20(r)-人參三醇衍生物的制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類20(R)?人參三醇衍生物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的20(R)?人參三醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ、式II、式III、式IV、式Ⅴ、式VI、式VII、式VIII、式IX、式Ⅹ、式XI和式XII。本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，對20(R)?人參三醇成功地進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了多種新型化合物，通過體外抗腫瘤細(xì)胞試驗證實，這些化合物具有較好的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的活性成分，具有廣泛的用途。
【專利說明】
20(R)-人參三醇衍生物的制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及20(R)_人參三醇衍生物及其制備方法以及該 衍生物的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，研究和開發(fā)抗腫瘤藥物一直是醫(yī)藥領(lǐng) 域的重要研究內(nèi)容。天然產(chǎn)物一直是人類尋找有效活性成分的源泉，在新藥開發(fā)過程中，一 方面具有良好活性的天然產(chǎn)物可以直接被用于臨床;另一方面，以天然活性成分為先導(dǎo)化 合物，通過有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)改造等方法尋找和開發(fā)新的高效低毒藥物，是被實踐證明最行之 有效的開發(fā)新藥的途徑之一。
[0003] 現(xiàn)代的藥理研究表明，20(R)_人參三醇具有較好的抑瘤作用，同時還能增強(qiáng)高三 尖衫酯堿、阿糖胞苷等化療藥物的療效。但是，20(R)_人參三醇屬于四環(huán)三萜類化合物，缺 乏活潑基團(tuán)，反應(yīng)位點少，采用常規(guī)化學(xué)反應(yīng)方法難以制備出滿足要求的衍生物。
[0004] 微生物轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是由微生物體系代謝過程中產(chǎn)生的酶作用的催化反應(yīng)。生物體 系中的酶能催化多種生化反應(yīng)，并且催化速度超出想象，催化反應(yīng)不僅能在體內(nèi)進(jìn)行，更能 在體外促進(jìn)天然化合物以及人工合成化合物的多種轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一系列20(R)_人參三醇衍生物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
[0007] -種具有3位，6位羰基，24β位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-24β_羥基 20 (R)_人參三醇，具有式I結(jié)構(gòu)：
[0009] -種具有3位，6位羰基，22β位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-22β-羥基 20 (R)_人參三醇，具有式II結(jié)構(gòu)：
[0011] 一種具有3位，6位，12位羰基，23β位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6，12-三羰基- 23β-羥基20(R)_人參三醇，具有式III結(jié)構(gòu)：
[0013] 一種具有3位，6位羰基，23α位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-23α-羥基 20 (R)_人參三醇，具有式IV結(jié)構(gòu)：
[0015] 一種具有3位，6位，23位羰基取代的人參三醇衍生物：3，6，23-三羰基20 (R)-人參 三醇，具有式V結(jié)構(gòu)：
[0017] 一種具有3位，6位羰基，15α位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-15α-羥基 20 (R)_人參三醇，具有式VI結(jié)構(gòu)：
[0019] 一種具有3位，6位羰基，15β位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-15β-羥基 20 (R)_人參三醇，具有式VII結(jié)構(gòu)：
[0021] 一種具有3位，6位，15位羰基取代的人參三醇衍生物：3，6，15-三羰基20 (R)-人參 三醇，具有式VIII結(jié)構(gòu)：
[0023] 一種具有3位，6位羰基，16β位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-16β-羥基 20 (R)_人參三醇，具有式IX結(jié)構(gòu)：
[0025] 一種具有3位，6位羰基，16β位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-16β-羥基 20 (S)-人參三醇，具有式X結(jié)構(gòu)：
[0027] 一種具有3位，6位羰基，Ια位，15α位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基-Ια， 15α-二羥基20 (R)_人參三醇，具有式XI結(jié)構(gòu)：
[0029] 一種具有3位，6位羰基，5α位，15α位羥基取代的人參三醇衍生物:3，6-二羰基_5α， 15α-二羥基20 (R)_人參三醇，具有式XII結(jié)構(gòu)：
[0031]本發(fā)明還提供了上述20(R)_人參三醇衍生物的制備方法，包括如下步驟：1)發(fā)酵 培養(yǎng)微生物，向培養(yǎng)基中加入20(R)_人參三醇接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，除去菌絲體后得到發(fā)酵 液，所述微生物為犁頭霉(468丨(1丨3)，小克銀漢霉((]111111；[11〖1^1]16113)，毛霉(111〇01')，鏈格孢 (Alternaria)，紅酵母(Rhodotorula)，共頭霉（3}〇1。6口11&1&81：1'11111)或根霉（1?11丨2(^118)屬的 菌株;2)將所述發(fā)酵液經(jīng)萃取后，蒸干萃取液，得到轉(zhuǎn)化物殘渣;3)將所述轉(zhuǎn)化物殘渣以硅 膠柱純化，所述硅膠柱純化采用氯甲烷-無水乙醇兩相系統(tǒng)梯度洗脫，收集合并組分;4)將 所述組分用反相高效液相色譜純化，優(yōu)選制備條件為半制備用色譜柱YMC-Pack 0SD-A，5y m，12.0 X 250mm(日本YMC)，乙腈-水(60:40，V/V)，流速3. OmL/min，檢測波長203nm得到結(jié)構(gòu) 式為式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物。 [0032]其中，微生物優(yōu)選為毛霉(Mucor)屬菌株，更優(yōu)選總狀毛霉。上述方法步驟1)中培 養(yǎng)基中20(R)_人參三醇的濃度為2-2000yg/mL。
[0033]上述方法步驟2)中萃取溶劑為常規(guī)機(jī)型有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。
[0034]本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明人參三醇衍生物式I、式II、式III、式IV、式V、式 VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物的用途。
[0035] 本發(fā)明通過實驗證實，本發(fā)明的20(R)_人參三醇衍生物具有良好的抗腫瘤活性， 可以作為抗腫瘤藥物的活性成分，所述腫瘤優(yōu)選宮頸癌、白血病、耐藥白血病、神經(jīng)母細(xì)胞 瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等。
[0036] 這些抗腫瘤藥物的活性成分可以是選自結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V、式 VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物中的一種或幾種。
[0037] 在以上述化合物為活性成分的藥物中，需要的時候還可以加入一種或多種藥學(xué)上 可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩 解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制 備。
[0038]本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，對20(R)_人參三醇成功地進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了 一類新的人參三醇衍生物，通過體外抗腫瘤細(xì)胞試驗證實，這些化合物具有較好的抗腫瘤 活性，可以作為抗腫瘤藥物的活性成分，具有廣泛的用途。
【附圖說明】
[0039]圖1為本發(fā)明所述人參三醇衍生物的HPLC液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0040] 實施例1、結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、 式XI和式XII的化合物的制備
[0041] 本發(fā)明采用微生物轉(zhuǎn)化方法，以20(R)_人參三醇為原料，經(jīng)過發(fā)酵、提取、分離等 步驟，來制備本發(fā)明化合物。具有轉(zhuǎn)化能力的微生物包括:犁頭霉(Absidia)，小克銀漢霉 (Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，鏈格抱(Alternaria)，紅酵母(Rhodotorula)，共頭霉 (Syncephalastrum)或根霉（Rhizopus)屬的微生物；其中轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的是犁頭霉 (Absidia)和毛霉(Mucor)屬的菌株。這些菌株均可以購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏管理 中心(CGMCC)或中國食品發(fā)酵研究所工業(yè)微生物保藏管理中心(CICC)，于固體斜面培養(yǎng)基 上置4°C冰箱內(nèi)保存。真菌培養(yǎng)基選用馬鈴薯培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)基選用LB培養(yǎng)基。
[0042] 馬鈴薯培養(yǎng)基的配制(PDA培養(yǎng)基）：取200g去皮馬鈴薯，切成薄片，放入適量水中， 煮沸后80 °C保溫lh。用雙層紗布過濾后取濾液，加入20g葡萄糖，攪拌使葡萄糖完全溶解，以 水定容至l〇〇〇mL。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入3 %瓊脂。
[0043]細(xì)菌培養(yǎng)基的制備(LB培養(yǎng)基）：每1000mL液體培養(yǎng)基加入5.0g酵母提取物，10.0g 蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，調(diào)pH值至7.0。配制固體斜面培養(yǎng)基再在液體培養(yǎng)基中加入 1.5%瓊脂。
[0044] 以總狀毛霉Mucor racemosus AS 3.205為例，制備結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式 IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物的過程如下：
[0045] 1)發(fā)酵、轉(zhuǎn)化以及萃取
[0046] 將總狀毛霉Mucor racemosus AS 3.205接入2個250mL三角瓶（裝有100mL馬鈴薯 培養(yǎng)基）中，作為種子液。于搖床上160rpm、26°C下振蕩培養(yǎng)1天后，待菌絲生長處于旺盛期， 用無菌移液管吸取lmL的種子液，加入到20個lOOOmL搖瓶(裝有400mL馬鈴薯培養(yǎng)基）中。振 蕩培養(yǎng)1天后，每個搖瓶中加入25mg 20(R)_人參三醇（0.2mL，125mg/mL無水乙醇溶液），共 用500mg底物。相同條件下繼續(xù)轉(zhuǎn)化7天，將發(fā)酵液過濾，濾除菌絲體，濾液用等體積的乙酸 乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮至干，得到轉(zhuǎn)化物殘渣約1.6g。
[0047] 2)硅膠柱純化
[0048]將所得殘渣溶于少量甲醇，與1.6g柱色譜硅膠(200-300目）混合拌樣，自然干燥， 加至裝有50g硅膠（200-300目）的色譜柱頂，用二氯甲烷-無水乙醇系統(tǒng)梯度洗脫(50:1-1: 8)，收集洗脫組分，采用TLC分析方法(硅膠G薄層板，二氯甲烷-無水乙醇（15:1)展開，10% 硫酸乙醇溶液噴霧，加熱顯色)將所得到的相似洗脫組分合并。
[0049] 3)反相高效液相色譜純化
[0050] 合并組分用反相高效液相色譜純化。制備條件為半制備用色譜柱￥1(^^士050-A，5μL?，12 · 0 X 250mm(日本YMC)，乙腈-水（60:40，V/V)，流速3 · OmL/min，檢測波長203nm。得 到結(jié)構(gòu)式為式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化 合物等12個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。色譜圖如圖1所示。
[0051 ] 化合物I，3，6-二羰基-24α-羥基-20(R)-人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3402[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0052] 化合物II，3,6_二羰基-22β-羥基-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3402[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0053] 化合物III，3，6，12-三羰基-23β-羥基-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末：·-ESI-MS(m/z)509.3242[M+Na] + (calculated for。3。1146〇5恥1，[]\1+似]+，509.3243)。其13(：-NMR數(shù)據(jù)如表1所示。
[0054] 化合物IV，3,6-二羰基-23a-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS(m/z) 511 · 3401 [M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511 · 3399)。其13C-NMR數(shù)據(jù)如表 1 所示。
[0055] 化合物V，3，6，23-三羰基-20 (R)-人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS(m/z) 509 · 3245[M+Na] + (calculated for C3〇H46〇5Nai，[M+Na] +，509 · 3243)。其 13C-匪R數(shù)據(jù)如表 1 所示。
[0056] 化合物VI，3,6_二羰基-15α-羥基-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3399[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0057] 化合物VII，3，6-二羰基-15β-羥基-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3399[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0058] 化合物VIII，3,6，15-三羰基-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末:HR-ESI-MS(m/z) 509.3244[M+Na] + (calculated for C3〇H46〇5Nai，[M+Na] + ,5109.3243)。其 13C-NMR數(shù)據(jù)如表 1 所示。
[0059] 化合物1乂，3,6-二羰基-16|3-羥基-20(1〇-人參三醇，白色無定形粉末:冊431-13 (m/z)511.3340[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0060] 化合物X，3，6-二羰基-15β-羥基-20 (s)-人參三醇，白色無定形粉末：HR-ESI-MS (m/z)511.3341 [M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-匪R數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0061 ] 化合物XI，3,6_二羰基-1α，15α-二羥基-20(R)-人參三醇，白色無定形粉末:·-ESI-MS(m/z )527.3351 [M+Na].(calculated for C3〇H48〇6Nai，[M+Na] +,527.3349)。其 13C-NMR數(shù)據(jù)如表1所示。
[0062] 化合物XII，3,6-二羰基-5α，15α-二羥基-20(R)_人參三醇，白色無定形粉末:冊-ESI-MS(m/z)527.3349[M+Na] + (calculated for。3。1148〇6恥1，[]\1+似]+，527.3349)。其13(：-NMR數(shù)據(jù)如表1所示。
[0063] 表1.式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的 碳譜數(shù)據(jù)(⑶Cl 3)
[0065] 以上結(jié)果表明，所得化合物結(jié)構(gòu)正確。
[0066] 利用其他屬的微生物，具體如刺囊毛霉111〇<^8口;[1108118八3 3.3450、少根根霉 1?1120卩118&1'1'1112118八3 3.3457、頂頭抱厶(^61]1〇11；[1111181：1'；[(31：11111八3 3.2059，均可以米用以上 相同的過程來制備得到結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、 式X、式XI和式XII的化合物。
[0067] 實施例2本發(fā)明結(jié)構(gòu)式為式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、 式X、式XI和式XII的化合物抗腫瘤活性。
[0068] 1)實驗材料
[0069] 儀器與試劑：C02培養(yǎng)箱（Jouan IG0150);酶標(biāo)儀(Bio-TEK ELx800);熒光倒置顯 微鏡(Olympus 1X51) ;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所）、RPM I 1640培養(yǎng)基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亞砜(DMS0)、胰蛋白酶（上海生物 工程有限公司）。
[0070]測試用腫瘤細(xì)胞株:Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞）、K562細(xì)胞(人白血病細(xì)胞）、K562/ ADR細(xì)胞(人白血病耐藥細(xì)胞）、SH-SY5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）、Du-145 (人前列腺癌細(xì) 胞）、HePG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞）、MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞），購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究 所。
[0071 ]測試樣品：實施例1所合成得到的化合物I-XII，純度在90%以上；同時，選取順鉑 為陽性對照藥物，各化合物均以DMS0溶解后稀釋。
[0072] 2)實驗方法
[0073]采用MTT法測定各受試化合物對腫瘤細(xì)胞株的半數(shù)抑制率IC5Q值:取對數(shù)生長期的 腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPM I 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5X 105/mL，接種于96孔 培養(yǎng)板，藥物處理組和細(xì)胞對照組加入每孔l〇〇yL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個復(fù)孔，空白對照組只 加入RPM I 1640全培養(yǎng)基，每孔100yL，設(shè)3個復(fù)孔。將96孔培養(yǎng)板置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱 培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的受試樣品，使終濃度為0. . 1-100μΜ，繼續(xù)培養(yǎng)72h。按MTT法于酶 標(biāo)儀，測定57Onm的吸光度（A)值，計算抑制率[抑制率=(1 -實驗組A值/對照組A值）X 100%]。實驗重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS 11.5軟件作回歸方程，計算各受試樣品對腫瘤細(xì)胞作用 72h的半數(shù)抑制濃度（IC50)。
[0074] 3)實驗結(jié)果
[0075]根據(jù)MTT法測試結(jié)果，計算本發(fā)明化合物I-XII對上述細(xì)胞的IC5Q值，結(jié)果如表2所 不。
[0076]表2.測試樣品體外細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果
[0078]結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物I-XII具有良好的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的 活性成分。
【主權(quán)項】
1. 具有下列結(jié)構(gòu)式的20(R)_人參三醇衍生物其藥學(xué)上可成的鹽：2. 如權(quán)利要求1所述人參二醇衍生物或其藥學(xué)上可成的鹽的制備方法，包括如下步驟： 1) 發(fā)酵培養(yǎng)微生物，向培養(yǎng)基中加入20 (R)-人參三醇，接著進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，除去菌絲體 后得到發(fā)酵液，所述微生物為犁頭霉，小克銀漢霉，毛霉，鏈格孢，紅酵母，共頭霉或根霉屬 的菌株； 2) 將步驟1)得到的發(fā)酵液經(jīng)萃取，得到轉(zhuǎn)化粗提物； 3) 將步驟2)得到的轉(zhuǎn)化粗提物經(jīng)過硅膠柱層析，采用二氯甲烷-無水乙醇兩相系統(tǒng)梯 度洗脫，收集合并組分； 4) 將步驟3)得到的洗脫組分用反相高效液相色譜進(jìn)一步純化，得到如權(quán)利要求1所述 的結(jié)構(gòu)式為式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化 合物。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述微生物為毛霉屬的菌株。4. 含有權(quán)利要求1所述20(R)_人參三醇衍生物或其藥學(xué)上可成的鹽為活性成分的抗腫 瘤藥物，活性成分選自結(jié)構(gòu)式為式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式 X、式XI和式XII的化合物中的一種或幾種。5. 如權(quán)利要求1所述20(R)_人參三醇衍生物或其藥學(xué)上可成的鹽在制備抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/65GK105949265SQ201610335371
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】陳廣通, 宋妍, 李建林, 葛紅娟, 李 杰, 顏森森
【申請人】南通大學(xué)