，5-二苯四唑溴化物；噻唑蘭)比色反應測定一組冷凍保存液(S1-S6)在第0及第120分鐘時的活細胞百分率。S1-S6溶液的成分詳列于下文表4。
圖26B顯示由吖啶橙染色法測定一組冷凍保存液(S1-S6)在第0及第120分鐘時的活細胞百分率。S1-S6溶液的成分詳列于下文表4。
圖27A為二氧化碳產(chǎn)量隨時間的變化，圖中對新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見表4)中液氮保存72小時的MCs進行了比較。冷凍和融解沒有對肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖27B為耗氧量隨時間的變化，圖中對新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見表4)中液氮保存72小時的MCs進行了比較。冷凍和融解沒有對肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖27C為pH隨時間的變化，圖中對新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見表4)中液氮保存72小時的MCs進行了比較。冷凍和融解沒有對肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖27D為葡糖濃度隨時間的變化，圖中對新鮮肝MCs和在S4(S4溶液的成分見表4)中液氮保存72小時的MCs進行了比較。冷凍和融解沒有對肝MCs產(chǎn)生不良影響。
圖28顯示由先在培養(yǎng)基中生長再與肝MC共培養(yǎng)的肝內皮細胞進行肝MC建群的顯微圖。培養(yǎng)的肝細胞可表達一種轉基因的β-半乳糖苷酶。顯象方法采用Lac Z染色，以使來源于細胞懸浮液的細胞呈藍色。
圖29顯示腎MCs的體內功能性。將腎MCs移植到正常大鼠的腹膜腔內，并在48小時后用RT-PCR方法分析凝乳酶、促紅細胞生成素(Epo)及T-PA的mRNAs表達情況。由圖可見，48小時后的凝乳酶水平提高，而促紅細胞生成素和T-PA的水平下降。M＝100bp梯形DNA分子量標記(Promega)。優(yōu)選實施方案詳述
本發(fā)明涉及對流體進行生物修飾的裝置，特別用于協(xié)助或替代在正常情況下行使這種修飾作用的器官來發(fā)揮功能。本說明書和附屬權利要求中使用的短語“對流體進行生物修飾”是指改變該流體的生物成分，在正常情況下，流體中這些生物成分的引入、去除或變化是通過一般在體內對血液進行修飾的器官的分泌、攝取或其催化活性來完成。優(yōu)選的是將本發(fā)明的裝置直接與受試者或患者相連或植入其體內，以對該受試者的流體進行修飾。文中使用的術語“受試者”和“患者”可彼此互換，二者都是指與本發(fā)明所述裝置聯(lián)接的、或被植入本發(fā)明所述裝置的、或被實施本發(fā)明所述方法的人或較低等動物。
利用附圖和附述可更好地理解本發(fā)明所述裝置對生物流體進行修飾的原理及操作。
在對本發(fā)明的至少一項實施方案進行詳細說明之前，應該了解本發(fā)明在應用時并不局限于以下敘述或附圖所指明的結構及配置細節(jié)。本發(fā)明可以有其它不同的實施方案或實踐或執(zhí)行方式。此外還應了解，文中使用的措詞和術語只是用于說明，而不作為限制。
對該說明書和附屬權利要求而言，術語“微器官”、“MC”和“MCs”是指仍保持原組織的細胞-細胞、細胞-基質和細胞-間質基本結構的至少一種組織，優(yōu)選的為多種組織，的外植塊。這些術語包括培養(yǎng)的外植塊、培養(yǎng)后灌注到本發(fā)明所述裝置中的外植塊以及不預先培養(yǎng)而直接灌注到本發(fā)明所述裝置中的外植塊。此外，這些術語還包括與來自一種懸浮液的細胞共培養(yǎng)的外植塊，以及由外植塊和多種特定細胞的共培養(yǎng)物形成的平面器官。
由于外植塊的尺寸對其細胞的存活力十分重要，所以若希望長時間維持微器官培養(yǎng)體，如1-21天或更長，就需要對組織外植塊的尺寸進行選擇，以使養(yǎng)分和氣體，如氧氣，能夠充分擴散到三維微器官的每個細胞，同時使細胞廢物能夠擴散出外植塊，以盡量減少廢物在微器官內停留而導致的細胞毒性及伴隨的死亡。因此，外植塊大小的確定要能夠滿足在不具備專門的遞送結構或合成基質的情況下對每個細胞最低限度的可達性的要求。據(jù)美國專利申請08/482,364所述，只要使表面積/體積指數(shù)處在特定范圍內，就能夠維持這種可達性。
處在該選定范圍內的表面積/體積指數(shù)能夠使細胞足以通過擴散來獲取營養(yǎng)和排除廢物，其依據(jù)是生物存在擴散極限，由發(fā)育的哺乳動物胚胎在血液循環(huán)開始前可達到的最大體積/表面積比以及細胞可通過擴散存活的最大體積/表面積比即可意識到這一點。而在含有上皮的哺乳動物組織中，細胞與毛細血管的距離幾乎無一例外地都不超過約400微米，由此也可對生物的擴散極限有所認識。
若文中定義為“Aleph”或“Aleph指數(shù)”的表面積/體積指數(shù)至少約為2.6mm-1，則能夠獲得并維持該可達性水平。由于第三條邊的變化，所以在確定表面積/體積指數(shù)時將其忽略。
而在確定Aleph時，a和x應被定義為組織片最短的兩條邊。
對該說明書和附屬權利要求而言，“Aleph”是指由公式1/x+1/a確定的表面積/體積指數(shù)，其中x＝組織厚度，a＝組織寬度，單位均為毫米。在優(yōu)選實施方案中，外植塊的Aleph應約為2.7-25mm-1，更優(yōu)選的約為2.7-15mm-1，再優(yōu)選的則約為2.7mm-1至約10mm-1。表1給出Aleph的實例，其中，例如，厚度0.1mm、寬度1mm的組織，其Aleph指數(shù)為11mm-1。
因此，舉例來說，單個微器官培養(yǎng)體或外植塊中位置最深的細胞離其最近端表面至少約150微米，但又不超過約225微米，這樣可使活體結構得以保留，同時確保所有細胞與氣源和營養(yǎng)源的距離都不超過約225微米。
表1表面積/體積指數(shù)“Aleph”隨a(寬度)和x(厚度)變化的不同mm-1
值
人們將直徑約700微米、長約2mm的多角形肝小葉作為肝臟的基本結構與功能單位達一個世紀之久。直到50年代才認識到肝臟的基本結構與功能單位是更小的腺泡。一個腺泡大致上是圍繞一根終動脈、一根微靜脈和一根門管區(qū)側支膽管排列的一個卵形的實質細胞團。腺泡兩端各有一根導管，稱為終末肝微靜脈(該導管在以前用于小葉的術語中被稱為中央靜脈)。腺泡作為一種小單位，其較短的邊約為300-450微米，它包括傳統(tǒng)意義上的兩個相鄰的小葉部分。應該指出的是，自從腺泡被發(fā)現(xiàn)以來就被認為是肝臟最小的結構與功能單位，同時它確定了所有肝細胞與氣源和營養(yǎng)源之間的最大距離。因此，以腺泡為代表的肝臟微觀結構確定了肝臟內所有細胞與營養(yǎng)源的距離都不超過約150-225微米。事實上，其它所有身體器官都是如此，因為氣體和營養(yǎng)的有效擴散上限被明顯確定在大約150-225微米。有關腺泡結構與功能的其它說明材料可在任一本組織學教科書中找到。例如“組織學教材”，Bloom and Fawcett Eds.12th Edition.Chatman and Hall.N.Y.-London.1994的第652-656頁。
在不受任何特定理論限制的前提下，該三維培養(yǎng)系統(tǒng)的許多因素都有助于其獲得成功。首先是通過使用，例如，上述的Aleph計算方法來合理地選擇外植塊的尺寸，這樣就可獲得適當?shù)谋砻娣e/體積比，使營養(yǎng)物能夠充分擴散到外植塊的所有細胞，并且使細胞廢物能夠由外植塊的所有細胞充分擴散出去。
其次，由于外植塊為立體結構，所以各種細胞仍能活躍生長，最重要的是仍可完全分化并發(fā)揮功能，相比之下，單層培養(yǎng)的細胞只能生長到鋪滿狀態(tài)，然后表現(xiàn)出接觸抑制并停止生長和分裂，從而使其功能受到限制。通過外植塊細胞的復制而產(chǎn)生的生長因子和調節(jié)因子可承擔起刺激增殖和調節(jié)分化、繼而調節(jié)培養(yǎng)細胞功能的部分責任，甚至對，例如，總體積不變的微器官培養(yǎng)體也是如此。
第三，外植塊的三維基質可保持一種與相應活體器官極為相似的細胞因子空間分布狀態(tài)。第四，細胞-細胞及細胞-基質相互作用可建立起能夠導致細胞成熟的局部微環(huán)境。人們已認識到，維持分化細胞的表型不但需要生長/分化因子，而且需要適當?shù)募毎嗷プ饔?。本發(fā)明可有效地模仿組織的微環(huán)境。微器官培養(yǎng)體的生物活性
本發(fā)明的一些實施方案中包含的肝微器官培養(yǎng)體被認為可行使所有種類的肝特異性生物學功能。這些功能的實例包括，例如，氨和尿素的代謝以及產(chǎn)生白蛋白。這些肝特異性生物學功能對于要在肝臟輔助裝置(LAD)中使用的細胞而言特別重要。在用較短期形式的LADS對諸如患有爆發(fā)性肝衰竭(FHF)、等待肝移植或具有無功能肝移植物的受試者進行支持時，上述肝特異性生物學功能更顯得至關重要。但除上文所述之外，還有其它同樣重要或更重要的功能。其它功能性缺陷可利用其它方法來支持(如提供葡糖或監(jiān)測葡糖水平)，或是無需給予嚴重關注(如膽汁酸的結合，或膽色素的產(chǎn)生，或藥物的代謝活性)?？蔀楦嗡ソ呋蚋喂δ懿蝗颊咛峁俺浞种С帧钡母闻K特異性生物活性水平是指，該水生物活性平能夠使血清蛋白、氨向尿素的轉化率、凝血因子、氨基酸以及由肝臟產(chǎn)生或代謝的其它代謝物保持在或接近正常水平。
這些改進可通過生化方法或受試者臨床狀況的改善來加以衡量。這些不同的分子、代謝參數(shù)與臨床參數(shù)、產(chǎn)物及其濃度或含量的生理學與病理學范圍已為該領域所熟知，或在，例如，Zakim & Boyer，肝臟病學；肝臟疾病教材，W.B.Saunders Company；Harcourt，Brace，Jovanovich，Inc.，Philadelphia，London，Toronto，Montreal，Sydney，Tokyo，(1990)中有所描述，在此引入作為參考。
本發(fā)明所述裝置的一些實施方案中包含的腎微器官培養(yǎng)體被認為可行使所有種類的腎特異性生物學功能。這些功能包括，例如，尿素代謝，分泌促紅細胞生成素、凝乳酶以及維生素D調節(jié)。當受試者排出尿素的功能不是由腎微器官培養(yǎng)體本身來完成時，也可用本發(fā)明所述裝置的一項優(yōu)選實施方案的血液透析部件來完成。該血液透析部件的功能將在下文敘述，其應用實例則在實施例部分的實施例18和19進行詳述。微器官培養(yǎng)體的保存
作為本發(fā)明的一部分使用的微器官培養(yǎng)體的優(yōu)選制備及冷凍保存方法是，在存在，例如，10％DMSO(二甲亞砜)和20％血清的條件下于-160℃將其逐漸冷凍和保存，直至使用。在一項優(yōu)選實施方案中，肝微培養(yǎng)體可被封裝在藻酸鹽等半透性基質片中，如圖2B所示，然后將其逐漸冷凍在，例如，含有10％DMSO和20％血清的諸如Ham’s F12等標準培養(yǎng)基中。再把冷凍的薄片保存于-160℃。舉例來說，可將含有微器官培養(yǎng)體的平面薄片插入到四周密封且大小與薄片十分接近的無菌合成塑料袋中。袋子的一端應帶有一個塑料管入口，反端則帶有一個塑料管出口。然后在裝入含有微器官培養(yǎng)體的平面薄片的塑料袋中灌注含有10％DMSO和20％血清的諸如Ham’s F12等標準培養(yǎng)基，并于一160℃逐漸冷凍和保存。
需要使用時，可將冷凍的薄片或冷凍的微器官培養(yǎng)體融解并裝到本發(fā)明的裝置中，優(yōu)選的是同時進行，然后與系統(tǒng)聯(lián)接。
本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案是先培養(yǎng)微器官，然后將其冷凍，下文將對此做更詳細的描述。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及冷凍的微器官。該方面的根據(jù)是發(fā)現(xiàn)將器官或器官的一部分冷凍保存的多次嘗試都不很成功，其原因與難以培育完整器官或部分器官的原因相同。即所述物體的表面積/體積比太小。在降低溫度前通過器官內的天然循環(huán)網(wǎng)絡用適當?shù)睦鋬霰４嬉簩毎M行灌注并使其到達器官內的大多數(shù)細胞，這樣就可在一定程度上克服這種限制。一旦器官被冷凍，就無法經(jīng)循環(huán)網(wǎng)絡到達所有細胞，原因是這些通道此時為凍結狀態(tài)。在實施本發(fā)明時發(fā)現(xiàn)，若仍在冷凍條件下將冷凍保存的器官或其部分適當?shù)厍懈睿蛊湓谌诮鈺r具有較大的表面積/體積比，就可確保所有細胞，包括微器官內位置最深的細胞，能夠迅速而充分地接觸流體并達到適當?shù)臏囟葪l件。其實現(xiàn)方法是，例如，制備的冷凍微器官需保留原器官的上皮/間質基本相互作用，并且所有細胞與表面的距離都不超過約500微米，優(yōu)選的是300微米，最優(yōu)選的則是150微米。將冷凍器官或其冷凍部分切割成微器官時可采用任何適當?shù)那懈钛b置，例如，但不局限于，冷凍切片機或帶有手動或機械傳動刀片并且處在預冷至適當溫度的小室內的裝置。
作為不限制本發(fā)明范圍的實例，冷凍微器官的制備方法可以是，利用該領域熟知的灌注方法用適當?shù)睦鋬霰４嬉簩ζ鞴龠M行灌注。然后以，例如，約每分鐘1度的速度逐漸降低溫度。當組織的溫度達到，例如，-10℃--30℃時把器官切割成微器官。用于保存的微器官可在，例如，-70℃下進一步冷卻，優(yōu)選的是-100℃，更優(yōu)選的則是在-196℃的液氮中。當需要使用微器官時，可將其快速融解，方法是，例如，將其快速浸泡在預熱至37℃的適當溶液中。由于微器官具有很大的表面積/體積比，因而可快速融解，從而減少融解過程中可能出現(xiàn)的細胞損傷。用微器官培養(yǎng)體形成連續(xù)的人造平面器官
本發(fā)明的事實依據(jù)是，如果能保持器官的顯微結構(micro-architecture)，并選擇適當條件(如尺寸)來確保所有細胞與氣源和營養(yǎng)源的距離處在合理范圍內，就能夠使來自體內的細胞發(fā)揮與體內細胞類似的功能。
下文實施例部分的實驗(見實施例13)可說明肝MC培養(yǎng)體的狀態(tài)作為厚度的函數(shù)變化。它是在來自體內的條件下，根據(jù)肝MC培養(yǎng)體對轉導的外源基因的表達能力而建立的。具有最佳結果的顯然是厚度為450微米的MCs。對培養(yǎng)物的組織學檢驗也進一步證實了該結果。
因此，可把本發(fā)明的MCs片看作平面器官，每片都基本相當于一個去卷曲的器官。正常的成熟器官被移出身體時會缺乏系統(tǒng)支持和為器官內每個細胞提供充足營養(yǎng)及氣體交換所必需的血液循環(huán)。另一方面，文中描述的來自體內平面器官可確保(i)能夠維持器官的結構，盡管其外形為平面，同時(ii)器官內所有細胞與營養(yǎng)源的距離都不超過約150-225微米。本發(fā)明的另一實施方案是制備出連續(xù)平面器官并用來實現(xiàn)本發(fā)明的方法和裝置。
連續(xù)平面器官的制備方法如下。用如上所述制備的單個微器官的集合作為滋養(yǎng)層或基底層來支撐或維持來源于相同組織但被制成懸浮液的細胞。因此，滋養(yǎng)層可提供一個表面，使懸浮液中的細胞粘附于該表面并增殖和(或)分化并且(或)發(fā)揮其生物學功能。最后，由粘附細胞產(chǎn)生的細胞能夠與單個MCs的集合形成一種相互粘著的連續(xù)平面器官片。舉例來說，連續(xù)肝平面器官的制備方法是將單個肝微器官培養(yǎng)體的集合與肝上皮細胞共培養(yǎng)。
因此，連續(xù)平面器官是一種重新設計的組合器官，它可保持基本的器官顯微結構或構造。本發(fā)明的連續(xù)平面器官可借助其平面尺寸來確保所有細胞與營養(yǎng)源的距離都不超過約150-225微米，因而可避免對血液循環(huán)的依賴。
應該了解的是，用單細胞層作為滋養(yǎng)層或基底層來培育其它類型細胞的想法并不是新近出現(xiàn)的，它曾被廣泛而又成功地使用過。
但用微器官的集合作為滋養(yǎng)層或基底層，更準確地說是作為“滋養(yǎng)器官”，的想法是嶄新的，它具有幾個優(yōu)點，主要是滋養(yǎng)器官上生長的細胞有非常復雜的基底來支持，這種基底更類似于體內增殖細胞的基底。
根據(jù)本發(fā)明的一項替代優(yōu)選實施方案，可利用腎微器官培養(yǎng)體來制備平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的另一項替代優(yōu)選實施方案，可同時使用腎微器官培養(yǎng)體和肝微器官培養(yǎng)體來制備一種既有腎臟功能又有肝臟功能的平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它一些特點，可在本發(fā)明所述裝置中加入一種血液透析部件。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的另一些特點，可將平面器官或含有微器官培養(yǎng)體的其它人造器官植入患者體內，而不是安裝在體外。
對該說明書和附屬權利要求而言，術語“基本培養(yǎng)基”是指化學成分確定的一種培養(yǎng)基，它只含有細胞在培養(yǎng)基中存活和增殖所必需的營養(yǎng)成分?；九囵B(yǎng)基一般不含生物提取物，如生長因子、血清、垂體提取物或細胞群體在培養(yǎng)基中存活和增殖的其它非必需物質。舉例來說，基本培養(yǎng)基通常含有至少一種氨基酸、至少一種維生素、至少一種鹽、至少一種抗生素、至少一種用來測定氫離子濃度的指示劑，如酚紅，葡糖、至少一種抗生素，以及細胞存活和增殖所必需的其它各種成分。基本培養(yǎng)基不含血清。從Gibco BRL，Gaithersburg，MD可購買到多種商品形式的基本培養(yǎng)基。
參考下文的實施例、注解和附圖可更好地理解本發(fā)明的裝置和方法。先看附圖，圖1A-1C顯示一種適于本發(fā)明所述裝置使用的生物反應器。生物反應器2是一種帶有灌注入口6和灌注出口24的小室4，其間有特定的流體流動通道。流體可如箭頭8所示由入口6進入，并如箭頭10所示由出口24流出。優(yōu)選的是將至少一個，更優(yōu)選的是多個，灌注室18置于小室4的流動通道上。每個灌注室18的范圍至少由一層，優(yōu)選的是多層，多孔膜19來確定。每個灌注室18含有至少一個，優(yōu)選的是多個，微器官培養(yǎng)體20，如肝微器官培養(yǎng)體。有一個或多個托架16與固定夾14或其它固定工具相連接，從而將灌注室18固定在小室4的流體通道上。優(yōu)選地，小室4內有導流板22來指導流體的流動。流體在小室4內流動的方向如箭頭所示。同樣優(yōu)選的是加入折返器21，使微器官培養(yǎng)體20集合的至少一種產(chǎn)物能夠返回受試者(未顯示)。
在圖1A-1C顯示的實施方案中，每個灌注室18的流動通道和壓力都基本相同。
因此，經(jīng)多孔膜19向灌注室18的擴散受簡單界面擴散原理的約束，如濃度梯度、布朗運動等。在這種擴散不能滿足要求的情況下，可通過，例如，跨灌注室18的壓力差來提高流體向小室4中滲透的速率。舉例來說，圖1D顯示圖1A的生物反應器2經(jīng)改裝后在小室4內具有兩種不同的流動通道，一個“流體”室4A和一個“濾液”室4B，流體交換只能通過灌注室18來進行，也就是只能通過微器官培養(yǎng)體20的集合來進行。在所示生物反應器2中可通過，例如，用閥門來限制流體出口24A下游流速的方法來建立跨灌注室18的壓力差。正壓力差(P流體-P濾液)會使流體從流體室4A向濾液室4B流動，從而使流經(jīng)小室4的流體能夠與微器官培養(yǎng)體20的集合相接觸，繼而被生物修飾。一般而言，優(yōu)選的是將濾液室4B的出口24B與流體室4A的出口24A重新合并后再返回受試者。
用于形成微器官灌注室的適當基質材料包括聚酰胺，其中包括尼龍，如聚已內酰胺和聚己二酸己二酯，聚酰胺-酰亞胺、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯，如聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸乙酯，和聚苯乙烯。對某些應用而言，適當?shù)幕|材料還包括不同類型的角蛋白(絲綢、羊毛、毛發(fā))、膠原蛋白、聚烯烴，如聚乙烯、聚丙烯和聚丁烯，聚酯，如聚對苯二酸乙二酯和聚己二酸乙二酯，聚氨酯，如聚酯型聚氨酯和聚醚型聚氨酯，玻璃，如玻璃纖維，不銹鋼、硅酮、有機聚硅氧烷和石墨，以及上文所述的組合。角蛋白基質可以是角蛋白、含角蛋白材料或角蛋白樣材料。其它材料已為該領域所熟知。例如，可參考美國專利5,344,454；美國專利4,883,666；美國專利4,892,538和5,106,627；美國專利4,391,909；以及美國專利4,353,888。
優(yōu)選的是將微器官培養(yǎng)體20的集合封裝在一種半透性基質中以形成一個隔離室，例如可使用該領域已知的多種半透性材料。微器官培養(yǎng)體和被處理流體之間的半透膜等材料允許養(yǎng)分和活體小分子通過，其中包括氧氣、葡糖和激素，但不允許免疫系統(tǒng)因子通過，如白細胞，如果需要，則還可包括抗體。文中使用的術語“顆?！卑ǚ肿?、細胞和蛋白。
更詳細地說，當微器官培養(yǎng)體來自另一種動物時(即相對于被處理的受試者而言為異種的)，孔徑的大小必須足以避免炎癥細胞和分子免疫原性因子通過而由宿主進入植入組織小室。該說明書中使用的“分子免疫原性因子”是指諸如抗體和補體等分子。足以阻斷人類炎癥細胞和分子免疫原性因子通過的孔徑大小約為0.015微米。當微器官培養(yǎng)體來自同種動物但其遺傳組成不同時(即同種異體)，孔徑的大小通常只需足以避免炎癥細胞通過而由宿主進入植入細胞小室。足以阻斷人類炎癥細胞通過的孔徑大小約為0.8微米。在大多數(shù)實施方案中，最好是將微器官培養(yǎng)體放置在一種免疫隔離室內，例如，可選擇孔徑大小和膜的厚度，以使截留的分子量(MW)約為10,000Da-250,000Da，這樣就只能使分子量小于約10,000Da-250,000Da的分子通過。
圖2A為該免疫隔離室的一種說明性實施方案，該圖顯示在由兩片相對的半透膜30形成的免疫隔離室28中至少放置一個，優(yōu)選的為其集合，微器官培養(yǎng)體26?？蓪⑽⑵鞴倥囵B(yǎng)體26的集合放在兩片半透膜30之間，也可如下圖(圖2B)所示封裝在一張半透膜中。通過使用，例如，一個或多個螺釘34將相對的夾具32固定在一起，這樣就能夠由每個夾具32的凸面脊36在微器官培養(yǎng)體26周圍形成基本防水的密封空間。作為選擇，同樣優(yōu)選的是用膠水、熱封、超聲焊接或該領域其它適當?shù)姆饨蛹夹g來代替夾具32將半透膜片30的邊緣密封。更優(yōu)選的是將微器官培養(yǎng)體26的集合直接封裝在一張?zhí)囟ù笮〉钠矫嬖逅猁}片中。其外形顯示于圖2B，圖中顯示出多個平面藻酸鹽片38。舉例來說，可制備第一條邊約為40cm、第二條邊約為60cm、第三條邊約為350微米的平面藻酸鹽片。這種藻酸鹽片每張可容納大約1-2×1010個細胞。因此，為了獲得與人類肝臟的細胞數(shù)量大致相同的細胞，需要使用，例如，約4-10張藻酸鹽片。
應該了解的是，其它結構的受試者生物反應器流體/濾液型實施方案也可形成多灌注室系統(tǒng)。這些結構也可采用上述的一種薄片結構。
舉例來說，圖3A-3C顯示一種基本的盒式裝置40，它能夠與其它盒式裝置40串聯(lián)，以形成一種帶有多個灌注腔的生物反應器(未顯示)。該說明性實施方案是將微器官培養(yǎng)體20的集合放在灌注室18中。兩個端板(end plate)42和44與灌注室18之間至少插有一塊隔板46，從而可在灌注室18的兩側形成流體室48和濾液室50。在運行時，由至少一個，優(yōu)選的為多個，流體入口52進入的流體可穿過流體室48，然后沿灌注室18的滲透性表面流動，再通過至少一個，優(yōu)選的為多個，橫向貫穿灌注室18的孔道，即流體管54，而離開流體室48。此后，由流體管54提供的流體可通過至少一個，優(yōu)選的為多個，流體出口56而離開盒式裝置40，從而不與濾液室50內的任何流體相接觸。與此方式類似，由至少一個，優(yōu)選的為多個，濾液入口58進入的濾液可被直接輸送到至少一個，優(yōu)選的為多個，濾液管60，從而不與流體室48內的任何其它流體相接觸。
但濾液管60可將濾液排到濾液室50中，使其與灌注室18的另一個(滲透性)表面直接接觸。滲析液則通過至少一個，優(yōu)選的為多個，濾液出口62而離開濾液室50。由此可見，來自流體室48的流體顯然還會滲透過灌注室18，被微器官培養(yǎng)體20的集合作用后，以代謝衍生物的形式返回濾液室50。
實際上，將盒式裝置40串聯(lián)排列時可把兩個相鄰盒式裝置中的第二個翻轉180°，以使第二個盒式裝置40的流體入口52和濾液入口58分別對準第一個盒式裝置40的流體出口56和濾液出口62。重復這種組裝方式即可將大量盒式裝置40順序連接，并有效地形成一種其間配有多個微器官培養(yǎng)體的流體室和濾液室。若將其中的第一個盒式裝置40的濾液入口加蓋或以其它方式封閉，則濾液室中流動的流體都是經(jīng)處理后離開灌注腔的流體。
圖4進一步說明了圖1-3的上述生物反應器2在本發(fā)明所述裝置中的應用。為了便于理解，優(yōu)選實施方案是根據(jù)采用肝微器官培養(yǎng)體的肝臟輔助裝置來加以描述。但是，如上文所述，也可利用本發(fā)明的裝置實現(xiàn)其它的器官強化作用。
圖4顯示本發(fā)明所述裝置的另一種實施方案，該方案優(yōu)選地含有圖1D、2B或3A-3C的生物反應器2。該實施方案只作為一個例子，并不限制本發(fā)明的范圍。另外還給出了該實施方案的使用方法。
通過圖中顯示的動脈管道64可將血液從受試者的雙腔靜脈導管(等等)引出。進入系統(tǒng)的血流可優(yōu)選地用，例如，一種蠕動泵66來控制。優(yōu)選地，可利用注射器68將諸如肝素等抗凝劑輸送到動脈管道64內。也可將尿素、凝血因子、來源于肝細胞的其它蛋白或轉化產(chǎn)物等添加到血液中。此后，血液進入動脈滴注室70，并在此監(jiān)測柱前壓(PI)。血液離開滴注室70后即進入生物反應器2，因而使生物反應器2(含有微器官培養(yǎng)體集合的小室)充滿受試者的血液。如果需要，還可將過濾器等(如商品形式的1mm篩網(wǎng)過濾器)裝在滴注室70與生物反應器2之間以避免裝置堵塞。生物反應器2有一組入口管道72，可接納來自動脈管道64的含有或不含抗凝劑的血液。生物反應器2，特別是其中包含的微器官培養(yǎng)體的集合，可對血液進行處理。
在流經(jīng)生物反應器2的過程中，分子，優(yōu)選的是分子量約為10,000Da-250,000Da的分子，最優(yōu)選的則是分子量約為60,000Da-80,000Da的分子，可通過擴散穿過免疫隔離膜而暴露于微器官培養(yǎng)體。血液中的細胞物質則不能與微器官培養(yǎng)體直接接觸。低于截留分子量的小分子和蛋白可被送回血液。
生物反應器2可將處理后的(如修飾的或解毒的)血液輸送到靜脈滴注室74和靜脈管道76，靜脈滴注室還可作為監(jiān)測血液中空氣的裝置的一部分。此外，該系統(tǒng)還可監(jiān)測滴注室74內的壓力，即靜脈壓(Pv)。由此可計算出柱壓(PI-Pv)。
血漿穿過微器官培養(yǎng)體時可被超濾，優(yōu)選的是在血流通過生物反應器2的同時進行。泵78的吸力可使血漿穿過微器官培養(yǎng)體室而進入濾液室，并在聚集后進入濾液滴注室80，然后流經(jīng)細胞過濾器82，如0.45μm濾膜，這樣可確保細胞或大分子不會進入受試者。測量濾液滴注室80的壓力(P2)，由此可計算出膜壓(PI-P2)。過濾器82可檢測并容納由微器官培養(yǎng)體滲漏出的所有細胞。然后將濾液與來自生物反應器2的血流重新混合。優(yōu)選的是將過濾器82的出口與一個三通(如Y形或T形)管的接頭相聯(lián)接，該三通管有一個接頭與氧合器管線聯(lián)接，管線另一端為氧合器，這樣就可以對流體充氧。
因此，圖4所示的濾液循環(huán)可產(chǎn)生一種跨微器官培養(yǎng)體室的壓力差，從而促進血清流過微器官培養(yǎng)體。優(yōu)選地，還可在動脈管道64與注射器68之間的管線上裝一個壓力傳感器84。壓力傳感器84可監(jiān)測從受試者到生物反應器2的動脈血的壓力。此外，優(yōu)選的是在與生物反應器2聯(lián)接的入口管處用一個壓力傳感器來監(jiān)測將肝素等抗凝劑泵入動脈管線后的壓力。優(yōu)選地，還可將其它壓力傳感器裝在出口靜脈管線上來監(jiān)測返回受試者的流體，或裝在回流管的不同位置來提高安全性。這樣就可利用壓力傳感器來監(jiān)控受試者的接入壓和回流壓以及跨裝置的壓力，從而探測裝置的堵塞或破裂問題。此外，在過濾器82兩邊使用壓力傳感器可監(jiān)控由裝置釋放的任何細胞顆粒或大顆粒。
完整的管道組86包括上述實施方案中使用的所有管道。優(yōu)選地，管道組86是由聚氯乙烯(PVC)擠壓管等制成，其級別一般應能夠用于在血液透析、治療性血漿置換和心臟直視手術中使用的系統(tǒng)。優(yōu)選的是將管道的泵送段設計成能在約100-500ml/分鐘，優(yōu)選的是250ml/分鐘，的血液流速下工作約120小時而不會逐漸破裂并導致受試者血液損失。管道組86中的模壓制件可含有硬PVC、Lexan HP樹脂等材料，并且可設計成能夠在符合上述應用的環(huán)境中與PVC管長期高強度結合。管道組86的消毒方法包括，用環(huán)氧乙烷對管道組86進行消毒。
此外，如圖4所示，可利用控制系統(tǒng)88來對整個系統(tǒng)的運轉進行控制?？刂葡到y(tǒng)88可以是包含多個模塊的單整合系統(tǒng)，也可以是分離的模塊。其中有一個模塊用于控制雙泵系統(tǒng)的運行。這種控制模塊可以在市場上買到(例如從CGH，Inc.of Lakew，Colo購買BSM-22DualPump Blood Safety Module)。
控制系統(tǒng)88的另一模塊為輔助監(jiān)控裝置(AMU)，可用來監(jiān)測壓力、通過輔助鍵盤等接收操作者的報警設定，以及在達到某些報警極限時通知操作者。控制系統(tǒng)88的第三個模塊是一種靜脈壓監(jiān)測器(VPM)，可在治療期間監(jiān)測體外回路中返回受試者的靜脈壓。VPM也可以從CGH公司購買，它可包含有兩種報警器。第一種報警器有一個上下限幅器，可在壓力值比選定值低40mmHg或以上、或比選定值高70mmHg或以上時觸發(fā)警報。第二種報警器即所謂的“溢出”報警器，可在壓力值高于+450mmHg或低于+10mmHg時觸發(fā)警報。當報警器被觸發(fā)時，血液泵將停止。VPM包括壓力傳感元件及電源。
優(yōu)選地，該說明性裝置的管道及其結合處可承受3個大氣壓(2,300mmHg)的正壓(由內向外)和0.75個大氣壓的負壓而不會出現(xiàn)嚴重損壞或在管道組內部與外部之間逐漸泄漏的情況。這種設計的起因是考慮到，一般用于體外處理的泵和管道可在大約0.7個大氣壓的負壓和1.5個大氣壓的正壓時達到其傳輸極限。上文確定的壓力范圍包含這些極限值，因而是一種合理的安全范圍。
優(yōu)選地，血液流速的可調范圍是0-500mls/分鐘。其原因有幾個方面。已經(jīng)明確的是，連續(xù)血液透析可在150mls/分鐘的血流速率下有效進行。與此相比，安靜狀態(tài)下正常腎臟中的流速約為1,000mls/分鐘。而肝臟的儲備能力要低于腎臟，因而最大流速在約為1,500ml/分鐘的安靜狀態(tài)下正常肝臟的血液流速中占有較大的比例。另外還知道，這種體外流速可利用常規(guī)的血液接入裝置來實現(xiàn)，如單腔或雙腔鎖骨下導管。更高的血液流速會提高治療的效果。
再循環(huán)管道組的再循環(huán)流速，如排出流速，可約為5-120ml/分鐘，優(yōu)選的則約為20-80ml/分鐘。也可根據(jù)占血液流速的比例來定義該流速。例如，排出流速約占血液流速的5％-30％，優(yōu)選的則占血液流速的10％-20％。優(yōu)選的是為操作者提供一份相對于血液流速的再循環(huán)流速表，作為選擇，也可優(yōu)選地將這些數(shù)據(jù)保存在控制系統(tǒng)88的存儲器中。
此外，或作為選擇，如果血液已經(jīng)是被生物修飾的流體，可優(yōu)選地在濾液回路上用一種血紅蛋白監(jiān)測器來顯示一個或多個微器官培養(yǎng)體小室的所有泄漏情況。還可以用血紅蛋白監(jiān)測器來檢測毛細血管外空間的任何細胞損失或顆粒損失，因為這些細胞能夠使光散射，并相應地降低監(jiān)測器的輸出值。此外，還可將血紅蛋白監(jiān)測器與多種報警電路相聯(lián)接，用來指明需要操作者注意的地方?？梢园褖毫鞲衅鹘拥筋愃频膱缶到y(tǒng)中，或是壓力傳感器本身就具有一種報警系統(tǒng)。血紅蛋白監(jiān)測器和壓力傳感器可以與一個控制器相聯(lián)接，并用來關停閉合循環(huán)系統(tǒng)的一個或多個泵。優(yōu)選的是利用可檢測60份血漿中的1份積壓紅細胞的血紅蛋白光學監(jiān)測器來檢測再循環(huán)線路的血液損失。優(yōu)選地，該檢測方法應即能檢測完整的紅細胞，又能檢測特定量的完全溶血的細胞。
此外還可以在系統(tǒng)配置中添加一種動靜脈瘺，這樣就無需使用與動脈管道64連接的泵。另外還可將結構修改成適于用單個針頭進行接入，方法是在生物反應器2的任一端添加一個貯器，同時在回流線路上加一個血液泵。在確定本發(fā)明所述裝置的操縱方法時，采用的是常規(guī)的醫(yī)療操作，普通技術人員即能夠很好地掌握設備的裝配方法。簡單地說，負責設備裝配的操作者需要將管道組86接在控制部件88上，并將泵頭正確地擰入泵66和78(如果存在)，將壓力監(jiān)控管與壓力監(jiān)測器74(如果存在)相聯(lián)接，設置適合于起動模式的報警設定值，在抗凝劑(如肝素)注射器68中裝滿規(guī)定劑量的肝素，并將肝素注射器68與管道72相聯(lián)接，再用控制部件88控制肝素注射器68，并將起動液加入動脈管64。起動液可以是一般的生理鹽水。
對血液接入而言，負責該操作的醫(yī)生需要確定適當?shù)某绦?，并實施血液接入的操作。該操作必須要以上文所述的流速來輸送血液，這是實現(xiàn)對受試者的預定治療效果所必需的。接入的血液需要如上所述用肝素等進行適當?shù)目鼓幚?。本發(fā)明所述裝置的工作原理要求某些血載物質能夠不受阻礙地進入裝有微器官培養(yǎng)體的灌注室，并可同樣由微器官培養(yǎng)體進入血液。應該避免由抗凝作用不足而導致這種運載能力受損的情況出現(xiàn)。在循環(huán)開始時，應特別注意準備過程中出現(xiàn)接入口內郁積而導致凝集的問題。
首先應連接受試者接入線路，如動脈管64。將起動液引入動脈管64，其速率需足以確?；亓鞴?6和回流線路聯(lián)接中沒有殘存空氣。聯(lián)接完畢后中斷起動液的流動，使醫(yī)生能夠監(jiān)控管道，以確保聯(lián)接處不存在非容許數(shù)量的空氣。然后聯(lián)接動脈管64。
開始操作時，將泵66起動。松開靜脈管76上的夾子，并注入肝素。檢查壓力監(jiān)控室的讀數(shù)，并在必要時進行調整。繼續(xù)操作時，操作者和助理人員應定期檢查裝置的滲漏情況、旁路管道組的血細胞聚集情況以及監(jiān)測室的讀數(shù)是否正常。監(jiān)測室的讀數(shù)若與額定值的差異大于0.5cm，就需要重新調整，其中額定值為滴注室的50％或更高。經(jīng)常調整監(jiān)測室的給定值會促使操作者去充分檢查管道的細微滲漏情況。另外還應監(jiān)測注射器68的抗凝劑剩余量，并在適當情況下進行更換。
當需要結束操作并拆卸裝置時，可依次終止泵66和肝素注射，然后夾緊動脈管64。利用流體或空氣置換方法使系統(tǒng)中剩余的血液返回受試者，然后夾緊靜脈管76。此時可以將控制部件88與聯(lián)接的管道組86以及治療裝置從重癥監(jiān)護室或使用區(qū)移走。
上文的敘述以本發(fā)明的裝置和方法為重點。以下則是成功制備可用于本發(fā)明所述裝置和方法的微器官培養(yǎng)體的實例，以及在體內使用本發(fā)明所述裝置的實例。這些實例只是用于說明，而不作為限制。
如下文說明性實施例所述，分離自肝臟的微器官培養(yǎng)體已在培養(yǎng)基中培育長達48天。但將培養(yǎng)體維持多于48天的情況亦處在本發(fā)明的范圍內。
構成本發(fā)明所述實施方案的裝置和方法不但可采用上文所述以及圖1、2、3、4和17所示的配置方式，也可均采用能夠移植于體內的配置方式。在那些可移植于體內的配置方式中，血液必須流經(jīng)的小室4的主壁是由生物相容性半透膜構成。這種膜有利于血液成分擴散到小室中，也有利于器官分泌物擴散到小室外，并且在植入受試者后可通過血管重新生成作用而被血管化。這些新血管可以為小室中的MCs提供血液，也可以使分泌物或代謝物返回受試者。
如果將微器官培養(yǎng)體與來自一種細胞懸浮液的細胞共培養(yǎng)以形成一種連續(xù)平面器官，即可提高構成本發(fā)明所述實施方案的裝置和方法的效率。來自細胞懸浮液的細胞與MCs之間的相互作用會使來自細胞懸浮液的細胞發(fā)生一定程度的組織化。
作為不限制本發(fā)明范圍的實例，細胞懸浮液可來源于一種干細胞群體。這些干細胞可以是，例如，全能性胚胎干細胞，它們對微器官的微環(huán)境產(chǎn)生應答的可能性很高，因而可摻入平面器官而成為其組成部分，并且可發(fā)生分化。這些干細胞可以是，例如，骨髓干細胞、神經(jīng)干細胞或其它任何有多種分化方向的干細胞，這些干細胞的分化方向取決于其微環(huán)境中的信號。這些部分組織化的細胞可補充MC的功能，并且可提高裝置的整體活性。
由于器官衰竭的緊迫性和醫(yī)療突發(fā)事件的不可預測性，有利的做法是提前制備MCs并大量儲備，以供后期使用。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，可將微器官培養(yǎng)體冷凍保存，并在使用前融解。在下文的實施例中將提供相關的實驗數(shù)據(jù)。
在MC的制備、操作和保存過程中，器官片承受的壓力會導致其結構受損，這會限制MC的功能，因此本發(fā)明提供將器官和器官片不經(jīng)培養(yǎng)而直接冷凍保存的特定實施方案。根據(jù)這些實施方案，可將完整器官或器官的一部分冷凍保存，然后冷凍切片至厚度約為200-400或450微米，用于形成微器官。冷凍的MCs可繼續(xù)保存，直至使用，也可立即融解并使用。
該方法可確保組織和細胞在切片過程中承受的壓力最小，并允許將組織精確切至所需的厚度。
利用該領域普通技術人員所了解的多種方法均可將器官或器官的一部分冷凍保存。有一種制備冷凍保存器官的方法，作為非限制性實例，其步驟包括(a)用一種冷凍保存液對器官進行體內灌注，使器官內的血液被置換成該冷凍保存液；(b)將器官由動物轉移到一種含有冷凍保存液的小室中；(c)將器官的一部分冷凍；并且(d)在冷凍后將冷凍部分切割成適當大小的切片。
該領域普遍了解的任何常規(guī)冷凍保存技術均可用來進行冷凍。作為不限制本發(fā)明范圍的實例，冷凍保存液可以是含有約5-30％DMSO(二甲亞砜)的諸如DMEM等適當培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還可添加海藻糖、葡糖以及該領域已知的其它添加劑。器官或器官的一部分可逐漸冷卻或快速冷卻，直至組織達到0℃以下的冷凍溫度，更優(yōu)選的是達到-70--100℃，最優(yōu)選的則是達到約-160℃。逐漸冷凍至-160℃的最簡單方法是將器官或其部分或器官切片以受控方式逐漸浸沒在液氨中。
為了由器官的冷凍部分制備出微器官，可利用適當方法將冷凍后的完整器官修整成適當大小的片段。作為選擇，也可以將冷凍前的器官修整成適當大小的片段，方法是直接由供體獲得器官片段，或是由供體取出器官后再將器官切成片段。
片段的大小可根據(jù)器官來源、預定用途以及隨后將其制備成MCs的方法而有所不同。作為不限制本發(fā)明范圍的實例，可將來源于完整器官的肝臟或腎臟片段切成長度和厚度均約為1/2至數(shù)厘米的矩形方塊。保持這些片段的冷凍狀態(tài)，并將其轉移到適當?shù)睦鋬銮衅b置中，利用該裝置將片段制成厚度約200-400或450微米的切片，同時保持組織的冷凍保存狀態(tài)。適當?shù)睦鋬銮衅b置可包括，但不必局限于，諸如低溫切片機或冷凍切片機等該領域已知的裝置。傳統(tǒng)的低溫切片機需進行改造，使其具有適當?shù)膴A具來固定器官/器官片段，從而使裝置能夠切出厚度約為200-400或450微米的切片。由于低溫切片機一般是用來制備組織學檢查使用的更薄的切片，因而進行這種改造十分必要。
利用上述方法由器官或器官片段獲得的外植塊的長度約為1/2至數(shù)厘米，厚度約為1/2至數(shù)厘米，寬度約為200-400或450微米，這種外植塊可作為單個微器官。由于微器官在制備過程中始終保持冷凍狀態(tài)，因而可將其貯存或立即使用。貯存時可使用該領域普通技術人員所了解的一種適當裝置，如液氮瓶或Revco超低溫冰箱。
上文主要以肝臟為例，但本發(fā)明的優(yōu)選實施方案還包括腎MC裝置和方法，以及肝與腎MCs均使用的裝置和方法。其它器官也可以使用。
由于腎臟的一個重要功能是將尿素等小分子排泄出體外，因此本發(fā)明還提供一種利用裝置中添加的透析部件來實現(xiàn)這種功能的實施方案。
參考圖17，該實施方案顯示一種裝置112，該裝置在充滿血漿116的半透膜110中含有微器官102。在裝置的外壁112內有一種貯器，可貯存流經(jīng)該裝置的受試者血液。在該裝置的如圖所示的體外實施方案中，血液可由裝置112的一端管道104進入，由另一端管道106離開。結構的完整性由硅墊片116和聚碳酸酯板119來維持。用彈力夾(未畫出)將整個裝置合成一體。透析作用是由含透析溶液124的透析室122來完成，由于透析室122緊靠半透膜110，所以可吸收由微器官102分泌到血漿116中并向外擴散過半透膜110的小分子。利用能夠與透析室122傳遞流體的管道126和128可不間斷地或定期地更換透析溶液124。
通過下文的非限制性實施例，該領域的普通技術人員將了解本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和新特點。此外，上文所述的以及下文權利要求部分申請專利保護的本發(fā)明的每個不同的實施方案和方面都可在下文實施例中找到實驗證據(jù)的支持。
實施例
以下實施例可供參考，這些實施例將與上文的敘述一同來對本發(fā)明進行說明。
一般而言，文中使用的術語和下文有關重組DNA技術的實驗方法均是該領域所熟知并經(jīng)常使用的。克隆、DNA與RNA的分離、擴增和純化均采用常規(guī)技術。涉及諸如DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內切酶等的酶反應一般是根據(jù)產(chǎn)品說明書來進行。這些技術以及其它不同的技術一般都按照Sambrook et al.，分子克隆實驗手冊，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)來實施。以下將該手冊稱為“Sambrook”。書中提供了其它的一般參考文獻。其中的方法被認為是該領域眾所周知的，并且以方便讀者的形式提供。其中包含的所有信息均在此引入作為參考。
以下是在下文實施例所述實驗中使用的材料與方法，僅供參考。
材料與方法用于微器官培養(yǎng)體的外植體
可分離出能夠在本發(fā)明所述裝置中使用的肝微器官培養(yǎng)體或腎微器官培養(yǎng)體的動物包括，例如，人和其它靈長類動物、豬，例如完全或部分近親繁殖的豬(如微型豬和轉基因豬)，以及嚙齒動物等。肝組織可來源于同種異體的肝臟組織，如不適于移植但仍含有存活肝細胞的人類肝臟的小葉。
也可使用異種異體的器官，其中包括，但不局限于，牛和山羊的器官，優(yōu)選的則是豬的器官。盡管長期暴露于異種抗原會引起免疫反應，但從短期來看，由于可避免受試者的血液細胞與肝微器官培養(yǎng)體相接觸，因而免疫應答在最初的臨床體驗中并不是一個問題。培養(yǎng)基
有多種組織培養(yǎng)基可用于動物細胞的培養(yǎng)。其中有復合型的，也有簡單的。器官的微器官培養(yǎng)體可在復合培養(yǎng)基中生長，也可在諸如Dulbecco’s基本培養(yǎng)基等簡單培養(yǎng)基中維持。此外，盡管培養(yǎng)體可在含有血清或其它生物提取物的培養(yǎng)基中生長，但血清或任何其它生物提取物都不是必需的(例如，參考美國專利申請08/482,364)。而且器官培養(yǎng)體可在不含血清的條件下維持很長一段時間。因此，在體外維持培養(yǎng)體的過程中，培養(yǎng)基內不必含有生長因子。
但也可通過添加這些因子或將其它特定細胞接種到培養(yǎng)體內來促進、改變或調節(jié)培養(yǎng)體細胞的增殖和成熟。這些因子包括，但不必局限于，胰島素、生長激素、促生長因子、集落刺激因子、促紅細胞生成素、表皮生長因子、肝紅細胞生成因子(肝促紅素)，以及肝細胞生長因子、前列腺素、白介素和天然的生長抑制因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-β家族的成員、肝細胞以及腎細胞。培養(yǎng)小室
微器官培養(yǎng)體可維持在任何適當?shù)呐囵B(yǎng)小室中，并且可維持在37℃和5％CO2的條件下?？蓪⑴囵B(yǎng)物進行振蕩以促進通氣。培養(yǎng)小室通?？梢允侨魏尾牧虾?或)形狀。有多種不同的材料可用來制成小室，其中包括，但不局限于尼龍(聚酰胺)、滌綸(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸脂、聚乙烯化合物(如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE、特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纖維素、棉花、聚乙醇酸(PGA)、腸線縫線、纖維素、明膠、葡聚糖等。這些材料中的任何一種都可編制成網(wǎng)。
若要長時間維持培養(yǎng)體或是將其冷凍保存，優(yōu)選的是使用諸如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、乙烯類聚合物、特氟隆、棉花等非降解性材料。可按本發(fā)明使用的一種適當?shù)哪猃埦W(wǎng)為Nitex，它是一種平均孔徑210微米、尼龍纖維平均直徑90微米的尼龍濾網(wǎng)(#3-210/36，Tetko，Inc.，N.Y.)。微器官的制備
腎臟或肝臟基本可取自適當?shù)恼９w動物(在下文實施例中為大鼠或小鼠)。對小型嚙齒動物而言，可將腎臟沿中線切成大致相等的兩半。對大型動物和人類而言，可沿中線切成厚度各約1-5cm的適當大小的數(shù)塊。然后用傳統(tǒng)的組織刀沿中線或橫向切成厚度約300微米的外植塊。然后按以下各實施例所述對所得MCs進行體外培養(yǎng)、來自體內灌注和體內灌注?；緦嵤┓桨?br> 本發(fā)明的基本實施方案，以下稱為基本裝置，須滿足兩條很特定的標準(i)MCs與待修飾流體之間的接觸面積最大；以及(ii)流體量最小。該基本裝置的制備方法如下將微器官彼此相鄰地鋪在5×25cm的聚碳酸酯片上，使MCs將125cm2的整個區(qū)域覆蓋。這需要約3.5克肝臟(約相當于300-350g大鼠的肝臟總質量的30-40％)。該基本實施方案如圖1B所示，其描述見上文。用另一張相同尺寸的聚碳酸酯片覆蓋MCs(組合件A)。將整個組合件A裝到5.5×25.5cm的扁平尼龍袋中則構成小室4。兩端分別插上P90聚丙烯管6和24，再用熱封機將兩端密封。下文實施例15、16和17的實驗均使用本發(fā)明的該基本裝置。免疫隔離實施方案
本發(fā)明的免疫隔離實施方案，以下稱為免疫隔離裝置(見圖2A)，是基本裝置的改進形式，該裝置將其中包含的MCs密封在半透膜30中，使血漿能夠穿膜與MCs接觸，同時防止血細胞發(fā)生這種接觸。該裝置基本上可利用血液將相同濃度的氧氣輸送到每個MC的所有表面細胞，無論是在裝置的入口處還是出口處。只有在氧氣穿過300微米厚的MCs時才會形成濃度梯度。由于紅細胞與MCs之間只隔有一層膜，所以該免疫隔離裝置還可進行實時血漿過濾，以促使紅細胞緊鄰MCs，并在數(shù)微米，而不是數(shù)毫米，的短距離條件下發(fā)生血漿分離。因此，MCs并不直接與血液接觸，而是只與血漿接觸。在此將對該實施方案做詳細描述。為了將該裝置與動物或患者聯(lián)接，可利用蠕動泵從髂動脈吸出血液。在生物反應器內，血漿可濾過半透膜30而被微器官中的細胞處理。處理過的血漿不斷擴散出去，并再次進入半透膜30周圍的血液，但仍處在該裝置的小室4中。用另一個蠕動泵從該裝置的小室中吸出血液，并使其返回被治療受試者的頸靜脈。下文實施例20的實驗采用本發(fā)明的該實施方案。
免疫隔離裝置須滿足幾個很特定的標準(i)MCs與待修飾流體之間的接觸面積最大；(ii)流體量最??；(iii)MCs的兩個大表面均與流體接觸；(iv)由血液實時分離血漿，以確保運輸氧氣的是緊鄰MCs的血液中的最有效載體，即血紅蛋白。透析免疫隔離實施方案
圖17顯示的透析免疫隔離實施方案，以下稱為透析免疫隔離裝置，是免疫隔離裝置的改進形式。它具有免疫隔離裝置的所有特征，此外還在含血液室108內插有一種常用于血液透析的透析部件122，因而可對含血漿室110中的血漿進行透析。在附加實施方案中，如圖所示，透析部件122的放置方法使其能夠對血液108和血漿116都進行透析。透析部件122充滿了常用于血液透析的透析溶液124。通過將附加管道126和128與分離的蠕動泵(未畫出)相連可不斷地更換透析溶液。作為選擇，也可通過定期沖洗所述附加管道來更換透析溶液。這種配置可將相同濃度的氧氣輸送到每個MC的所有表面細胞，無論是在裝置的入口處還是出口處。只有在氧氣穿過300微米厚的MCs時才會形成濃度梯度。該裝置還可進行實時血漿過濾，因此MCs102并不直接與血液108接觸，而是只與血漿116接觸。該裝置通過管道104和106與動物聯(lián)接。由兩個蠕動泵驅動的附加回路可促使透析液進入該裝置的透析部件122。透析液在進入該裝置前可流經(jīng)一種能夠調節(jié)氣體、葡糖和小分子的小小室。該透析免疫隔離裝置須滿足幾個很特定的標準(i)MCs與待修飾流體之間的接觸面積最大；(ii)流體量最??；(iii)MCs的兩個大表面均與流體接觸；(iv)由血液實時分離血漿，以確保運輸氧氣的是緊鄰MCs的血液中的最有效載體，即血紅蛋白；以及(v)添加透析部件后，有可能利用擴散過小孔透析膜的方法來調節(jié)氣體和小分子的濃度。下文實施例18和19的實驗采用本發(fā)明的該實施方案。
實驗結果
下文實施例1-13和21-26涉及對只含肝組織的MCs的實驗。實施例1-12、22、23和26敘述對只含肝組織的MCs的體外實驗。實施例13、21、24和25涉及活體血液對肝MCs的體外灌注。實施例14-20涉及與腎MCs有關的實驗。實施例17演示了腎MCs與肝MCs在同一裝置中的應用。實施例20涉及來自某一物種但與另一物種或受試者聯(lián)接的MCs的應用。實施例14-17敘述的是體外實驗。實施例18-20敘述活體血液對MCs的灌注。實施例27-30則對本發(fā)明及其優(yōu)勢和應用做進一步的詳述。
實施例1
肝微器官培養(yǎng)體的制備
小鼠肝微器官培養(yǎng)體的制備方法如下。取出器官并用解剖刀切成寬2mm、長3mm的適當片段，再用組織刀或其它適當?shù)那懈罘椒ㄇ谐珊?00微米的切片。將這些微器官放在24孔微量滴定板中，然后置于5％CO2及37℃條件下的不含胎牛血清(FCS)的400ml Dullbeco’s基本培養(yǎng)基(DMEM)中，并以12rpm的速度持續(xù)振蕩1-8天。每孔培育20個微型外植塊。
實施例2
肝微器官培養(yǎng)體的細胞增殖測定
將幾個小鼠器官切成微器官培養(yǎng)體，并利用實施例1的微器官細胞培養(yǎng)技術在37℃增濕培養(yǎng)箱中進行無血清培養(yǎng)。細胞分裂的評定是利用標準方案(Kobayashi，et al.(1994)，J Biomater Sci Polym Ed6(4)325-42)對摻入的氚標記胸腺嘧啶脫氧核苷進行測量。其結果說明在培養(yǎng)期間可進行DNA合成(圖5)。另外還按實施例1所述將小鼠肝微器官培養(yǎng)體培育14天，并用溴脫氧尿苷脈沖標記4小時，然后固定，并用抗溴脫氧尿苷的熒光抗體進行染色，以標記有絲分裂的細胞核(Sigma Chemical)。在這些培養(yǎng)體中觀測到DNA合成十分活躍的細胞核(數(shù)據(jù)未顯示)。該結果說明MCs可在體外長期存活，并能夠來自體內增殖。
實施例3
微器官培養(yǎng)體中的小鼠肝細胞可產(chǎn)生白蛋白
白蛋白分泌及尿素產(chǎn)量的測定結果(見圖6)顯示，在實施例1的微器官培養(yǎng)體中生長的小鼠原始肝細胞至少可將功能維持4周。ELISA和比色法的測試結果都說明微器官培養(yǎng)體中的小鼠肝細胞可產(chǎn)生較大量的白蛋白(試劑盒No631，Sigma Chem.Co.St.Louis MO)。下文的直方圖顯示每106個細胞每小時產(chǎn)生的白蛋白量。應該指出的是，甚至在培養(yǎng)一個月后，白蛋白的產(chǎn)率仍然很高，與另兩種傳統(tǒng)培養(yǎng)條件相比則尤其明顯。A是取自Nyberg et al.(Cell Transplant，2441-52)的數(shù)據(jù)，B是取自Shatford et al.(J.Surg.Res.，53549-57，1992)的數(shù)據(jù)。此結果說明肝MCs可長時間維持重要的生理功能。
實施例4
小鼠肝微器官培養(yǎng)體中氨向尿素的轉化
分離小鼠肝臟，并利用實施例1的微器官細胞培養(yǎng)技術進行無血清或無外源生長因子的體外培養(yǎng)。利用Urea-Nkit No 640-A(Sigma Chem.Co.St.Louis MO)以標準比色法測量上清液中的尿素和氨含量。圖7所示數(shù)據(jù)說明，微器官培養(yǎng)體中的小鼠肝細胞甚至在培養(yǎng)48天后仍可產(chǎn)生大量尿素。相比之下，Dixit et al.(Transplantation，55616-22)報道的微囊密封的體外大鼠肝細胞在培養(yǎng)1天后的尿素合成值為14.6mg/小時/百萬細胞，培養(yǎng)10天后的值則為11.7mg/小時/百萬細胞。該結果說明肝MCs可長時間維持重要的生理功能。
實施例5
人類肝微器官培養(yǎng)體可長期地將大量氨轉化成尿素
人類肝微器官培養(yǎng)體的制備方法如下。將楔形的人類活體肝臟制成塊。再將肝臟塊切成寬2mm、長3mm的適當大小，然后用組織刀切成厚300微米的切片。將這些切片放在24孔微量滴定板中，其中加有0.4ml含或不含胎牛血清(FCS)的DMEM，然后在5％CO2及37℃條件下以12rpm的速度持續(xù)振蕩。每孔培育20個微型外植塊。每兩天更換培養(yǎng)基，并取樣進行尿素和氨含量測定。圖8顯示分泌到培養(yǎng)基中的任意單位的尿素量，其數(shù)值相當于10-25微克尿素/小時/百萬細胞。
人每天可產(chǎn)生11.2克尿素，而人類肝臟中至少有1011個肝細胞。因此，人類肝細胞的體內尿素產(chǎn)量約為5mg/小時/百萬細胞?？梢钥闯?，人類肝微器官培養(yǎng)體可在體外將氨轉化成尿素，其速率即使不高于正常的體內肝細胞，也是大致相等。
實施例6
人類肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性
按實施例5所述制備人類肝微器官培養(yǎng)體。培養(yǎng)的肝MCs能夠將氨轉化成尿素。結果顯示于圖9。該結果說明在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下至少可將人類器官的重要生理功能維持6天。
實施例7
冷凍保存的肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時仍具有功能
按實施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體，并在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉移至液氮。幾天后，將微器官培養(yǎng)體快速融解，清洗，并在10％FCS中培養(yǎng)幾天。然后進行氨向尿素轉化的能力測定，其結果說明微器官培養(yǎng)體中的肝細胞仍可存活，并能夠發(fā)揮功能，甚至在培養(yǎng)數(shù)天后也是如此。測定結果顯示于圖10，這些結果與培養(yǎng)在類似條件下的新鮮微器官培養(yǎng)體的測定結果有可比性。這說明提前制備和保存鼠MCs以供后期使用的方法是可行的。
實施例8
冷凍保存的人類肝微器官培養(yǎng)體培育在37℃時仍具有功能
按實施例5所述制備人類肝微器官培養(yǎng)體，并在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉移至液氮。幾天后，將微器官培養(yǎng)體快速融解，清洗，并在10％FCS中培養(yǎng)幾天。然后進行氨向尿素轉化的能力測定，圖11顯示的測量結果說明微器官培養(yǎng)體中的肝細胞仍可存活，并能夠發(fā)揮功能，甚至在培養(yǎng)數(shù)天后也是如此。這些結果與培養(yǎng)在類似條件下的新鮮微器官培養(yǎng)體的測定結果有可比性。這說明提前制備和保存人以供后期使用的方法是可行的。
實施例9
封裝在藻酸鹽片中的肝微器官培養(yǎng)體具有代謝活性
按實施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體。將其中的一半封裝在藻酸鹽薄片(厚度約400微米)中。在含有10％FCS的DMEM中將藻酸鹽片封裝的微器官培養(yǎng)體來自體內培養(yǎng)12天。每兩天更換培養(yǎng)基，并取樣進行尿素和氨含量測定。圖12顯示分泌到培養(yǎng)基中的任意單位的尿素量，其數(shù)值相當于10-15微克尿素/小時/百萬細胞。左邊為單獨的微器官培養(yǎng)體，右邊為藻酸鹽片中的微器官培養(yǎng)體。該結果說明封裝的方法是可行的，當需要在醫(yī)療應用過程中將MCs取出人類患者時，此方法可作為潛在的重要考慮因素。
實施例10
培育在100％胎牛血清中的小鼠肝微器官培養(yǎng)體仍具有功能
按實施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體。其中的一半在DMEM和10％FCS中培育5天(左)，另一半在100％FCS中培育5天(右)。每兩天更換培養(yǎng)基，并取樣進行氨和尿素含量測定。結果顯示于圖13，這些結果可證明，肝微器官培養(yǎng)體不但能在體外條件下良好地發(fā)揮功能，而且在更接近全血但經(jīng)常對體外細胞產(chǎn)生毒性的100％血清中也是如此，所以這些結果具有特別的重要性。
實施例11
封裝在平面藻酸鹽片中冷凍并保存于-80℃然后再于37℃培育的
大鼠肝微器官培養(yǎng)體仍具有代謝活性
按實施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)體。將其中的一半封裝在藻酸鹽薄片(厚度約400微米)中。在10％DMSO中將微器官培養(yǎng)體和封裝在藻酸鹽片中的微器官培養(yǎng)體逐漸冷凍至-80℃，然后轉移至液氮。幾天后，將微器官培養(yǎng)體快速融解，清洗，并在10％FCS中培養(yǎng)幾天。每兩天更換培養(yǎng)基，并取樣進行尿素和氨含量測定。圖14顯示分泌到培養(yǎng)基中的任意單位的尿素量(a)和白蛋白量(b)。該結果說明，先封裝、再冷凍保存、然后融解并培養(yǎng)的MCs不會喪失生理功能。
實施例12
確定肝微器官培養(yǎng)體的最佳厚度
小鼠肝微器官培養(yǎng)體的制備方法如下。用剪刀取出器官，并剪成寬2mm、長3mm的適當大小，然后用組織刀或其它適當?shù)那懈罘椒ㄇ谐珊?50-700微米不等的切片。將這些切片放在35mm培養(yǎng)皿中，其中加有2ml含10％胎牛血清(FCS)的F12培養(yǎng)基，然后在5％CO2及37℃條件下以12rpm的速度持續(xù)振蕩3周。每個培養(yǎng)皿含有指定厚度的微器官培養(yǎng)體。每兩天取一次樣并進行常規(guī)組織學處理和尿素產(chǎn)量測定。此外還在培養(yǎng)6天后以1千萬CFUs/ml的濃度用能夠使lac-Z基因轉錄的腺衍生病毒構建體對微器官培養(yǎng)體進行轉導(參考J.Clin.Invest.902598-2607，1992)。轉導兩周后取樣，固定，并測定由重組β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的β-gal含量。圖16顯示β-gal產(chǎn)量隨厚度的變化。獲得最大產(chǎn)量的450微米厚的微培養(yǎng)體器官。與此類似，在培養(yǎng)3周后進行的組織學及尿素產(chǎn)量測定的結果均說明，與150、300和700微米厚的微培養(yǎng)體器官相比，最理想的是450微米厚的微培養(yǎng)體器官。
實施例13含有封裝在藻酸鹽片中的肝微器官培養(yǎng)體的生物反應器可安全地與正
?；铙w大鼠相連接
通過右頸動脈和左頸靜脈將大鼠與上述樣機相聯(lián)接。進行數(shù)小時的血液灌注。同時監(jiān)測幾種生化參數(shù)，其中當然包括整個動物的健康狀況。利用蠕動泵將流經(jīng)微器官培養(yǎng)體的血液重新引入頸靜脈(見圖15，為清晰起見，照片中的大鼠用輪廓表示)。在持續(xù)約8小時的實驗過程中，該動物始終存活著。這說明用MCs來補充活體動物的肝臟功能的方法是可行的。
實施例14腎MCs可長期體外培養(yǎng)并能夠在開始培養(yǎng)4天后被干擾的情況下對pH
進行調節(jié)
如上所述制備腎MCs，并將其培育在含有2mM谷氨酰胺的F-12中。培養(yǎng)4天后，用含有4mM谷氨酰胺和10mM HEPES的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)體的F-12培養(yǎng)基。培養(yǎng)體的氨產(chǎn)量增加，甚至在實驗開始8天后仍是如此(圖20)。這說明微器官可長時間保持活力，并且還能維持內環(huán)境穩(wěn)定，即調節(jié)pH水平。
實施例15
腎MCs可在血液中良好地發(fā)揮功能
如上所述制備腎MCs，并在一種基本裝置中(見上文“材料與方法”)無灌注培養(yǎng)4小時。與類似條件下的肝MCs相比，腎MCs中的尿素濃度隨培養(yǎng)時間的延長而降低，氨濃度則增加(圖19)。由于肝MCs和腎MCs均顯示出該活性，所以此結果說明肝MCs中尿素濃度增加的觀測結果是肝MC生理功能的表現(xiàn)，而不是培養(yǎng)系統(tǒng)的假象。
實施例16腎MCs適用于含有指定培養(yǎng)基、正常大鼠血以及肝切除動物血的來自
體內基本裝置
如上所述制備腎MCs，并在正常動物血(+MC N)、肝切除動物血(+MCHEP)和含有2mM谷氨酰胺的F-12培養(yǎng)基(+MC MED)中培養(yǎng)5小時。作為基準，對含有相同培養(yǎng)基(-MC MED)或正常血(-MCN)但不含MCs的相同的基本裝置(見上文的“材料與方法”)進行培養(yǎng)(圖20A-E)。監(jiān)測pH、碳酸鹽離子濃度、O2飽和度和CO2飽和度隨時間的變化值。腎MCs在培養(yǎng)基和正常動物血或肝切除動物血中能夠同樣良好地發(fā)揮功能。該結果進一步證明，腎MCs適用于補充活體動物的腎臟功能。
實施例17
在基本裝置中組合培養(yǎng)的肝與腎MCs可協(xié)同發(fā)揮功能
如上所述制備腎MCs。按前文所述制備肝MCs。方法基本上是，將正常成體大鼠的肝臟切成表面積為8mm×8mm的肝臟塊。再用組織刀將組織塊切成厚300微米的外植塊。這樣即獲得8mm×8mm×0.3mm的肝MCs。在一種基本裝置(見上文的“材料與方法”)中將腎MCs和肝MCs培養(yǎng)5小時，其比例與正常動物中的比例大致相等(即每1份腎用6份肝)。對含有正常動物血和肝切除動物血的該基本裝置進行來自體內操作。隨著培養(yǎng)時間的延長，pO2明顯降低，而pCO2明顯增加。盡管如此，在腎MCs的調節(jié)作用下，HCO3的濃度仍十分穩(wěn)定(圖21A-E)。這些結果說明混合使用MCs的裝置是可行的。
實施例18腎MCs能夠在與部分腎切除大鼠聯(lián)接的一種透析免疫隔離裝置中良好
地發(fā)揮功能
將一只大鼠的右腎完全切除，左腎70％切除。3小時后將其與包含透析室和小室的一種透析免疫隔離裝置(見上文的“材料與方法”)相聯(lián)接，所述小室中含有相當于該動物腎臟質量的30％的腎微器官。腎MCs的制備方法如上文所述。透析液為不含酚紅但含有5％葡糖、30mg％/HCO3和1％葡聚糖的F12培養(yǎng)基。用16％O2、5％CO2與空氣的混合物對透析液進行連續(xù)充氣。如下表2所示，腎微器官在4個小時的總連接時間內始終具有生物活性。將處理后進入0期昏迷的大鼠移走。完成連接后，從生物反應器中取出MCs，提取RNA，并通過RT-PCR測定MCs的促紅細胞生成素基因轉錄情況。在0時間與腎切除動物聯(lián)接后，MCs能夠以大致相同的水平連續(xù)轉錄促紅細胞生成素。該結果進一步證明，腎MCs適用于補充活體動物的腎臟功能。
表2時間(小時)動脈pO2 透析液pO2 生物反應器pO2
0 113.273.9
1 103.4 159.3 100.8
2 102.6 151.2 110
4 112.6 147.1 114.3時間動脈pCO2 透析液pCO2 生物反應器pCO2 0 35.5 37 1 39.9 18.037.4 2 39.2 19.637.0 4 39.1 21.838.7時間動脈葡糖透析液葡糖生物反應器葡糖 0 96 - 97 2 114 106 74 4 103 112 87
實施例19裝在透析免疫隔離裝置中的腎MCs在與部分腎切除大鼠第二次聯(lián)接后
仍可保持全部活性
24小時后，將實施例18的動物再次與實施例18的含有腎MCs的透析免疫隔離裝置相聯(lián)接。除使用2％葡聚糖溶液外，其余條件與上一實施例相同。動物進入0期昏迷即被釋放，整個實驗過程中的生理參數(shù)均正常。這說明制備24小時后的腎MCs是可以使用的。該結果進一步證明腎MCs適用于補充活體動物的腎臟功能。該結果說明，即使只定期地與動物相聯(lián)接，腎MCs也同樣適用于補充活體動物的腎臟功能。
實施例20裝到一種免疫隔離裝置中的豬肝MCs在與異種大鼠聯(lián)接時可良好地發(fā)
揮功能
完全按照實施例17所述的相同條件制備豬肝MCs，只是組織的來源為豬的肝臟。將含有豬肝MCs的免疫隔離裝置(見上文的“材料與方法”)與正常大鼠相聯(lián)接。在該條件下處理的大鼠未顯示出不良的副作用。此外，根據(jù)耗氧量和葡糖產(chǎn)量的測定結果判斷，來源于豬肝的MCs比大鼠MCs更有活性。另外還發(fā)現(xiàn)，用豬MCs來處理大鼠也未對豬MCs產(chǎn)生不良影響。在零時間、在與正常大鼠聯(lián)接的裝置中使用4小時后，以及在F-12培養(yǎng)基中再體外培養(yǎng)18小時后對MCs進行MTT測定。這三種條件下測量的MTT活性水平都非常高，并且彼此之間難以區(qū)分。此外，在UV顯微鏡下檢驗吖啶橙摻入的結果顯示，這三種情況下的細胞存活率都＞90％。
圖25A-D顯示，豬MCs至少在調節(jié)氧/二氧化碳壓力平衡、碳酸鹽離子濃度和葡糖濃度方面與大鼠MCs同樣有效。在培養(yǎng)基和大鼠血清中都是如此。
這些結果表明，用豬肝臟對豬以外的其它哺乳動物進行處理是可行的。
實施例21
肝MC裝置可明顯延長92％肝切除的大鼠的壽命
在受控體內實驗中，用含有肝MC的本發(fā)明所述裝置對12只肝切除大鼠進行處理(圖22；已處理)。用不含MCs的裝置在相同條件下對另外10只肝切除大鼠進行處理(圖22；對照)。處理時間為4小時。處理完后將動物釋放，并繼續(xù)觀察直至死亡。圖22顯示，利用含有MC的裝置可將存活時間平均延長10個小時。該結果經(jīng)t分布檢驗為有效結果(P＜0.05)。
實施例22
肝MCs在經(jīng)連接至92％無肝大鼠的裝置進行灌注期間和之后
能夠以體內正常水平轉錄白蛋白和凝血因子IX及X的信使RNAs
肝MCs在對本發(fā)明的裝置進行灌注后仍具有功能，并能夠轉錄白蛋白和凝血因子IX與X的mRNA，其使用的RT-PCR方法如下。
逆轉錄的實現(xiàn)方法是，將1μg RNA(約10μl)、0.5μg Oligo-dT(1μl，Promega)和無RNase的H2O(總體積15μl)70℃保溫5分鐘。將混合物放在冰上冷卻，然后添加以下成分5μl RT緩沖液(Promega)、5μl dNTPs混合物(10mM，Promega)、20單位的RNAsin(Promega)和100單位的MLV-逆轉錄酶(Promega)。添加無RNase的H2O至終體積50μl。將反應體系置于42℃保溫60分鐘。
PCR擴增的方法是，制備含有2.5μl 10×反應緩沖液、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、2μl由RT反應獲得的單鏈DNA、0.6mM(1μl)各種引物(上游引物和下游引物)、2.5單位(0.5μl)Taq DNA聚合酶(Promega)的混合物，并加H2O至終體積25μl。循環(huán)條件為第1個循——94℃60秒，TM℃60秒和74℃5分鐘；第2-34個循環(huán)——94℃45秒，TM℃60秒和74℃2分鐘；最后一個循環(huán)——94℃60秒，TM℃60秒和74℃5分鐘，其中TM為下文進一步詳述的每對擴增引物的特征性解鏈溫度。
反應采用以下擴增引物對。擴增白蛋白cDNA的678bp產(chǎn)物時使用TM為45℃的Alb15’-TGAACTGGCTGACTGCTGTG-3’(序列號1)和Alb25’-CATCCTTGGCCTCAGCATAG-3’(序列號2)。擴增凝血因子IX cDNA的821bp產(chǎn)物時使用TM為42℃的IX15’-TCTGT TGCCTACAATTCT-3’(序列號3)和IX25’-TAGTATATATTCCATATT-3’(序列號4)。擴增凝血因子X cDNA的1158bp產(chǎn)物時使用TM為46℃的X15’-ATAAAGAAAGGAAAT CTG-3’(序列號5)和X25’-TCACAAAGTAGGTGTCTT-3’(序列號6)。
在室溫和100V條件下將所有PCR產(chǎn)物在0.5×TBE中進行1.5％瓊脂糖凝膠(BRL)電泳。結果顯示于圖23。
在圖23中，第1-4泳道顯示由白蛋白mRNA的特異性引物產(chǎn)生的718bp條帶。第6-9泳道顯示由凝血因子IX mRNA的特異性引物產(chǎn)生的821bp條帶。第11-14泳道顯示由凝血因子X mRNA的特異性引物產(chǎn)生的1158bp條帶。第5和第10泳道為分子量標準。
第1、6和11泳道的樣品來自灌注前的第175號動物，第2、7和12泳道的樣品來自灌注后4小時的同一動物。第3、8和13泳道的樣品來自灌注前的第176B號動物，第4、9和14泳道的樣品來自灌注后4小時的同一動物。這兩只動物在灌注后均可轉錄所有3種肝臟基因，說明肝MCs可在灌注過程中維持其復雜的生理功能。
實施例23
對利多卡因消耗量的測定結果說明
來自體內培養(yǎng)在受控條件下的MCs可顯示出P450功能
對來自體內培養(yǎng)的MCs進行利多卡因代謝測定，作為其肝臟功能的另一種指標(圖24)。培養(yǎng)基中的利多卡因濃度持續(xù)下降了30個小時，說明微器官培養(yǎng)體的肝細胞具有攝取利多卡因的P450功能。
實驗采用以下材料。DMEM培養(yǎng)基；HEPES；青霉素-鏈霉素溶液(10,000單位，10mg/ml)購買于Biological Industries Ltd.，Israel。甘氨酸；葡糖；谷氨酰胺；胰島素；皮質醇購買于Sigma Israel。利多卡因(Esracain2％鹽酸利多卡因，200mg/ml)購買于MedicalLaboratories Ltd.，Israel。
在補加有2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、1/500(體積比)的抗生素溶液；3mM甘氨酸；2克/升(重量體積比)的葡糖；1mg/％(重量體積比)胰島素；7.5μg/ml皮質醇的每毫升DMEM培養(yǎng)基(無酚紅)中放4個Lewis大鼠肝MCs，開始培養(yǎng)時將80μg/ml(重量體積比)的利多卡因添加到培養(yǎng)基中，然后在37℃和5％CO2/95％空氣的增濕培養(yǎng)箱(FormaScientific)中培養(yǎng)48小時。在下文所述的時間點取100μl培養(yǎng)基樣品至微量離心管中，2,000rpm離心，然后保存于-20℃，直至利用熒光偏振免疫測定法進行TDx/TDxFLx利多卡因測定，測定采用商品化試劑和Pape B.E.et al；Clinical Chemistry24(11)2020-2922，1978的方法。結果總結于下表3。
表3
時間(小時)鹽酸利多卡因μg/ml
T0-10.50 AM 0 62.2
T1-18hr PM 7.1 33.9
T2-11hr AM 24.123.7
T3-17hr PM 30.120.9
實施例24
含有MC的裝置可避免與其連接的無肝大鼠惡化達13小時
當無肝大鼠與含有肝MCs的本發(fā)明所述裝置連接時，可以從II期昏迷恢復到I期昏迷，甚至可恢復到0期。這些大鼠在長達13個小時的整個灌注期內始終保持在該昏迷期。這些結果說明，本發(fā)明在肝衰竭病例中具有潛在的臨床實用性。
實施例25
冷凍保存后的肝MCs仍可恢復功能
配制并測試一系列不同的冷凍保存液(表4)。用MTT和吖啶橙染色法評定冷凍保存72小時并融解后的細胞活力(圖26A和B)。根據(jù)這些標準來判斷，最有效的是含有20％DMSO和100mM海藻糖的溶液(S4)，因而將其應用于其它研究。由二氧化碳產(chǎn)量、耗氧量、pH調節(jié)和葡糖產(chǎn)量的來自體內測試結果發(fā)現(xiàn)，冷凍保存的MCs表現(xiàn)出與新制備的MCs類似的性能(圖27A-D)。
表4MC的冷凍保存條件的優(yōu)化**在液氮中將S1-S6各溶液中的肝MCs冷凍72小時。
這些冷凍保存方法具有重要意義，原因有三點。第一，這些方法允許用中央設施來制備MCs?？梢灾苽涑龃笈鶰Cs并將其冷凍保存。在銷售和使用前可由每批抽樣融解并測試性能。
第二，可在1個小時之內將保存在液氮中的MCs安裝到功能性生物裝置中。這一點對處理急性器官衰竭患者而言至關重要。
第三，利用這種方式可將用于移植但仍未移植的供體人類器官無限期保存，以供后期使用。將這種方法與上文所述的免疫隔離裝置協(xié)同使用可幫助消除器官排斥的問題，并且可提高供體器官的實際使用百分率。
實施例26
肝平面器官的制備
由轉基因Rosa26小鼠(參考Kennedy et al.(1997)Blood，1，90(3)986-93)獲得可通過組成型啟動子表達β-半乳糖苷酶的原始肝臟間充質細胞。將表達轉基因β-半乳糖苷酶的細胞植入MCs，然后可利用簡單的比色反應來鑒別這些細胞。
將轉基因間充質細胞植入原生肝MCs中，并進一步保溫在適當條件下。如圖28所示，MCs中摻入了轉基因細胞(藍色)。該結果論證了將多個摻有間充質細胞的MCs結合成平面器官的可能性。
實施例27
冷凍微器官表現(xiàn)出能與新鮮微器官一樣良好地發(fā)揮功能
通過4項實驗來評定冷凍微器官相對于新鮮微器官的功能性。按本發(fā)明所述制備冷凍微器官。用改進的Krebs溶液和MEM-α溶液對大鼠肝臟進行灌注。分離出肝小葉并切成0.8cm的小塊。將肝臟塊在冰上放30分鐘，然后轉移至-15℃。用Leitz低溫切片機在-15℃的溫度下將冷凍塊切成300微米的切片。然后將切片轉到冰上，放置30分鐘，再用液氮以緩慢冷凍的方法(-1℃/分鐘)進行冷凍。然后迅速浸沒在含有10％胎牛血清的37℃DMEM中(每ml放4個MCs)使切片融解，然后培養(yǎng)在37℃。同時并行制備和培養(yǎng)新鮮微器官以作為對照。所有在培養(yǎng)皿中進行的實驗都是每4片MCs使用1ml FCS。
第一項實驗(表5)是在培養(yǎng)皿中培育由冷凍保存組織獲得的冷凍保存的MCs。第二項實驗(表6)是在圖17所述的裝置中培育由冷凍保存組織獲得的冷凍保存的MCs。第三項實驗(圖7)是在標準培養(yǎng)皿中培育由新鮮組織獲得的冷凍保存的MCs。第四項實驗(表8)則是在標準培養(yǎng)皿中培育由新鮮組織獲得的新鮮的MCs。在這四種實驗設置條件下分別對下文表5-8所示的幾種象征肝臟功能的因素進行監(jiān)測。在這四種不同的實驗條件下，MC的功能未表現(xiàn)出明顯的整體變化。
表5
表6
表7
表8
實施例28移植到大鼠體內48小時后的腎MCs可表達凝乳酶、Epo及T-PA的mRNA
按上文所述制備腎MCs，并移植到大鼠的腹膜腔內。48小時后取出腎MCs，利用RT-PCR分析凝乳酶、Epo和T-PA mRNAs的表達情況，并與時間計算起點時腎MCs中這些mRNAs的表達情況進行比較。
逆轉錄的實現(xiàn)方法是，將1μg RNA(約10μl)、0.5μg Oligo-dT(1μl，Promega)和無RNase的H2O(總體積15μl)70℃保溫5分鐘。將混合物放在冰上冷卻，然后添加以下成分5μl RT緩沖液(Promega)、5μl dNTPs混合物(10mM，Promega)、20單位的RNAsin(Promega)和100單位的MLV-逆轉錄酶(Promega)。添加無RNase的H2O至終體積50μl。將反應體系置于42℃保溫60分鐘。
PCR擴增的方法是，制備含有2.5μl 10×反應緩沖液、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、2μl由RT反應獲得的單鏈DNA、0.6mM(1μl)各種引物(上游引物和下游引物)、2.5單位(0.5μl)Taq DNA聚合酶(Promega)的混合物，并加H2O至終體積25μl。循環(huán)條件為94℃45秒，54℃ 60秒和74℃2分鐘。
反應采用以下擴增引物對。擴增凝乳酶cDNA的657bp產(chǎn)物時使用Rennin15’-GCTTTG GACGAATCTTGC-3’(序列號7)和Rennin25’-AATGTTGAGGGTCACTGC-3’(序列號8)。擴增Epo cDNA的325bp產(chǎn)物時使用Epo15’-ACCACTCCCAACCCTCATCAA-3’(序列號9)和Epo25’-CGTCCAGCACCCCGTAAATAG-3’(序列號10)。擴增T-PA cDNA的493bp產(chǎn)物時使用T-PA15’-GCAGAAAATGGGGCTGAA-3’(序列號11)和T-PA25’-GTTTGTATTGCCTCAGGC-3’(序列號12)。
在室溫和100V條件下將所有PCR產(chǎn)物在0.5×TBE中進行1.5％瓊脂糖凝膠(BRL)電泳。結果顯示于圖29。由圖可見，48小時后的凝乳酶含量增加，而促紅細胞生成素和T-PA的含量降低。
實施例30
與肝-腎裝置相聯(lián)接的無肝動物可表現(xiàn)出幾乎正常的性能
通過Lewis大鼠(體重241克)的髂靜脈和頸動脈將其與一種同時含有腎MCs和肝MCs的本發(fā)明所述體外裝置相聯(lián)接。利用已預先經(jīng)過70％乙醇、生理鹽水和含有200單位肝素的生理鹽水清洗的Harvard泵使大鼠的血液以0.5ml/分鐘的速度流經(jīng)該裝置。該裝置包含一種夾層狀的0.2μm聚碳酸酯膜，其間共含有9.7克肝MCs、0.5克腎MCs和13ml含有供體大鼠血液的培養(yǎng)基。用含有5％CO2的空氣對含有95ml血溶膠、5ml 5.88％HCO3、280mg％葡糖、和4％葡聚糖的培養(yǎng)基進行飽和充氣，并在培養(yǎng)基中添加抗生素和Hepes緩沖液。3天后將大鼠的肝臟切除(取出3.05克肝臟)。與裝置相聯(lián)接的大鼠在肝切除35小時后進入I期昏迷。不進行通氣。死后檢驗的結果顯示未出現(xiàn)腹部大量出血。脾臟、腎臟和胰臟看上去很正常。大鼠呈黃色，其尿液亦呈黃色。按下文表9所述在肝切除后的前5小時內取樣并進行分析。肝切除2小時后將8μl維生素K和0.4ml 25％甘露醇注入大鼠。
因此，每小時取4份樣品，并對每份樣品的血細胞比容(Htc)、pH、pCO2、pO2、碳酸氫鹽(HCO3 mM)以及葡糖進行測定。樣品則來源于進入裝置的動脈血(Art)、離開裝置的血液(Bio)、進入裝置的透析培養(yǎng)基(Min)和離開裝置的透析培養(yǎng)基(mout)。血液氣體的測定采用一種氣體分析儀(ABL-330 Radiometer Copenhagen)。血糖的測定采用常規(guī)的便攜式葡萄糖計(Elite)。此外還在實驗過程中每小時記錄一次昏迷期(C.S.)、呼吸率(Resp rate)和體溫(B.T.)。
表9
盡管已對本發(fā)明連同其特定實施方案進行了描述，但對該領域的技術人員而言，明顯還存在其它的選擇、改進和變化。因而希望將所有處在附加權利要求的精神和范圍內的這些選擇、改進和變化都包括在內。
序列表
序列表<110>Mitrani，Eduardo<120>對流體進行生物修飾的裝置及方法<130>01/23134<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>1tgaactggct gactgctgtg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>2catccttggc ctcagcatag 20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>3tctgttgcct acaattct 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>4tagtatatat tccatatt 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>5ataaagaaag gaaatctg 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>6tcacaaagta ggtgtctt 18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>7gctttggacg aatcttgc 18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>8aatgttgagg gtcactgc 18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>9accactccca accctcatca a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>10cgtccagcac cccgtaaata g21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>11gcagaaaatg gggctgaa18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>單鏈DNA多聚核苷酸<400>12gtttgtattg cctcaggc18
權利要求
1.一種用來對流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；以及
(b)用來對流體進行生物修飾的肝微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的各肝微器官培養(yǎng)體都含有肝細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個肝培養(yǎng)體中位置最深的肝細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本顯微結構，該肝微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
2.權利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
3.權利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)肝平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將來源于肝臟的細胞與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述來源于肝臟的細胞的混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
4.權利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內。
5.權利要求4的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
6.權利要求4的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
7.權利要求1的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述肝微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
8.權利要求7的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過。
9.權利要求7的裝置，其中的多孔膜可限制白細胞和紅細胞通過。
10.權利要求1的裝置，該裝置還包括多個管道，用來與含有待生物修飾流體的受試者相聯(lián)接，所述管道中至少有一個與所述入口相聯(lián)接，并且至少有另一個與所述出口相聯(lián)接。
11.權利要求1的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
12.權利要求4的裝置，其中的薄片的特征是被裝在所述小室內。
13.一種用來對受試者的流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；
(b)用來對流體進行生物修飾的肝微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的每個肝微器官培養(yǎng)體都含有肝細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個肝培養(yǎng)體中位置最深的肝細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本顯微結構，該肝微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸；
(c)具有第一和第二末端的第一管道，所述第一末端用來聯(lián)接受試者以接收受試者的流體，所述第二末端用來聯(lián)接所述入口；以及
(d)具有第一和第二末端的第二管道，所述第一末端用來聯(lián)接所述出口，所述第二末端用來聯(lián)接受試者以使生物修飾后的流體返回受試者。
14.權利要求13的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
15.權利要求13的裝置，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)肝平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將來源于肝臟的細胞與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述來源于肝臟的細胞的混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
16.權利要求13的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
17.權利要求16的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
18.權利要求16的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
19.權利要求13的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述肝微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
20.權利要求19的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過。
21.權利要求19的裝置，其中的多孔膜可限制白細胞和紅細胞通過。
22.權利要求19的裝置，其中的薄片的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
23.一種對受試者的流體進行生物修飾的方法，該方法包括，用受試者的流體對含有肝微器官培養(yǎng)體集合的一種小室進行灌注，以使所述肝微器官培養(yǎng)體集合能夠對流體進行生物修飾，其中所述集合的各肝微器官培養(yǎng)體都含有肝細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個肝培養(yǎng)體中位置最深的肝細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本顯微結構。
24.權利要求23的方法，該方法的步驟還包括，在制備用于安裝在所述灌注室內的所述微器官培養(yǎng)體之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
25.權利要求23的方法，其中的流體為血液。
26.權利要求23的方法，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)肝平面器官中提供，該肝平面器官的制備方法是將來源于肝臟的細胞與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由所述微器官培養(yǎng)體與來源于肝臟的細胞混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
27.權利要求23的方法，其中的肝微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內。
28.權利要求27的方法，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
29.權利要求27的方法，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
30.權利要求23的方法，其中的小室內包含一種多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述肝微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
31.權利要求30的方法，其中的多孔膜允許分子量約為10,000Da-250,000Da的顆粒通過。
32.權利要求30的方法，其中的多孔膜可限制白細胞和紅細胞通過。
33.權利要求30的方法，其中的薄片的特征是在基本裝入所述小室之前被冷凍保存。
34.權利要求23的方法，該方法的步驟還包括，使流體返回受試者。
35.權利要求34的方法，該方法的步驟還包括，至少使所述肝微器官培養(yǎng)體集合分泌的一種產(chǎn)物返回受試者。
36.一種制備連續(xù)平面器官的方法，該方法包括
(a)獲得一種器官的單個微器官培養(yǎng)體的集合，使所述集合的各微器官培養(yǎng)體均含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使該單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體結構；以及
(b)將一種細胞懸浮液添加在所述微器官培養(yǎng)體上，并將該細胞懸浮液與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述懸浮液中的細胞的混合物形成連續(xù)平面器官。
37.權利要求36的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述微器官培養(yǎng)體集合之前，至少將器官的一部分冷凍保存。
38.一種制備連續(xù)肝平面器官的方法，該方法包括
(a)獲得單個肝微器官培養(yǎng)體的集合，使該集合的各微器官培養(yǎng)體均含有肝細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使該單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體肝臟的基本結構；以及
(b)將來源于肝臟的細胞的懸浮液添加在所述肝微器官培養(yǎng)體上，并將所述細胞懸浮液與所述肝微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述來源于肝臟的細胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
39.權利要求38的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述肝微器官培養(yǎng)體集合之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
40.一種用來對流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；以及
(b)用來對流體進行生物修飾的微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的各微器官培養(yǎng)體都含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官結構，該微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
41.權利要求40的裝置，其中，所述器官的所述微器官培養(yǎng)體集合由該器官的冷凍保存部分制成。
42.權利要求40的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將懸浮細胞與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述懸浮細胞的混合物形成所述連續(xù)平面器官。
43.權利要求40的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內。
44.權利要求43的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
45.權利要求43的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
46.權利要求40的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
47.權利要求46的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過。
48.權利要求46的裝置，其中的多孔膜可限制白細胞和紅細胞通過。
49.權利要求40的裝置，該裝置還包括多個管道，用來與含有待生物修飾流體的受試者相聯(lián)接，所述管道中至少有一個與所述入口相聯(lián)接，并且至少有另一個與所述出口相聯(lián)接。
50.權利要求40的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
51.權利要求42的裝置，其中的薄片的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
52.一種用來對受試者的流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括
(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；
(b)用來對流體進行生物修飾的微器官培養(yǎng)體的集合，該集合的各微器官培養(yǎng)體都含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官結構，該微器官培養(yǎng)體集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸；
(c)具有第一和第二末端的第一管道，所述第一末端用來聯(lián)接受試者以接收受試者的流體，所述第二末端用來聯(lián)接所述入口；以及
(d)具有第一和第二末端的第二管道，所述第一末端用來聯(lián)接所述出口，所述第二末端用來聯(lián)接受試者以使生物修飾后的流體返回受試者。
53.權利要求52的裝置，其中，所述器官的所述微器官培養(yǎng)體集合由該器官的冷凍保存部分制成。
54.權利要求52的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將懸浮細胞與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述懸浮細胞的混合物形成所述連續(xù)平面器官。
55.權利要求52的裝置，其中的微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內。
56.權利要求55的裝置，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
57.權利要求55的裝置，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
58.權利要求52的裝置，該裝置還包括一種基本位于所述小室內的多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
59.權利要求58的裝置，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過。
60.權利要求58的裝置，其中的多孔膜可限制白細胞和紅細胞通過。
61.權利要求58的裝置，其中的薄片的特征是在基本裝入所述小室之前被冷凍保存。
62.一種對受試者的流體進行生物修飾的方法，該方法包括，用受試者的流體對含有微器官培養(yǎng)體集合的一種小室進行灌注，以使所述微器官培養(yǎng)體集合能夠對流體進行生物修飾，其中，所述集合的各微器官培養(yǎng)體都含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使所述單個培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持器官單位的活體器官結構。
63.權利要求62的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述微器官培養(yǎng)體集合之前，至少將器官的一部分冷凍保存。
64.權利要求62的方法，其中的流體為血液。
65.權利要求62的方法，其中的微器官培養(yǎng)體集合是在一種連續(xù)平面器官中提供，該平面器官的制備方法是將衍生的懸浮細胞與所述微器官培養(yǎng)體集合共培養(yǎng)，從而由來源于所述微器官培養(yǎng)體的細胞與所述懸浮細胞的混合物形成所述連續(xù)平面器官。
66.權利要求62的方法，其中的微器官培養(yǎng)體集合被封裝在一種生物相容性聚合物薄片中，該薄片被裝在所述小室內。
67.權利要求66的方法，其中的薄片的第一條邊約為10-90cm，第二條邊約為10-90cm，第三條邊約為300-900μm。
68.權利要求66的方法，其中有方向基本平行的多層所述薄片被裝在所述小室中。
69.權利要求62的方法，其中的述小室內包含一種多孔膜，該多孔膜可影響流體與所述微器官培養(yǎng)體集合的接觸。
70.權利要求69的方法，其中的多孔膜允許分子量小于約10,000Da-250,000Da的顆粒通過。
71.權利要求69的方法，其中的多孔膜可限制白細胞和紅細胞 通過。
72.權利要求69的方法，其中的薄片的特征是在基本裝入所述小室之前被冷凍保存。
73.權利要求69的方法，該方法的步驟還包括，使流體返回受試者。
74.權利要求73的方法，該方法的步驟還包括，至少使所述微器官培養(yǎng)體集合分泌的一種產(chǎn)物返回受試者。
75.一種體外裝置，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該裝置包括
(a)一種位于受試者體外的小室，該小室配有能夠與受試者的循環(huán)系統(tǒng)進行流體交通的第一管道和第二管道，從而使血液能夠通過第一管道由受試者流入小室，并通過第二管道由小室流至受試者；以及
(b)裝在所述小室中的多個肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述的多個肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
76.權利要求75的裝置，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
77.權利要求75的裝置，該裝置還包括
(c)處在所述小室內并裝有所述多個肝微器官培養(yǎng)體的生物相容性薄膜，該薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過。
78.權利要求77的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
79.權利要求75的裝置，該裝置還包括
(d)來源于一種細胞懸浮液的細胞，這些細胞與所述多個肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
80.權利要求79的裝置，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于肝臟的細胞。
81.權利要求75的裝置，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
82.一種體內裝置，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該裝置包括
(a)一種可移植于體內的小室，該小室由一個或多個所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；以及
(b)裝在所述小室中的多個肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
83.權利要求82的裝置，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
84.權利要求82的裝置，其中的薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過。
85.權利要求84的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
86.權利要求82的裝置，該裝置還包括
(d)來源于一種細胞懸浮液的細胞，這些細胞與所述多個肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
87.權利要求86的裝置，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于肝臟的細胞。
88.權利要求84的裝置，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
89.權利要求84的裝置，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過。
90.權利要求82的裝置，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
91.一種方法，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使該小室內裝有多個肝微器官培養(yǎng)體，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)當位于患者體外時，在所述小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成一種流體交通，從而使血液能夠通過第一管道由受試者流入小室，并通過第二管道由小室流至受試者，從而使所述肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸。
92.權利要求91的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
93.權利要求91的方法，其中，處在所述小室內的生物相容性薄膜裝有所述多個肝微器官培養(yǎng)體，該薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過。
94.權利要求93的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
95.權利要求91的方法，該方法的步驟還包括，將來源于一種細胞懸浮液的細胞與所述多個肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
96.權利要求95的方法，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于肝臟的細胞。
97.權利要求91的方法，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
98.一種方法，用于為受試者提供一種或多種肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種可移植于體內的小室，該小室由一個或多個所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；和
(b)使該小室內裝有多個肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)將該小室植入受試者。
99.權利要求98的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將肝臟的一部分冷凍保存。
100.權利要求98的方法，其中的薄膜可以使血液成分和肝臟分泌物透過。
101.權利要求100的方法，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
102.權利要求98的方法，該方法的步驟還包括，將來源于一種細胞懸浮液的細胞與所述多個肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
103.權利要求102的方法，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于肝臟的細胞。
104.權利要求100的方法，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
105.權利要求100的方法，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過。
106.權利要求98的方法，其中的多個肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
107.一種體外裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該裝置包括
(a)一種位于受試者體外的小室，該小室配有能夠與受試者的循環(huán)系統(tǒng)進行流體交通的第一管道和第二管道，從而使血液能夠通過第一管道由受試者流入小室，并通過第二管道由小室流至受試者；以及
(b)裝在所述小室中的多個腎微器官培養(yǎng)體，從而使所述的多個腎微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
108.權利要求107的裝置，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的腎臟的至少一部分制成。
109.權利要求107的裝置，該裝置還包括
(c)處在所述小室內并裝有所述多個腎微器官培養(yǎng)體的生物相容性薄膜，該薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過。
110.權利要求109的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
111.權利要求107的裝置，該裝置還包括
(d)來源于一種細胞懸浮液的細胞，這些細胞與所述多個腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
112.權利要求111的裝置，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于腎臟的細胞。
113.權利要求107的裝置，該裝置還包括一種能夠與所述小室進行流體交通的血液透析部件，用于對所述受試者的血液進行透析。
114.權利要求107的裝置，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
115.一種體內裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該裝置包括
(a)一種可移植于體內的小室，該小室由一個或多個所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；以及
(b)裝在所述小室中的多個腎微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個腎微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
116.權利要求115的裝置，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的腎臟的至少一部分制成。
117.權利要求115的裝置，其中的薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過。
118.權利要求117的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
119.權利要求115的裝置，該裝置還包括
(d)來源于一種細胞懸浮液的細胞，這些細胞與所述多個腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
120.權利要求119的裝置，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于腎臟的細胞。
121.權利要求117的裝置，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
122.權利要求117的裝置，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過。
123.權利要求115的裝置，其中的小室包含一種裝有可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個流體交通管道，該管道的遠端裝有一個閥門，選擇的該管道的長度足以使所述閥門位于受試者的體外，從而可用來更換所述透析緩沖液。
124.權利要求115的裝置，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
125.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該方法包括
(a)提供一種配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使該小室內裝有多個腎微器官培養(yǎng)體，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)當位于患者體外時，在所述小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成一種流體交通，從而使血液能夠通過第一管道由受試者流入小室，并通過第二管道由小室流至受試者，從而使所述腎微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸。
126.權利要求125的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個腎微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分冷凍保存。
127.權利要求125的方法，其中，處在所述小室內的生物相容性薄膜裝有所述多個腎微器官培養(yǎng)體，該薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過。
128.權利要求127的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
129.權利要求125的方法，該方法的步驟還包括，將來源于一種細胞懸浮液的細胞與所述多個腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
130.權利要求129的方法，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于腎臟的細胞。
131.權利要求125的方法，該方法的步驟還包括，提供一種能夠與所述小室進行流體交通的血液透析部件，用于對所述受試者的血液進行透析。
132.權利要求125的方法，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
133.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟功能，該方法包括
(a)提供一種可移植于體內的小室，該小室由一個或多個所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；和
(b)使該小室內裝有多個腎微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個腎微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)將該小室植入受試者。
134.權利要求133的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個腎微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分冷凍保存。
135.權利要求133的方法，其中的薄膜可以使血液成分和腎臟分泌物透過。
136.權利要求135的方法，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
137.權利要求133的方法，該方法的步驟還包括，將來源于一種細胞懸浮液的細胞與所述多個腎微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
138.權利要求137的方法，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞為來源于腎臟的細胞。
139.權利要求135的方法，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
140.權利要求135的方法，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過。
141.權利要求133的方法，該方法的步驟還包括，使所述小室內裝有一種包含可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個流體交通管道，該管道的遠端裝有一個閥門，選擇的該管道的長度足以使所述閥門位于受試者的體外，從而可用來更換所述透析緩沖液。
142.權利要求133的方法，其中的多個腎微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
143.一種體外裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該裝置包括
(a)一種位于受試者體外的小室，該小室配有能夠與受試者的循環(huán)系統(tǒng)進行流體交通的第一管道和第二管道，從而使血液能夠通過第一管道由受試者流入小室，并通過第二管道由小室流至受試者；以及
(b)包含在所述小室中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
144.權利要求143的裝置，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體是由已被冷凍保存的腎臟的至少一部分和已被冷凍保存的肝臟的至少一部分制成。
145.權利要求143的裝置，該裝置還包括
(c)處在所述小室內并裝有所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體的生物相容性薄膜，該薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過。
146.權利要求145的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
147.權利要求143的裝置，該裝置還包括
(d)來源于一種細胞懸浮液的細胞，這些細胞與所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
148.權利要求147的裝置，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞選自來源于腎臟的細胞和來源于肝臟的細胞。
149.權利要求145的裝置，該裝置還包括一種能夠與所述小室進行流體交通的血液透析部件，用于對所述受試者的血液進行透析。
150.權利要求143的裝置，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是在裝入所述小室之前被冷凍保存。
151.一種體內裝置，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該裝置包括
(a)一種可移植于體內的小室，該小室由一個或多個所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；以及
(b)包含在所述小室中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死。
152.權利要求151的裝置，其中，在用于獲得所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分和肝臟的一部分冷凍保存。
153.權利要求151的裝置，其中的薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過。
154.權利要求153的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
155.權利要求151的裝置，該裝置還包括
(d)來源于一種細胞懸浮液的細胞，這些細胞與所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)而形成一種連續(xù)平面器官。
156.權利要求155的裝置，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞選自來源于腎臟的細胞和來源于肝臟的細胞。
157.權利要求153的裝置，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
158.權利要求153的裝置，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過。
159.權利要求151的裝置，其中的小室內裝有一種包含可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個流體交通管道，該管道的遠端裝有一個閥門，選擇的該管道的長度足以使所述閥門位于受試者的體外，從而可用來更換所述透析緩沖液。
160.權利要求151的裝置，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
161.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使該小室內裝有多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)當位于患者體外時，在所述小室與受試者的循環(huán)系統(tǒng)之間形成一種流體交通，從而使血液能夠通過第一管道由受試者流入小室，并通過第二管道由小室流至受試者，從而使所述腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在所述受試者的血液流經(jīng)該小室時至少與其中的一部分相接觸。
162.權利要求161的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分和肝臟的一部分冷凍保存。
163.權利要求161的方法，其中，處在所述小室內的生物相容性薄膜裝有所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體，該薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過。
164.權利要求163的裝置，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
165.權利要求161的方法，該方法的步驟還包括，將來源于一種細胞懸浮液的細胞與所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
166.權利要求165的方法，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞選自來源于腎臟的細胞和來源于肝臟的細胞。
167.權利要求161的方法，該方法的步驟還包括，提供一種能夠與所述小室進行流體交通的血液透析部件，用于對所述受試者的血液進行透析。
168.權利要求161的方法，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
169.一種方法，用于為受試者提供一種或多種腎臟和肝臟功能，該方法包括
(a)提供一種可移植于體內的小室，該小室由一個或多個所有邊緣均被密封從而形成密封袋的生物相容性薄膜構成，選擇的該薄膜使植入受試者后的所述密封袋中能夠形成血管；和
(b)使該小室內裝有多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體，從而使所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體能夠在血管形成發(fā)生時至少與所述受試者的部分血液相接觸，其中，在所述多個微器官培養(yǎng)體的單個微器官培養(yǎng)體內位置最深的細胞離該單個微器官培養(yǎng)體的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各微器官培養(yǎng)體中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各微器官培養(yǎng)體內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(c)將該小室植入受試者。
170.權利要求169的方法，該方法的步驟還包括，在用于獲得所述多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體之前，至少將腎臟的一部分和肝臟的一部分冷凍保存。
171.權利要求169的方法，其中的薄膜可以使血液成分以及腎臟和肝臟的分泌物透過。
172.權利要求171的方法，其中的薄膜為聚碳酸酯膜。
173.權利要求169的方法，該方法的步驟還包括，將來源于一種細胞懸浮液的細胞與所述多個腎一及肝微器官培養(yǎng)體共培養(yǎng)，從而形成一種連續(xù)平面器官。
174.權利要求173的方法，其中來源于一種細胞懸浮液的所述細胞選自來源于腎臟的細胞和來源于肝臟的細胞。
175.權利要求171的方法，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體為層狀排列。
176.權利要求171的方法，其中的薄膜允許分子量小于約10,000Da-500,000Da的顆粒通過。
177.權利要求169的方法，該方法的步驟還包括，使所述小室內裝有一種包含可更換的透析緩沖液的透析袋，該透析袋有一個流體交通管道，該管道的遠端裝有一個閥門，選擇的該管道的長度足以使所述閥門位于受試者的體外，從而可用來更換所述透析緩沖液。
178.權利要求169的方法，其中的多個腎-及肝微器官培養(yǎng)體的特征是被冷凍保存，并在裝入所述小室之前融解。
179.一種制備和使用冷凍微器官的方法，該方法包括
(a)至少將器官的一部分冷凍保存，以獲得該器官的冷凍保存片段；
(b)在冷凍保存狀態(tài)下將該冷凍保存片段切成片；
(c)在使用前將該冷凍切片融解，以獲得融解的切片；以及
(d)用融解的切片作為微器官。
180.權利要求179的方法，其中，至少將所述器官的所述部分冷凍保存，以便在一種溶液中獲得所述器官的所述冷凍保存組織，該溶液至少有一種組分選自DMEM、DMSO、甘油、海藻糖、蜜三糖、一種抗生素、一種抗霉菌素和葡萄糖。
181.權利要求179的方法，其中，用于冷凍保存的溫度為-180℃-0℃。
182.權利要求179的方法，其中，所述切片的厚度約為200-400微米。
183.權利要求179的方法，該方法的步驟還包括
(e)在將所述切片融解前，在能夠維持其冷凍保存狀態(tài)的溫度下將該切片保存一段時間。
184.權利要求179的方法，其中，將所述融解切片作為微器官的方法是
(i)提供一種小室；
(ii)將多個所述切片置于該小室內；
(iii)至少將受試者的部分血液引入該小室，以使所述多個融解切片與該受試者的血液相接觸，其中，在所述多個融解切片的單個融解切片內位置最深的細胞離該單個融解切片的最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而可在各融解切片中保持活體組織的結構，同時使所述多個微器官培養(yǎng)體的各融解切片內位置最深的這些細胞能夠得益于擴散的營養(yǎng)物質和加氧作用，從而避免其壞死；以及
(iv)至少將一部分已經(jīng)與融解切片接觸的受試者血液重新引入受試者。
全文摘要
一種對流體進行生物修飾的裝置，該裝置包括(a)帶有一個流體入口和一個流體出口的一種小室；以及(b)至少一種器官的微器官培養(yǎng)體的集合，用來對流體進行生物修飾，該集合的每個微器官培養(yǎng)體均含有細胞，并且培養(yǎng)體的尺寸能夠使單個微器官培養(yǎng)體中位置最深的細胞離其最近端表面至少約100微米，但又不超過約225微米，從而在各微器官培養(yǎng)體中可保持器官單位(如肝腺泡)的活體器官構造(器官結構)，微器官培養(yǎng)體的集合位于所述小室內，并至少能夠與流經(jīng)該小室的部分流體相接觸。
文檔編號A61M1/16GK1407853SQ00813290
公開日2003年4月2日 申請日期2000年7月19日 優(yōu)先權日1999年7月23日
發(fā)明者E·米特拉尼 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發(fā)展公司