專利名稱：一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種適合單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的含植物GUS基因內(nèi)含子的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是研究生物發(fā)育和基因功能的一種重要工具， 是通過引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA (有義RNA和反義RNA)，從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，進(jìn)而抑制其相應(yīng)的基因表達(dá)。RNAi具有特異性、穩(wěn)定性、效率高、速度快及不改變基因組的遺傳組成等優(yōu)點(diǎn)，為植物功能基因組學(xué)研究以及植物遺傳改良提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。目前，RNA干擾技術(shù)已應(yīng)用于油脂和淀粉品質(zhì)改良、營(yíng)養(yǎng)成分增加與有害物質(zhì)降低及抗褐化、果實(shí)耐貯性等作物品質(zhì)改良研究，其中構(gòu)建一種能成功轉(zhuǎn)化并能達(dá)到改良目的靶基因的RNAi載體是其核心技術(shù)。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，糧食安全始終是關(guān)系我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定和國(guó)家自立的全局性重大戰(zhàn)略問題。玉米作為我國(guó)第二大作物，不僅是重要的糧食來源，而且還是重要的飼料、工業(yè)原料，玉米生產(chǎn)狀況在糧食安全體系中具有舉足輕重的作用。在我國(guó)以玉米為支柱產(chǎn)業(yè)的飼料工業(yè)中，由于玉米籽粒的賴氨酸含量低，在配、混合飼料中必須添加飼料添加劑賴氨酸，才能滿足畜禽生長(zhǎng)發(fā)育的需要，但這些飼料添加劑目前主要依靠進(jìn)口，因此飼料品質(zhì)不高特別是賴氨酸含量偏低是目前我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一。另一方面，我國(guó)部分省份特別是貧困山區(qū)的人群仍以玉米為主食，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要依賴于玉米， 但目前生產(chǎn)上種植的玉米大多是普通玉米，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較差，缺乏人體及單胃動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育必需的賴氨酸、色氨酸等。玉米籽粒的蛋白質(zhì)含量為10%左右，其中50-60%為人畜不能吸收利用的醇溶蛋白。國(guó)際玉米小麥改良中心(CIMMYT)在20世紀(jì)70年代開始利用隱性突變基因Opaqiw-2 (oJ )及其修飾基因?qū)⒋既艿鞍缀坑?5. 1%降至22. 9%，使賴氨酸含量水平達(dá)普通玉米的 2倍，進(jìn)而選育了大批高賴氨酸玉米即優(yōu)質(zhì)蛋白玉米并在全世界廣泛應(yīng)用(譚靜等.優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種研究進(jìn)展.玉米科學(xué)2006，14 : 15-19)，但該方法轉(zhuǎn)育周期長(zhǎng)(7-10年)、效率低、預(yù)見性差，加之選育出的高賴氨酸玉米胚乳呈軟質(zhì)及抗病性差等問題，已越來越不適應(yīng)現(xiàn)代育種目標(biāo)的需要。研究表明，由于醇溶蛋白特別是22-kD和19-kD醇溶蛋白基因的表達(dá)對(duì)賴氨酸含量有顯著的負(fù)面效應(yīng)，然而傳統(tǒng)的育種方法難于找到理想的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)，獲得賴氨酸含量高而醇溶蛋白低表達(dá)的玉米品種難度很大，主要原因在于其表型鑒定即賴氨酸含量測(cè)定需要使用高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析，由于HPLC運(yùn)行成本很高，很難在大規(guī)模種質(zhì)篩選及新品種選育過程中的大批量后代選擇中廣泛應(yīng)用。因此，如果能通過RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建RNAi載體并轉(zhuǎn)化獲得賴氨酸含量高而醇溶蛋白低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米，將是一種簡(jiǎn)便，快捷和有效的途徑
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)(利用OJ 基因及其修飾基因轉(zhuǎn)育獲得醇溶蛋白含量低而賴氨酸含量高的玉米品種)轉(zhuǎn)育周期長(zhǎng)、效率低、預(yù)見性差，以及用現(xiàn)有技術(shù)選育出的高賴氨酸玉米品種由于oJ 基因的連鎖效應(yīng)導(dǎo)致其籽粒呈軟質(zhì)胚乳及抗病性差等缺陷和不足，其目的是提供一種能抑制玉米醇溶蛋白的表達(dá)，提高賴氨酸含量水平的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體。本發(fā)明提供了兩個(gè)玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD和 pUC19-RNAi-19KD，將兩個(gè)載體分別導(dǎo)入玉米品種中，成功獲得了高賴氨酸含量的玉米轉(zhuǎn)基因植株，在所有轉(zhuǎn)基因植株中，有40-50%的植株其賴氨酸含量得到了提高，與非轉(zhuǎn)基因玉米植株相比，轉(zhuǎn)基因玉米的籽粒賴氨酸含量提高了 15-60%，與現(xiàn)有常規(guī)育種技術(shù)培育的高賴氨酸玉米品種相比，賴氨酸含量有同等水平的提高或稍高于常規(guī)育種技術(shù)培育的高賴氨酸玉米，并且與常規(guī)育種(5-7年)相比，轉(zhuǎn)育周期顯著縮短，只需1-2年。此外本發(fā)明通過 RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)玉米醇溶蛋白的合成，解決了常規(guī)育種中利用oJ 基因選育的高賴氨酸玉米品種胚乳呈軟質(zhì)及抗病性差等關(guān)鍵問題。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了利用RNA干擾原理創(chuàng)制高賴氨酸含量玉米新材料的目的，對(duì)玉米品質(zhì)改良具有重要意義。本發(fā)明RNAi載體的獲得一方面，通過在構(gòu)建的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體上加入GUS基因內(nèi)含子，提高了 RNAi載體的沉默效率；另一方面，比常規(guī)RNAi載體的獲得縮短了載體構(gòu)建的時(shí)間，提高了效率。常規(guī)RNAi載體的構(gòu)建方法是按啟動(dòng)子、正向目的片段、一段不表達(dá)序列、反向目的片段、終止子poly (A)的順序逐一連接到骨架載體上，本發(fā)明RNAi載體的構(gòu)建將啟動(dòng)子和正向目的片段、反向目的片段和終止子Poly(A)分別連接在骨架載體PUC19上，然后再將兩個(gè)載體進(jìn)行酶切和連接，進(jìn)而將反向目的片段和終止子poly (A)插入到含有啟動(dòng)子和正向目的片段的重組載體上。由于兩個(gè)中間載體可同時(shí)構(gòu)建，因此縮短了載體構(gòu)建的時(shí)間，提高了效率。本發(fā)明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD是在骨架載體 PUC19上含有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P_zp22/6位于所述的 RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的酶切位點(diǎn)&ic I和Sma I間；正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_22KD的酶切位點(diǎn)Sma I和 Xba I間；反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的酶切位點(diǎn)Xba I和Xho I間；在正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P之間含有⑶S基因內(nèi)含子，⑶S基因內(nèi)含子位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的)(ba I 酶切位點(diǎn)間；終止子poly(A)位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_22KD酶切位點(diǎn)Hind III和 Xho I間；所述的胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，所述 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述⑶S 基因內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，所述終止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19_RNAi_22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。所構(gòu)建的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的圖譜如圖8所示。上述玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi_22KD還可以按以下方法構(gòu)建獲得
(1)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-ZP22/6的重組載體pUC19-p22/6
①胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的獲得以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特異啟動(dòng)子P引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 ；
②構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6
用he I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子， 然后與同樣經(jīng)Mc I和)(ba I酶切的骨架載體pUC19連接，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；
(2)構(gòu)建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl
①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的獲得
以玉米籽?？俁NA為模板，以SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示序列的R22-6引物對(duì)， 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后以此RT-PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 7所示序列的R22-7引物對(duì)，再進(jìn)行RT-PCR，得到如SEQ ID NO: 8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA 片段 22-KD-P ；
②構(gòu)建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl
用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段22-KD-P，然后與同樣經(jīng)Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl ；
(3)構(gòu)建插入反向目的片段22-KD-P的重組載體pUC19-22KD2
用Hind III和)(ba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段22-KD-P，然后與同樣經(jīng)Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重組載體pUC19_22KD2 ；
(4)構(gòu)建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)
以表達(dá)載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的終止子 poly(A)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的終止子poly (A)；進(jìn)一步用Bio I和Hind III雙酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的終止子poly (A)，然后與同樣經(jīng)B10 I 和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體pUC19-22KD2連接，得到含有終止子poly (A) 的重組載體 pUC19-22KD2-poly (A)；
(5)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)
將步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl和步驟(4)構(gòu)建的重組載體 pUC19-22KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 22-KD-P和終止子poly㈧的酶切產(chǎn)物22KD2_poly㈧連接到步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl上，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P_zp22/6，正、反向目的基因 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_2 2KDl-22KD2-poly(A)；
(6)⑶S基因內(nèi)含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構(gòu)建以質(zhì)粒載體pGreen-0229 Backbone DNA為模板，用 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示序列的⑶S基因內(nèi)含子的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:14所示的⑶S基因內(nèi)含子；進(jìn)一步用)(ba I單酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的GUS基因內(nèi)含子，然后與同樣經(jīng))(ba I 單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly(A)連接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。本發(fā)明所提供的另一個(gè)玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi_19KD是在骨架載體PUC19上含有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的酶切位點(diǎn)Mc I和Sma I間；正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的酶切位點(diǎn)Sma I 和)(ba I間；反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi 載體pUC19-RNAi-19KD的酶切位點(diǎn))(ba I和Β ο I間；在正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P之間含有⑶S基因內(nèi)含子，⑶S基因內(nèi)含子位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的)(ba I 酶切位點(diǎn)間；終止子poly(A)位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_19KD酶切位點(diǎn)Hind III和 Xho I間；所述胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述19-KD 醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示，所述⑶S基因內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示，所述終止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示。所構(gòu)建的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的圖譜如圖9所示。本發(fā)明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD還可以按以下方法構(gòu)建獲得
(1)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6
①胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的獲得
以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特異啟動(dòng)子P引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 ；
②構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6序列的重組載體pUC19-p22/6
用I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子， 然后與同樣經(jīng)Mc I和)(ba I酶切的骨架載體pUC19連接，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；
(2)構(gòu)建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl
①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的獲得
以玉米籽?？俁NA為模板，以SEQ ID N0:16和SEQ ID N0:17所示序列的R19-4引物對(duì)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后以此RT-PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:19所示序列的R19-5引物對(duì)，再進(jìn)行RT-PCR，得到如SEQ ID N0:20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P ；
②構(gòu)建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6-19KDl
用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段19-KD-P，然后與同樣經(jīng)Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl ；
(3)構(gòu)建插入反向目的片段19-KD-P的重組載體pUC19-19KD2
用Hind III和)(ba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段19-KD-P，然后與同樣經(jīng)Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重組載體pUC19_19KD2 ；
(4)構(gòu)建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-19KD2-poly(A)
以表達(dá)載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示的終止子poly (A) 的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO: 11所示的終止子poly (A)；進(jìn)一步用Bio I 和Hind III雙酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的終止子poly (A)，然后與同樣經(jīng)Bio I和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體PUC19-19KD2連接，得到含有終止子poly (A)的重組載體 pUC19-19KD2-poly(A)；
(5)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)
將步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-19KD和步驟(4)構(gòu)建的重組載體 pUC19-19KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 19-KD-P和終止子poly㈧的酶切產(chǎn)物19KD2_poly㈧連接到步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-19KDl上，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P_zp22/6，正、反向目的基因 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_l 9KDl-19KD2-poly(A)；
(6)⑶S基因內(nèi)含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的構(gòu)建以質(zhì)粒載體 pGreen-0229 Backbone DNA 為模板，用 SEQ ID N0:12 和 SEQ ID
N0:13所示序列的⑶S基因內(nèi)含子的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:14 所示序列的GUS基因內(nèi)含子；進(jìn)一步用)(ba I單酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的GUS基因內(nèi)含子，然后與同樣經(jīng))(ba I單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構(gòu)建的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)連接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-19KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0:21 所示。序列表中SEQ ID N0:1所示的是本發(fā)明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD或RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的特異啟動(dòng)子ρ引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID Ν0:2所示的是本發(fā)明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD或RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的特異啟動(dòng)子ρ引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID Ν0:3所示的是胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子Ρ-ζρ22/6的核苷酸序列。序列表中SEQ ID Ν0:4所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-6引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:5所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的R22-6引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:6所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-7引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:7所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-7引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:8所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO:9所示的是終止子poly (A)的上游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 10所示的是終止子poly (A)下游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 11所示的是終止子poly (A)的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:12所示的是⑶S基因內(nèi)含子的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:13所示的是⑶S基因內(nèi)含子的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:14所示的是⑶S基因內(nèi)含子的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:15所示的是本發(fā)明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:16所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-4引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:17所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-4引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:18所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-5引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:19所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-5引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:20所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:21所示的是本發(fā)明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:22所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_22KD轉(zhuǎn)化Ttl代再生植株的PCR檢測(cè)22TO引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:23所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_22KD轉(zhuǎn)化Ttl代再生植株的PCR檢測(cè)22TO引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:24所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_19KD轉(zhuǎn)化Tci代再生植株的PCR檢測(cè)1OT5引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:25所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_19KD轉(zhuǎn)化Tci代再生植株的PCR檢測(cè)1OT5引物的下游引物序列。


圖 1 是 RNAi 載體 pUC19-RNAi-22KD 或 pUC19_RNAi_19KD 的構(gòu)建示意圖。圖2是胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子P-zp22/6的PCR鑒定結(jié)果，泳道M. DNA marker, 1.胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子P_zp22/6的PCR產(chǎn)物。圖3是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22_KD_P的PCR鑒定結(jié)果，
泳道M. DNA Marker, 1. 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的PCR產(chǎn)物。圖4是終止子poly (A)的PCR鑒定結(jié)果，泳道M. DNA Marker, 1.終止子poly (A) 的PCR產(chǎn)物。圖5是⑶S基因內(nèi)含子的PCR鑒定結(jié)果，
泳道M. DNA marker, 1. GUS基因內(nèi)含子的PCR產(chǎn)物。圖6是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19_KD_P的PCR鑒定結(jié)果，
泳道M. DNA Marker, 1. 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的PCR產(chǎn)物。圖 7 是 RNAi 載體 pUC19_RNAi_22KD 和 pUC19_RNAi_19KD 的酶切檢測(cè)，
A 是 pUC19-RNAi-22KD 酶切分析，B 是 pUC19_RNAi_19KD 酶切分析；泳道 M. DNA Marker, 1 和 5: Xba I 和 Hind III雙酶切，2 和 6: Xba I 單酶切，3 和 7: Sac I 和 Xba I 雙酶切，4和8: Sac I和Hind III雙酶切。圖 8 是 pUC19-RNAi_22KD 載體圖譜。圖 9 是 pUC19-RNAi_19KD 載體圖譜。圖10是玉米胚性愈傷組織。圖11是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體基因槍轉(zhuǎn)化后的愈傷組織。圖12是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體基因槍轉(zhuǎn)化后愈傷組織的再生。圖13是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體轉(zhuǎn)化后分化小苗的壯苗培養(yǎng)。圖14是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體轉(zhuǎn)化得到的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的田間表現(xiàn)。圖15是以pUC19-RNAi-19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體轉(zhuǎn)化得到的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實(shí)情況。圖16是pUC19-RNAi-22KD載體轉(zhuǎn)化的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定，
泳道M. DNA Marker, CK+ 陽性對(duì)照(pUC19-RNAi_22KD干擾載體擴(kuò)增)，CK-陰性對(duì)照 (B73非轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增)，CK 空白對(duì)照(水為模板)，1-9 =T0代轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增。圖17是pUC19-RNAi-19KD載體轉(zhuǎn)化的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定，
泳道M. DNA Marker, CK+ 陽性對(duì)照(pUC19_RNAi_19KD干擾載體擴(kuò)增)，CK-陰性對(duì)照 (B73非轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增)，CK 空白對(duì)照(水為模板)，1-7 =T0代轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)中所用的各種試劑均可從商業(yè)渠道購買，實(shí)驗(yàn)中使用的骨架載體pUC19、質(zhì)粒載體pGreen-02^ BacWxme、表達(dá)載體P3301、T載體及質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、 Marker、高保真DNA聚合酶、dNTPs、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞和bar基因均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4-DNA連接酶購自美國(guó)NEB公司；氨芐青霉素、 IPTG、X-gal等試劑均購自大連寶生物工程有限公司；RQ DNA酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、5X反應(yīng)緩沖2,基因組DNA的PCR擴(kuò)增
1)反應(yīng)體系
IOXBuffer (Γ含 Mg， IOmM dNTr' .ddftO
.上游引物(2+0+μ mo TB^ 功丨20μιηο1/1.' Τ-. m_ ( ΠΓ； α ι ■ 基 ill 組 DNA_
液、dNTP、RNA酶抑制劑購自Promega公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；基因槍PDS-1000/ He及其消耗品購自Bio-Rad公司。核苷酸測(cè)序均由華大基因公司完成。所用的引物序列均由北京奧科生物技術(shù)公司合成。實(shí)驗(yàn)中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi_22KD的構(gòu)建
一、供試材料玉米(Zm mays L.)自交系B73，是目前廣泛應(yīng)用于玉米遺傳研究及育種實(shí)踐的玉米種質(zhì)，能夠從種子公司(如云南田瑞種業(yè)有限公司，地址云南省昆明市北郊龍頭街)直接購買。二、實(shí)驗(yàn)方法
1、B73玉米基因組DNA的提取
1)取玉米葉片300mg，加液氮充分研磨；
2)加入700μ 1 65°C預(yù)熱的2%CTAB提取液，輕輕混勻；
3)置于65°C水浴 30-60 min ；
4)室溫放置2min，加入300 μ 1氯仿-異戊醇(24:1)，充分震蕩1-2 h ；
5)10，000 rpm 離心 10 min ；
6)取上層水相至新的離心管中，加入600μ 1異丙醇，室溫放置10 min ；
7)10,000 rpm 離心 1 min，棄上清；
8)加入75%的乙醇500μ 1，室溫放置30 min ；
9)重復(fù)步驟7和8；
10)10,000 rpm離心30 s，棄上清，自然干燥DNA ；
11)加入100μ 1 TE緩沖液溶解DNA ；
12)檢測(cè)后分裝，-70°C保存。2)反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5 min，(95°C變性 50 s，57°C退火 50 s，72°C延伸 1 min) 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。3、B73玉米籽?？俁NA的提取
1)取自交授粉后18天的玉米籽粒50-100mg，用液氮充分研磨；
2)加入1ml Trizol試劑，劇烈震蕩混勻；
3)12，000 rpm 離心 10 min，取上清；
4)加入200μ 1氯仿，劇烈震蕩混勻，冰浴3 min ；
5)12，000 rpm 離心 15 min (4°C)；
ι—I Tx Tx Ix Tx Tx Ix
HKU-H^ =L ζ! β =L
O 6 15 5 3 O
2.1.3.0.0.0.2. 1
O
206)取上層水相至新的離心管中，加入等量體積的異丙醇，_20°C放置10min ；
7)12,000 rpm離心15 min (4°C )，棄上清，加入700 μ 1 70%乙醇洗滌沉淀；
8)8,000 rpm 離心 10 min (4°C)，棄上清;
9)沉淀用30μ 1 DEPC-H2O溶解；
10)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA。
4、RNA反轉(zhuǎn)錄體系
反應(yīng)體系玉米籽?？俁NA 8 μ ，加入1 μ RQ DNA酶和1 μ RQ緩沖液，37°C水浴 30 min，取出后置于冰上，加入1 μ RQ終止緩沖液，65°C水浴10 min ；然后取出9 μ 1 作為RNA模板，加入OligodT 1 μ ，混勻后置于70°C水浴5 min，然后冰上冷卻2 min ；再加入5倍RT MLV緩沖液4 μ , 10 mM dNTP 4 Pl，RNA酶抑制劑1 μ (20U)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ (200U)，42°C水浴 1 h;72°C滅活 10 min，冰浴 10 min，于 _20°C保存。
5、RT-PCR 反應(yīng)fl
10 X Buffer (.含 Mg，2.0μ 1
IOmM dNTP1. Oμ
ddftO13. 7μ
上游引物(20 prnol/1)0. 5μ
下游引物(20 pmol/1)0.5μ
Taqll (5U/μ 1)0. 3μ
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μ
總體枳
1 U.
O
O 2反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5 min，(94°C變性 40 s，59°C退火 45 s，72°C延伸 1 min) 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。
6, PCR產(chǎn)物與T載體的連接反應(yīng)體系
PCR產(chǎn)物4 μ pEASY- Tl 載體(5 I■ig) 1 μ!總體積5 Jul
反應(yīng)
輕輕棍合后室溫反應(yīng)5 Mn,然后將離心管置于冰上< 7、連接產(chǎn)物向大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
1)取感受態(tài)細(xì)胞DH5a100 μ ，加入T載體連接物2 μ ，冰浴30 min
2)42°C水浴熱激90 s，立即置于冰上2 min ；
3)加入500μ LB培養(yǎng)基，在37°C條件下200Xg搖1 h;
4)；3500 Xg離心1 min，靜置1 h后棄部分上清；
5)力口人5 μ ZPTG 禾口 50 μ X-Gal ；6)涂板、封口；
7)37°C培養(yǎng) 16 h ；
8)挑白色單菌落，37°C進(jìn)行搖菌。8、重組載體DNA的提取
用北京全式金生物技術(shù)有限公司質(zhì)粒提取試劑盒提取，步驟如下 1)取4 ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌10，000 X g離心1 min ；
2)加入250μ 1無色RB (含RNase Α)，震蕩懸浮細(xì)菌沉淀；
3)加入250μ 1藍(lán)色LB，不超過5 min ；
4)加入；350μ 1黃色ΝΒ，室溫靜置2 min ；
5)15，000Xg離心5 min，取上清加入吸附柱中；
6)15，000 Xg離心1 min，棄流出液；
7)加入650μ 1溶液WB，15，000 Xg離心1 min，棄流出液；
8)15，OOOXg離心2 min，徹底去除殘留的WB ；
9)將吸附柱置于干凈的離心管中，在柱中加入50μ 70°C預(yù)熱的EB或去離子水 (pH>7.0)室溫靜置 1 min ；
10)10，000Xg 離心 1 min，洗脫 DNA，于-20°C保存。9、重組載體DNA的酶切
權(quán)利要求
1.一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD是在骨架載體pUC19上含有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6位于所述的RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD的酶切位點(diǎn)I和Sma I間；正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分 cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_22KD的酶切位點(diǎn)Sma I和Xba I 間；反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P位于所述的RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD的酶切位點(diǎn)Xba I和Xho I間；在正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P之間含有⑶S基因內(nèi)含子，⑶S基因內(nèi)含子位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的)(ba I 酶切位點(diǎn)間；終止子poly(A)位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_22KD酶切位點(diǎn)Hind III和 Xho I間；所述的胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，所述 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述⑶S 基因內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，所述終止子poly(A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19_RNAi_22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，其特征在于所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD按以下方法構(gòu)建獲得(1)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6①胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的獲得以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特異啟動(dòng)子P引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 ；②構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6用he I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子， 然后與同樣經(jīng)Mc I和)(ba I酶切的骨架載體pUC19連接，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；(2)構(gòu)建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的獲得以玉米籽?？俁NA為模板，以SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示序列的R22-6引物對(duì)， 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后以此RT-PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO: 7所示序列的R22-7引物對(duì)，再進(jìn)行RT-PCR，得到如SEQ ID NO: 8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA 片段 22-KD-P ；②構(gòu)建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段22-KD-P，然后與同樣經(jīng)Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl ；(3)構(gòu)建插入反向目的片段22-KD-P的重組載體pUC19-22KD2用HindII^n^Cba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段22-KD-P，然后與同樣經(jīng)Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重組載體pUC19_22KD2 ；(4)構(gòu)建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)以表達(dá)載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的終止子 poly(A)的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的終止子poly (A)；進(jìn)一步用Bio I和Hind III雙酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的終止子poly (A)，然后與同樣經(jīng)B10 I 和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體pUC19-22KD2連接，得到含有終止子poly (A) 的重組載體 pUC19-22KD2-poly(A)；(5)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)將步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl和步驟(4)構(gòu)建的重組載體 pUC19-22KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 22-KD-P和終止子poly (A)的酶切產(chǎn)物22KD2_poly (A)連接到步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl上，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P_zp22/6，正、反向目的基因 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_2 2KDl-22KD2-poly(A)；(6)⑶S基因內(nèi)含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構(gòu)建以質(zhì)粒載體pGreen-0229 Backbone DNA為模板，用 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示序列的⑶S基因內(nèi)含子的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:14所示的⑶S基因內(nèi)含子；進(jìn)一步用)(ba I單酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的GUS基因內(nèi)含子，然后與同樣經(jīng))(ba I 單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly(A)連接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
3.一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD是在骨架載體pUC19上含有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6位于所述的RNAi載體 pUC19-RNAi-19KD的酶切位點(diǎn)I和Sma I間；正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分 cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的酶切位點(diǎn)Sma I和Xba I 間；反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P位于所述的RNAi載體 pUC19-RNAi-19KD的酶切位點(diǎn)Xba I和Xho I間；在正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分 cDNA片段19-KD-P和反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P之間含有 ⑶S基因內(nèi)含子，⑶S基因內(nèi)含子位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的)(ba I酶切位點(diǎn)間；終止子poly (A)位于所述的RNAi載體pUC19-RNAi_19KD酶切位點(diǎn)Hind III和Xho I 間；所述胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子zp22/6的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述⑶S基因內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示，所述終止子poly (A)的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11 所示，所述玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 21 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD，其特征在于所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD按以下方法構(gòu)建獲得(1)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-ZP22/6的重組載體pUC19-p22/6①胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的獲得以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列的特異啟動(dòng)子P引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 ；②構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6序列的重組載體pUC19-p22/6用I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子， 然后與同樣經(jīng)Mc I和)(ba I酶切的骨架載體pUC19連接，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；(2)構(gòu)建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的獲得以玉米籽?？俁NA為模板，以SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17所示序列的R19-4引物對(duì)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后以此RT-PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示序列的R19-5引物對(duì)，再進(jìn)行RT-PCR，得到如SEQ ID NO: 20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P ；②構(gòu)建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段19-KD-P，然后與同樣經(jīng)Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl ；(3)構(gòu)建插入反向目的片段19-KD-P的重組載體pUC19-19KD2用Hind III和)(ba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的目的片段19-KD-P，然后與同樣經(jīng)Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重組載體pUC19_19KD2 ；(4)構(gòu)建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-19KD2-poly(A)以表達(dá)載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示的終止子poly (A) 的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO: 11所示的終止子poly (A)；進(jìn)一步用Bio I 和Hind III雙酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的終止子poly (A)，然后與同樣經(jīng)Bio I和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體pUC19-19KD2連接，得到含有終止子poly(A)的重組載體 pUC19-19KD2-poly(A)；(5)構(gòu)建含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)將步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-19KD和步驟(4)構(gòu)建的重組載體 pUC19-19KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 19-KD-P和終止子poly㈧的酶切產(chǎn)物19KD2_poly㈧連接到步驟(2)構(gòu)建的重組載體pUC19-p22/6-19KDl上，得到含有胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子P_zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_l 9KDl-19KD2-poly(A)；(6)⑶S基因內(nèi)含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的構(gòu)建以質(zhì)粒載體 pGreen-0229 Backbone DNA 為模板，用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13所示序列的⑶S基因內(nèi)含子的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO: 14 所示序列的GUS基因內(nèi)含子；進(jìn)一步用)(ba I單酶切帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的GUS基因內(nèi)含子，然后與同樣經(jīng))(ba I單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構(gòu)建的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)連接，得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-19KD，玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:21 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體。所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD含有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，正、反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P，GUS基因內(nèi)含子和終止子poly(A)。還提供了另一個(gè)玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD，該載體含有胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子P-zp22/6，正、反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P，GUS基因內(nèi)含子和終止子poly(A)。該載體導(dǎo)入玉米品種能成功獲得高賴氨酸含量的玉米轉(zhuǎn)基因植株，賴氨酸含量提高15-60%，轉(zhuǎn)育周期只需1-2年。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102517314SQ20121001054
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2012年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月14日
發(fā)明者劉麗, 王琨, 番興明, 陳威 申請(qǐng)人:云南田瑞種業(yè)有限公司, 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所