專利名稱：消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染的方法及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染的方法及其表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物(煙草)的問世，標(biāo)志著全球新一輪“綠色革命”的開始。經(jīng)過20年的研究與開發(fā)，全球轉(zhuǎn)基因植物的種植面積已經(jīng)突破了5000萬公頃/年，轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、玉米、大豆和馬鈴薯等已經(jīng)進(jìn)入大規(guī)模商品化生產(chǎn)階段。我國自20世紀(jì)80年代中后期展開轉(zhuǎn)基因植物研究以來，在國家“863”計(jì)劃、“轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化”專項(xiàng)和自然科學(xué)基金等的大力資助下，轉(zhuǎn)基因植物研究和利用取得了長足的進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因植物種植面積超過150萬公頃，成為世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積最大的五個(gè)國家之一(肖興國等，植物學(xué)報(bào)，2003，45(增刊)92-103)。
轉(zhuǎn)基因植物的大面積種植，特別是抗蟲和抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的種植，提高了農(nóng)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，減少了農(nóng)藥的利用，在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益的同時(shí)也減少了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染，正在為或者解決人口增長導(dǎo)致的食品等緊缺等問題發(fā)揮著巨大的作用，并且隨著轉(zhuǎn)基因植物或作物種類的增加和導(dǎo)入目標(biāo)基因的種類的增加，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)人類所需要的糧、棉、油、菜、果、糖、木材和牧草等經(jīng)典需求和植物工廠產(chǎn)品(如，色素、香精油、特殊氨基酸和疫苗等)現(xiàn)代需求的貢獻(xiàn)會(huì)越來越大。并且，轉(zhuǎn)基因可以給植物引入植物界本身所不具備的新基因，如抗蟲性的Bt基因和抗除草劑的Bar基因等，豐富現(xiàn)存植物的基因資源并提高其生存能力(如導(dǎo)入抗逆和抗病基因等)。
然而，隨轉(zhuǎn)基因植物或作物種類的增加和導(dǎo)入目標(biāo)基因的種類的增加，轉(zhuǎn)基因植物可能對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，特別是可能對(duì)環(huán)境的污染也越來越受到關(guān)注和爭議，特別是公眾的關(guān)注和爭議。關(guān)注和爭議的熱點(diǎn)之一是轉(zhuǎn)基因植物的基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。這些風(fēng)險(xiǎn)主要包括1.在轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)過程中，除了引入可提高作物抗病、抗蟲、抗逆(耐寒、耐旱、耐澇等)或提高品質(zhì)(如淀粉、糖份、蛋白質(zhì)含量的提高)的外來基因外，轉(zhuǎn)基因植物還可能引入選擇基因(如Bar基因、抗生素基因)或報(bào)告基因(如GFP基因、GUS基因)等外來基因，一旦含有上述外來基因的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入大田后，通過花粉傳播、種質(zhì)滲入等與栽培種或野生種雜交而有可能導(dǎo)致這些外來基因的基因漂移。如含有抗蟲性的Bt基因的轉(zhuǎn)基因玉米在大田生產(chǎn)中與野生種和近緣種雜交導(dǎo)致鱗翅目昆蟲因食取被基因漂移污染的植物而死亡，從而造成生態(tài)失衡(Zangerl AR等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，2001，98(21)11908-11912)。又如含有便于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或作為選擇基因的抗除草劑的Bar基因的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，在大田生產(chǎn)中與野生種和近緣種或相關(guān)近緣雜草雜交，導(dǎo)致抗除草劑的新作物或新雜草產(chǎn)生，造成雜草蔓延，甚至產(chǎn)生“超級(jí)雜草”(Ellstrand NC，Plant Physiol.2001，1251543-1545)。因此政府和公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的基因漂移可能造成的環(huán)境污染存在憂慮，從而不利于轉(zhuǎn)基因植物的研究和大面積栽培(轉(zhuǎn)基因生物風(fēng)險(xiǎn)與管理(薛大元主編)，2005，中國環(huán)境科學(xué)出版社，北京，280頁)。2、轉(zhuǎn)基因植物外源基因可能會(huì)滲入到野生近緣種破壞生態(tài)系統(tǒng)原有的生物多樣性(魏偉等，植物學(xué)報(bào)，1999，41(4)343-348)。在現(xiàn)實(shí)中，也偶有關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入大田后造成對(duì)栽培種或野生種污染的報(bào)道。如，2001年墨西哥政府報(bào)告的本土玉米污染問題及加拿大田間出現(xiàn)自生自長的能抗三種除草劑的油菜(Dalton R等，Nature，2001，413337；OrsonJ，English Nature Research Report No 443)；油菜、大豆、甘蔗、萵苣、向日葵、草莓、馬鈴薯和禾谷類作物均可以與相關(guān)近緣雜草發(fā)生基因轉(zhuǎn)移(Chevre AM，et al.Biofutur，172，44-48；Conner AJ，The Royal Society of New Zealand，Miscellaneous Series，3910-14；Ford LB，Nature，1998，394(6695)715)。盡管許多對(duì)轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境評(píng)估結(jié)果證明發(fā)生這些轉(zhuǎn)基因植物基因漂移的概率非常低(Anthony J，et al，The Plant Journal，2003，3319-46)，但也表明存在基因漂移對(duì)環(huán)境污染的潛在危險(xiǎn)性。因此，世界各國，特別是發(fā)達(dá)國家的政府和科學(xué)家們都開始研究如何消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染的潛在危險(xiǎn)性的策略和方法，以在大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí)，創(chuàng)建更好的方法去控制和減弱轉(zhuǎn)基因植物可能對(duì)環(huán)境造成的不良后果。
近幾年，已經(jīng)有一些關(guān)于防止轉(zhuǎn)基因植物基因漂移和保障環(huán)境生物安全的新途徑和新技術(shù)的報(bào)道。綜合起來主要有采用共轉(zhuǎn)化，位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座子技術(shù)等刪除抗生素和除草劑標(biāo)記基因(Yoder JI et al.，Bio/Technology，1994，12263-267；Cregg JM et al.，Mol Gen Genet，1989，219320-323；EbinumaH et al.，Proc Nati Acad Sci USA 1997，942117-2121)、使用生物安全標(biāo)記基因如GFP(Zhang CL et al.，Mol Biotechnol，2001，17，2109-117)、利用葉綠體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化來減少基因漂流的發(fā)生率(Daniell H et al.，NatureBiotechnol，1998，16345-348)、終止子技術(shù)(Visser B et al.，Biotechn Dev.Monit，2001，48，9-12)以及功能可恢復(fù)阻斷(RBF)技術(shù)(Kuvshinov V et al.，Plant Science，2001，160517-522)和人工雄性不技術(shù)(Mariani et al.，Nature，1990，347737-741；Van de meer et al.，Plant Cell，1992，4253-262；XuHL et al.，Porc.Natl.Acad.Sci.USA，1995922106-2110；李艷紅等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1997，3255-258；Burgress DG et al.，Plant J，2002，31(1)113-125；肖興國等，中國專利ZL00109108.5，2004，等等)。但這些方法也各有弊端，如，共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)選擇標(biāo)記基因和目標(biāo)基因之間缺乏緊密的聯(lián)系，造成得到無目標(biāo)基因的株系增多，需要進(jìn)行大量的轉(zhuǎn)化事件才能得到目標(biāo)植株，費(fèi)事費(fèi)力；位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座子技術(shù)在轉(zhuǎn)化過程中需要特定時(shí)間表達(dá)重組酶或轉(zhuǎn)座子，技術(shù)性要求高，實(shí)際上轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低，目前在農(nóng)作物應(yīng)用范圍有限(GoldsteinD A，et al.Journal of Applied Microbiology，2005，99，7-23)；利用葉綠體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植株可能后代性狀不穩(wěn)定；終止子技術(shù)能夠使胚胎死亡，無法留種，從出現(xiàn)就引起爭議，遭到農(nóng)民的強(qiáng)烈抵制；RBF技術(shù)目前僅是一種模式，還需要做更多的工作去驗(yàn)證；人工雄性不育目前還因?yàn)槠洳挥缘姆€(wěn)定性和徹底性不夠育種的要求而使用有限，也有人擔(dān)憂萬一人工雄性不育基因逃逸而污染環(huán)境，將導(dǎo)致相關(guān)野生種和近緣種的毀滅。所以，上述方法的最大缺點(diǎn)或弱點(diǎn)是都只注意到了如何防止轉(zhuǎn)基因植物基因的漂移或逃逸，而都沒有考慮萬一發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移或逃逸后如何消除或消滅該轉(zhuǎn)基因植物和受其污染的植物的問題。
因此目前需要一種發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移或逃逸后可有效殺死或消除該轉(zhuǎn)基因植物和受其污染的植物的方法。
胞嘧啶脫氨酶基因(codA)編碼胞嘧啶脫氨酶(Cytosine Deaminase，CD)，它最早從大腸桿菌(E.coli)中克隆出。在細(xì)菌和真菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有胞嘧啶脫氨酶，但在高等植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)都沒有發(fā)現(xiàn)它的存在(Stouggard J等，Plant J.1993，3755-761；Austin等，Mol.Pharmacol.，1993，43380-387)。在細(xì)菌體內(nèi)，胞嘧啶脫氨酶參與核酸的合成代謝，它能在體內(nèi)把5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)脫氨為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，而5-FU被代謝為5-FUTP(5-氟三磷酸尿苷)和5-FdUTP(5-氟三磷酸脫氧尿苷)。5-FUTP能代替UTP整合到RNA從而抑制rRNA和mRNA的合成。5-FdUTP則能抑制胸腺苷酸合成酶(TS)，從而抑制胸腺苷酸的合成，導(dǎo)致dNTP的衰竭從而引起了細(xì)胞的DNA合成障礙(Beck CF，J.Bacteriol.，1972，5)3)219-228)。也就是說5-FU可以從RNA和DNA分子水平來干擾細(xì)胞的存活，因而是細(xì)胞毒劑，而其前體藥物5-FC則是無毒無害。
利用5-氟胞嘧啶(5-FC)與codA基因配對(duì)聯(lián)用在人體及動(dòng)物的腫瘤治療方面的研究在國內(nèi)外都有很多。在國內(nèi)，將大腸桿菌codA基因體外轉(zhuǎn)染小鼠紅白血病細(xì)胞(FBL3)，得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，再用5-FC對(duì)含有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的小鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行處理，明顯地提高了對(duì)腫瘤的殺傷效果。外用大于1μmol/L的5-FC時(shí)，對(duì)含轉(zhuǎn)codA基因的小鼠T淋巴細(xì)胞(T/PCD2)有顯著的殺傷作用，而對(duì)未轉(zhuǎn)基因的正常T淋巴細(xì)胞基本無毒性，且轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在加入5-FC后生存時(shí)間明顯短于未轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。在直腸癌、肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤以及前列腺癌等的治療研究結(jié)果也表明，codA/5-FC的聯(lián)合作用均有一定的療效。由于5-FC價(jià)格非常低，它與codA基因聯(lián)用也就成為若干癌癥治療的首先方案(陳綱等，腫瘤防治雜志，2001，8(6)611-613)。
在植物上，codA基因主要用作轉(zhuǎn)基因植物研究的一種選擇標(biāo)記基因(Perera RJ等，Plant Mol.Biol.，1993，23793-799；Dai S等，Plant Cell Report，2001，20738-743)。植物，特別高等植物，盡管自身因?yàn)闆]有codA基因或codA基因不表達(dá)而對(duì)外源5-FC不敏感，但是對(duì)外源5-FU卻非常敏感(Helmi R等，Plant J.，1997，11(6)1377-1385；Babwah AV等，Thoer.Appl.Genet.，2000，100802-809；Prasad KVSK等，Plant Sci.，2000，159233-242)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移或逃逸后可有效殺死或消除該轉(zhuǎn)基因植物和受其污染的植物的方法及其植物表達(dá)載體。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的植物表達(dá)載體，包含(1)含有化控式炸彈基因的表達(dá)盒，其中所述化控式炸彈基因是編碼一種能將對(duì)植物無毒的外源化學(xué)物質(zhì)(化控劑)轉(zhuǎn)變成對(duì)植物有毒的內(nèi)源物質(zhì)的酶的基因；和(2)需要被防止出現(xiàn)基因漂移的靶基因表達(dá)盒。
對(duì)于上述植物表達(dá)載體而言，所述炸彈基因的“引爆”由人工外用化學(xué)劑控制，通過將該炸彈基因與改良植物或作物性狀的“靶基因”(又稱為“目標(biāo)基因”)緊密偶聯(lián)，使它們能緊密連鎖遺傳或傳遞。這樣，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株在獲得“靶基因”的同時(shí)，也獲得了“炸彈基因”。在不人工施用“引爆劑”—特定的化學(xué)劑控制時(shí)，炸彈基因不起作用，轉(zhuǎn)基因植株所表達(dá)的外源基因只是“靶基因”。但當(dāng)人工施用“引爆劑”時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的“炸彈基因”發(fā)生“爆炸”---發(fā)揮作用，從而將植株本身殺死或毒死。同理，受到轉(zhuǎn)基因植物基因漂移污染的植物，也毫無例外地會(huì)接受“炸彈基因”。因此，人們可以通過對(duì)這些被污染的植物施用“引爆劑”而將其殺死或毒死。從而能夠完全消除任何轉(zhuǎn)基因植物的基因漂移對(duì)環(huán)境造成危害的危險(xiǎn)。
其中，所述炸彈基因優(yōu)選為胞嘧啶脫氨酶基因。
所述胞嘧啶脫氨酶基因可具有下述核苷酸序列之一1)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；2)編碼胞嘧啶脫氨酶基因的核苷酸序列，所述胞嘧啶脫氨酶基因具有如SEQ IDNo.1的氨基酸序列或?qū)⑷鏢EQ ID No.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與如SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與如SEQ ID №2限定的DNA序列具有60％以上同源性，優(yōu)選80％以上同源性、更優(yōu)選90％以上同源性、最優(yōu)選95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
其中，序列表中的SEQ ID No.2由1284個(gè)脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自5′端第1位-1281位脫氧核苷酸，編碼具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列的胞嘧啶脫氨酶。
所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜。
發(fā)明者認(rèn)為，5-FU也可以從RNA和DNA分子水平來干擾植物細(xì)胞的存活。外源codA基因在植物體內(nèi)不僅能正確表達(dá)，而且表達(dá)產(chǎn)物—胞嘧啶脫氨酶(CD)能將外源無毒的5-FC在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成有毒的5-FU，從而賦予轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、器官乃至個(gè)體對(duì)無毒的5-FC的敏感性?；谶@一點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明者創(chuàng)造性地將codA作為炸彈基因，與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有益的靶基因偶聯(lián)共組成植物表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化植物，并通過外源無毒的5-FC來殺死出現(xiàn)基因漂移的轉(zhuǎn)基因植株。
所述靶基因表達(dá)盒包括目的基因表達(dá)盒，和/或選擇基因表達(dá)盒，和/或報(bào)告基因表達(dá)盒；所述炸彈基因的表達(dá)盒包括植物組成型啟動(dòng)子、炸彈基因和終止子；所述目的基因表達(dá)盒包括植物組成型或組織特異性啟動(dòng)子、目的基因和終止子；所述選擇基因表達(dá)盒包括植物組成型啟動(dòng)子、抗生素抗性基因和終止子；報(bào)告基因表達(dá)盒包括組成型啟動(dòng)子、報(bào)告基因和終止子。
所述目的基因可為具有改良植物有益性狀功能的基因，或具有以植物為“工廠”生產(chǎn)非傳統(tǒng)植物產(chǎn)品功能的基因；所述具有改良植物有益性狀功能的基因，包括抗蟲基因、抗病或耐病基因、抗病毒或耐病毒基因、抗旱或耐旱基因、抗寒或耐寒基因、抗凍或耐凍基因、抗鹽堿或耐鹽堿基因、耐貯藏基因、人工雄性不育基因、品質(zhì)改良基因和提高產(chǎn)量基因等；所述具有以植物為“工廠”生產(chǎn)非傳統(tǒng)植物產(chǎn)品功能的基因包括抗體基因、疫苗基因、醫(yī)用和/或食品用蛋白合成基因、醫(yī)用和/或食品用氨基酸合成基因、醫(yī)用和/或食品用脂類合成相關(guān)基因、色素基因、香精油合成相關(guān)基因、可生物降解塑料合成相關(guān)基因和“植物石油”合成相關(guān)基因等。
所述抗生素抗性基因在植物轉(zhuǎn)化中具有選擇轉(zhuǎn)基因植株的功能，包括抗卡那霉素kan、新霉素neo和巴龍霉素的新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶II(NPT II)、新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶I(NPT I)/新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶III(NPT III基因)或抗朝霉素類的hpt基因。
所述報(bào)告基因在植物轉(zhuǎn)化中具有鑒定轉(zhuǎn)基因植株的功能，包括β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、熒光素酶(LUC)基因、綠色熒光蛋白(GFP)基因或β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。
所述組成型啟動(dòng)子是能驅(qū)動(dòng)基因(內(nèi)源和外源)編碼區(qū)在植物的組織和器官都表達(dá)的啟動(dòng)子。所述組成型啟動(dòng)子包括但不限于椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動(dòng)子、玉米泛蛋白(Ubiquitin)啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白1(Actin 1)啟動(dòng)子等。除了上述組成型啟動(dòng)子之外，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，針對(duì)不同植物選擇合適的其它組成型啟動(dòng)子屬于本領(lǐng)域技術(shù)的公知常識(shí)，因此本發(fā)明不可能也沒有必要對(duì)此進(jìn)行例舉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組成型啟動(dòng)子用于雙子葉植物時(shí)優(yōu)選為CaMV35s，用于單子葉植物時(shí)優(yōu)選Ubiquitin啟動(dòng)子。
所述終止子包括但不限于Nos終止子，Ocs終止子(章魚堿合成酶基因的終止子)和花椰菜花葉病毒CaMV 35s終止子。
用于構(gòu)建所述消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的表達(dá)載體的出發(fā)載體可為Ti類質(zhì)粒載體和病毒載體，優(yōu)選為Ti類質(zhì)粒載體。
所述Ti類質(zhì)粒載體優(yōu)選為目前通用或商品雙元載體，如pCAMBIA3301，pCAMBIA1301，pCAMBIA1303，pBI101，pBI121，pBIN19，pART27和pART69(澳大利亞CAMBIA中心、Introgen，Premega，Lif Sciencesh和新西蘭Hort-Research等公司)等。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(如抗卡那霉素基因NPT II、NPT I和NPT III，抗潮霉素基因hpt等)或除草劑抗性基因(如，bxn、aroA、EPSPS等)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)一步提供了含有靶基因表達(dá)盒和化控式“炸彈基因”表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA。其中植物表達(dá)載體p33UbdA的結(jié)構(gòu)圖參見圖1，構(gòu)建過程參見實(shí)施例1。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的方法。
本發(fā)明所提供的消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的方法，包括以下步驟(1)將上述含有炸彈基因與靶基因表達(dá)盒的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，篩選得到可表達(dá)靶基因和可化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)炸彈基因的轉(zhuǎn)基因植株；和(2)當(dāng)需要?dú)⑺擂D(zhuǎn)基因植物或殺死通過基因漂移被轉(zhuǎn)基因植物污染的植物時(shí)，利用化學(xué)誘導(dǎo)藥劑誘導(dǎo)炸彈基因的表達(dá)，從而致使轉(zhuǎn)基因植株或被轉(zhuǎn)基因植物污染的其它植物整株死亡。
當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物在大田應(yīng)用中通過基因漂移或基因逃逸而污染其野生種、遠(yuǎn)緣種或近緣種植物時(shí)(如轉(zhuǎn)基因植物通過花粉傳播并雜交其野生種、遠(yuǎn)緣種或近緣種植物，造成基因漂移)，對(duì)它們相應(yīng)分別噴施(可機(jī)械噴施)無毒的化學(xué)藥劑以“引爆”體內(nèi)的炸彈基因，從而殺死轉(zhuǎn)基因植物及其污染的其他植株或后代。
其中，所述炸彈基因優(yōu)選為胞嘧啶脫氨酶基因，所述化學(xué)誘導(dǎo)藥劑優(yōu)選為5-氟胞嘧啶。
本發(fā)明進(jìn)一步提供提供了利用含有靶基因表達(dá)盒和化控式“炸彈基因”表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA來消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染隱患的的方法。
所述5-氟胞嘧啶的適宜使用濃度為對(duì)未轉(zhuǎn)基因植株或未受轉(zhuǎn)基因植物花粉污染的植株不產(chǎn)生毒害的最高濃度。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，針對(duì)不同植物選擇合適的5-氟胞嘧啶濃度范圍的方法均是公知方法，例如通過試管或溫室的毒性試驗(yàn)可確定5-氟胞嘧啶的適宜使用的濃度范圍。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，5-氟胞嘧啶的適宜使用濃度范圍一般為100-250mg/L，單子葉植物高于雙子葉植物(煙草)，可能達(dá)到350mg/L或以上。
所述5-氟胞嘧啶的使用時(shí)期為受污染植物的整個(gè)發(fā)育期，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)育期優(yōu)選是營養(yǎng)生長期，更優(yōu)選是幼苗期。
所述通過基因漂移被轉(zhuǎn)基因植物污染的植物是轉(zhuǎn)基因植物的野生種、遠(yuǎn)緣種、近緣種或與其雜交親和的栽培品種或品系。
所述通過基因漂移被轉(zhuǎn)基因植物污染的植物可以是單子葉植物和雙子葉植物，特別是能異花授粉或常異花授粉的單子葉植物和雙子葉植物，包括農(nóng)作物、園藝作物、園林作物、森林和綠化作物或植物、牧草作物和藥用植物或作物。所述單子葉植物包括但不限于小麥、水稻、高梁、谷子、玉米、甘蔗和牧草及其野生種、遠(yuǎn)緣種和近緣種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述被污染的單子葉植物是小麥；所述雙子葉植物包括但不限于煙草、油菜、大白菜、小白菜、甘藍(lán)、番茄、黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒、棉花、苜蓿和牧草及其野生種、遠(yuǎn)緣種和近緣種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述被污染的雙子葉植物是煙草。
本發(fā)明的消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染隱患的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得以轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞或組織中。
本發(fā)明通過消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染隱患的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)炸彈基因的化控組成型表達(dá)，通過5-氟胞嘧啶實(shí)現(xiàn)引爆受轉(zhuǎn)基因植物花粉漂移等污染的植物體內(nèi)的基因炸彈，將植株殺死。本發(fā)明的消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染隱患的方法，使人們能夠根據(jù)自己的意愿隨時(shí)、定向、徹底地清除受轉(zhuǎn)基因植物花粉漂移等污染的植物，而對(duì)未轉(zhuǎn)基因植物和未受轉(zhuǎn)基因植物污染的植物不產(chǎn)生任何負(fù)作用，從而能放心大膽地種植轉(zhuǎn)基因植物(作物)，以大幅度提高植物(作物)的產(chǎn)量和品質(zhì)。例如，將抗蟲或抗病基因表達(dá)盒與本發(fā)明提供的化控式炸彈基因表達(dá)盒偶聯(lián)，并其導(dǎo)入水稻、玉米、小麥、棉花、大豆等任何想導(dǎo)入的植物或作物，獲得抗蟲或抗病而且?guī)в谢厥秸◤椈虻霓D(zhuǎn)基因植物或作物品種。在大面積種植這些轉(zhuǎn)基因植物或作物品種時(shí)，萬一轉(zhuǎn)基因植物或作物通過花粉漂移等污染其野生種、遠(yuǎn)緣種或近緣種，那么這些被污染的植物就同時(shí)接受了化控式炸彈基因。人們可以隨時(shí)通過噴實(shí)施(或其它的施用方法)無毒的化控藥劑(如5-氟胞嘧啶)來“引爆”受污染植物體內(nèi)的基因炸彈，殺死這些受污染者，而未受污染者因?yàn)槠潴w內(nèi)沒有這樣的炸彈基因?qū)ι鲜龌瘜W(xué)“引爆劑”不起反應(yīng)，因此不會(huì)受到傷害。又例如，抗除草劑基因表達(dá)盒與本發(fā)明提供的化控式炸彈基因codA基因表達(dá)盒偶聯(lián)，并其導(dǎo)入水稻、玉米、小麥、棉花、大豆等任何想導(dǎo)入的植物或作物，獲得抗除草劑而有帶有codA炸彈基因的轉(zhuǎn)基因植物或作物品種。在大面積種植這些轉(zhuǎn)基因植物或作物品種時(shí)，萬一轉(zhuǎn)基因植物或作物通過花粉漂移等污染其野生種、遠(yuǎn)緣種或近緣種，那么這些被污染的植物就同時(shí)接受了化控式炸彈基因。人們可以隨時(shí)通過噴實(shí)施(可用機(jī)械乃至飛機(jī)噴施)5-氟胞嘧啶來“引爆”受污染植物體內(nèi)的基因炸彈而將其殺死，而未受污染者因?yàn)槠潴w內(nèi)沒有這樣的炸彈基因?qū)ι鲜龌瘜W(xué)“引爆劑”不起反應(yīng)，因此不會(huì)受到傷害。因此，就不會(huì)出現(xiàn)人們所擔(dān)心的抗除草劑或抗抗菌素的“超級(jí)雜草”。該方法在發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移后可有效殺死或消除該轉(zhuǎn)基因植物和受其污染的植物，并消除政府和公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的基因漂移可能造成的環(huán)境污染的憂慮，有利于轉(zhuǎn)基因植物的研究和大面積推廣應(yīng)用。


圖1為含有化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒和靶基因(Bar基因)表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為5-FC在含有植物表達(dá)載體p33UbdA的轉(zhuǎn)基因煙草葉盤和對(duì)照煙草植株葉盤在試管芽誘導(dǎo)階段引爆炸彈基因的效果比較。
圖3為5-FC在含有植物表達(dá)載體p33UbdA的轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草植株在試管苗生根導(dǎo)階段引爆炸彈基因的效果比較。
圖4為250mg/L 5-FC在轉(zhuǎn)p33UbdA煙草和對(duì)照植株在控制溫室引爆炸彈基因的效果比較。
具體實(shí)施例方式
除非有其它說明，本發(fā)明的實(shí)施使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)，和克隆技術(shù)。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的，并在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。參見，例如，Sambrook and Russell″Molecular CloningA Laboratory Manual″(2001)；CloningA Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)；″王關(guān)林、方宏筠，“植物基因工程”第二版，2002年第2版。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了利用植物表達(dá)載體p33UbdA消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移對(duì)環(huán)境污染隱患的的方法。方法包括首先將植物表達(dá)載體p33UbdA導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，篩選得到可表達(dá)目標(biāo)基因和/或選擇基因和可化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)炸彈基因的轉(zhuǎn)基因植株并經(jīng)過常規(guī)育種方法培育成品種或品系。然后按照國家規(guī)定種植，在大面積種植有該轉(zhuǎn)基因品種或品系的地方及其附件地區(qū)檢測與該轉(zhuǎn)基因品種的親緣種(包括種植的和野生的親緣種)，看是否有轉(zhuǎn)基因的飄逸或逃逸污染(本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道如何檢測)。萬一有污染并且需要?dú)⑺擂D(zhuǎn)基因植物或殺死通過基因漂移被轉(zhuǎn)基因植物污染的其它植物時(shí)，利用化學(xué)誘導(dǎo)藥劑5-氟胞嘧啶誘導(dǎo)炸彈基因的表達(dá)，從而致使轉(zhuǎn)基因植株或被轉(zhuǎn)基因植物污染的其它植物整株死亡。
現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實(shí)施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，下面的實(shí)施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對(duì)上述本發(fā)明總體的限制。例如，盡管大量關(guān)于化控式炸彈基因(codA基因)的實(shí)施例，但是應(yīng)當(dāng)理解，這里公開的本發(fā)明也可應(yīng)用于其它化控式炸彈基因，只要該炸彈基因?qū)儆谀芫幋a一種能將對(duì)植物無毒的外源化學(xué)藥劑(化控劑)轉(zhuǎn)變成對(duì)植物有毒的內(nèi)源物質(zhì)的酶的基因均落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍中。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、含有化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒和靶基因(Bar基因)表達(dá)盒表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA的構(gòu)建根據(jù)GenBank登記號(hào)AY331712的描述，從大腸桿菌JM101基因組DNA中克隆長為1284bp(序列2)的codA基因，并在其5’端和3’端分別加上限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac I識(shí)別位點(diǎn)后連接到經(jīng)過BamHI和Sac I雙酶切的pGEM-T載體(美國，Promega公司)上，生成中間載體pdAJM備用。用Hind III酶切含有Ubiquilin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)盒的通用質(zhì)粒pAHC25(該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方法見Chritensen AH et al.，Plant Mol.Biol，1992，18675-689)，回收ubi啟動(dòng)子-內(nèi)含子-GUS-nos終止子(完整的表達(dá)盒)的片段，插入經(jīng)同樣酶切的pGEM-13Zf(美國，Promega公司)中，形成中間載體pGEM13GUS備用。再從備用中間載體pdAJM上用Bam HI和Sac I雙酶切取出codA基因片段，插入經(jīng)BamHI和Sac I雙酶切的另外一個(gè)中間載體pGEM13GUS，從而以codA基因片段取代GUS基因片段，得到含有codA嵌合基因表達(dá)盒的表達(dá)載體pGEM13dA。再用Hind III酶切表達(dá)載體pGEM13dA，取出codA嵌合基因表達(dá)盒(ubi-intron∷codA-nos)---化控式“炸彈基因”表達(dá)盒，插入經(jīng)過Hind III酶切的通用雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA3301(含PPT抗性基因Bar的表達(dá)盒，即靶基因表達(dá)盒。澳大利亞CAMBIA中心產(chǎn)品)中，得到含有炸彈基因表達(dá)盒和靶基因表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA，該載體p33UbdA的結(jié)構(gòu)圖參見圖1。
實(shí)施例2、試管獲得含有化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒和靶基因(Bar基因)表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA的轉(zhuǎn)基因植株(一)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化用凍融法(Hfgen R et al.，Nucleic Acids Res，1988，169877)將實(shí)施例1構(gòu)建好的植物表達(dá)載體p33UbdA轉(zhuǎn)入通用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105(購自鼎國生物技術(shù)公司)。挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上長出的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌的單菌落，經(jīng)含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，用小量堿液法(Sambrook等，2001，分子克隆手冊(cè))提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒用BamHI和Sac I雙酶切，切出1.28kb(codA)的目標(biāo)帶和大于12kb的載體帶，鑒定和確認(rèn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的成功。轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化煙草。
(二)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草煙草的轉(zhuǎn)化用Horch等(Science 2271229-1231，1985)的葉盤法進(jìn)行，葉盤取自在固體MS(Murashige T，Skoog F，Physiol Plant，1962，15473-497)培養(yǎng)基(MS+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+肌醇100mg/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)、于25℃16小時(shí)光照下培養(yǎng)的煙草NC89(Nicotiana tobacumcv NC89，購于中國農(nóng)科院種子公司)組培苗的葉片。轉(zhuǎn)化煙草葉盤的誘導(dǎo)芽分化的選擇壓為PPT 1.25mg/L，芽苗的生根選擇壓為PPT 5.0mg/L，所述PPT購自德國赫斯特公司或德國Riedel-de Haen公司。結(jié)果表明未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照葉盤在這些選擇壓下被殺死，不能分化出芽，或即使有極少量的芽也不能生根。因此，在這些連續(xù)選擇壓下能正常生根與生長的PPT-抗性苗作為轉(zhuǎn)基因候選苗，以待作分子(PCR和Southern雜交)鑒定確認(rèn)。
(三)煙草轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定煙草基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB法(Porebski S et al.，Plant MolBiol Rep，1997，158-15)。PCR引物為目標(biāo)基因codA兩端的特異性引物對(duì)dA1和dA2，序列如下dA15’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’dA25’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’反應(yīng)程序94℃ 5min；94℃ 60s，63℃ 60s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 90s。擴(kuò)增反應(yīng)在PE-7400PCR儀(美國，PE公司)上進(jìn)行。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因苗能被擴(kuò)增出大約1280bp的帶，表達(dá)載體質(zhì)粒(p33UbdA)陽性對(duì)照也能被擴(kuò)增出大約1280bp的帶，而未轉(zhuǎn)基因的陰性植株對(duì)照和空白對(duì)照都不能被擴(kuò)增出帶，更沒有1280bp左右的帶。
(四)煙草轉(zhuǎn)化子的Southern雜交鑒定取上述PCR陽性植株的葉片和未轉(zhuǎn)基因植株的葉片，用CTAB法提取基因組DNA。基因組DNA和植物表達(dá)載體質(zhì)粒(p33UbdA)都同樣用限制性酶Hind III完全酶切，0.8％瓊脂糖凝膠分離后轉(zhuǎn)到帶正電荷的尼龍膜(Amersham PharmaciaBiotech，Hybond-N+)上，80℃烤膜2小時(shí)固定DNA，用地高辛標(biāo)記codA片段做探針(Sambrook等，2001，分子克隆手冊(cè))。雜交和洗膜都按照地高辛DNA 標(biāo)記和檢測試劑盒(Anti-Digoxigenin-AP，alkaline phosphotase)(Roche AppliedScience)說明完成。結(jié)果表明表達(dá)載體質(zhì)粒(p33UbdA)被雜交出很強(qiáng)的大約1280bp的目標(biāo)帶和很弱的載體帶，PCR陽性植株多數(shù)被雜交出1-4條帶，而未轉(zhuǎn)基因的陰性對(duì)照植株沒有出現(xiàn)任何帶。
實(shí)施例3.含有化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒和靶基因(Bar基因)表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA轉(zhuǎn)基因植株的試管化學(xué)引爆試驗(yàn)取通過實(shí)施例2獲得的靶基因(Bar基因，抗PPT基因)表達(dá)盒和化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因煙草試管苗的葉片和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵菰嚬苊绲娜~片，切成直徑0.8-1cm的圓盤，接種到含有不同濃度的化學(xué)引爆劑5-FC(江蘇南通海爾斯藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)(0，100，250和500mg/L)固體MS培養(yǎng)基(MS+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+肌醇100mg/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)上，在25±2℃ 16光照下培養(yǎng)。30天后觀察到轉(zhuǎn)基因葉盤在含有100mg/L5-FC的培養(yǎng)基上不能分化出芽，但有65％(39/60)的葉片有愈傷組織出現(xiàn)，而80％(48/60)的對(duì)照葉盤可以分化小芽。當(dāng)5-FC濃度達(dá)到250mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因葉盤發(fā)黃萎縮，而此條件下對(duì)照葉盤68.3％仍能分化出小芽，盡管小芽沒有正常生長，但保持綠色(圖2，0、100、250、500分別表示含有0、100、250、500mg/L 5-FC的培養(yǎng)基；上排是轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉盤；下排是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵葜仓甑娜~盤)。由此可見，在試管條件下，化學(xué)引爆劑能夠引爆轉(zhuǎn)基因體內(nèi)的炸彈基因，使轉(zhuǎn)基因葉盤發(fā)黃萎縮而死，并且化學(xué)引爆劑的適宜濃度范圍在100-250mg/L，這樣含有與炸彈(codA)基因偶聯(lián)的靶基因(Bar)的轉(zhuǎn)基因葉盤不能分化出小芽，從而被殺死。
為了確認(rèn)化學(xué)引爆劑5-FC對(duì)轉(zhuǎn)基因試管苗生根階段引爆炸彈基因的效率，把轉(zhuǎn)基因和對(duì)照煙草芽苗轉(zhuǎn)到含有250，500或750mg/L引爆劑5-FC的生根培養(yǎng)基(MS+IAA 0.5mg/L+肌醇100mg/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)上。培養(yǎng)條件同上。30天后，觀察到250mg/L 5-FC下轉(zhuǎn)基因植株生長正常，但根比對(duì)照植株(未轉(zhuǎn)基因植株)的短；當(dāng)5-FC提高到500mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株雖然能長高，但不生根；當(dāng)5-FC達(dá)到750mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株受到嚴(yán)重抑制，萎縮，而對(duì)照植株即使在750mg/L 5-FC的培養(yǎng)基上，都能形成旺盛的根系，生長良好(圖3，左側(cè)的三張照片是轉(zhuǎn)基因煙草(5-FC在生根培養(yǎng)基中的濃度從左到右依次為250、500和750mg/L)，右側(cè)的三張照片是未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照煙草(5-FC在生根培養(yǎng)基中的濃度從左到右依次為250、500和750mg/L))。這些結(jié)果說明，在轉(zhuǎn)基因植株試管苗的生根階段，化學(xué)引爆劑仍然能夠引爆轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的炸彈基因，只不過是引爆濃度需要得高一些(500＜N≤750mg/L)，這樣含有與炸彈基因(codA基因)偶聯(lián)的靶基因(Bar)的轉(zhuǎn)基因芽苗不能生根，最終被殺死。
實(shí)施例4、大田獲得含有化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒和靶基因(Bar基因)表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA的轉(zhuǎn)基因植株，以及大田化學(xué)引爆炸彈基因的試驗(yàn)將按照實(shí)施例2和3的方法獲得含有化控式炸彈基因(codA基因)表達(dá)盒和靶基因(Bar基因)表達(dá)盒的植物表達(dá)載體p33UbdA轉(zhuǎn)基因試管苗植株按照常規(guī)方法移栽到控制溫室(按照目前國家和農(nóng)業(yè)部有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物及其試驗(yàn)的管理辦法，在批準(zhǔn)環(huán)境釋放前必須在控制溫室進(jìn)行，以防止轉(zhuǎn)基因漂移)。當(dāng)苗高達(dá)到4-6片葉時(shí)進(jìn)行了化學(xué)引爆劑的濃度試驗(yàn)。
(一)確定大田中化學(xué)引爆劑的適宜的濃度范圍選取4-6葉期同樣狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑娜~片，用100-350mg/L的化學(xué)引爆劑5-FC進(jìn)行點(diǎn)涂抹。15天后觀察，轉(zhuǎn)基因植株葉片在250mg/L及以上濃度的涂抹點(diǎn)出現(xiàn)明顯的壞死斑，而對(duì)照葉片無反應(yīng)。初步說明，化學(xué)引爆劑能引爆室外栽培的含有炸彈基因的植株體內(nèi)的炸彈基因，并且適宜的濃度范圍250-350mg/L。
(二)根據(jù)所確定的濃度范圍進(jìn)行大田化學(xué)引爆炸彈基因的試驗(yàn)用涂抹篩選到的低值有效濃度(250mg/L)的化學(xué)引爆劑5-FC對(duì)試驗(yàn)植株的全株進(jìn)行噴灑。選取4-8葉期同樣狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，用背?fù)式噴霧器整株噴灑250mg/L的化學(xué)引爆劑5-FC，到葉片滴水為宜。同時(shí)，以轉(zhuǎn)基因植株噴灑清水為陰性對(duì)照。噴后3周檢查統(tǒng)計(jì)，未噴灑5-FC的轉(zhuǎn)基因植株的生長正常，而噴灑了5-FC的轉(zhuǎn)基因植株葉片發(fā)黃，逐漸萎縮(見表1和圖4，圖4中A，未轉(zhuǎn)基因但噴施了5-FC的煙草；B，轉(zhuǎn)基因噴施了5-FC的煙草；C，轉(zhuǎn)基因但未噴施5-FC的煙草)。未轉(zhuǎn)基因的野生型煙草在噴灑了5-FC后，開始葉片也出現(xiàn)輕微的發(fā)黃，但幾天后就恢復(fù)正常。這些結(jié)果表明，化學(xué)引爆劑的確能引爆室外栽培的含有炸彈基因的植株體內(nèi)的炸彈基因從而殺死含有靶基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，并且在大量噴灑的條件下，適宜的化學(xué)引爆劑濃度不超過250mg/L。
表1.250mg/L 5-FC噴灑轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)基因煙草，30天后煙草敏感性統(tǒng)計(jì)
序列表<160>2<210>1<211>427<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly1 5 10 15Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala20 25 30Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp35 40 45Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His50 55 60Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly65 70 75 80Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu85 90 95Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln100 105 110Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp115 120 125Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val130 135 140Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu165 170 175Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu180 185 190
Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr195 200 205Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser210 215 220Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly225 230 235 240Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly245 250 255Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn260 265 270Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp275 280 285Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu290 295 300Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp305 310 315 320Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu325 330 335His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly GlnIle Asn Asp Gly Leu Asn340 345350Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly355 360 365Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn370 375 380Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg385 390 395 400Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr405 410 415Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg420 425
<210>2<211>1284<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>2atgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag1020ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg1080acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg1140ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt1200ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca1260gaagccatcg attacaaacg ttga 128權(quán)利要求
1.一種消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的表達(dá)載體，包含(1)含有化控式炸彈基因的表達(dá)盒，其中所述化控式炸彈基因是編碼一種能將對(duì)植物無毒的外源化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成對(duì)植物有毒的內(nèi)源物質(zhì)的酶的基因；和(2)需要被防止出現(xiàn)基因漂移的靶基因表達(dá)盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述炸彈基因是胞嘧啶脫氨酶基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述胞嘧啶脫氨酶基因具有下述核苷酸序列之一1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；2)編碼胞嘧啶脫氨酶的核苷酸序列，所述胞嘧啶脫氨酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或?qū)⑷鏢EQ ID No.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與如SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與如SEQ ID №2限定的核苷酸序列具有60％以上同源性，且編碼具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述靶基因表達(dá)盒包括目的基因表達(dá)盒，和/或選擇基因表達(dá)盒，和/或報(bào)告基因表達(dá)盒；所述炸彈基因的表達(dá)盒包括組成型啟動(dòng)子、炸彈基因和終止子；所述目的基因表達(dá)盒包括組成型或組織特異性啟動(dòng)子、目的基因和終止子；所述選擇基因表達(dá)盒包括組成型啟動(dòng)子、抗生素抗性基因和終止子；報(bào)告基因表達(dá)盒包括組成型啟動(dòng)子、報(bào)告基因和終止子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述目的基因?yàn)榫哂懈牧贾参镉幸嫘誀罟δ艿幕颍蚓哂幸灾参餅椤肮S”生產(chǎn)非傳統(tǒng)植物產(chǎn)品功能的基因；所述具有改良植物有益性狀功能的基因，包括抗蟲基因、抗病或耐病基因、抗病毒或耐病毒基因、抗旱或耐旱基因、抗寒或耐寒基因、抗凍或耐凍基因、抗鹽堿或耐鹽堿基因、耐貯藏基因、人工雄性不育基因、品質(zhì)改良基因和提高產(chǎn)量基因；所述具有以植物為“工廠”生產(chǎn)非傳統(tǒng)植物產(chǎn)品功能的基因包括抗體基因、疫苗基因、醫(yī)用和/或食品用蛋白合成基因、醫(yī)用和/或食品用氨基酸合成基因、醫(yī)用和/或食品用脂類合成相關(guān)基因、色素基因、香精油合成相關(guān)基因、可生物降解塑料合成相關(guān)基因和“植物石油”合成相關(guān)基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述抗生素抗性基因包括抗卡那霉素、新霉素和巴龍霉素的NPT II、NPTI/NPTIII基因，或抗朝霉素類的hpt基因；所述報(bào)告基因包括GUS基因、CAT基因、LUC基因、GFP基因或LacZ。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述終止子包括Nos終止子、Ocs終止子/和CaMV 35s終止子；所述組成型啟動(dòng)子包括CaMV 35s啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子和Actin 1啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體是如圖1所示的p33UbdA。
9.一種消除轉(zhuǎn)基因植物基因漂移或逃逸對(duì)環(huán)境污染的方法，包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1-8中任一所述的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官中，篩選得到可表達(dá)靶基因和可化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)炸彈基因的轉(zhuǎn)基因植株；和(2)當(dāng)需要?dú)⑺擂D(zhuǎn)基因植物或殺死通過基因漂移被轉(zhuǎn)基因植物污染的植物時(shí)，利用化學(xué)誘導(dǎo)藥劑誘導(dǎo)炸彈基因的表達(dá)，從而致使轉(zhuǎn)基因植株或被轉(zhuǎn)基因植物污染的植物整株死亡。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述炸彈基因是胞嘧啶脫氨酶基因，所述的化學(xué)誘導(dǎo)藥劑是5-氟胞嘧啶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述5-氟胞嘧啶的使用時(shí)期為轉(zhuǎn)基因植物或受轉(zhuǎn)基因植物基因污染的植物的營養(yǎng)生長期，所述5-氟胞嘧啶的適宜使用濃度為對(duì)未轉(zhuǎn)基因植株或未受轉(zhuǎn)基因植物花粉污染的植株不產(chǎn)生毒害的最高濃度。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述營養(yǎng)生長期為幼苗期，所述5-氟胞嘧啶的適宜使用濃度范圍為100-350mM，優(yōu)選100-250mg/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種消除轉(zhuǎn)基因植物的基因漂移對(duì)環(huán)境污染的方法及其表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體包含炸彈基因表達(dá)盒和需要被防止出現(xiàn)基因漂移的靶基因表達(dá)盒。所述的方法包括，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物并得到含有炸彈基因表達(dá)盒并可表達(dá)靶基因的轉(zhuǎn)基因植株。一旦發(fā)現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物通過基因漂移污染其野生種、遠(yuǎn)緣種和/或近緣種等后，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其污染的其他植物施用無毒化控劑以引爆基因炸彈，殺死轉(zhuǎn)基因植物及其受污染的其他植物，未受污染的植物不會(huì)受到影響。該方法在發(fā)生轉(zhuǎn)基因漂移后可有效殺死或消除該轉(zhuǎn)基因植物和受其污染的植物，并消除政府和公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的基因漂移可能造成的環(huán)境污染的憂慮，有利于轉(zhuǎn)基因植物的研究和大面積推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1778915SQ20051010833
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者肖興國, 王志林, 曹克浩, 韓曉紅, 孫曉紅 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)