專利名稱：生產(chǎn)具有多重脅迫耐受性的植物的重組表達載體以及使用其制備多重脅迫－耐受性植物 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有多重脅迫耐受性的植物的重組表達載體，轉化了上述載體的多重脅迫耐受性植物，和制備所述植物的方法，所述重組表達載體通過將多重脅迫耐受性基因附著到源于甘薯的氧化脅迫誘導性啟動子上以在葉綠體中表達所述基因而制備。
背景技術：
包括植物的大多數(shù)生物不僅易受生物脅迫諸如病原體、昆蟲、病毒等的影響，而且易受各種環(huán)境壓力諸如高溫、鹽、干旱、污染、損傷、凍傷、過度光照條件、臭氧、二氧化硫、過度暴露于UV、滲透性沖擊等的影響。當植物受到如上述各種環(huán)境壓力的影響時，其中生命支持必需的氧轉變成活性氧自由基，包括超氧陰離子自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、氫氧自由基等，這在體內(nèi)引起嚴重的生理紊亂。精確地，少量的氧自由基在體內(nèi)足以在細胞中傳導信號，并且在植物中誘導自我防御必需的基因(抗氧化酶、熱激蛋白等)的表達。然而，活性氧自由基的增加通過劑量-依賴性方式引起生理紊亂，甚至引起細胞死亡。
最近，許多研究者對植物中氧自由基介導的信號傳導途徑非常感興趣。這是由于所述途徑的調控使得細胞中抗氧化酶和宿主-防御蛋白的表達增加，并且導致具有針對任何環(huán)境脅迫的強抗性的植物的發(fā)展(Kovtun，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(6)2940-2945，2000)。依據(jù)最近的報道，MAP激酶級聯(lián)(MARK級聯(lián))在植物中由氧自由基介導的信號傳導途徑中起重要作用(Kovtun，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97(6)2940-2945，2000)。
超氧化物歧化酶(SOD)是一種將超氧陰離子自由基(O2-)轉化成過氧化氫(H2O2)的酶，并且按照酶中所包含的金屬輔因子分為CuZnSOD，MnSOD和FeSOD。這些酶在細胞中分布不同，例如CuZnSOD在細胞質和葉綠體中發(fā)現(xiàn)，MnSOD在線粒體中發(fā)現(xiàn)，以及FeSOD存在于葉綠體中。SOD是一種消除生物體中由環(huán)境脅迫產(chǎn)生的氧自由基的重要的環(huán)境耐受性因子，其可以用于產(chǎn)生醫(yī)藥供給、食品、化妝品等。并且因此，制備包含SOD基因的表現(xiàn)出強活性脅迫耐受性的轉基因植物導致具有針對環(huán)境脅迫諸如臭氧、低溫、除草劑等的強抗性的植物的發(fā)展(PlantPhysiology，101049-1054，1995；US Patent No5,538,878)。
抗壞血酸過氧化物酶(APX)是一種通過使用維生素C作為電子供體而將H2O2轉化成水的酶，并且在植物和昆蟲中大量地發(fā)現(xiàn)。已知這種酶在植物中存在于細胞質、葉綠體基質和類囊體膜中(Free Rad.Biol.Med.23473-479，1997)。
在植物的葉綠體中，氧含量相對高，并且應用從利用光能分解水產(chǎn)生的電能操縱電子轉運系統(tǒng)，因此這一器官對各種氧化脅迫非常敏感。因此，葉綠體抗氧化能力的增加可能極大地幫助維持植物在環(huán)境脅迫下的生產(chǎn)力。
到現(xiàn)在，為了開發(fā)脅迫耐受性植物，不管什么條件都能組成型表達的CaMV 35S啟動子，已經(jīng)廣泛地與具有針對具體脅迫的抗性的基因組合應用，來構建表達載體。因此，得到的植物具有只針對具體的脅迫的抗性。為了克服這一問題，需要制備一種表達載體，其包括能夠在任何脅迫環(huán)境下表達的啟動子和脅迫耐受性基因，并且制備用所述載體轉染的轉基因植物。
為了開發(fā)具有針對環(huán)境災難的耐受性的轉基因農(nóng)作物，本發(fā)明人制備了用于植物轉化的新型表達載體，其通過將多重脅迫耐受性基因SOD(超氧化物歧化酶)和APX(抗壞血酸過氧化物酶)附著到源于甘薯的氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子SWPA2上而在植物的葉綠體中表達所述基因。然后，本發(fā)明人通過組織培養(yǎng)再生從馬鈴薯、甘薯和高羊茅制備的轉化植物。最后，本發(fā)明人通過證實本發(fā)明的轉基因植物具有增加的多重脅迫耐受性而完成本發(fā)明。
公開內(nèi)容技術問題本發(fā)明的一個目的是提供一種用于植物轉化的重組表達載體，其通過將多重脅迫耐受性基因附著到源于甘薯的氧化脅迫誘導性啟動子上以在葉綠體中表達所述基因而制備。
本發(fā)明的另一個目的是提供轉化了上述表達載體的多重脅迫耐受性植物，以及關于其的制備方法。
技術方案為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)多重脅迫耐受性植物的重組表達載體‘pSSA-K’和‘pSSA-H’，其含有氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子、煙草蝕刻病毒(TEV)前導序列、多重脅迫耐受性基因、用于葉綠體靶向表達的轉運肽序列、CaMV 35S轉錄終止子、抗生素抗性基因和T-DNA邊界序列(T-DNA boarder sequence)。
本發(fā)明還提供用上述pSSA-K或pSSA-H表達載體轉化的轉基因植物。
本發(fā)明還提供多重脅迫耐受性轉基因植物的制備方法，所述方法包括下述步驟i)制備用于植物轉化的表達載體，所述載體包括SWPA2啟動子、SOD基因和APX基因；ii)通過將上述表達載體插入到植物或培養(yǎng)細胞中而制備轉化體；iii)培養(yǎng)上述轉化體；和iv)在組織-培養(yǎng)所述轉化體后通過再生而制備轉基因植物。
在下文中將詳細地描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供用于生產(chǎn)多重脅迫耐受性植物的重組表達載體pSSA-K和pSSA-H，其包含氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子、煙草蝕刻病毒(TEV)前導序列、用于葉綠體靶向表達的轉運肽序列、多重脅迫耐受性基因、CaMV 35S轉錄終止子、抗生素抗性基因和T-DNA邊界序列。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，由SEQ.ID.No 11代表的SWPA2(甘薯過氧化物酶陰離子2)啟動子的核苷酸序列，優(yōu)選地用作源于甘薯的氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子，和由SEQ.ID.No 12代表的SOD基因核苷酸序列以及由SEQ.ID.No 13代表的APX基因核苷酸序列優(yōu)選地用作多重脅迫耐受性基因。
本發(fā)明人將由本發(fā)明人按上述制備的用于生產(chǎn)多重脅迫耐受性植物的表達載體pSSA-K和pSSA-H于2003年11月7日保存在韓國生命工學研究院(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB))的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for TypeCultures(KCTC))。pSSA-K表達載體的保藏號是KCTC 10536BP，和pSSA-H表達載體的保藏號是KCTC 10537BP。
SWPA2啟動子是本發(fā)明人從甘薯(Ipomoea batatas)分離的氧化脅迫誘導性啟動子，其對于開發(fā)脅迫耐受性植物和產(chǎn)生其它有用產(chǎn)物的植物細胞系非常有用(韓國專利公布No2001-51095；國際公布NoWO01/31018(于2000年10月28日申請)；Kim，等.，Plant Mol.Biol.，51831-838，2003)。精確地，作為在培養(yǎng)細胞中高度表達的過氧化物酶啟動子，SWPA2是一種受到氧化脅迫而誘導表達的基因。特別地，所述基因特異地在甘薯懸浮培養(yǎng)細胞和轉化的煙草懸浮培養(yǎng)細胞中在對數(shù)期末期高度表達(國際公布NoWO 01/31018)。在使用煙草原生質體用GUS蛋白進行的瞬時檢測中，所述啟動子表現(xiàn)出比CaMV 35S啟動子高至少30倍的活性。在正常條件下，所述啟動子不在植物的葉片中表達，但是當它們受到諸如臭氧的氧化脅迫、低溫、損傷等時，其表達(Kim，等.，Plant Mol.Biol.，51831-838，2003)。因此，本發(fā)明的SWPA2啟動子可以有效地用于開發(fā)環(huán)境脅迫耐受性植物，和用于應用轉化的植物細胞而生產(chǎn)有用的產(chǎn)物。
本發(fā)明的SWPA2啟動子有效地通過脅迫而誘導目標基因的表達。本發(fā)明的SWPA2啟動子包括識別由ABA(脫落酸)、茉莉酮酸甲酯、損傷、組織缺氧、氧自由基、熱或氮氣產(chǎn)生的外來脅迫的因子。基于所述啟動子的這一特征，SWPA2啟動子用于構建嵌合基因結構，其中將具有啟動子活性的DNA序列連接到結構基因上以于啟動子序列有效地起作用。由于在參與生產(chǎn)有價值的因子的結果基因和SWPA2啟動子之間的連接，這樣的嵌合基因結構可以通過控制SWPA2啟動子而使有價值的因子在任何環(huán)境脅迫下表達，以便它可以有效地用于制備生產(chǎn)有用產(chǎn)物的轉化體。另外，當多重脅迫耐受性基因作為結構基因給予嵌合基因結構時，可以產(chǎn)生具有脅迫耐受性的轉化體。
用于本發(fā)明的SOD基因通常從多于30種植物中分離。并且，特別地，從作為SOD高-生產(chǎn)細胞系選擇的木薯(Manihot esculenta)的培養(yǎng)細胞首先分離的CuZnSOD基因(mSOD1)，與從豌豆分離的APX基因(Free Rad.Biol.Med.23473-479，1997)一起用于本發(fā)明(Mol.Gen.Genet.262807-814，1999)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明人通過將由SEQ.ID.No 15代表的SWPA2啟動子與pRW20載體連接而構建pSA載體，在pRW20載體中插入由SEQ.ID.No 16代表的mSOD1基因而制備pSS載體(參見

圖1)。然后，將pSS載體的SWPA2pro-TEV-TP-SOD-35S轉錄終止子結構插入到包含潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的用于植物轉化的表達載體中，然后將從pSA分離的SWPA2pro-TEV-TP-APX-35S轉錄終止子結構插入到其中。結果，構建了用于生產(chǎn)多重脅迫耐受性植物的pSSA-K和pSSA-H表達載體(參見圖2)。除了分別包括使得用所述載體轉化的多重脅迫耐受性植物易于選擇的潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因外，上述pSSA-K和pSSA-H表達載體還包括SWPA2啟動子、mSOD1、APX基因、煙草蝕刻病毒(TEV)前導序列、用于葉綠體靶向表達的轉運肽序列和CaMV 35S轉錄終止子，這使得對轉化了所述載體的多重脅迫耐受植物的選擇更加容易。
本發(fā)明還提供用pSSA-K或pSSA-H表達載體轉化的多重脅迫耐受性植物。所有種類的植物可以用于生產(chǎn)轉基因植物，但是優(yōu)選大豆、大麥屬、玉蜀黍、馬鈴薯、甘薯或高羊茅，并且特別地更優(yōu)選馬鈴薯、甘薯或高羊茅。
本發(fā)明提供多重脅迫耐受性轉基因植物，其通過轉化用于產(chǎn)生多重脅迫耐受性植物的重組表達載體而制備，所述重組表達載體包含SWPA2啟動子、SOD基因和APX基因，以在植物中大量表達SOD基因和APX基因。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將上述構建的pSSA-K或pSSA-H表達載體插入到植物中，優(yōu)選地插入到大豆、大麥屬、玉蜀黍、馬鈴薯、甘薯或高羊茅中，并且更優(yōu)選地插入到馬鈴薯、甘薯或高羊茅中，以表達SOD基因和APX基因。特別地，本發(fā)明人通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105或者通過粒子轟擊的方法將上述表達載體插入到馬鈴薯、甘薯或高羊茅的嫩葉或葉柄切片中，以制備轉化體。將得到的轉化體進行組織培養(yǎng)，以誘導在植物中的再生(參見圖3A，圖4A和圖5A)。從每種再生的轉基因馬鈴薯、甘薯或高羊茅中提取基因組DNA，通過PCR從所述基因組DNA中擴增SWPA2啟動子或APX基因，以證實SWPA2啟動子或APX基因插入到植物基因組中(參見圖3B，圖4B和圖5B)。在通過PCR證實了成功轉化后，還從每種轉基因植物中提取基因組DNA，將其轉移到膜上。使用SWPA2啟動子或APX基因進行DNA印跡雜交，以再次驗證SWPA2啟動子或APX基因在植物基因組中的插入(參見圖3C，圖4C和圖5C)。
為了證實用pSSA-K或pSSA-H表達載體轉化的轉基因植物的脅迫抗性，本發(fā)明人例如應用甲基紫精(MV)或過氧化氫而在轉化的馬鈴薯、甘薯或高羊茅的葉片或植物本身誘導氧化脅迫，然后研究離子傳導率(參見圖6，7，9，10和11)、可見的損傷(參見圖8A和圖11C)、光合作用效率(參見圖11A)、葉片干重(參見圖8B和圖11B)以及葉綠素含量(參見圖8C)。結果，證實用本發(fā)明的pSSA-K或pSSA-H表達載體轉化的轉基因植物與未轉化的植物相比，表現(xiàn)出極好的氧化脅迫耐受性。還證實本發(fā)明的轉基因植物可以在其它脅迫如高溫(參見圖13B～圖14B)、低溫(參見圖15A和圖15B)或SO2脅迫(參見圖16和圖17)下保持正常的狀況。
本發(fā)明還提供用上述pSSA-K或pSSA-H表達載體轉化的轉基因植物。
本發(fā)明還提供多重脅迫耐受性轉基因植物的制備方法，所述方法包括下述步驟i)制備用于植物轉化的表達載體，所述載體包括SWPA2啟動子、SOD基因和APX基因；ii)通過將上述表達載體插入到植物或培養(yǎng)細胞中而制備轉化體；
iii)培養(yǎng)上述轉化體；和iv)在組織-培養(yǎng)所述轉化體后通過再生而制備轉基因植物。
這時，pSSA-K或pSSA-H優(yōu)選地作為表達載體，并且任何植物可以用作上述植物或培養(yǎng)細胞，但是優(yōu)選大豆、大麥屬、玉蜀黍、馬鈴薯、甘薯或高羊茅，并且更優(yōu)選馬鈴薯、甘薯或高羊茅。
上述轉化體可以通過常規(guī)植物轉化方法(Horsch，等.，Cold SpringHarb Symp Quant Biol.，50433-7，1985；Rogerset，等.，1986)而制備，但是在本文中優(yōu)選地應用粒子攻擊而產(chǎn)生轉化體。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，由于所述載體含有SWPA2啟動子、SOD基因、APX基因、用于葉綠體靶向表達的轉運肽序列、煙草蝕刻病毒(TEV)前導序列、CaMV 35S轉錄終止子和潮霉素或卡那霉素抗性基因，所以用所述載體轉化的轉基因植物可以容易地選擇，因此，pSSA-K或pSSA-H用作表達載體。
附圖描述圖1是顯示本發(fā)明同時表達SOD(超氧化物歧化酶)和APX(抗壞血酸過氧化物酶)基因的載體的生產(chǎn)流程的示意圖，圖2是顯示含有SOD和APX基因用于生產(chǎn)多重脅迫耐受性植物的重組表達載體的示意圖，圖3A是顯示在將通過使用產(chǎn)生多重脅迫耐受性植物的重組表達載體(pSSA-K)而產(chǎn)生的具有卡那霉素抗性的轉基因馬鈴薯(品種Superior)進行組織培養(yǎng)后再生的植物的各個器官的形態(tài)的照片，圖3B是使用SEQ.ID.No 1和No 2代表的引物通過PCR驗證SWPA2啟動子在用本發(fā)明的表達載體(pSSA-K載體)轉化的轉基因馬鈴薯植物中的擴增的電泳照片，圖3C是驗證SOD和APX基因存在于通過使用本發(fā)明的表達載體(pSSA-K載體)而制備的轉基因馬鈴薯植物的基因組中的DNA印跡照片，圖4A是顯示在將通過使用本發(fā)明的表達載體(pSSA-K載體)而產(chǎn)生的卡那霉素抗性轉基因甘薯(品種Yulmi)進行組織培養(yǎng)后再生的植物的各個器官的形態(tài)的照片，圖4B是使用SEQ.ID.No 1和No 2代表的引物通過PCR驗證SWPA2在用本發(fā)明的表達載體(pSSA-K載體)轉化的轉基因甘薯植物中的擴增的電泳照片，圖4C是驗證SOD和APX基因存在于用本發(fā)明的表達載體(pSSA-K載體)轉化的轉基因甘薯植物的基因組中的DNA印跡照片，圖5A是顯示獲自通過使用本發(fā)明的表達載體(pSSA-H載體)而制備的潮霉素抗性轉基因高羊茅的組織培養(yǎng)物的再生植物的一組照片，圖5B是驗證SOD和APX基因存在于用本發(fā)明的表達載體(pSSA-H載體)轉化的轉基因高羊茅植物的基因組中的PCR照片，圖5C是驗證SOD和APX基因存在于用本發(fā)明的表達載體(pSSA-H載體)轉化的轉基因高羊茅植物的基因組中的DNA印跡照片，圖6是顯示在將它們用不同濃度(0，3，5和10μM)的甲基紫精(MV)溶液處理后NT和SSA馬鈴薯植物葉片中的膜損傷的一組照片，其通過研究溶液中離子傳導率而測定，圖7是顯示在用不同濃度0，150，200和250μM的MV溶液噴灑5天后的馬鈴薯植物中的MV抗性水平的一組照片，圖8是顯示在用不同濃度0，150，200和250μM的MV溶液噴灑5天后的馬鈴薯植物葉片中的可見損傷(A)、存活葉片的相對干重(B)、和葉綠素含量(C)，圖9是顯示用不同濃度的MV溶液(0，2.5，5和10μM)處理72小時的NT和SSA植物的甘薯葉片中的膜損傷的一組圖表，其通過研究溶液中的離子傳導率而檢測，圖10是顯示用不同濃度0，100，150和200μM的MV溶液噴灑5天后的甘薯植物的MV抗性水平的一組照片，圖11是顯示不同濃度0，100，150和200μM的MV溶液噴灑5天后的甘薯植物的光合作用效率(A)、存活葉片的相對干重(B)以及葉片中的可見損傷(C)的一組圖表，圖12是顯示用5μM MV溶液(A)和50mM H2O2溶液(B)處理的高羊茅植物葉片中的膜損傷的一組圖表，
圖13是顯示在馬鈴薯植物的葉片中觀察到的高溫抗性的一組圖表，精確地，在高溫(25℃(A)和37℃(B))處理60小時后研究膜中的離子傳導率，圖14是顯示馬鈴薯植物高溫抗性研究結果的一組照片和圖表。精確地，研究在42℃熱處理10小時導致的可見損傷(A)，和在42℃處理10小時、20小時后以及在高溫處理后在25℃復蘇3小時后的光合作用效率(B)，圖15是顯示甘薯植物低溫抗性研究結果的一組照片和圖表。精確地，顯示在4℃處理24小時后的可見植物損傷(A)，在所述處理后在25℃復蘇12小時的植物的照片(B)，和在4℃低溫處理24小時過程中以及在25℃復蘇12小時后的光合作用效率(C)，圖16是顯示每天用500ppb二氧化硫處理8小時持續(xù)處理5天導致的SSA甘薯植物的二氧化硫抗性的照片，圖17是顯示NT和SSA甘薯植物的光合作用效率的圖表，其在用500ppb二氧化硫處理5天過程中，和在用二氧化硫處理5天后適應正常條件(0ppb)后而獲得。
發(fā)明模式如在下述實施方案中所示，本發(fā)明實用的和目前優(yōu)選的實施方案是示例性的。
然而，應該理解，考慮到本公開內(nèi)容，本領域的技術人員可以進行術語本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的更改和改進。
<實施例1>構建多重脅迫耐受性基因的表達載體pSSA-K和pSSA-H本發(fā)明人通過將SEQ.ID.No 16代表的編碼木薯CuZnSOD(CuZn超氧化物歧化酶，mSOD1)的cDNA(GenBank登記號AF170297，Lee，等.，Mol.Gen.Genet.，262807-814，1999)和SEQ.ID.No 17代表的編碼豌豆APX(抗壞血酸過氧化物酶；Randy，等.，F(xiàn)ree Rad.Biol.Med.，23473-479，1997)的cDNA連接到SEQ.ID.No 15代表的氧化脅迫誘導性SWPA2啟動子(韓國專利公布No2001-51095；國際公布NoWO 01/31018)上，而構建載體。
具體地，使用每種由SEQ.ID.No 1和No 2代表的引物而進行PCR，在94℃ 1分鐘，51℃ 1分鐘，72℃ 1.5分鐘(這一循環(huán)重復30次)，以擴增SWPA2啟動子序列。并且按照制造者的流程，將擴增的SWPA2啟動子序列克隆到pGEM-T Easy質粒載體(Promega，USA)中。并且分析載體的核苷酸序列，以證實SWPA2啟動子的目標序列是否正確地擴增。引物的核苷酸序列具有Hind III和Xho I限制性位點。因此，可以通過用Hind III和Xho I處理而從pGEM-T Easy質粒載體分離SWPA2啟動子序列。并且，將為把豌豆的APX(抗壞血酸過氧化物酶)遞送到葉綠體而構建的pRW20載體(Allen，等.，F(xiàn)ree Rad.Biol.Med.，23473-479，1997)用相同的酶消化，以消除增強型CaMV 35S啟動子。然后，將更早先分離的SWPA2啟動子連接到載體上，形成pSA載體的構建(圖1)。
為了用mSOD1基因取代pSA載體中的APX基因，使用分別由SEQ.ID.No 3和No 4代表的引物進行PCR，在94℃ 1分鐘，57℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘(這一循環(huán)重復30次)，以擴增mSOD1基因。并且按照制造者的流程，將擴增的mSOD1克隆到pGEM-T Easy質粒載體(Promega，USA)中。進行核苷酸序列分析以驗證目標mSOD1基因是否得到正確地擴增。引物的核苷酸序列具有Sal I和Sac I限制性位點。因此，將mSOD1基因從pGEM-T Easy質粒載體分離，通過用Sal I和Sac I處理更早地將mSOD1基因克隆到所述載體中。然后，將分離的mSOD1基因插入到用相同的限制性酶消化的上述pSA載體中。并且得到的載體命名為pSS載體(圖1)。
最后，通過使用含有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300質粒(Centerfor Application of Molecular Biology to International Agriculture，Australia)和含有卡那霉素抗性基因的pCAMBIA2300質粒(Center for Applicationof Molecular Biology to International Agriculture，Australia)，構建用于植物轉化的載體pSSA-K和pSSA-H，以同時轉化SOD和APX。具體地，將上述pSS載體用Hind III消化，以獲得大約2.0kb大小的DNA片段，將其插入到用相同的酶預先消化的pCAMBIA1300質粒和pCAMBIA2300質粒中。還將pSA用Pst I消化，以獲得2.3kb大小的DNA片段，將其插入到上述質粒中，導致構建成具有SOD和APX基因的表達載體pSSA-K載體(將DNA片段插入到pCAMBIA2300中)和pSSA-H載體(將DNA片段插入到pCAMBIA1300中)(圖2)。本發(fā)明人將由本發(fā)明人按上述構建的pSSA-K和pSSA-H于2003年11月7日保存在韓國生命工學研究院的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心。pSSA-K表達載體的保藏號是KCTC10536BP，和pSSA-H表達載體的保藏號是KCTC 10537BP。在圖1和圖2中，SWPA2 pro氧化脅迫誘導性啟動子，E35S pro增強型CaMV 35S啟動子，TEV煙草蝕刻病毒(TEV)前導序列，TP豌豆CuZnSOD(Cu·Zn超氧化物歧化酶)的信號序列，35S 3’CaMV 35S轉錄終止子，Amp抗生素(氨芐青霉素)抗性基因，HHind III，PPst I，XhXho I，REcoR l，NNco l，SSal l，BBamH l，XXba l，和SaSac l。
按照An’s方法(An，Meth.Enzymol.，153292-305，1987)，通過將上文構建的用于植物轉化的表達載體(pSSA-K或pSSA-H)插入到根癌農(nóng)桿菌EHA105中而制備轉基因馬鈴薯植物(Hood，等.，Trans.Res.，2208-218，1993)。
并且此外，通過使用Qiagen Co(U.S.A)提供的質粒Maxi試劑盒，從大腸桿菌分離質粒DNA(pSSA-K載體)，然后，通過粒子轟擊用于轉化甘薯，這將在下文實施例3中進行解釋。
<實施例2>制備轉化了pSSA-K表達載體的轉基因馬鈴薯<2-1>制備轉基因馬鈴薯植物本發(fā)明人通過共培養(yǎng)馬鈴薯植物的葉片圓片和含有在上文實施例1中構建的pSSA-K載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105而制備轉基因馬鈴薯植物。
具體地，通過在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)世界上最廣泛培養(yǎng)的品種Superior和用于處理的品種Atlantic而制備本文用于轉化的馬鈴薯植物(Solanumtuberosum L.)。將馬鈴薯植物在補充了3％蔗糖的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.，15473-497，1962)中培養(yǎng)，在25℃培養(yǎng)室中在冷白色熒光(40μmol·m-2·sec-1)下16小時光照/8小時黑暗的光條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，將葉柄和在芽頂端的第二或第三片葉子分離，并且用作植物轉化的材料。
將補充了50mg/l卡那霉素的5ml LB培養(yǎng)基(細菌用蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l和NaCl 10g/l)接種農(nóng)桿菌，然后在28℃搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。將100μl農(nóng)桿菌培養(yǎng)物溶液和馬鈴薯植物的葉片和葉柄片在含有10ml MS基本液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中完全混合，然后在黑暗中在25℃共培養(yǎng)2天。將農(nóng)桿菌用MS基本液體培養(yǎng)基洗滌，然后用無菌濾紙消除獲自共培養(yǎng)馬鈴薯植物的葉片和葉柄片中的水分。然后，將葉片和葉柄片置于選擇培養(yǎng)(含有2mg/l玉米素，0.01mg/l NAA(萘乙酸)，0.1mg/l GA3(赤霉素)，300mg/l claforan和100mg/l卡那霉素的MS培養(yǎng)基)上。每3周將所述圓片轉移到新鮮的新培養(yǎng)基中，然后進行亞培養(yǎng)。在從培養(yǎng)開始的3-4周后，觀察到卡那霉素抗性的芽和胼胝體的產(chǎn)生。
當長出一或兩片葉子時，將芽轉移到根誘導培養(yǎng)基(含有300mg/l claforan和100mg/l卡那霉素的MS基本培養(yǎng)基)中以誘導根。根從所述芽得到很好的誘導，并且將有根的小植物從培養(yǎng)容器中取出，暴露在外4-5天(適應培養(yǎng)室)，然后轉移到溫室苗床花盆中，然后在培養(yǎng)箱中進一步培養(yǎng)(圖3A)。結果，在生長在培養(yǎng)箱中的馬鈴薯植物中形成微管(圖3A)。在攜帶外來基因的轉基因馬鈴薯植物和未轉化的馬鈴薯植物之間的形態(tài)上沒有顯著差異。同時，當葉柄用作轉化材料時，比當葉片用于轉化時形成更多的芽。盡管，通過PCR驗證它們中的大多數(shù)是沒有轉化的。
<2-2>通過PCR和DNA印跡檢驗轉化體為了研究在上述實施例2-1中制備的馬鈴薯植物是否正確地轉化，將再生的植物首先在補充了卡那霉素的培養(yǎng)基中進行選擇，然后用SEQ.ID.No 5和No 6代表的SWPA2啟動子的特異性引物進行PCR，在94℃ 1分鐘，53℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘(這一循環(huán)重復30次)，以擴增SWPA2啟動子序列，進行轉化體的選擇(圖3B)。結果，從攜帶外來基因的植物擴增了0.5kb的片段，這表明插入了SWPA2啟動子。在圖3B中，M分子量大小標記，NT未轉化的馬鈴薯植物，1-5卡那霉素抗性馬鈴薯植物，和P陽性對照DNA。
對通過PCR驗證的隨機選擇的馬鈴薯植物進行DNA印跡。精確地，通過使用Dneasy Plant Maxi試劑盒(QIAGEN Co.)，從在培養(yǎng)箱中生長的每株Atlantic和Superior植物的葉片中提取基因組DNA。將30μg的基因組DNA用限制性酶EcoRI消化，然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳。將在凝膠上的基因組DNA轉移到Zeta Probe膜(Bio-Rad Co.)上，然后使用作為探針的32P標記的SWPA2啟動子序列的0.5kb DNA片段雜交轉移的DNA。一旦完成雜交，將膜進行洗滌，并且暴露于X射線膠片，以檢測條帶。結果，盡管在非轉基因對照植物中沒有觀察到條帶，但是在轉化的Atlantic和Superior植物中觀察到3條條帶，這意味著SWPA2啟動子穩(wěn)定地插入到馬鈴薯的基因組中(圖3C)。在圖3C中，NT未轉化的馬鈴薯植物，A1和A2轉化的Atlantic植物，以及S1和S2轉化的Superior植物。
<實施例3>通過使用pSSA-K表達載體制備轉基因甘薯植物<3-1>制備轉基因甘薯植物本發(fā)明人通過粒子轟擊使用在上述實施例1中構建的pSSA-K載體轉化甘薯胚發(fā)生胼胝體。
具體地，將在韓國培養(yǎng)的甘薯(Ipomoea batatas Lam.；品種Yulmi)的胚發(fā)生胼胝體用作本發(fā)明的轉化材料。更精確地，將甘薯的胚發(fā)生胼胝體誘導并且保持，以建立甘薯植物再生系統(tǒng)(Kwon，等.，Korean J.PlantBiotechnol.，29189-192，2002)。
將胚發(fā)生胼胝體按細胞簇切成直徑1-2mm。將細胞簇置于在補充了1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的MS固體培養(yǎng)基上直徑2cm的中心環(huán)內(nèi)，將其培養(yǎng)1天，然后進行粒子攻擊(圖4A)。更精確地，制備在實施例1中構建的用于植物轉化pSSA-K載體的質粒DNA。然后，將金粒子(直徑1μm)用所述質粒DNA包被，然后在1,100psi壓力下9cm距離處使用PDS-1000/He粒子遞送系統(tǒng)(BioRad Co.)進行粒子轟擊。在粒子轟擊后，將植物在暗處在25℃培養(yǎng)3天，然后從補充了1mg/l 2，4-D和100mg/l卡那霉素的的MS選擇培養(yǎng)基選擇卡那霉素抗性的胚發(fā)生胼胝體。在亞培養(yǎng)過程中，選擇以3周的時間間隔持續(xù)5-6個月。將卡那霉素抗性胚發(fā)生胼胝體轉移到只補充了100mg/l卡那霉素沒有2，4-D的MS基本培養(yǎng)基中。并且在培養(yǎng)箱中在25℃在40μμmol m-2.sec-1冷白色熒光條件下，將胚發(fā)生胼胝體轉化成體細胞胚，這導致植物的再生(圖4A)。
<3-2>通過PCR和DNA印跡驗證轉化體為了驗證在上述實施例3-1中制備的轉基因甘薯植物是否得到正確地轉化，將再生的植物首先在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中進行選擇。使用SEQ.ID.No 7和No 8代表的SWPA2啟動子的特異性引物或者SEQ.ID.No 9和No 10代表的APX基因的特異性引物，對所述植物進行PCR，在94℃ 1分鐘，56℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘(這一循環(huán)重復30次)，以擴增SWPA2啟動子或APX基因，然后進行電泳以選擇轉化體(圖4B)。結果，當使用SWPA2啟動子的特異性引物時，從插入外源基因的植物擴增得到1kb DNA片段，和當使用APX基因特異性引物時從其中擴增得到大約0.5kb的DNA片段，這表明SWPA2或APX基因被穩(wěn)定地插入。在圖4B中，M分子大小標記，NT未轉化的甘薯植物，1-9卡那霉素抗性甘薯植物，和P陽性對照DNA。
對通過PCR驗證的隨機選擇的甘薯植物進行DNA印跡。具體地，通過使用Dneasy Plant Maxi試劑盒(QIAGEN Co.)，從在培養(yǎng)箱中生長的甘薯植物的葉片中提取基因組DNA。將30μg得到的基因組DNA用限制性酶EcoR I消化，然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳。將在凝膠上的基因組DNA轉移到Zeta Probe膜(Bio-Rad Co.)上。將轉移的DNA雜交0.5kb的DNA片段，所述DNA片段是mSOD1的一部分，用32P標記用作探針。一旦完成雜交，將膜進行洗滌，并且暴露于X射線膠片，以發(fā)現(xiàn)條帶。結果，在卡那霉素抗性甘薯植物中穩(wěn)定地插入了多于2個拷貝的mSOD1，而在對照植物中沒有觀察到條帶(圖4C)。在圖4C中，NT未轉化的甘薯植物，和T1-T4轉化的甘薯(品種Yulmi)植物。
<實施例4>通過使用pSSA-H表達載體制備轉基因高羊茅植物<4-1>制備轉基因高羊茅植物本發(fā)明人共培養(yǎng)含有在上述實施例1中構建的pSSA-H載體(質粒DNA)的根癌農(nóng)桿菌EHA105和高羊茅切片，以誘導其的轉化。
具體地，將主要作為動物飼料而培養(yǎng)的Kenturky-31用來轉化高羊茅(葦狀羊茅(Festuca arundinacea Schreb.))。為了制備用于高羊茅轉化的胼胝體，將種子滅菌，并且去掉種子的表皮。然后，將種子在胼胝體誘導培養(yǎng)基[含有9mg/l 2，4-D，0.1mg/l BA(苯甲基腺嘌呤)，30g/l蔗糖，5g/l gelite的MS培養(yǎng)基]中培養(yǎng)4周以誘導胼胝體。將在28℃在補充了50mg/l卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基(10g/l細菌用-蛋白胨，10g/l酵母提取物和5g/l NaCl)中培養(yǎng)2天的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物溶液離心以得到細菌細胞。然后，將溶液懸浮在補充了100μM乙酰丁香酮，20mg/l抗壞血酸和5mg/l硝酸銀(AgNO3)的誘導胼胝體的液體培養(yǎng)基中，直到OD600達到1。在真空下將所述胼胝體浸在農(nóng)桿菌懸浮液中30分鐘以誘導感染。然后，將剩余的農(nóng)桿菌去除，并且將胼胝體轉移到共培養(yǎng)基(含有100μM乙酰丁香酮，20mg/l抗壞血酸和5mg/l硝酸銀)中，然后在28℃進一步培養(yǎng)3天。將感染的胼胝體轉移到培養(yǎng)后培養(yǎng)基(含有5mg/l 2，4-D，1mg/l BA，140mg/l FeNaEDTA，70mg/l肌醇，25mM脯氨酸，0.4mM硫代脯氨酸，50mM K2SO4，2g/l酵母提取物，30g/l蔗糖和5g/l gelite的MS培養(yǎng)基)中，然后進一步培養(yǎng)1周。然后，將所述胼胝體再在初級選擇培養(yǎng)基(含有0.5mg/l 2，4-D，2mg/l BA，140mg/lFeNaEDTA，70mg/l肌醇，25mM脯氨酸，0.4mM硫代脯氨酸，50mMK2SO4，2g/l酵母提取物，30g/l蔗糖，5g/l gelite和25mg/l潮霉素的N6基本培養(yǎng)基)中培養(yǎng)2周。將在初級選擇培養(yǎng)基中存活的胼胝體和再生的芽轉移到第二選擇培養(yǎng)基(第一選擇培養(yǎng)基+50mg/l潮霉素)中，然后培養(yǎng)3天，以再生轉基因植物。將再生植物的芽切下，然后移植到補充了50mg/l潮霉素和30g/l蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基中，以誘導根的發(fā)育。只選擇那些表現(xiàn)出潮霉素抗性的個體。在適應環(huán)境后，將這些個體移植到花盆中并且進行培養(yǎng)(圖5A)。
<4-2>通過PCR驗證轉化體使用基因組DNA進行PCR和DNA印跡，以驗證目標基因是否插入到在上述實施例4-1中制備的轉基因高羊茅植物中。同時，將從在含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基中表現(xiàn)出強抗性的高羊茅植物中提取的基因組DNA和從正常萌芽長成的野生型高羊茅的對照中提取的基因組DNA用作模板。并且此外，在pSSA-H載體的核苷酸序列中選擇由SEQ.ID.No11代表的正向引物和由SEQ.ID.No 12代表的反向引物，并且用于PCR，以通過擴增所述表達載體特異性核苷酸序列區(qū)而驗證目標基因的插入。PCR進行30個循環(huán)，每個循環(huán)在94℃/1分鐘，52℃/1分鐘，和72℃/1分鐘。結果，擴增得到大約0.5kb大小的目標片段，這表明APX基因正確地插入。在圖5B中，Mw分子大小標記，P陽性對照DNA，NT未轉化的高羊茅植物，1-3潮霉素抗性高羊茅植物。
每種基因組DNA從潮霉素抗性高羊茅植物和從正常萌芽長成的野生型高羊茅植物提取，然后用限制性酶Hind III消化，然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳。將DNA轉移到尼龍膜上。使用由SEQ.ID.No 13和No14代表的引物通過PCR擴增的APX基因片段(426bp)作為探針，進行DNA印跡。結果，在具有強潮霉素抗性的高羊茅植物中觀察到一條特異性的條帶。另一方面，在對照植物中沒有檢測到條帶(圖5C)。在圖5C中，2，3和4轉化的高羊茅植物。
<實施例5>SSA轉基因植物的環(huán)境抗性<5-1>氧化脅迫抗性<5-1-1>馬鈴薯植物葉片的氧化脅迫抗性為了研究SSA轉基因馬鈴薯(品種Atlantic)的氧化脅迫抗性，在溫室中生長未轉化的植物(NT植物)和SSA植物。從7周大的植物的葉片(從頂部的第5或第7片葉片)上采取10個葉片圓片(直徑8mm)，將其漂浮在含有0，3，5和10μM甲基紫精(MV)的5ml 0.4M山梨糖醇溶液中。將它們在暗處培養(yǎng)12小時，以使它們吸收MV。此后，將它們再在光處培養(yǎng)48小時。然后，通過使用電導計(Orion，Model 162)測定溶液的離子傳導率，這導致對葉片損傷的測定(圖6)。圖6A顯示用0μMMV處理的結果，6B顯示用3μM MV處理的結果，6C顯示用5μM MV處理的結果，和6D顯示用10μM MV處理的結果。在不處理的情形中，NT和SSA植物葉片的離子傳導率保持穩(wěn)定在20％持續(xù)48小時。在MV處理的情形中，含有SSA植物葉片的溶液的電導率比含有NT植物葉片的溶液的電導率低得多。從在用3，5，和10μM MV處理后12小時，在NT植物中開始觀察到嚴重的葉片損傷。特別地，在處理后48小時后觀察到大于80％的細胞損傷。然而，在處理后36小時，SSA植物中的細胞損傷僅為大約40％。這些結果表明SSA植物具有的強抗性是NT植物所具有的抗性的兩倍。即，其中SOD和APX同時在葉綠體中表達的轉基因馬鈴薯植物具有針對由MV引起的氧化脅迫的增加的抗性。在圖6中，NT未轉化的植物和SSA攜帶pSSA-K載體的植物。
<5-1-2>馬鈴薯植物的氧化脅迫抗性為了研究植物的針對氧化脅迫的抗性能力，通過使用噴霧柜(ModelSB-6，DeVries Manufacturing，Hollandale，MN)，將NT植物、EV植物(攜帶pCAMBIA2300載體的植物)和SSA植物用70ml不同濃度0，150，200和250μM的MV溶液(含有0.1％吐溫20)處理。在噴灑MV溶液5天后，研究植物葉片中的可見損傷。結果，當噴灑150μM MV時，在NT和EV植物的葉片中觀察到部分萎蔫，但是在SSA植物中沒有觀察到損傷。NT和EV植物葉片中的損傷隨著MV濃度的增加而增加。使用250μM的濃度，植物的葉片損傷90％，而SSA植物的葉片只是輕微地損傷(圖7)。在圖7中，NT非轉化體，EV攜帶pCAMBIA2300載體的植物和SSA攜帶pSSA-K載體的馬鈴薯植物。
檢測可見損傷、葉片干重和葉綠素含量，以研究SSA植物的MV抗性。當將150μM MV溶液噴灑到每株NT植物和EV植物葉片上時，在每株植物中觀察到20-40％的葉片損傷，但是在SSA植物中的損傷少于20％(圖8A)。同時，在MV處理后NT和EV植物的存活的正常葉片的干重隨著MV濃度的增加而減少。當用250μM MV溶液處理時，葉片的干重減少50％(圖8B)。相反，在轉基因植物的情形中，處理后存活的葉片的干重幾乎與未處理的葉片的干重相同，與MV濃度無關。關于葉綠素含量的研究結果與干重檢測的結果相似。未處理的植物和MV處理的轉基因植物的葉綠素含量為大約40mg/cm2(圖8C)。在圖8A-8C中，NT非轉化體，EV攜帶pCAMBIA2300載體的植物和SSA攜帶pSSA-K載體的馬鈴薯植物。
<5-1-3>甘薯植物葉片的氧化脅迫抗性為了研究SSA轉基因甘薯(品種Yulmi)的氧化脅迫抗性，將非轉基因植物(NT植物)和SSA植物每種3株生長在溫室中。從已經(jīng)生長8周的植物的葉片(頂端第三或第四片葉子)采取10個葉片圓片，然后通過與實施例5-1-1中所用的相同方法用0，2.5，5和10μM甲基紫精(MV)處理。在MV處理后，測定不同濃度MV處理導致的葉片圓片中的損傷(圖9)。圖9A顯示0μM MV處理的損傷，B顯示2.5μM MV處理的損傷，C顯示5μM MV處理的損傷，以及D顯示10μM MV處理的損傷。與含有NT植物的葉片圓片的溶液的電導率相比，含有SSA植物葉片圓片的溶液的電導率非常低。而在MV處理12小時后，在NT植物的葉片圓片中觀察到大于50％的細胞損傷，在SSA植物的葉片圓片中細胞損傷低于30％。特別地，與NT植物相比，5μM MV處理在SSA植物的葉片圓片中引起45％的細胞損傷。在圖9中，NT未轉化的植物和SSA攜帶pSSA-K載體的甘薯植物。
<5-1-4>甘薯植物的氧化脅迫抗性為了研究桉樹植物針對氧化脅迫的抗性能力，將在溫室中生長4周的NT植物和SSA植物用70ml不同濃度0，100，150和200μM的MV溶液(含有0.1％吐溫20)處理，處理方法與實施例5-1-2中所述的類似。MV處理后5天，觀察到植物葉片的可見損傷。當噴灑100-150μM MV時，NT植物的葉片患有白化病而萎蔫。然而，在SSA植物的葉片中只觀察到部分損傷。同時，當噴灑200μM MV時，NT植物的葉片幾乎萎蔫了，但是只在SSA植物的葉片的某些部分觀察到白花現(xiàn)象(圖10)。在圖10中，NT非轉化體，EV攜帶pCAMBIA2300載體的甘薯植物和SSA攜帶pSSA-K載體的甘薯植物。
SSA植物的MV抗性還通過測定光合作用效率、葉片干重和可見葉片損傷而進行研究。在MV處理2天后，采取植物頂端第三片葉子檢測光合作用效率。當噴灑100μM MV時，與處理前相比，NT和SSA植物中的光合作用效率稍微下降到0.7(圖11A)。當噴灑150μM和200μM MV時，光合作用效率大于0.4，這是NT植物光合作用效率的兩倍高。在MV處理5天后，還測定了葉片干重。結果，在處理前，NT植物和SSA植物的干重大約400mg，但是NT植物中葉片的干重隨著MV濃度的增加而減少。精確地，當用200μM MV處理時，與未用MV處理的植物相比，干重減少90％。同時，SSA植物葉片的干重減少60％，這表明抗性比NT植物高出3倍(圖11B)。并且此外，在MV處理后5天觀察到植物的可見損傷。結果，在用100μM MV處理的NT植物和SSA植物之間，在可見損傷中沒有很多差異。然而，NT植物的葉片85％被200μM MV損傷，而SSA植物的葉片40％或更少被損傷，這意味著與NT植物的抗性相比，SSA植物中MV抗性加倍(圖11C)。在圖11A-11C中，NT非轉化體，SSA4和SSA5攜帶pSSA-K載體的甘薯植物。
<5-1-5>高羊茅植物的葉片圓片的氧化脅迫抗性為了研究SSA轉基因高羊茅植物的氧化脅迫抗性，在溫室中生長未轉化的植物(NT植物)和SSA植物。從7周大的植物的葉片(從頂部的第5-第7片葉片)上采取10個葉片圓片(直徑8mm)，然后將其漂浮在補充了5μM甲基紫精(MV)的5ml 0.4M山梨糖醇溶液中，然后在暗處培養(yǎng)12小時，以使所述圓片吸收MV。在用黑暗處理后，將它們再在光處培養(yǎng)48小時。然后，通過使用電導計(Orion，Model 162)測定溶液的離子傳導率，以測定葉片損傷(圖12A)。MV處理后，與NT植物相比，含有SSA植物葉片圓片的溶液的電導率非常低。從MV處理后12小時，在NT植物的葉片圓片出現(xiàn)嚴重的損傷，并且從處理后48小時，NT植物中細胞損傷大于75％。直到MV處理后36小時，SSA植物中的細胞損傷才為40％。這些結果表明，與NT植物相比，SSA植物具有2倍更高的針對MV誘導的氧化脅迫的抗性。將用上述相同方法生長的高羊茅植物的葉片圓片用50mM過氧化氫處理，然后進一步培養(yǎng)48小時。通過電導計測定溶液的離子傳導率，以研究葉片損傷(圖12B)。在用過氧化氫處理后，與NT植物相比，SSA植物中的細胞損傷很低。更精確地，在處理后12小時，NT植物中的細胞損傷大于65％。相反，直到處理后48小時，SSA植物中細胞損傷少于25％?？傊cNT植物相比，SSA植物具有至少2.6倍更高的針對由過氧化氫引起的氧化脅迫的抗性。從上述結果證實，SSA植物比NT植物具有更高的針對由NV和過氧化氫引起氧化脅迫的抗體。即，SOD和APX同時在葉綠體中表達的轉基因高羊茅植物具有增加的針對由MV和過氧化氫引起的氧化脅迫的抗性。在圖12A-12B中，NT未轉化的植物和SSA攜帶pSSA-H載體的植物。
<5-2>針對溫度脅迫的抗性<5-2-1>馬鈴薯植物葉片圓片的熱脅迫抗性為了研究SSA轉基因馬鈴薯植物(品種Atlantic)的熱脅迫(高溫)抗性，在溫室中生長NT植物(未轉化的植物)和SSA植物。從7周大的植物的葉片(從頂部的第5-第7片葉片)上采取10個葉片圓片(直徑8mm)，并且將其漂浮在5ml 0.4M山梨糖醇溶液中，然后，在37℃培養(yǎng)60小時。對照植物在除了25℃的溫度外的相同條件下培養(yǎng)。每12小時測定溶液的離子傳導率，以研究葉片損傷。當不給予高溫脅迫時(25℃處理組)，NT植物和SSA植物的離子傳導率穩(wěn)定保持60小時(圖13A)。然而，當給予37℃的高溫脅迫時，SSA植物針對高溫的脅迫抗性顯著增加(圖13B)。在高溫處理12小時后，開始在SSA植物中檢測到脅迫抗性，并且在36和48小時的離子傳導率分別為42％和52％。并且在處理60小時后，抗性加倍。在圖13A和圖13B中，NT未轉化的植物和SSA攜帶pSSA-K載體的植物。
<5-2-2>馬鈴薯植物的熱脅迫抗性為了研究轉基因馬鈴薯(品種Atlantic)針對由高溫引起的脅迫的抗性，將生長4周的馬鈴薯植物(品種Atlantic)的NT植物、EV植物和SSA植物暴露于42℃的溫度10小時。結果，NT植物和EV植物萎蔫，但是SSA植物健康地存活下來(圖14A)。比較在高溫處理前和高溫處理后的光合作用效率。結果，在NT植物中，高溫處理10和20小時分別將光合作用效率減少15％和30％，但是在SSA植物中，高溫處理即使20小時也只將光合作用效率減少6％(圖14B)。高溫處理后，將植物在25℃復蘇3小時。結果，在NT植物和EV植物中，與處理前的光合作用效率相比，光合作用效率恢復50％。同時，SSA植物中光合作用效率幾乎恢復到初始的光合作用效率。在圖14A和圖14B中，NT非轉化體，EV攜帶pCAMBIA2300載體的植物，和SSA攜帶pSSA-K載體的植物。
<5-2-3>甘薯植物針對由低溫引起的脅迫的抗性為了研究轉基因甘薯(品種Yulmi)針對由低溫引起的脅迫的抗性，將在溫室中生長4周的NT植物和SSA植物暴露于4℃的溫度24小時。結果，NT植物萎蔫，但是SSA植物保持正常(圖15A)。低溫處理24小時后，將植物在25℃復蘇12小時。結果，盡管NT植物幾乎不能恢復，仍然是萎蔫的，但是SSA植物幾乎恢復到初始狀態(tài)(圖15B)。在低溫處理前，NT植物和SSA植物的光合作用效率都是0.8。低溫處理后6小時，它們的光合作用效率與在處理前獲得的那些光合作用效率沒有很大差異，但是從那時起，光合作用效率時間-依賴性地減少。因此，24小時后，在NT植物中，光合作用效率減少大于30％，并且在SSA植物中減少大于20％。低溫處理24小時后，將植物在25℃復蘇12小時，然后再研究光合作用效率。結果，在復蘇后，NT植物的光合作用效率仍然減少到60％。同時，SSA植物的光合作用效率恢復到處理之前的水平，盡管在個體間存在稍微的差異(圖15C)。在圖15A-15C中，NT未轉化的甘薯植物，SSA4和SSA5攜帶pSSA-K載體的植物。
<5-3>二氧化硫抗性為了研究SSA轉基因甘薯植物的二氧化硫(SO2)抗性，將在溫室中生長4周的甘薯植物(品種Yulmi)的NT植物和SSA植物用500ppb的二氧化硫處理，每天8小時，持續(xù)5天。結果，與SSA植物相比，NT植物的葉片由于二氧化硫而萎蔫，并且植物生長也停止。同時，SSA植物保持正常和健康，表現(xiàn)出茂盛的生長(圖16)。在圖16中，NT非轉化體，和SSA攜帶pSSA-K載體的甘薯植物。
SSA植物的二氧化硫抗性通過測定光合作用效率而研究。從二氧化硫處理的第二天起，測定植物頂端第三片葉片的光合作用效率。結果，NT植物(SSA plant)的光合作用效率從0.80(處理前)逐漸減少到第五天的0.47。相反，SSA植物中，光合作用效率在處理的第五天后機會沒有減少(仍為0.76)，這表明與NT植物相比，SSA植物保持健康(圖17)。在植物用二氧化硫處理后，將它們在溫室中生長5天，在生長過程中，檢測光合作用效率。結果，NT植物的光合作用效率為0.32，這表明它幾乎失去了光合作用功能。同時，SSA植物中，光合作用效率為0.75，這表明它幾乎從二氧化硫損傷中恢復了?？傊?，SSA植物表現(xiàn)出針對最典型的污染物質之一的二氧化硫的增加的抗性。
產(chǎn)業(yè)適用性如在上文中解釋的那樣，用本發(fā)明產(chǎn)生多重脅迫耐受性植物的重組表達載體轉化的轉基因植物表現(xiàn)出針對氧化脅迫誘導性除草劑、冷損傷、高溫、鹽損傷或產(chǎn)生氧自由基的各種環(huán)境脅迫的強抗性。因此，本發(fā)明的載體可以是對于增加農(nóng)作物的生產(chǎn)力或有用成分的大量生產(chǎn)的極大的貢獻。
序列表文本SEQ.ID.No 1和No 2是在實施例1中進行的SWPA2啟動子PCR所用的引物序列。
SEQ.ID.No 3和No 4是在實施例1中進行的mSOD1 PCR所用的引物序列。
SEQ.ID.No 5和No 6是在實施例2-2中進行的SWPA2-1 PCR所用的引物序列。
SEQ.ID.No 7和No 8是在實施例3-2中進行的SWPA2-2 PCR所用的引物序列。
SEQ.ID.No 9和No 10是在實施例3-2中進行的APX PCR所用的引物序列。
SEQ.ID.No 11是在實施例4-2中進行的mSOD1 PCR所用的正向引物序列。
SEQ.ID.No 12是在實施例4-2中進行的CaMV 35S終止子PCR所用的反向引物序列。
SEQ.ID.No 13和No 14是在實施例4-2中進行的APX的DNA印跡所述的引物序列。
SEQ.ID.No 15是源于甘薯(Ipomoea batatas)的氧化脅迫誘導性SWPA2啟動子的核苷酸序列。
SEQ.ID.No 16是編碼木薯(Manihot seculenta)CuZnSOD的cDNA序列。
The SEQ.ID.No 17是編碼豌豆(Pisum sativum)APX的cDNA序列。
本領域的技術人員應該理解，在前述描述中公開的概念和具體實施方案可以容易地用作改進或設計實施本發(fā)明相同目的的其它實施方案的基礎。本領域的技術人員還應該理解，這樣等價的實施方案沒有背離本發(fā)明在附上的權利要求中提出的精神和范圍。
用于專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約國際表格微生物保藏證明按照細則Rule 7.1發(fā)行致KWAK，Sang-Soo韓國生命工學研究院，#52，Oun-dong，Yuseong-gu，Daejeon，305-333，韓國

用于專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約國際表格微生物保藏證明按照細則Rule 7.1發(fā)行致KWAK，Sang-Soo韓國生命工學研究院#52，Oun-dong，Yuseong-gu，Daejeon，305-333，韓國

序列表<110>韓國生命工學研究院<120>生產(chǎn)具有多重脅迫耐受性的植物的重組表達載體以及使用其制備多重脅迫-耐受性植物的方法<130>4fpo-12-10<150>KR 10-2004-93945<151>2004-11-17<160>17<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SWPA2啟動子的正向引物<400>1ttaaagcttc catgatcaga tcgata 26<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SWPA2啟動子的反向引物<400>2cgggtctaga ggtcaaagga aaat 24<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>mSOD1基因的正向引物<400>3gtcgacgtga aggctgaa 18<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>mSOD1的反向引物<400>4gagctctatc ctcgcaaacc20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性SWPA2-1的正向引物<400>5atttatcggc aaggaggagg ta 22<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性SWPA2-1的反向引物<400>6cccggtgagg tgatttgaa 19
<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性SWPA2-2的正向引物<400>7caccaagtac ccaaaccctc tatt 24<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性SWPA2-2的反向引物<400>8gttggcgtga ccgtacatta ttg23<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性APX的正向引物<400>9ttcggaacaa ttaagcacca a 21<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>特異性APX的反向引物<400>10aagagggcgg aatacagagt cagt 24<210>11<211>20<212>DNA<213>引物<400>11gctgaagctg ttcttaccag20<210>12<211>20<212>DNA<213>引物<400>12ctcaacacat gagctaaacc20<210>13<211>20<212>DNA<213>引物<400>13agaggaagct cagaggtttt20<210>14<211>20<212>DNA<213>引物<400>14ccaccagata gagcaacaat20<210>15<211>1325<212>DNA
<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>15aagcttccat gatcagatcg ataataccaa atggtaccac ctaactaggt gatatatatt 60atgtatgtca ttattttaaa ctgtattaca aagactattt tttcattaat tggtacaaag 120aaaaattaaa cagaaaagaa aggaaaaaat gactcaccac ctagcaccta gacacctaga 180caccaagtac ccaaaccctc tattttcaac atctattttc agatgtaaat atgagttgga 240cgaagaaggt gttagcaatt atttgattaa tcttgctacg ataattatga tccactcact 300tagtcatttt tttcagacca agacaactag cttgagtttt ttattgtatg tggtcggaac 360gttttttgta attaaaaaaa taaaagttgc atcattatat atggtagatt aagtaattga 420tcaatcaacg tttaattttg catttatcgg caaggtggag gttccaactt ccagtcgaac 480ttagagagtc attggagacc ttgaccagtt aactagcggt gtcgaaaacc tgcacaactt 540gagatttaat tgcatacctt ttatatatga cgcgttttat ttttttttcc tagaaaataa 600tttggaagaa aataagaata tgtattctgt gaaagctagg ccaaaacgaa tgtcttttcg 660tcgttttcgt taaaggttta gatcatattt catctggtcc aacactcaaa cttgtataat 720ggacgaatta ttagtcattt tagacctacc ggctagcgcg acttttttgt tttccataaa 780gattcgataa ttgcatggcc agatgcaaag tttgaaattt aatgtttgcc aaatcctatc 840atacaccaca acacatgtct cagggccaag tggcaccagc aaacattcct gtcataatta 900atttttttaa tgagaaggag gaaactcaca gctattactc gaaggtatat aatattgagt 960aaatcttact ttgtgattct agttgacaaa acaccgcaag ataaactata ctaagttcaa1020atcacctcac cgggttggct cagattggtt ttttcaatac aagagggggt gtgaactccc1080gtgccgacct cttttgaggg acaataatgt acggtcacgc caacctagct tgattttttc1140tgacaaatat attactacat atattacacg gtcaaataat taatcaaaaa ataaaaaaag1200accccaatta aagtccccaa ccactctcaa atattctatt taagggaaac cttagaggca1260attcatgcat cctcaacccc ttcttcttca ttttcttaat cttacatttt cctttgaccc1320
tcgag1325<210>16<211>801<212>DNA<213>木薯(Manihot esculenta)<400>16tctcgatctt ctctgtctaa gctctaaagg ggtgctctga gatcacgtaa aacaatggtg 60aaggctgaag ctgttcttac cagtagtgag ggggttagcg gaacaatctt ctttacccaa 120gaaggagatg gtcctaccac tgtaactgga aacatttccg gccttaagcc agggcttcat 180gggttccacg tccatgccct tggagacaca acaaacggtt gcatgtcaac tgggccacac 240tttaaccctt ctggcaaaga tcatggtgcc cctgaggatg agattcgtca tgctggtgat 300ctgggaaatg tcactgctgg tgatgatggc actgctagtt tcacaattat tgacaagcat 360attcctcttt ctggtcaaaa ttcaatcata ggaagggcag ttgttgttca tgcagatcct 420gatgatcttg gcaggggagg acatgaactc agtaaaacca ccggaaatgc tggtggcaga 480gtagcatgcg gtattattgg tttgcgagga tagagtgctt ctccagagat caataacaag 540acaaagacag ctgaaacatg cacagccgga caacctttag aagaacgtta ggagaccatt 600aactcatttg aataaaagaa agaataatac tgtagttttg gctggtttgg tcttgtgatc 660tcaagatggt gtatgctttg tatggtttcg tgaagtttat tgaactttga actttttcga 720atggtagggc ttgctctttg tctggtccaa attcaggccg tggatgtttt atactgcttt 780aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 801<210>17<211>1054<212>DNA<213>豌豆(Pisum sativum)<400>17gaattcggct tgtgctctcc tcgtgtcact agggtttaac ttcttcgttt ttgcttctta 60
gatttcgaga atcgtttgct atgggaaaat cttacccaac tgttagtccc gattaccaga 120aggccattga aaaggctaag aggaagctca gaggttttat cgctgagaag aaatgcgctc 180ctctaattct ccgtttggca tggcactctg ctggtacttt tgattccaag acaaagactg 240gtggtccttt cggaacaatt aagcaccaag ctgagcttgc tcatggtgct aacaacggtc 300ttgatatcgc ggttaggctg ttggagccta ttaaggagca attccctatt gtgagctatg 360ctgatttcta ccagttggct ggtgttgttg ctgttgagat taccggtgga cctgaagttc 420ctttccaccc tggtagggag gacaagcctg agccaccacc tgagggtcgc ttgcctgatg 480ccactaaggg ttctgaccat ttgagggatg tgtttggaaa ggctatgggg cttagtgatc 540aggacattgt tgctctatct ggtggtcaca ccattggagc tgcacacaag gagcgttctg 600gatttgaggg accatggact tctaatcctc tcatttttga caactcatat ttcactgagt 660tgttgactgg tgagaaggat ggccttcttc agttgccaag tgataaggca cttttgactg 720actctgtatt ccgccctctt gttgagaaat atgctgcgga tgaagatgtt ttctttgctg 780attatgctga agcacatctt aagctctctg agcttggatt tgctgaagcc taagtcacag 840ttgtttggtg tttagagagg agcactgtcc tgaatttcac ataaatttca tagacgttgc 900ttttattttc aatgtgattc atcttagttg ggtagcattt tggatgtatt ttggaagttt 960gattgttttc tctattgttg atccttggtt aaataacatt gttaagtggt aatgcccagc1020tattgcattt tcctgataaa aaaaaaaccg aatt105權利要求
1.一種用于產(chǎn)生多重脅迫耐受性植物的重組表達載體，其包含氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子、存在于所述氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子下游的多重脅迫耐受性基因、抗生素抗性基因、煙草蝕刻病毒(TEV)前導序列、用于葉綠體靶向表達的轉運肽序列、CaMV 35S轉錄終止子、和T-DNA邊界序列。
2.權利要求1提出的表達載體，其中所述氧化脅迫誘導性過氧化物酶啟動子是SEQ.ID.No 15代表的甘薯過氧化物酶陰離子2(SWPA2)的核苷酸序列。
3.權利要求1提出的表達載體，其中所述多重脅迫耐受性基因是SEQ.ID.No 16代表的超氧化物歧化酶(SOD)基因和SEQ.ID.No 17代表的抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因。
4.權利要求1提出的表達載體，其中所述載體是pSSA-K(保藏號KCTC10536BP)或pSSA-H(保藏號KCTC 10537BP)。
5.一種用權利要求1的表達載體轉化的轉基因植物。
6.權利要求5的轉基因植物，其中所述植物選自由馬鈴薯、甘薯和高羊茅組成的組。
7.一種關于多重脅迫耐受性轉基因植物的制備方法，所述方法包括下述步驟i)制備用于植物轉化的表達載體，所述載體包括SWPA2啟動子、SOD基因和APX基因；ii)通過將上述表達載體插入到植物或培養(yǎng)細胞中而制備轉化體；m)培養(yǎng)上述轉化體；和iv)在組織-培養(yǎng)所述轉化體后通過再生而制備轉基因植物。
8.權利要求7提出的制備方法，其中所述表達載體是pSSA-K或pSSA-H。
9.權利要求7提出的制備方法，其中所述植物或培養(yǎng)細胞選自由馬鈴薯、甘薯或高羊茅組成的組。
10.權利要求7提出的制備方法，其中步驟ii)的轉化體通過粒子攻擊而制備。
11.權利要求7提出的制備方法，其中步驟ii)由下述亞步驟組成i)向農(nóng)桿菌(Agrobacteria)中引入表達載體；和ii)通過共培養(yǎng)農(nóng)桿菌與胼胝體或培養(yǎng)細胞而制備轉化體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生多重脅迫耐受性植物的重組表達載體，轉化了所述載體的多重脅迫耐受性植物，和制備所述植物的方法，所述重組表達載體通過將多重脅迫耐受性基因附著到氧化脅迫誘導性啟動子上而制備，更精確地，一種用于產(chǎn)生多重脅迫耐受性植物的重組表達載體，其通過將源于甘薯的氧化脅迫誘導性啟動子(SWPA2)與多重脅迫耐受性基因(SOD(超氧化物歧化酶)和APX(抗壞血酸過氧化物酶))組合以在葉綠體中表達所述多重脅迫耐受性基因而制備，轉化了上述表達載體的多重脅迫耐受性植物，以及制備所述植物的方法。本發(fā)明的重組表達載體對于生產(chǎn)具有針對由氧化脅迫誘導性除草劑、冷損傷、高溫、鹽損傷或產(chǎn)生氧自由基的各種環(huán)境污染引起的多重脅迫的非常強的抗性的轉化植物非常有用，以致所述載體可以是增加農(nóng)作物的生產(chǎn)力或有用成分的大量生產(chǎn)的極大的貢獻。
文檔編號C12N15/82GK101061227SQ200580039172
公開日2007年10月24日 申請日期2005年1月28日 優(yōu)先權日2004年11月17日
發(fā)明者郭尚洙, 權錫胤, 李幸順, 湯莉, 林純, 李炳顯 申請人:韓國生命工學研究院