專利名稱：一種快速高效的植物人工微rna表達(dá)載體構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是生物基因克隆表達(dá)技術(shù)，特別是一種快速高效構(gòu)建植物人工微RNA (artificial microRNAs， amiRNAs)表達(dá)載體的方法。特別適合用于大規(guī)模的構(gòu)建針對(duì)植物的 不同基因的植物人工微RNA表達(dá)單元，以研究植物基因的功能。
背景技術(shù)：
隨著越來(lái)越多的物種全基因組序列測(cè)定工作的完成，當(dāng)前的基因組學(xué)研究熱點(diǎn)已經(jīng)由結(jié) 構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向了功能基因組學(xué)，從而發(fā)展能夠快速、高效、高通量的基因功能研究方法和 策略也自然成為了研究熱點(diǎn)。RNA干擾(RNAinterference, RNAi)技術(shù)由于特異性高，操 作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，已成為當(dāng)今動(dòng)植物基因功能研究中重要的手段之一，然而由于動(dòng)植物細(xì) 胞本身內(nèi)在的特點(diǎn)，RNAi技術(shù)在動(dòng)物基因功能研究中的應(yīng)用己經(jīng)相當(dāng)廣泛和普遍，而在植物 中，由于脫靶效應(yīng)的存在導(dǎo)致其應(yīng)用相對(duì)受阻。近一年多來(lái)，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)植物人工微RNA (artificial microRNAs， amiRNAs)能夠高效、高特異性地沉默植物的內(nèi)源和外源基因，而且 應(yīng)用范圍比傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)更加廣泛。在美國(guó)的擬南芥2010計(jì)劃中，就運(yùn)用了植物 amiRNAs表達(dá)技術(shù)研究擬南芥中以多基因家族形式存在的基因的功能。
目前，已知的構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體的方法主要有三種第一種是采用重疊延伸 PCR的方法，先按照需要設(shè)計(jì)三對(duì)引物，進(jìn)行三輪獨(dú)立的PCR,獲得的三種PCR產(chǎn)物分別 含有待干擾的目的基因的靶序列、amiRNAs的環(huán)序列以及待干擾的目的基因靶序列的互補(bǔ) 序列；然后采用重疊延伸PCR的方法將獲得的三種PCR產(chǎn)物拼接成完整的amiRNAs莖環(huán) 結(jié)構(gòu)序列(見(jiàn)圖1)，再將其克隆到植物雙元表達(dá)載體上。第二種是設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物分 別含有針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的靶序列以及與靶序列互補(bǔ)的序列，且兩端分別帶有特定的酶切位 點(diǎn)，以從植物中獲得的microRNA (miRNA)的cDNA序列作為模板進(jìn)行PCR,獲得的產(chǎn)物 經(jīng)酶切酶連處理后克隆到入口載體上，然后采用Gateway重組的方法將amiRNAs的莖環(huán)結(jié) 構(gòu)序列克隆到植物雙元表達(dá)載體上(見(jiàn)圖2)。第三種是直接合成法。通過(guò)以上方法雖然能夠 成功構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體，但是明顯存在不足，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面
一、步驟繁瑣，克隆效率低。以上三種方法都需要對(duì)克隆的目的片段和載體進(jìn)行特殊處 理，需要目的片段與載體的連接反應(yīng)。三種方法中，載體都需要經(jīng)過(guò)合適的酶切、純化處理。 第一種方法需要用三對(duì)不同的引物經(jīng)第一輪PCR獲得三段200bp左右大小的DNA片段，對(duì) 其分別進(jìn)行純化處理后，再以該純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪重疊延伸PCR,得到完整的 amiRNAs結(jié)構(gòu)。由于第一輪PCR產(chǎn)物通常在200bp以下，因此純化效率較低，成本較高。
而且植物雙元載體一般較大(10kb以上)，amiRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)克隆上去之前的酶切、純化、 酶連操作相對(duì)困難。第二種方法需要在引物中額外添加針對(duì)干擾目的基因設(shè)計(jì)的靶序列以及 amiRNAs的側(cè)翼序列，通常需要長(zhǎng)引物(大于60nt)或者多輪的PCR擴(kuò)增才能獲得完整的 amiRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，獲得的PCR產(chǎn)物也需要酶切，然后與同樣酶切處理過(guò)的入口載體 進(jìn)行連接反應(yīng)。這個(gè)過(guò)程不僅花費(fèi)時(shí)間，而且增加了載體的自連背景，使后續(xù)的篩選過(guò)程復(fù) 雜化。第三種方法需要化學(xué)合成的兩條寡核苷酸單鏈體外退火，得到的產(chǎn)物需要純化處理， 然后與處理好的載體連接反應(yīng)；由于待克隆的片段小于100bp，因此難以回收純化，而且要 鑒定正確的重組質(zhì)粒較難，假陽(yáng)性率高。
二、 不適合高通量的操作。以上三種方法中的待克隆目的片段都需要預(yù)先處理純化，都 依賴于載體與片段的連接反應(yīng)。這些操作對(duì)于構(gòu)建單個(gè)或少數(shù)植物amiRNAs表達(dá)載體可能 有效，但如果大規(guī)模構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體卻非常困難，效率低下。第一種方法中， 得到一個(gè)完整的amiRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列需要兩對(duì)特定的引物，四次獨(dú)立的PCR和回收步驟， 這不僅步驟煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且成本高。第二種方法中使用的引物通常大于60nt，第三種 方法需要使用的寡核苷酸單鏈通常為80-100nt，合成這些長(zhǎng)的引物或寡核苷酸單鏈不僅大 大增加了實(shí)驗(yàn)成本，而且堿基合成正確率大大下降，從而使得后續(xù)的篩選工作成本增加。
三、 不適合用于所有植物miRNA的種類。植物體內(nèi)不同的miRNA的側(cè)翼序列和環(huán)序列 的長(zhǎng)度差異很大。前兩種方法都不適合用于以環(huán)序列長(zhǎng)度過(guò)短的miRNA為基礎(chǔ)的amiRNAs 的構(gòu)建。第一種方法中，如果amiRNAs的環(huán)長(zhǎng)度過(guò)短，將使得第一輪PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度過(guò)短， 最終導(dǎo)致純化困難，回收效率低下。第二種方法只適合側(cè)翼序列堿基數(shù)目少而且環(huán)長(zhǎng)度較長(zhǎng) 的植物miRNA。
(參見(jiàn)刊物"Plant Cell. 2006 May; 18(5): 1134^51" ; "Plant Cell. 2006 May; 18(5): 1121-33." "Nat Biotechnol. 2006 Nov;24(11): 1420-8."參見(jiàn)網(wǎng)頁(yè)http:〃2010.cshl.edu/)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的植物人工微RNA (artificial microRNAs， amiRNAs)表達(dá)載 體構(gòu)建技術(shù)。該技術(shù)主要包括植物amiRNAs表達(dá)單元的構(gòu)建和amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物 雙元表達(dá)載體兩大步驟。該技術(shù)不需訂購(gòu)長(zhǎng)度大于60nt的引物，不需要對(duì)PCR產(chǎn)物及載體進(jìn) 行酶切、連接步驟就能迅速地構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體，真正做到快速、高效、低成本的 構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體。
本發(fā)明中構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體的具體方法為(見(jiàn)圖5):
—)含araiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的構(gòu)建
1)選擇并改造供體骨架載體。在miRNA 5'與3'側(cè)翼序列之間克隆一篩選標(biāo)記基因或報(bào) 告基因的表達(dá)單元(如gfp、 ccdB等)，通過(guò)該表達(dá)單元的缺失，可以直接鑒定出含有植物 amiRNAs表達(dá)單元的重組子；在5'側(cè)翼序列(5'f lank)的前面添加一個(gè)控制植物amiRNAs表達(dá) 的啟動(dòng)子(promoter),在3'側(cè)翼序列(3'flank)的后面添加一終止子序列(temiinator)，得到植 物amiRNAs的供體骨架載體(見(jiàn)圖3)。
2) 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)在線軟件或相關(guān)運(yùn)算規(guī)則，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因進(jìn)行RNA干擾的靶序 列。首先以miRNA的環(huán)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)一條長(zhǎng)度與其相同的引物①；然后根據(jù)前面所述的 amiRNAs的供體骨架載體上miRNA的5'側(cè)翼序列和3'側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物(引 物②和引物③)，該對(duì)引物應(yīng)該在與amiRNAs供體骨架載體特異性退火的序列5'末端加上已 設(shè)計(jì)的靶序列(TS1、 TS2),除此之外，引物②還應(yīng)在5'末端加上與引物①特異性退火的序列 LSP1，弓l物③的5'末端還應(yīng)加上引物①5，末端的10-15nt序列HR,使兩者末端產(chǎn)生10-15bp 的同源序列。(具體參見(jiàn)圖5B)
3) PCR擴(kuò)增。利用2)中設(shè)計(jì)的引物①,，以前面所述的araiRNAs供體骨架載體為模 板，經(jīng)套式PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物含有amiRNAs供體骨架載體上的miRNA的側(cè)翼序列和 干擾目的基因的靶序列，而且PCR產(chǎn)物5'和3'末端分別帶有部分miRNA的環(huán)序列，同時(shí)PCR 產(chǎn)物缺失了 amiRNAs骨架載體中的篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因的表達(dá)單元(如gfp、 ccdB等)。
(具體參見(jiàn)圖5C)
4) 同源重組轉(zhuǎn)化篩選。獲得的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1鄰感受態(tài)細(xì)胞，在大腸桿 菌體內(nèi)經(jīng)同源重組自環(huán)化，得到含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒。
以上敘述過(guò)程參見(jiàn)圖5中路線A—B—C—F。
除了以上敘述的方法外，構(gòu)建含amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒還可以通過(guò)下列方法實(shí)現(xiàn):
1) 選擇并改造供體骨架載體。首先在miRNA 5'與3'側(cè)翼序列之間克隆一篩選標(biāo)記基因 或報(bào)告基因的表達(dá)單元(如gfp、 ccdB等)，通過(guò)該表達(dá)單元的缺失，可以直接鑒定出含有 植物amiRNAs表達(dá)單元的重組子；在5'側(cè)翼序列(5'f lank)的前面添加一個(gè)控制植物amiRNAs 表達(dá)的啟動(dòng)子(promoter)，在3'側(cè)翼序列(3'f lank)的后面添加一終止子序列(terminator)，得 到植物amiRNAs的供體骨架載體(見(jiàn)圖3)。
2) 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)在線軟件或相關(guān)運(yùn)算規(guī)則，設(shè)計(jì)干擾目的基因的靶序列。根據(jù)前面所 述的amiRNAs的供體骨架載體上miRNA 5'側(cè)翼序列和3'側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物④和⑤； 同時(shí)根據(jù)該miRNA的環(huán)序列，再設(shè)計(jì)一對(duì)引物⑥和⑦，該引物應(yīng)該在與所選用的植物miRNA 的環(huán)序列特異性退火的序列5'末端依次加上已設(shè)計(jì)的靶序列(TS1、 TS2)以及引物④和引物 ⑤的5'末端的10-15nt序列(冊(cè)l、冊(cè)2)，使兩PCR產(chǎn)物末端分別產(chǎn)生10-15bp的同源序列。
(具體參見(jiàn)圖5D/G)
3) PCR擴(kuò)增。利用2)中設(shè)計(jì)的引物④和(D，以前面所述的amiRNAs供體骨架載體為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用引物⑥和⑦，以含有所選用的植物miRNA的環(huán)序列的載體為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4) 同源重組轉(zhuǎn)化篩選。獲得的兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后按1: 5-10比例混合轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌DH10p感受態(tài)細(xì)胞，在大腸桿菌體內(nèi)經(jīng)同源重組后，得到含有干擾目的基因的靶序 列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒。
以上敘述過(guò)程參見(jiàn)圖5中路線A—D/G—E—F。
由于在以amiRNAs供體骨架載體為模板的PCR過(guò)程中，miRNA5，與3，側(cè)翼序列之間的篩
說(shuō)明書(shū)第4/8頁(yè)
選標(biāo)記基因或報(bào)告基因的表達(dá)單元(如gfp、 CcdB等)缺失，重組質(zhì)粒和原始模板可以通過(guò) 瓊脂糖凝膠電泳有效區(qū)分；還可以通過(guò)篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因自身的特點(diǎn)，如gfp報(bào)告 基因表達(dá)能自發(fā)熒光，在大腸桿菌中，原始模板表達(dá)gfp自發(fā)熒光，排除因模板污染而產(chǎn)生 的背景。
二)人工微RNAs (amiRNAs)表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上
1) 選擇并改造受體載體。首先在植物雙元載體上克隆一大腸桿菌的條件致死基因表達(dá)單 元，如/^ s基因(在培養(yǎng)基中加入氯化苯丙氨酸，表達(dá)的PHES對(duì)大腸桿菌有致死效應(yīng))， 而且該表達(dá)單元兩端分別帶有一個(gè)I-5bel酶切位點(diǎn)以及一段與含有araiRNAs表達(dá)單元的供體 質(zhì)粒同源的50bp序列，獲得植物雙元受體載體(見(jiàn)圖4),將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BUN21 (pML300) 中。
2) 采用接合輔助的遺傳整合克隆方法(mating-assisted genetically integrated cloning ， MAGIC)將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上，具體操作步驟如下
a) 將攜帶有包含ainiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒(構(gòu)建過(guò)程前面已敘述)的大腸桿菌DH10p 接種于含有氨芐青霉素(Amp) 100wg/ml、葡萄糖0.2%的LB平板，將含有植物雙元受體載 體的大腸桿菌BUN21 (pML300)接種于含有卡那霉素(Kan) 50ug/ml、壯觀霉素(Spec) 50 P g/ml和葡萄糖0.2%的LB平板，于30X:過(guò)夜培養(yǎng)。
b) 挑取已長(zhǎng)出的單菌落接種于5ml相應(yīng)的液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。
c) 第二天，分別于4000rpm室溫離心5min，收集菌體，將收集的兩種菌體分別重懸于 lmlLB液體，重復(fù)上述離心重懸操作1-3次。將兩種菌體各取40"1分別加入到兩支不同的 試管中，試管內(nèi)含有2ml添加了0.2X鼠李糖的LB培養(yǎng)基，于30'C搖2小時(shí)左右，使兩試管 中菌體的OD湖值達(dá)到0.15 - 0. 25。
d) 1: l混合上述兩種菌體，加阿拉伯糖使其終濃度為0.2%，混勻后，37'C靜置2小時(shí)， 然后37'C搖床培養(yǎng)2小時(shí)。
e) 將上述菌體涂布于含有氨芐青霉素100ug/ml、卡那霉素50iig/ml的LB固體平板， 42'C過(guò)夜培養(yǎng)。
f) 挑取單菌落，驗(yàn)證重組子，選出植物人工微RNA (amiRNAs)表達(dá)載體。 上述步驟中，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加阿拉伯糖，從大腸桿菌BUN21 (pML300)中誘導(dǎo)表
達(dá)出的內(nèi)切酶I-S"I,可將供體質(zhì)粒上amiRNAs表達(dá)單元和植物雙元受體載體上的大腸桿菌條 件致死基因表達(dá)單元(如pAe5)分別從其兩側(cè)I-S"I酶切位點(diǎn)處切下，因含有amiRNAs表 達(dá)單元的供體質(zhì)粒和植物雙元受體載體經(jīng)內(nèi)切酶酶切后，切下的amiRNAs表達(dá)單元和 植物雙元受體載體的線性化酶切產(chǎn)物末端帶有50bp的彼此同源序列，所以在大腸桿菌BUN21 (pML300)中，由鼠李糖誘導(dǎo)表達(dá)出的重組酶可以使帶有50bp同源序列的兩片段在大腸桿 菌體內(nèi)發(fā)生同源重組，從而獲得含有amiRNAs表達(dá)單元的植物雙元載體，即植物amiRNAs表 達(dá)載體。
所述的植物amiRNAs表達(dá)載體包括以所有植物miRNA結(jié)構(gòu)為骨架構(gòu)建的含有植物
amiRNAs表達(dá)單元的載體；控制植物amiRNAs表達(dá)的啟動(dòng)子可以是組成型、誘導(dǎo)型、細(xì)胞 或組織特異性啟動(dòng)子。
當(dāng)步驟一)中構(gòu)建的含有植物amiRNAs表達(dá)單元的載體用于植物原生質(zhì)體的瞬間表達(dá)檢 測(cè)、或者通過(guò)除步驟二)所述的接合輔助的遺傳整合克隆方式以外的方法將amiRNAs表達(dá)單 元克隆到植物雙元載體上、或者不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植株轉(zhuǎn)化時(shí)，用到的載體可以是能在 大腸桿菌體內(nèi)復(fù)制的所有載體。
步驟二:)所述的將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上，還可以通過(guò)傳統(tǒng)的酶切連 接的方法或者Gateway重組的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)
一、 本發(fā)明中，獲得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10p菌株的感受態(tài)細(xì)胞，產(chǎn)物通過(guò)在大 腸桿菌體內(nèi)同源重組，得到含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元的供體載體。然 后通過(guò)接合輔助的遺傳整合克隆的方式,快速高效地將含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs 表達(dá)單元轉(zhuǎn)移到植物雙元表達(dá)載體上。整個(gè)過(guò)程不需要酶切連接反應(yīng)，也不需要對(duì)載體或目 的片段進(jìn)行特殊處理，PCR產(chǎn)物就可直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單方便， 實(shí)驗(yàn)周期短,.重組效率高，能夠快速高效地構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體。
二、 本發(fā)明在amiRNAs供體骨架載體上引入篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因的表達(dá)單元(如 gfp、 ccdB等)，通過(guò)該表達(dá)單元的缺失，根據(jù)篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因自身的特點(diǎn)，可以直 接鑒定出含有植物amiRNAs表達(dá)單元的重組子，如g/p報(bào)告基因表達(dá)能自發(fā)熒光，經(jīng)PCR 后^^表達(dá)單元缺失，可根據(jù)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌落發(fā)光與否將模板淘汰；且最終的amiRNAs 供體質(zhì)粒與模板大小有一定差異，也能通過(guò)簡(jiǎn)單的瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分開(kāi)來(lái)；在amiRNAs受 體骨架載體上引入一個(gè)大腸桿菌的條件致死基因(如P力es)表達(dá)單元，amiRNAs表達(dá)單元 轉(zhuǎn)移上去之后該單元缺失，因此可通過(guò)在培養(yǎng)基中添加特殊化學(xué)物質(zhì)(如氯化苯丙氨酸) 將含有模板質(zhì)粒的大腸桿菌淘汰。利用引入的篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因(如gfp、 ccdB等) 以及大腸桿菌的條件致死基因(如P力es)的方法能有效去除模板污染，真正做到零背景的 構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體。
三、 本發(fā)明中構(gòu)建amiRNAs表達(dá)單元所用到的每條引物長(zhǎng)度都可控制在60nt以內(nèi)，不僅 節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本，而且大大降低了引物合成中的堿基錯(cuò)誤率。
四、 本發(fā)明采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植 物雙元載體上，整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單方便，實(shí)驗(yàn)周期短，重組效率高。
五、 本發(fā)明的整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高，很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量操作。 該方法不僅適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模的單個(gè)基因功能研究，也適用于大規(guī)模的功能基因組學(xué)研究。


圖1:重疊延伸PCR構(gòu)建amiRNAs結(jié)構(gòu)過(guò)程。
其中A和B為基于模板載體設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，I 一IV為帶有針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的耙序列 的引物。重疊延伸PCR為將引物A-IV、 II-ffl、 I-B分別擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物混于一個(gè)反 應(yīng)體系，利用引物A-B進(jìn)行PCR得到的PCR產(chǎn)物為完整的amiRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
圖2: Gateway重組的方式構(gòu)建amiRNAs表達(dá)載體過(guò)程。
其中FW primer和RV primer為帶有干擾目的基因的耙序列引物，同時(shí)引物5'帶有 miR159a的側(cè)翼序列以及額外引入的酶切位點(diǎn)。
圖3:本發(fā)明中構(gòu)建的amiRNAs供體骨架載體。Promoter為控制amiRNA表達(dá)的啟動(dòng)子， 5' flank和3' flank為miRNA兩端側(cè)翼序列，她表示包括她在內(nèi)的所有篩選標(biāo)記基因或 報(bào)告基因表達(dá)單元，terminator表示終止信號(hào)，AmpK表示氨芐青霉素抗性基因，H3和H4表 示與50bp受體載體同源的序列，I-Scel表示酶切位點(diǎn)。
圖4:本發(fā)明中構(gòu)建的amiRNAs受體骨架載體。LB和RB分別表示植物雙元表達(dá)載體的 左邊界和右邊界，ba^表示除草劑抗性基因，hyg^表示潮霉素抗性基因，H3和H4表示50bp 與amiRNAs供體載體同源的序列，pheS表示包括在內(nèi)的所有大腸桿菌條件致死基因表 達(dá)單元，I-Scel表示酶切位點(diǎn)。
圖5:本發(fā)明中植物amiRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。
其中A表示amiRNAs供體骨架載體，5' flank和3' flank分別表示miRNA的5'和3' 側(cè)翼序列。B和D表示根據(jù)miRNA的側(cè)翼序列和環(huán)序列設(shè)計(jì)的引物，箭頭所指方向?yàn)橐?' —3'方向，①表示根據(jù)環(huán)序列設(shè)計(jì)的一條引物；引物②和③中，SP1和SP2表示與側(cè)翼序列 退火區(qū)域，TS1和TS2表示針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的干擾耙序列及其互補(bǔ)序列，LSP1表示與引物 ①退火區(qū)域,，HR表示與環(huán)序列末端的同源區(qū)域；引物④和⑤中，5' flank和3' flank分別表 示miRNA的5'和3'側(cè)翼序列，VP1和VP2表示與載體退火區(qū)域。C和E表示PCR擴(kuò)增 得到的線性產(chǎn)物。F表示經(jīng)大腸桿菌體內(nèi)同源重組后得到的含有amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì) 粒。G表示根據(jù)miRNA的環(huán)序列設(shè)計(jì)的引物⑥和⑦，loop sequence表示miRNA的環(huán)序列， LP1和LP2表示與環(huán)序列的退火區(qū)域，TS1和TS2表示針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的干擾靶序列及其 互補(bǔ)序列，HR1和HR2表示與載體兩端同源的區(qū)域。H表示本發(fā)明中構(gòu)建的amiRNAs受體 骨架載體。I表示采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式獲得的植物amiRNAs表達(dá) 載體。
具體實(shí)施例方式
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明 實(shí)施例l:
利用本發(fā)明的方法構(gòu)建以模式植物擬南芥的一種miRNA~~miR156b為骨架，干擾目的基 因——P-葡萄糖酸苷酶基因(GUS)的amiRNAs表達(dá)載體。
1) 含干擾GUS基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的構(gòu)建 首先構(gòu)建一個(gè)包含由RNA聚合酶II型啟動(dòng)子(CaMV35S)控制的miR156b表達(dá)單元
(CaMV35S-raiR156b-N0S)的供體質(zhì)粒，在該供體質(zhì)粒中包含的miR156b序列的5'側(cè)翼序列和 3'側(cè)翼序列之間引入妳基因表達(dá)單元，得到供體骨架載體pDonorl56b^fj)。根據(jù)miR156b 的環(huán)序列設(shè)計(jì)一條引物(D~~pl561oop，根據(jù)在線軟件設(shè)計(jì)干擾GUS基因的amiRNAs的耙 序列，根據(jù)miR156b的5'側(cè)翼序列和3'側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向PCR擴(kuò)增供體質(zhì)粒 pDonorl56b-gfi)的引物@——pGUSl和引物@——pGUS2，具體序列為 pl561oop: 5， atgcaggcactgttatgtgtctataactttgcgtgtgc 3 ，；
pGUS 1: 5 ， tgtctataactttgcgtgtgc加aflfcgc"gtoagrgcgGTTGCCTATCTCTGCCTG 3 ，； pGUS2: 5， ataacagtgcctgcaWaafcgc"gtoflgrgcgGTTTTCTCTGTTGCATTCCT3 ，:
其中，斜體為干擾GUS基因的靶序列,大寫(xiě)為與供體骨架載體特異性退火的序列，pGUSl 中下劃線部分為與引物pl561oop退火的序列，pGUS2中下劃線部分為15nt的同源序列。以 構(gòu)建好的供體骨架載體pDonorl56b-gfip為模板，利用上述3條引物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，得到 的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10p感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組質(zhì)粒，即含有干擾GUS基 因的耙序列的amiRNA表達(dá)單元的供體質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性克隆率大于95%。
2) amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上
首先構(gòu)建一個(gè)植物amiRNAs受體骨架載體在植物雙元載體pCAMBIA2300的多克隆位 點(diǎn)處引入一 p/iM基因表達(dá)單元，同時(shí)該表達(dá)單元兩端攜帶酶切位點(diǎn)及與供體骨架載體 pDonorl56b-gfi)中amiRNAs表達(dá)單元兩端同源的50bp序列，獲得植物雙元受體載體pR-2300， 并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BUN21 (pML300)中。
采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式，將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙 元載體上，具體操作步驟如下
a) 將攜帶有包含干擾GUS基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的大腸桿菌 DH1鄰接種于含有氨芐青霉素(Amp) 100ug/ml、葡萄糖0.2%的LB平板，將含有植物雙元 受體載體PR-2300的大腸桿菌BUN21 (pML300)接種于含有卡那霉素(Kan) 50ug/ml、壯觀 霉素(Spec) 50 u g/ml和葡萄糖0.2%的LB平板，于30匯過(guò)夜培養(yǎng)。
b) 挑取已長(zhǎng)出的單菌落接種于5ml相應(yīng)的液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)。
c) 第二天，分別于4000rpm室溫離心5min,收集菌體，將收集的兩種菌體分別重懸于 lml LB液體，重復(fù)上述重懸、離心操作1-3次。將兩種菌體各取40ul分別加入到兩支不同 的試管中，試管內(nèi)含有2ml添加了0.2W鼠李糖的LB培養(yǎng)基，于30'C搖2小時(shí)左右，使兩試 管中菌體的0D湖值達(dá)到0.15 ~ 0.25。
d) 按l: l比例混合上述兩種菌體，加阿拉伯糖使其終濃度為0.2%，混勻后，37"靜置 2小時(shí)，然后37'C搖床培養(yǎng)2小時(shí)。
e) 將上述菌體涂布于含有氨芐青霉素100ug/ml、卡那霉素50ng/ml的LB固體平板， 42'C過(guò)夜培養(yǎng)。
f)挑取單菌落，驗(yàn)證重組子，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒即為含有干擾GUS基因的amiRNAs表 達(dá)載體。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得amiRNAs表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆率達(dá)到100%。 實(shí)施例2:
利用本發(fā)明的方法構(gòu)建以模式植物擬南芥的一種miRNA—-raiR319a為骨架，干擾擬南芥 八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因的araiRNAs表達(dá)載體。
1) 含干擾PDS基因的耙序列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的構(gòu)建 首先構(gòu)建一個(gè)包含由RNA聚合酶II型啟動(dòng)子(CaMV35S)控制的miR319a表達(dá)單元
(CaMV35S-raiR319a-NOS)的供體質(zhì)粒載體，在該供體質(zhì)粒載體中包含的miR319a的5'側(cè)翼序 列和3'側(cè)翼序列之間引入她基因表達(dá)單元，得到供體骨架載體pDonor319a-g^。根據(jù)在線 軟件設(shè)計(jì)干擾PDS基因的amiRNAs靶序列，根據(jù)miR319a的5'側(cè)翼序列和3'側(cè)翼序列設(shè)計(jì) 一對(duì)反擴(kuò)供體骨架載體pDonor319a-gfj)的引物0——pD319a-l和引物 ——pD319a-2，根據(jù) miR319a的環(huán)序列序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物 ——p319a-PDSl和引物@——p319a-PDS2，設(shè)計(jì)好的 引物序列為:
pD319a-h 5， ctetcttttgtattccaatttagctcga 3 ，； pD319a-2: 5, ctacatatatattcctaaaacatcaagagtccc3 ，；
p319a-PDS 1: 5, ggaatatatatgtag c/cgc欲a加toaftcacaggtcgtgatatgattca3,; p319a-PDS2: 5' g幼tacaaaagagag ctogcgga加to"cgafca tcaaagagaatcaatgatccaa3';
其中，斜體為干擾PDS基因的amiRNAs的靶序列，小寫(xiě)灰色陰影部分為與反擴(kuò)供體骨 架載體pDonor319a-gfj)的PCR產(chǎn)物的15nt同源區(qū)，下劃線部分為與miR319a環(huán)序列的退火 序列。以質(zhì)粒pDonor319a-g^為模板，利用引物pD319a-l和pD319a-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以 帶有完整miR319a序列的質(zhì)粒為模板，利用引物p319a-PDSl和p319a-PDS2進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得的兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后按1: 5-10的比例混合，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1鄰感受 態(tài)細(xì)胞，篩選獲得的重組質(zhì)粒，即為含有干擾PDS基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元的供 體質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性克隆率大于80%。
2) amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上
首先構(gòu)建一個(gè)植物amiRNAs受體骨架載體在植物雙元載體pCAMBIA2300的多克隆位 點(diǎn)處引入一 p/j^基因表達(dá)單元，同時(shí)該p/!M基因表達(dá)單元兩端攜帶酶切位點(diǎn)及與供體 載體pDonoi319a-gQ)中的amiRNAs表達(dá)單元兩端同源的50bp序列，獲得植物雙元受體載體 pR-2300。
采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式(操作步驟同實(shí)施例1)，將amiRNAs 表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上，獲得含有攜帶干擾PDS基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元 的植物amiRNAs表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得植物amiRNAs表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆率達(dá)到 100%。
權(quán)利要求
1.一種快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于步驟為一)含amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的構(gòu)建1)選擇并改造供體骨架載體，在miRNA5’與3’側(cè)翼序列之間克隆一篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因表達(dá)單元，在5’側(cè)翼序列的前面添加一個(gè)控制植物amiRNAs表達(dá)的啟動(dòng)子，在3’側(cè)翼序列的后面添加一終止子序列，得到植物amiRNAs的供體骨架載體；2)引物設(shè)計(jì)，根據(jù)在線軟件或相關(guān)運(yùn)算規(guī)則，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因進(jìn)行RNA干擾的靶序列，首先以miRNA的環(huán)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)一條長(zhǎng)度與其相同的引物①；然后根據(jù)前面所述的amiRNAs的供體骨架載體上miRNA的5’側(cè)翼序列和3’側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物②和③，該對(duì)引物應(yīng)該在與amiRNAs供體骨架載體特異性退火的序列5’末端加上已設(shè)計(jì)的靶序列TS1、TS2，除此之外，引物②還應(yīng)在5’末端加上與引物①特異性退火的序列LSP1，引物③的5’末端還應(yīng)加上引物①5’末端的10-15nt序列HR，使兩者末端產(chǎn)生10-15bp的同源序列；3)PCR擴(kuò)增，利用2)中設(shè)計(jì)的引物①②③，以前面所述的amiRNAs供體骨架載體為模板，經(jīng)套式PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物含有amiRNAs供體骨架載體上的miRNA的側(cè)翼序列和干擾目的基因的靶序列，而且PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有部分miRNA的環(huán)序列，同時(shí)PCR產(chǎn)物缺失了amiRNAs骨架載體中的篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因表達(dá)單元；4)同源重組轉(zhuǎn)化篩選，獲得的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10β感受態(tài)細(xì)胞，在大腸桿菌體內(nèi)經(jīng)同源重組自環(huán)化，得到含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒；二)將人工微RNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上1)選擇并改造受體載體，首先在植物雙元載體上克隆一大腸桿菌條件致死基因表達(dá)單元，而且該表達(dá)單元兩端分別帶有一個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)以及一段與含有amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒同源的50bp序列，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BUN21(pML300)中；2)采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上，驗(yàn)證重組子，選出植物人工微RNA表達(dá)載體。
2、 一種快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于步驟為 一)含amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的構(gòu)建1) 選擇并改造供體骨架載體，首先在miRNA 5'與3'側(cè)翼序列之間克隆一篩選標(biāo)記基因 或報(bào)告基因表達(dá)單元，在5'側(cè)翼序列的前面添加一個(gè)控制植物amiRNAs表達(dá)的啟動(dòng)子，在3' 側(cè)翼序列的后面添加一終止子序列，得到植物amiRNAs的供體骨架載體；2) 引物設(shè)計(jì)，根據(jù)在線軟件或相關(guān)運(yùn)算規(guī)則，設(shè)計(jì)干擾目的基因的靶序列，根據(jù)前面所 述的amiRNAs的供體骨架載體上miRNA 5，側(cè)翼序列和3，側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物④和⑤； 同時(shí)根據(jù)該miRNA的環(huán)序列，再設(shè)計(jì)一對(duì)引物⑥和⑦，該引物應(yīng)該在與所選用的植物miRNA 的環(huán)序列特異性退火的序列5'末端依次加上已設(shè)計(jì)的靶序列TS1、 TS2，以及引物④和引物 ⑤的5，末端的10-15nt序列HR1、 HR2，使兩PCR產(chǎn)物末端分別產(chǎn)生10-15bp的同源序列； 3) PCR擴(kuò)增，利用2)中設(shè)計(jì)的引物④和⑤，以前面所述的amiRNAs供體骨架載體為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；利用引物⑥和⑦，以含有所選用的植物miRNA的環(huán)序列的載體為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4) 同源重組轉(zhuǎn)化篩選，獲得的兩種PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后按1: 5 10比例混合轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌DH10P感受態(tài)細(xì)胞，在大腸桿菌體內(nèi)經(jīng)同源重組后，得到含有干擾目的基因的靶序 列的amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒；二)人工微RNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上1) 選擇并改造受體載體，首先在植物雙元載體上克隆一大腸桿菌條件致死基因表達(dá)單元， 而且該表達(dá)單元兩端分別帶有一個(gè)I-5bel酶切位點(diǎn)以及一段與含有araiRNAs表達(dá)單元的供體 質(zhì)粒同源的50bp序列，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BUN21 (pML300)中；2) 采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上，驗(yàn) 證重組子，選出植物人工微RNA表達(dá)載體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征 在于采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上的具體 操作步驟如下a) 將構(gòu)建的攜帶有包含amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的大腸桿菌DH1鄰接種于含有氨芐 青霉素(Amp) 100ug/ml、葡萄糖0.2%的LB平板，將含有植物雙元受體載體的大腸桿菌 BUN21 (pML300)接種于含有卡那霉素50 u g/ml、壯觀霉素50 u g/ml和葡萄糖0.2%的LB平 板，于3(TC過(guò)夜培養(yǎng)；b) 挑取已長(zhǎng)出的單菌落接種于5ml相應(yīng)的液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)；c) 第二天，分別于4000rpm室溫離心5min，收集菌體，將收集的兩種菌體分別重懸于 lmlLB液體，重復(fù)上述離心重懸操作1-3次，將兩種菌體各取40ul分別加入到兩支不同的 試管中，試管內(nèi)含有2ml添加了 0.2M鼠李糖的LB培養(yǎng)基，于3(TC搖2小時(shí)左右，使兩試管 中菌體的OD腳值達(dá)到0. 15 ~ 0. 25;d) 1: l混合上述兩種菌體，加阿拉伯糖使其終濃度為0. 2%，混勻后，37'C靜置2小時(shí)， 然后37'C搖床培養(yǎng)2小時(shí)；e) 將上述菌體涂布于含有氨芐青霉素100u g/ml、卡那霉素50 w g/ml的LB固體平板， 42X:過(guò)夜培養(yǎng)；f) 挑取單菌落，驗(yàn)證重組子，選出植物人工微RNA表達(dá)載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征 在于將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上的方法還可以通過(guò)傳統(tǒng)的酶切連接的方法 或者Gateway重組的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征 在于構(gòu)建的含有植物amiRNAs表達(dá)單元的載體所用到的載體可以是能在大腸桿菌體內(nèi)復(fù)制的 所有載體。
6、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征 在于所述的植物amiRNAs表達(dá)載體包括以所有植物miRNA結(jié)構(gòu)為骨架構(gòu)建的含有植物 amiRNAs表達(dá)單元的載體；控制植物amiRNAs表達(dá)的啟動(dòng)子可以是組成型、誘導(dǎo)型、細(xì)胞 或組織特異性啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種快速高效的植物人工微RNA(amiRNAs)表達(dá)載體構(gòu)建方法，它是通過(guò)以下兩大步驟完成的。一)含amiRNAs表達(dá)單元的供體質(zhì)粒的構(gòu)建1)選擇并改造供體骨架載體，2)引物設(shè)計(jì)，3)PCR擴(kuò)增，4)同源重組轉(zhuǎn)化篩選；二)將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上1)選擇并改造受體載體，2)采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達(dá)單元克隆到植物雙元載體上，驗(yàn)證重組子，選出植物amiRNAs表達(dá)載體。在改造供體骨架載體和受體載體時(shí)，分別克隆了篩選標(biāo)記基因或報(bào)告基因表達(dá)單元和大腸桿菌條件致死基因表達(dá)單元。本發(fā)明不需要酶切連接反應(yīng)，也不需要對(duì)載體或目的片段進(jìn)行特殊處理，整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單方便，實(shí)驗(yàn)周期短，重組效率高，能夠快速、高效、零背景、高通量地構(gòu)建植物amiRNAs表達(dá)載體。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101368188SQ20071005356
公開(kāi)日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月16日
發(fā)明者紅 嚴(yán), 馬立新 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)