玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然蛋白質(zhì)化學(xué)改性及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物及其制備方法與其在肝細(xì)胞支架材料構(gòu)建方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]源于主要農(nóng)作物的玉米醇溶蛋白，是一類(lèi)量大面廣、無(wú)毒且易生物降解的天然高分子，近年作為生物醫(yī)用材料、特別是組織工程支架材料的改性和高值化利用研究，正逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。與組織工程支架構(gòu)建常用的合成高分子原材料如聚乳酸、聚已內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚羥基乙酸等相比，這類(lèi)天然高分子不僅具有原料豐富、可再生和良好的生物相容性，且其分子結(jié)構(gòu)中還富含可供進(jìn)一步化學(xué)修飾改性的氨基、羧基、羥基和巰基等反應(yīng)性功能基團(tuán)。早在2004年，采用溶液澆鑄法制備的玉米醇溶蛋白多孔膜便被報(bào)道用作人體肝臟細(xì)胞(HL-7702)和鼠類(lèi)纖維原細(xì)胞(NH3T3)支架;其后，采用鹽瀝濾法制備的玉米醇溶蛋白多孔支架亦被報(bào)道用作骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)支架以修復(fù)骨組織缺損及用作牙周韌帶細(xì)胞支架以修復(fù)牙組織缺損。然而，直接由玉米醇溶蛋白構(gòu)建的支架材料，與種子細(xì)胞的相互作用較弱、粘附性較差，因而難以在醫(yī)學(xué)臨床中獲得實(shí)際應(yīng)用。
[0003]糖聚肽是近年新發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型仿生高分子，不僅無(wú)毒和具有優(yōu)良的生物相容性、水溶性和可生物降解性，還特別具有能夠模擬哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面糖蛋白的“多元效應(yīng)”，因而一直被視為天然糖蛋白的理想仿生類(lèi)似物。這類(lèi)生物模擬高分子通常由含糖氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐大單體通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合而得，具有簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，且其分子量大小及其分布可控。其中，生物活性糖組分在細(xì)胞表面的生物學(xué)識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它既可為能夠與多種組織(包括皮膚、肝、心肌等)細(xì)胞中跨膜表達(dá)的C型凝集素受體進(jìn)行特異性識(shí)別的甘露糖，也可為能夠與哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面高度表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體進(jìn)行特異性識(shí)別的半乳糖；而聚肽組分則是由若干氨基酸經(jīng)酰胺鍵(肽鍵)連接而成的大分子，在生物酶作用下可降解成在體內(nèi)進(jìn)行代謝和吸收的小分子氨基酸，具有很高的生物相容性和與天然蛋白大分子類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。目前，糖聚肽仿生高分子已被用于制備具有生物活性的聚合物囊泡和聚合物膠束，但未見(jiàn)有研究工作將其用于改性玉米醇溶蛋白以構(gòu)建組織工程用特異性細(xì)胞支架材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物的制備方法。本發(fā)明首先利用玉米醇溶蛋白大分子固有的氨基引發(fā)含疊氮官能團(tuán)的N-羧酸內(nèi)酸酐單體開(kāi)環(huán)聚合，得到由含疊氮側(cè)基的多肽修飾的玉米醇溶蛋白，再利用疊氮與炔基間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將半乳糖接枝到多肽鏈段側(cè)基上，得到玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物，借助靜電紡絲技術(shù)可將其制備出相應(yīng)的電紡纖維膜用作肝細(xì)胞支架材料。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制得的玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物。本發(fā)明制備的玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物，其主體材料為玉米醇溶蛋白，它具有很好的生物相容性和降解性，安全無(wú)毒，并且價(jià)格低廉。
[0006]同時(shí)，本發(fā)明制備的玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物，其聚肽組分由若干氨基酸經(jīng)酰胺鍵(肽鍵)連接而成，具有與天然蛋白類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可望對(duì)所制得支架材料的力學(xué)、生物降解性能進(jìn)行有效調(diào)控。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物的應(yīng)用。本發(fā)明提供的玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物由于引入了大量的半乳糖側(cè)基，因此可與肝細(xì)胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)特異性結(jié)合，使肝細(xì)胞在電紡膜材料表面很好的粘附生長(zhǎng)。
[0008]此外，本發(fā)明采用靜電紡絲技術(shù)進(jìn)行加工成型，賦予材料纖維結(jié)構(gòu)，使其具有比表面積大、孔隙率高的特點(diǎn)，因而作為細(xì)胞支架材料使用時(shí)更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、養(yǎng)分傳輸和代謝物的排放。
[0009]本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物的制備方法，包括以下步驟:
[0011 ] (I )3-炔丁基2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷的制備:將10.00質(zhì)量份半乳糖五乙酸酯和2.3體積份3-丁炔-1-醇溶于50?100體積份二氯甲烷(優(yōu)選用干燥的二氯甲烷)中，在-10?4°C并于惰性氣體保護(hù)下滴加4.8體積份三氟化硼乙醚(Et20.BF3)，于室溫下反應(yīng)2h制得3-炔丁基2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷；
[0012](2)3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷的制備:將10.00體積份3-炔丁基2，3，4，6-四-0-乙?；?β-D-吡喃半乳糖苷溶于50?150體積份無(wú)水甲醇中 ，加入I體積份甲醇鈉的甲醇溶液;反應(yīng)6?24h制得3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷；
[0013](3) 2-疊氮乙醇的制備:將10體積份2-氯乙醇、7.80質(zhì)量份NaN3和0.40質(zhì)量份NaOH溶于25?50體積份水中，于室溫下攪拌反應(yīng)48?72h制得2-疊氮乙醇；
[0014](4) γ-2-疊氮乙基-L-谷氨酸(CELG-N3)的制備:將20.00質(zhì)量份L-谷氨酸分散于50?60體積份2-疊氮乙醇中，冷卻至(TC，再緩慢滴加8體積份濃硫酸，于室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜制得γ -2-疊氮乙基-L-谷氨酸(CELG-N3);
[0015](5) γ -2-疊氮乙基-L-谷氨酸酯N-羧酸內(nèi)酸酐(CELG-N3-NCA)的制備:在惰性氣體保護(hù)下，將5.00質(zhì)量份CELG-N3分散于50?150體積份四氫呋喃(THF)(優(yōu)選用干燥的四氫呋喃)中，加熱至45?52°C，加入3.90質(zhì)量份三聚光氣，溶液立即變澄清;反應(yīng)30min制得γ -2-疊氮乙基-L-谷氨酸酯nca(celg-n3-nca)；
[0016](6)玉米醇溶蛋白與聚(γ-2-疊氮乙基-L-谷氨酸)接枝物(Zein-PCELG-N3)的合成:將0.50質(zhì)量份CELG-N3-NCA溶解于1?30體積份N ,N’ -二甲基甲酰胺(DMF)(優(yōu)選用干燥的DMF)中，于惰性氣體保護(hù)下加入適量玉米醇溶蛋白(通過(guò)改變玉米醇溶蛋白的加入量對(duì)聚肽鏈段的接枝比例進(jìn)行調(diào)控)，于室溫下攪拌反應(yīng)24?96h制得Zein-PCELG-N3;
[0017](7)玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物(ZG)的合成:將0.02質(zhì)量份Zein-PCELG-N3和
0.02質(zhì)量份3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷溶于20?50體積份DMSO或DMF中，于惰性氣體保護(hù)下加入0.06質(zhì)量份五水硫酸銅，再通惰性氣體10?20min后加入0.09質(zhì)量份抗壞血酸鈉，于40?60 °C下攪拌反應(yīng)24?96h，透析72?96h，凍干得產(chǎn)物玉米醇溶蛋白與糖聚肽接枝物。
[0018]步驟(I)所述的半乳糖五乙酸酯可優(yōu)選為通過(guò)以下步驟制備得到的半乳糖五乙酸酯:將5.0O質(zhì)量份D-半乳糖溶于15?30體積份吡啶中，在O°C并于惰性氣體保護(hù)下加入27體積份乙酸酐;反應(yīng)12?36h后緩慢倒入70?150體積份冰水中，然后用有機(jī)溶劑萃取，將有機(jī)相用飽和NaHCO3溶液清洗至無(wú)氣體產(chǎn)生，再依次用水、濃鹽水清洗，干燥后旋蒸，得油狀產(chǎn)物即為半乳糖五乙酸酯；
[0019]其中用于萃取的有機(jī)溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯，萃取次數(shù)優(yōu)選為3?5次;所述依次用水、濃鹽水清洗次數(shù)優(yōu)選3?5次;所述干燥優(yōu)選用無(wú)水硫酸鎂干燥。
[0020]步驟(I)中反應(yīng)完成后產(chǎn)物先用二氯甲烷稀釋后分別用飽和NaHCO3溶液和水洗滌，然后干燥有機(jī)相，再旋蒸后柱層析分離，得黃色油狀液體即為3-炔丁基2，3，4，6_四-0-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷；
[0021 ]步驟(I)中所述洗滌的次數(shù)優(yōu)選為3?5次，所述干燥有機(jī)相優(yōu)選用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)相，所述柱層析分離用體積比為2:1的石油醚和乙酸乙酯洗脫，Rf = 0.28。
[0022]步驟(2)中反應(yīng)完成后加入H+型離子交換樹(shù)脂IR 120，攪拌過(guò)夜后過(guò)濾，減壓蒸餾得淡黃色固體，使用正丙醇重結(jié)晶得3-炔丁基-β-D-吡喃半乳糖苷；
[0023 ] 步驟(2)所述甲醇鈉的甲醇溶液中甲醇鈉濃度為Imo 1/L。
[0024]步驟(3)中反應(yīng)完成后用有機(jī)溶劑萃取，合并有機(jī)層，干燥后旋蒸得黃色液體即為2-疊氮乙醇；
[0025]步驟(3)所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為二氯甲烷，萃取次數(shù)優(yōu)選為三次;所述干燥優(yōu)選用無(wú)水硫酸鈉干燥。
[0026]步驟(4)中反應(yīng)完成后將反應(yīng)液緩慢倒入200?500體積份三乙胺中，抽濾得沉淀并用甲醇洗滌，即得γ -2-疊氮乙基-L-谷氨酸(CELG-N3)。
[0027]步驟(5)中反應(yīng)完成后冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，將棕色油狀物溶于50?150體積份乙酸乙酯中，用飽和NaHCO3冰水溶液洗滌至無(wú)氣體產(chǎn)生，再用冰水洗滌;干燥有機(jī)相后旋蒸得到棕色油狀產(chǎn)物即為γ -2-疊氮乙基-L-谷氨酸酯nca(celg-n3-nca);
[0028]步驟(5)所述用冰水洗滌的次數(shù)優(yōu)選為3次，所述干燥有機(jī)相優(yōu)選用無(wú)水硫酸鎂干燥。
[0029]步驟(6)中所述的玉米醇溶蛋白與γ-2-疊氮乙基-L-谷氨酸酯NCA的質(zhì)量比優(yōu)選為0.05?0.10:0.