專利名稱：多聚構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療病理性新血管形成，例如哮喘、關(guān)節(jié)炎、癌癥和黃斑變性的重組構(gòu)建蛋白。
背景技術(shù)：
病理性新血管形成是濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和哮喘之類疾病的關(guān)鍵因素。其還在腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散中起到重要作用。通過促血管新生和抗血管新生因子的精妙平衡調(diào)節(jié)新血管形成。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已知對(duì)于新血管形成是必須的。在AMD、關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中和在各種腫瘤模型中，VEGF活性的抑制已證明抑制了新血管形成。用于抑制VEGF活性的方法包括抗體、受體融合蛋白、肽和小分子。
VEGF-R1(Flt-1)和VEGF-R2(KDR)蛋白質(zhì)已證明以高親合力結(jié)合VEGF。Flt-1和KDR在其細(xì)胞外區(qū)域中均具有7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域2已經(jīng)證明對(duì)于VEGF結(jié)合是必不可少的。全長(zhǎng)可溶受體(結(jié)構(gòu)域1-7)和結(jié)構(gòu)域1-3各自與IgG Fc的融合有效地結(jié)合VEGF。但是，IgG Fc僅與Ig樣結(jié)構(gòu)域2融合不能結(jié)合VEGF，Ig樣結(jié)構(gòu)域1和2的組合也是如此。Davis-Smyth，1996。因此，對(duì)于有效的VEGF結(jié)合，除結(jié)構(gòu)域2外，似乎還需要Ig樣結(jié)構(gòu)域1和3。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供融合蛋白。融合蛋白具有式X-Y-Z。X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本由5-25氨基酸殘基多肽構(gòu)成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是式X-Y-Z的多肽。X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本由提供5-25氨基酸殘基的空間隔離(spatial separation)的連接體部分構(gòu)成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。
本發(fā)明的再一方面是式X-Y-Z的融合蛋白。X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本由5-25氨基酸殘基多肽構(gòu)成。Z是抗體分子的Fc部分。
還提供了式X-Y-Z的融合蛋白。X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本由提供5-25氨基酸殘基的空間隔離的連接體部分構(gòu)成。Z是抗體分子的Fc部分。
本發(fā)明的再一方面是使多肽X多聚的方法。多肽X通過多肽Y連接到多肽Z上以形成多肽XYZ。X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本由5-25氨基酸殘基多肽構(gòu)成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。形成的多肽XYZ多聚(multimerizes)。
本發(fā)明的再一實(shí)施方案提供了使多肽X多聚的方法。多肽X通過Y部分連接到多肽Z上以形成聚合物XYZ。X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的多肽。Y基本由提供5-25氨基酸殘基的空間隔離的連接體部分構(gòu)成。Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。如此形成的多肽XYZ多聚。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了核酸分子。該核酸分子編碼包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2、連接體和多聚結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。該融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了融合蛋白。該融合蛋白包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2、連接體和多聚結(jié)構(gòu)域。該融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了體外方法。將核酸分子輸送到分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。該核酸分子編碼包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2、連接體或多聚結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。該融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。通過啟動(dòng)子控制融合蛋白的表達(dá)。形成表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞。
本發(fā)明的再一實(shí)施方案是將融合蛋白輸送給哺乳動(dòng)物的方法。將表達(dá)融合蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞輸送給哺乳動(dòng)物。細(xì)胞表達(dá)并分泌融合蛋白，由此將融合蛋白供應(yīng)給哺乳動(dòng)物。該融合蛋白包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2、連接體和多聚結(jié)構(gòu)域。該融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。
本發(fā)明的另一方面是向哺乳動(dòng)物供應(yīng)融合蛋白的方法。將包含VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2、連接體和多聚結(jié)構(gòu)域的融合蛋白輸送給哺乳動(dòng)物。該融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列?；蛘撸梢詫⒕幋a所述融合蛋白的核酸構(gòu)建體輸送給哺乳動(dòng)物，由此使哺乳動(dòng)物表達(dá)該融合蛋白。
下面更詳細(xì)描述的本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案為本領(lǐng)域提供治療與血管增生和炎癥有關(guān)的疾病的方法和試劑。這些試劑提供了相對(duì)于蛋白質(zhì)天然形式的穩(wěn)定性和生物利用率。


圖1.D2-9Gly-Fc構(gòu)建體中9-Gly連接體的柔韌(flexible)區(qū)域。通過Karpus和Schultz(1985)法所預(yù)測(cè)的相對(duì)柔韌性表明，與不含9-Gly連接體的D2-Fc構(gòu)建體相比，D2-9Gly-Fc蛋白中的多聚甘氨酸9-mer(9-Gly)連接體(aa 94至103)是柔韌性高于平均水平(＞1)的區(qū)域。這兩種融合蛋白均含有相同的封在框中的氨基酸序列sp-信號(hào)肽(aa-24至-1)、Flt-1結(jié)構(gòu)域2(aa1至93)和IgG1-Fc殘基(244aa)。箭頭代表使用SignalP V2.0程序(Nielsen等，1997)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽酶裂解位點(diǎn)。
圖2.D2-9Gly-Fc vs.D2-Fc的生物活性。293細(xì)胞在饑餓培養(yǎng)基(starvation media)(M199+5％FCS)中生長(zhǎng)并在CMV啟動(dòng)子的控制下用含有D2-9Gly-Fc和D2-Fc表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。72小時(shí)后收集條件培養(yǎng)基(CM)。將HUVECs種入含有饑餓培養(yǎng)基+VEGF(10納克/毫升)種96孔板(2E3細(xì)胞/孔)，并在24小時(shí)后加入50微升CM加VEGF(10納克/毫升)。來自對(duì)照pEGFP(Clontech；pEGFP帶有野生型綠色熒光蛋白(GFP)的紅移變體，其經(jīng)過最優(yōu)化以獲得更亮的熒光和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更高的表達(dá))質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照物(+/-VEGF)在CM中培養(yǎng)。陽性對(duì)照用50納克Flt-1-IgG重組蛋白(R&D Systems)處理。使用CellTiter 96AQueous試劑(Promega)檢測(cè)HUVECs在處理后3天的增殖。數(shù)據(jù)是各分三份檢測(cè)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的OD490平均值的平均數(shù)。
圖3.D2-9Gly-Fc和D2-Fc的免疫印跡分析。D2-9Gly-Fc和D2-Fc蛋白的尺寸在非還原性凝膠中遷移時(shí)均為在還原性凝膠中遷移時(shí)的兩倍大。蛋白質(zhì)載自在表達(dá)D2-9Gly-Fc和D2-Fc質(zhì)粒的293細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的條件培養(yǎng)基，通過SDS-電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用山羊抗人抗-IgG1 Fc和兔抗山羊IgG-HRP抗體探測(cè)印跡。
圖4.含有9Gly連接體和VEGF Ex3的sFlt-1雜交蛋白質(zhì)。D2-9Gly-Ex3/CH3與之前構(gòu)建的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)比。所有三種蛋白質(zhì)均含有Flt-1結(jié)構(gòu)域2的相同氨基酸序列，由Flt-1信號(hào)肽的24aa和Flt-1結(jié)構(gòu)域2的93aa構(gòu)成。D2-9Gly-Ex3/CH3含有9Gly連接體的9aa、VEGFEx3的14aa和人IgG1重鏈Fc的CH3區(qū)的120aa。
圖5.D2-9Gly-Ex3/CH3 vs.D2-9Gly-Fc的生物活性。蛋白質(zhì)D2-9Gly-Ex3/CH3(其中結(jié)構(gòu)域2通過9Gly連接體連接到CH3區(qū)和VEGF Ex3上)與對(duì)照蛋白D2-9Gly-Fc和D2-Fc相比，也有效抑制了VEGF依賴型HUVECs增殖。使用50納克重組Flt-1-IgG(R&D Systems)作為對(duì)照物。
圖6.比較D2-(Gly4Ser)3-Fc蛋白質(zhì)活性與D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3的HUVECs增殖檢測(cè)。
圖7.免疫印跡。來自用表達(dá)(1)D2-9Gly-Fc；(2)D2-(G4S)3-Fc和(3)-EGFP蛋白質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(15微升CM)的蛋白質(zhì)(未還原和還原)通過SDS-電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用山羊抗人IgG1 Fc和兔抗山羊IgG-HRP抗體探測(cè)印跡。
圖8.含/不含9Gly連接體或VEGF Ex3的蛋白質(zhì)組合。三種含或不含9Gly連接體和/或VEGF Ex3、D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2-Ex3/CH3的新型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比較。
圖9.用帶有9Gly、Ex3和CH3組合的Flt-1(D2)構(gòu)建體進(jìn)行的HUVECs增殖檢測(cè)。將來自293細(xì)胞的含有蛋白質(zhì)D2-Ex3/CH3、D2-9Gly-CH3和D2-CH3的條件培養(yǎng)基(5微升)與D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3進(jìn)行比較。
圖10.免疫印跡。用表達(dá)(1)D2-9Gly-Fc；(2)D2-9Gly-CH3(52/26 kDa)和(3)D2-CH3(50/25 kDa)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。將來自293細(xì)胞條件培養(yǎng)基(15微升CM，未還原和/或還原)的蛋白質(zhì)通過SDS-電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用抗-人VEGF-R1 HRP結(jié)合物(conjugate)(R&D Systems)探測(cè)印跡。
圖11.VEGF“體外”結(jié)合檢測(cè)。將含有已知濃度的D2-9Gly-Fc和Flt-1 D(1-3)對(duì)照可溶受體(濃度為0.29-150pM)的來自293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基連續(xù)稀釋并用10pM VEGF混合。然后通過ELISA測(cè)量未結(jié)合的VEGF的量。D2-9Gly-Fc以比所有其他構(gòu)建體高的親合力結(jié)合VEGF?！皀”代表獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(轉(zhuǎn)染和結(jié)合檢測(cè))的數(shù)量。
圖12.用BIAcore儀器通過表面等離子體共振測(cè)量可溶Flt-1構(gòu)建體的結(jié)合動(dòng)力。將sFlt-1構(gòu)建體固定到傳感器芯片上，并以0.2至1.5nM的濃度注射VEGF165。使用BIA Evaluation程序評(píng)測(cè)sensorgrams，測(cè)定速率常數(shù)Ka和Kd，并由Kd/Ka＝KD的比率計(jì)算離解常數(shù)(KD)。越低的KD值意味著越好的親合力。
圖13A-13C.圖13A顯示含有各種連接體的Flt-1構(gòu)建體的表達(dá)水平。圖13B顯示了含有各種連接體和IgG1的Fc的CH3部分的Flt-1構(gòu)建體的二聚或多聚。未還原和還原條件之間的差異表明，蛋白質(zhì)已經(jīng)多聚。圖13C顯示了在存在VEGF的HUVEC增殖檢測(cè)中在條件培養(yǎng)基中存在的所示Flt-1構(gòu)建體的抑制生物活性。每一構(gòu)建體均表現(xiàn)出與HUVEC在不存在VEGF情況下的增殖水平接近的抑制活性。
圖14.使用視網(wǎng)膜血管新生(NV)的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)鼠科模型，對(duì)鼠眼施加Flt-1構(gòu)建體之一，并測(cè)定新血管形成。使鼠暴露在含氧量高的條件下。測(cè)定處理過的眼中的新生血管事件數(shù)，與相同動(dòng)物的未處理過的眼中的事件數(shù)進(jìn)行比較。如果新生血管事件數(shù)降低了50％以上，該動(dòng)物就被視為“反應(yīng)者”。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt-1Ig樣結(jié)構(gòu)域2在沒有結(jié)構(gòu)域1和3的情況下能夠有效結(jié)合VEGF并抑制VEGF依賴型內(nèi)皮細(xì)胞增殖。結(jié)構(gòu)域2可以通過連接體共價(jià)連接到多聚結(jié)構(gòu)域上。連接體通常是多肽鏈。鏈長(zhǎng)可以為6、7、9、11、13、15個(gè)或更多氨基酸殘基，但通常為5至25個(gè)殘基。根據(jù)長(zhǎng)度和側(cè)鏈組成，連接體可以但不需要具有大于平均水平的柔韌性。柔韌性可以使用本領(lǐng)域已知的運(yùn)算法計(jì)算。多聚結(jié)構(gòu)域是多聚蛋白質(zhì)的促進(jìn)亞單位結(jié)合形成例如二聚體、三聚體、四聚體等等的那些部分。適用于有效結(jié)合VEGF和/或抑制VEGF依賴型內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重組蛋白選自SEQ ID NO2、8、21、23或25。
此外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多聚結(jié)構(gòu)域和連接體可以與各種其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分一起使用以引發(fā)多聚。這類蛋白質(zhì)可以是僅在多聚時(shí)結(jié)合到配體或受體上的蛋白質(zhì)，或可以是在多聚時(shí)提高其結(jié)合親合力的蛋白質(zhì)。適合多聚的蛋白質(zhì)包括細(xì)胞外受體(包括其部分)、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子。適合的蛋白質(zhì)包括酪氨酸激酶受體和絲氨酸蘇氨酸激酶受體。細(xì)胞外受體的具體例子包括EGF-受體、G蛋白偶聯(lián)受體、FGF受體、Fc受體、T細(xì)胞受體等?？贵w可變區(qū)的例子包括Fab、F(ab’)2和ScFv。細(xì)胞因子的例子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNF-β。趨化因子的例子包括BCA-1/BLC、BRAK、趨化因子CC-2、CTACK、CXCL-16、ELC、ENA、ENA-70、ENA-74、ENA-78、Eotaxin、Exodus-2、Fractalkine、GCP-2、GRO、GROα(MGSA)、GRO-β、GRO-γ、HCC-1、HCC-4、I-309、IP-10、I-TAC、LAG-1、LD78-β、LEC/NCC-4、LL-37、淋巴細(xì)胞趨化因子(Lymphotactin)、MCP、MCAF(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC、MDC、MDC-2、MDC-4、MEC/CCL28、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、MIP-3/MPIF-1、MIP-3α、MIP-3 bet、MIP-4(PARC)、MIP-5、NAP-2、PARC、PF-4、RANTES、RANTES-2、SDF-1α、SDF-1β、TARC和TECK。生長(zhǎng)因子的例子包括人雙調(diào)蛋白、人血管生成蛋白、人ACE、人血管生成素(Angiogenin)、人促血管生成素(Angiopoietin)、人血管抑制素(angiostatin)、人β細(xì)胞素(betacellulin)、人BMP、人BMP-13/CDMP-2、人BMP-14/CDMP-1、人BMP-2、人BMP-3、人BMP-4、人BMP-5、人BMP-6、人BMP-7、人BMP-8、人BMP-9、人集落刺激因子、人flt-3-配體、人G-CSF、人GM-CSF、人M-CSF、人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、人cripto-1、人cryptic、人ECGF、人EGF、人EG-VEGF、人促紅細(xì)胞生成素、人胎球蛋白、人FGF、人FGF-1、人FGF-10、人FGF-16、人FGF-17、人FGF-18、人FGF-19、人FGF-2、人FGF-20、人FGF-3、人FGF-4、人FGF-5、人FGF-6、人FGF-7/KGF、人FGF-8、人FGF-9、人酸性FGF(acidic)、人堿性FGF(basic)、人GDF-11、人GDF-15、人生長(zhǎng)激素釋放因子、人HB-EGF、人Heregulin、人HGF、人IGF、人IGF-I、人IGF-II、人抑制素、人KGF、人LCGF、人LIF、人混合生長(zhǎng)因子(Miscellaneous Growth Factors)、人MSP、人肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin)、人肌肉生長(zhǎng)抑制素前肽、人神經(jīng)生長(zhǎng)因子、人制瘤素M、人PD-ECGF、人PDGF、人PDGF(AA同型二聚體)、人PDGF(AB異型二聚體)、人PDGF(BB同型二聚體)、人PDGF(CC同型二聚體)、人PIGF、人PIGF、人PIGF-1、人PIGF-2、人SCF、人SMDF、人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人SCGF-α、人SCGF-β、人血小板生成素、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、人TGF-α、人TGF-β和人VEGF。
Flt-1受體蛋白具有包含7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外部分。這些位于Genbank接受號(hào)(accession no.)P17948的殘基號(hào)32...123、151...214、230...327、335...421、428...553、556...654和661...747，也參見SEQ IDNO15。殘基號(hào)1-26包含信號(hào)序列。用Genbank接受號(hào)NM_002019(SEQ ID NO14)所示的DNA序列編碼Flt-1蛋白。
可以如本領(lǐng)域已知的那樣使用多聚結(jié)構(gòu)域。可以使用IgG1或IgG2λ重鏈的Fc部分的序列，例如單獨(dú)使用CH3(aa 371-477)或一起使用CH2和CH3域(aa247-477)。Ig分子的Fc部分是通過用木瓜蛋白酶裂解整個(gè)抗體分子而得的?？梢允褂闷渌绞将@得這些部分。對(duì)于IgG1λ重鏈蛋白質(zhì)序列，參見Genbank accession no Y14737和SEQ ID NO10。可以使用例如來自其他IgG類型和來自IgA、IgM、IgD或IgE抗體的其他Fc區(qū)域。也可以使用VEGF的多聚區(qū)域。編碼VEGF的DNA序列顯示在Genbank接受號(hào)NM_003376和SEQ ID NO11中。VEGF的氨基酸序列顯示在Genbank接受號(hào)CAC19513和SEQ ID NO12中。VEGF外顯子3(VEGF Ex3)編碼的VEGF的多聚區(qū)域(SEQ ID NO13)大致位于VEGF蛋白質(zhì)的氨基酸殘基75-88處(SEQ ID NO12)。多聚結(jié)構(gòu)域會(huì)導(dǎo)致至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或95％的單體融合蛋白在非變性聚丙烯酰胺凝膠上以適合多聚體的速率遷移。糖基化可以影響蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移。盡管在此列出了特定序列，但也可以使用等位變體之類的變體。通常，這些變體與所公開的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
如本文所示，可以例如使用還原和非還原性凝膠檢驗(yàn)多聚。還可以通過檢測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)其配體/受體提高的結(jié)合親合力來檢驗(yàn)多聚。在這方面可以使用BiaCoreTM表面等離子體共振檢驗(yàn)。這些檢驗(yàn)法通過測(cè)量接近傳感器芯片表面的水層中折射率的變化來檢測(cè)質(zhì)量變化。可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法來檢測(cè)多聚。
本發(fā)明的連接體部分可以包含例如5-100氨基酸殘基、5-75氨基酸殘基、5-50氨基酸殘基、5-25氨基酸殘基、5-20氨基酸殘基、5-15氨基酸殘基、5-10氨基酸殘基、5-9氨基酸殘基?？捎眠B接體的例子包括gly9(SEQ ID NO27)、glu9(SEQ ID NO28)、ser9(SEQ ID NO29)、gly5cyspro2cys(SEQ ID NO30)、(gly4ser)3(SEQ ID NO31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO32)、Pro SerCys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO13)、GlyAsp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys(SEQ ID NO26)和Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO34)?？捎玫钠渌嚯倪B接體包括不同長(zhǎng)度，包括5、7或30個(gè)殘基的多聚甘氨酸。此外，可以使用Flt-1的其他部分作為連接體，例如Flt-1的結(jié)構(gòu)域3。參見SEQ ID NO15。連接體部分還可以由其他聚合物，例如聚乙二醇制成。這類連接體可以具有10至1000、10-500、10-250、10-100或10-50個(gè)乙二醇單體單元。合適的聚合物應(yīng)該具有與被適當(dāng)范圍的氨基酸殘基占據(jù)的尺寸類似的尺寸。典型大小的聚合物提供大約10-25埃的間隔。
本發(fā)明的融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法制造。盡管這些蛋白質(zhì)可以合成，或通過連接制成的部分制造，也可以使用重組制造。融合基因序列可以使用重組DNA的標(biāo)準(zhǔn)工具制造。融合基因序列可以被插入載體，例如病毒或質(zhì)粒載體，以復(fù)制融合基因序列?？梢栽谌诤匣蛐蛄械纳嫌我朐谧罱K受體細(xì)胞中有作用的啟動(dòng)子序列。所用啟動(dòng)子可以是組成型的(constitutive)、可誘導(dǎo)的或可抑制的。每一類型的例子是本領(lǐng)域中公知的。載體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式引入宿主細(xì)胞或哺乳動(dòng)物?？捎玫暮线m的載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒或質(zhì)粒。如果載體在病毒載體中且載體已經(jīng)包裝(packaged)，則可以使用病毒粒子傳染細(xì)胞。如果使用裸DNA，則可以使用適合特定宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化程序。采用聚合物、脂質(zhì)體或納米球(nanospheres)的裸DNA制劑可用于融合基因輸送。可以用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以是對(duì)技術(shù)人員而言方便的任何細(xì)胞?？捎玫氖纠约?xì)胞類型包括細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可以視方便選擇許多組織類型的細(xì)胞?？捎玫氖纠约?xì)胞是成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。這些細(xì)胞可用于在體外制造蛋白質(zhì)，或可以輸送給包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物以在體內(nèi)制造編碼蛋白。這種輸送手段是向哺乳動(dòng)物輸送核酸、向哺乳動(dòng)物輸送病毒載體和向哺乳動(dòng)物輸送融合蛋白的替代形式。
蛋白質(zhì)或核酸的組合物可以在載體中，例如緩沖劑、水性或親脂載體、消毒或未消毒、熱源(pyrogenic)或未熱源載體。未熱源載體可用于可注射配方。配方可以是液體或固體，例如凍干的。配方還可以以氣溶膠形式施用。組合物可以包含一種或多種融合蛋白或一種或多種核酸，或即包含融合蛋白又包含核酸。組合物中的融合蛋白和/或核酸可以是同源的，在這種情況下會(huì)形成同源多聚體(homomultimer)蛋白質(zhì)，或它們?cè)诮M合物中是異源的，在這種情況下會(huì)形成異源多聚體(heteromultimer)蛋白質(zhì)。在異源多聚體的情況下，融合蛋白之間的X部分不同，但融合蛋白之間的Z部分相同。
可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式向細(xì)胞或哺乳動(dòng)物宿主提供融合蛋白?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)輸送(delivered)到細(xì)胞或宿主中，可以將核酸施用(administered)到細(xì)胞或宿主上?？梢詫⑥D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞施用到細(xì)胞或宿主上。在后一種情況下，需要相同遺傳背景的細(xì)胞以降低移植排異。
適用于輸送給哺乳動(dòng)物宿主動(dòng)物的細(xì)胞包括來自任何器官、腫瘤或細(xì)胞系的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。例如，可以使用人、鼠、山羊、綿羊、牛、狗、貓和豬的細(xì)胞。適用的細(xì)胞類型包括，但不限于，成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和干細(xì)胞。
融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸的輸送方式包括表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞的輸送、融合蛋白的輸送、和編碼融合蛋白的核酸的輸送。融合蛋白、細(xì)胞或核酸可以通過例如注射、導(dǎo)管插入或內(nèi)窺鏡檢查直接輸送給所需器官或腫瘤。它們也可以靜脈內(nèi)、支氣管內(nèi)、腫瘤內(nèi)(intra-tumorally)、鞘內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、局部、皮下、透皮或經(jīng)口輸送?？色@得有效治療的患者包括患有濕性年齡相關(guān)性黃斑變性、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎、哮喘和癌癥的患者。治療會(huì)改善癥狀和/或疾病標(biāo)記和/或疾病嚴(yán)重性。
核酸可以在任何所需載體中輸送給哺乳動(dòng)物，特別是人類。這些包括病毒的或非病毒的載體，包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和質(zhì)粒載體。病毒的示例性類型包括HSV(單純皰疹病毒)、腺病毒、AAV(腺相關(guān)病毒)、HIV(人類免疫缺陷性病毒)、BIV(牛免疫缺陷性病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。核酸可以以提供足夠有效的輸送水平的任何所需形式施用，包括在病毒粒子中、在脂質(zhì)體中、在納米粒子中和絡(luò)合到聚合物上。
可以結(jié)合使用蛋白質(zhì)、核酸聯(lián)合治療。例如，可以向患者施用本發(fā)明的融合蛋白。如果觀察到有利的響應(yīng)，就可以施用編碼融合蛋白的核酸分子以獲得長(zhǎng)期作用?；蛘?，可以同時(shí)或幾乎同時(shí)施用蛋白質(zhì)和核酸。在另一選擇中，可以在施用對(duì)配體的抗體或融合蛋白之后或相伴地，施用對(duì)受體的抗體或融合配偶體(partner)。
另一選擇是使用核酸組合(combination)，其中一種核酸編碼抗體，另一種編碼融合蛋白。可以與本發(fā)明的Flt-1構(gòu)建體(無論是蛋白質(zhì)還是核酸形式)結(jié)合使用的一些抗體是貝伐單抗(bevacizumab)和ranibizumab，兩者均針對(duì)VEGF。這些分別特別可用于治療癌癥和黃斑變性。
除非另行說明，本發(fā)明的實(shí)踐使用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)。在文獻(xiàn)中充分解釋了這類技術(shù)，例如，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition(Sambrook等，1989)；CurrentProtocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等，eds.，1987)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait.，ed.，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook Of Experimental Immunology(D.M.Wei&C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos，eds.，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction(Mullis等，eds.，1994)；Current Protocols In Immunology(J.E.Coligan等，eds.，1991)；AntibodiesA Laboratory Manual(E.Harlow與D.Lane，eds.(1988))；和PCR 2A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))。
基因輸送載體是可以將插入的多聚核苷酸帶入宿主細(xì)胞的任何分子?；蜉斔洼d體的例子是脂質(zhì)體、生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒外殼(artificial viral envelopes)；金屬粒子和細(xì)菌、病毒，例如桿狀病毒、腺病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒，噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體和本領(lǐng)域通常使用的其它重組載體，它們已經(jīng)被描述成用于在各種真核和原核宿主中表達(dá)，并可用于基因治療以及用于簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)表達(dá)。
本文所用的基因輸送、基因轉(zhuǎn)移之類的術(shù)語是指將外源多聚核苷酸(有時(shí)稱作“轉(zhuǎn)基因(transgene)”)引入宿主細(xì)胞，不管引入方法如何。這類方法包括各種公知技術(shù)，例如載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(通過，例如，病毒感染/轉(zhuǎn)染，或各種其他基于蛋白質(zhì)或基于脂質(zhì)的基因輸送復(fù)合物)以及促進(jìn)“裸”多聚核苷酸輸送的技術(shù)(例如電穿孔、“基因槍”輸送和用于引入多聚核苷酸的各種其他技術(shù))。引入的多聚核苷酸可以穩(wěn)定地或短暫地保持在宿主細(xì)胞中。穩(wěn)定保持通常要求引入的多聚核苷酸含有與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制原點(diǎn)或整合到宿主細(xì)胞的復(fù)制子中，例如染色體外復(fù)制子(例如質(zhì)粒)或核的或線粒體的染色體中。如本領(lǐng)域已知和本文所述的那樣，許多載體已知能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
將外源多聚核苷酸插入載體，例如腺病毒、部分缺失的腺病毒、完全缺失的腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、裸質(zhì)粒、質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物等等，以經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、門靜脈(intraportal)內(nèi)或其它施用途徑輸送給宿主。在本發(fā)明的方法和組合物中可用的表達(dá)載體包括，例如，病毒載體。最常用的基因治療施用方法之一(體內(nèi)和體外)，是使用用于基因輸送的病毒載體。許多類型的病毒是已知的，且許多已經(jīng)研究用于基因治療用途。最常用的病毒載體包括衍生自腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)和反轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒，例如人類免疫缺陷性病毒(HIV)的那些。
腺病毒是具有大約36kb基因組的未包膜(non-enveloped)的核DNA病毒，其已經(jīng)通過在經(jīng)典遺傳學(xué)和分子生物學(xué)中的研究來充分表征(Hurwitz，M.S.，Adenoviruses Virology，3rdedition，F(xiàn)ields等，eds.，Raven Press，New York，1996；Hitt，M.M.等，Adenovirus Vectors，TheDevelopment of Human Gene Therapy，F(xiàn)riedman，T. ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York 1999)。將病毒基因分類成早期(名為E1-E4)和晚期(名為L(zhǎng)1-L5)轉(zhuǎn)錄單元，這是指病毒蛋白的兩個(gè)時(shí)間段(temporal classes)分類的產(chǎn)生。這些事件的分界線是病毒DNA復(fù)制。根據(jù)包括血紅細(xì)胞的凝集、致瘤性、DNA和蛋白質(zhì)氨基酸組成和同源性、和抗原關(guān)系在內(nèi)的性質(zhì)，將人類腺病毒被劃分成許多血清型(大約47，相應(yīng)地編號(hào)并分成6類A、B、C、D、E和F)。
重組腺病毒載體對(duì)于用作基因輸送載體具有一些優(yōu)點(diǎn)，包括對(duì)分裂和未分裂細(xì)胞的向性、最小致病可能、復(fù)制至高滴定度以制備載體原料的能力，和攜帶大插入物的能力(Berkner，K.L.，Curr.Top.Micro.Immunol.15839-66，1992；Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 151-641994)。具有各種腺病毒基因序列缺失的腺病毒載體，例如假腺病毒(pseudoadenoviral)載體(PAVs)和部分缺失的腺病毒(被稱作“DeAd”)經(jīng)過設(shè)計(jì)以利用腺病毒的合意特征，這使其成為適用于將核酸輸送給受體細(xì)胞的載體。
特別地，也被稱作“空殼腺病毒(gutless adenovirus)”或“微小腺病毒(mini-adenoviral)”載體的假腺病毒載體(PAVs)，是由含有載體基因組的復(fù)制和包裝(packaging)所需的最小順式作用核苷酸序列和可以含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的腺病毒基因組衍生成的腺病毒載體(參見，美國(guó)專利5,882,877，其涵蓋假腺病毒載體(PAV)和制造PAV的方法，作為參考并入本文)。PAVs經(jīng)過設(shè)計(jì)以利用腺病毒的合意特征，這使其成為適用于基因輸送的載體。盡管腺病毒載體通?？梢酝ㄟ^刪除對(duì)病毒生長(zhǎng)而言不必要的區(qū)域而帶有最多8kb大小的插入物，但可以使用含有多數(shù)病毒編碼序列包括PAVs的缺失的腺病毒載體，實(shí)現(xiàn)最大承載能力。參見Gregory等人的美國(guó)專利5,882,877；Kochanek等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935731-5736，1996；Parks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9313565-13570，1996；Lieber等人，J.Virol.708944-8960，1996；Fisher等人，Virology 21711-22，1996；美國(guó)專利5,670,488；1996年10月24日公開的PCT申請(qǐng)公開WO96/33280；1996年12月19日公開的PCT申請(qǐng)公開WO96/40955；1997年7月19日公開的PCT申請(qǐng)公開WO97/25446；1995年11月9日公開的PCT申請(qǐng)公開WO95/29993；1997年1月3日公開的PCT申請(qǐng)公開WO97/00326；Morral等人，Hum.Gene Ther.102709-2716，1998?？梢匀菁{最多大約36kb外來核酸的這種PAVs是有利的，因?yàn)檩d體的承載能力最優(yōu)化，同時(shí)降低宿主對(duì)載體的免疫響應(yīng)可能或有復(fù)制能力的(replication-competent)病毒的生成。PAV載體含有5’反向末端重復(fù)(ITR)和含有復(fù)制原點(diǎn)的3’ITR核苷酸序列，和PAV基因組的包裝所需的順式作用核苷酸序列，并可以容納一個(gè)或多個(gè)帶有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等等)的轉(zhuǎn)基因。
其他部分缺失的腺病毒載體提供了部分缺失的腺病毒(被稱作“DeAd”)載體——其中從載體中刪除病毒復(fù)制所需的大部分腺病毒早期基因并在條件啟動(dòng)子的控制下置于生產(chǎn)(producer)細(xì)胞染色體內(nèi)。置于生產(chǎn)細(xì)胞中的可刪除腺病毒基因可以包括E1A/E1B、E2、E4(僅需要將ORF6和ORF6/7置入細(xì)胞中)、pIX和pIVa2。也可以從載體中刪除E3，但因?yàn)檫@對(duì)于載體制造不是必須的，這可以從生產(chǎn)細(xì)胞中省略。腺病毒晚期基因，通常在主要晚期啟動(dòng)子(MLP)的控制下，存在于載體中，但MLP可以被條件啟動(dòng)子取代。
適合用在DeAd載體和生產(chǎn)細(xì)胞系中的條件啟動(dòng)子包括具有下列特征的那些在未誘導(dǎo)狀態(tài)下的低基本表達(dá)，從而不以對(duì)細(xì)胞有害的程度表達(dá)細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性腺病毒基因；在誘導(dǎo)狀態(tài)下的高水平表達(dá)，從而制造足夠量的病毒蛋白以支持載體復(fù)制和裝配。適用在DeAd載體和生產(chǎn)細(xì)胞系中的優(yōu)選條件啟動(dòng)子包括以免疫抑制劑FK506和雷帕霉素為基礎(chǔ)的二聚體基因控制體系，蛻皮激素基因控制體系和四環(huán)素基因控制系統(tǒng)。同樣可用于本發(fā)明的是在Abruzzese等人，Hum.Gene Ther.1999 101499-507中描述的GeneSwitchTM技術(shù)(Valentis，Inc.，Woodlands，TX)，其公開的內(nèi)容作為參考并入本文。在WO99/57296中進(jìn)一步描述了部分缺失的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，其公開的內(nèi)容作為參考并入本文。
腺相關(guān)病毒(AAV)是基因組大小為4.6kb的單鏈人類DNA細(xì)小病毒。AAV基因組含有兩種主要基因編碼rep蛋白質(zhì)(Rep76、Rep68、Rep52和Rep40)的rep基因，和編碼AAV復(fù)制、恢復(fù)(rescue)、轉(zhuǎn)錄和整合(integration)的cap基因，同時(shí)cap蛋白質(zhì)形成AAV病毒粒子。AAV的名字源自其對(duì)腺病毒或其他輔助病毒(例如皰疹病毒)的依賴性以供應(yīng)允許AAV經(jīng)歷生產(chǎn)性感染(即在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制)的必需基因產(chǎn)品。在不存在輔助病毒時(shí)，AAV作為前病毒整合到宿主細(xì)胞的染色體中，直至通過輔助病毒(通常腺病毒)對(duì)宿主細(xì)胞的重復(fù)感染將其恢復(fù)(rescue)(Muzyczka，Curr.Top.Micor.Immunol.15897-127，1992)。
AVV作為基因轉(zhuǎn)移載體的重要性來自其生物學(xué)的一些獨(dú)特特征。在AAV基因組的兩個(gè)末端均有被稱作反向末端重復(fù)(ITR)的核苷酸序列，其含有病毒復(fù)制、恢復(fù)、包裝和整合所需的順式作用核苷酸序列。反式下的rep蛋白質(zhì)介導(dǎo)的ITR整合作用能夠使AAV基因組在不存在輔助病毒的情況下整合到感染后的細(xì)胞染色體中。病毒的這種獨(dú)特性質(zhì)與AVV在基因轉(zhuǎn)移中的使用有關(guān)，因?yàn)槠湓试S含有相關(guān)基因的重組AAV整合到細(xì)胞染色體中。因此，可以使用rAAV載體實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)移的許多目標(biāo)而言理想的穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化。此外，AAV用的整合位點(diǎn)是非常確定的并定位于人類的染色體19(Kotin等，Proc.Natl.Acad.Sci.872211-2215，1990)。整合位點(diǎn)的這種可預(yù)測(cè)性降低了任意插入細(xì)胞基因組中的危險(xiǎn)，這可能激活或鈍化宿主基因或打斷編碼序列，結(jié)果可能限制了載體的應(yīng)用——其中AVV的整合、在rAAV載體設(shè)計(jì)中這種基因的去除可能導(dǎo)致使用rAAV載體已經(jīng)觀察到的改變的整合模式(Ponnazhagan等人，Hum Gene Ther.8275-284，1997)。
使用AAV進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移具有其他優(yōu)點(diǎn)。AAV的宿主范圍很寬。此外，與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，AAV可以感染休眠和分裂細(xì)胞。此外，AAV尚未與人類疾病聯(lián)系在一起，這消除了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生基因轉(zhuǎn)移載體引起的許多顧慮。
重組rAAV載體生成的標(biāo)準(zhǔn)方法要求一系列細(xì)胞內(nèi)事件的配合用含有在側(cè)面與AAV ITR序列相接的所需轉(zhuǎn)基因的rAAV載體基因組轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，通過編碼反向(in trans)所需的AAV rep和cap蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，和用輔助病毒感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞以提供intrans所需的非AAV輔助功能(Muzyczka，N.，Curr.Top.Micor.Immunol.15897-129，1992)。腺病毒(或其他輔助病毒)蛋白質(zhì)激活A(yù)AV rep基因的轉(zhuǎn)錄，而rep蛋白質(zhì)隨后激活A(yù)AV cap基因的轉(zhuǎn)錄。Cap蛋白質(zhì)隨后利用ITR序列將rAAV基因組包入rAAV病毒粒子。因此，足量結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的可得性以及rAAV載體基因組所需的任何順式作用包裝(packaging)序列的可達(dá)性(accessibility)部分決定包裝效率。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基因輸送的常用工具(Miller，Nature(1992)357455-460)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將非重新排列的單副本基因輸送到多種嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物和人類體細(xì)胞中的能力使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體非常適合將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，其中病毒基因組是RNA。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，將基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為非常有效地整合到受感染細(xì)胞的染色體DNA中的DNA中間體。這種整合的DNA中間體被稱作前病毒。前病毒的轉(zhuǎn)錄和裝配為傳染性病毒，在存在適當(dāng)輔助病毒的情況下或在含有能夠在不同時(shí)產(chǎn)生污染輔助病毒的情況下實(shí)現(xiàn)殼體化的適當(dāng)序列的細(xì)胞系中發(fā)生。如果通過與適當(dāng)載體的共轉(zhuǎn)染提供用于殼體化的序列，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制造就不需要輔助病毒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組和前病毒DNA具有三種基因gag、pol和env，其兩側(cè)是兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列。gag基因編碼內(nèi)部結(jié)構(gòu)(基質(zhì)、衣殼和核殼體)蛋白；pol基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)，env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTRs用以促進(jìn)病毒粒子RNAs的轉(zhuǎn)錄和多聚腺苷酸化。LTR含有病毒復(fù)制所需的所有其他順式作用序列。慢病毒具有附加的基因，包括vit vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。與5’LTR相鄰的是基因組的逆轉(zhuǎn)錄(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))和病毒RNA有效殼體化到粒子中(Psi位點(diǎn))所必須的序列。如果殼體化(或逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA包裝到傳染性病毒粒子中)所必須的序列從病毒基因組中丟失，結(jié)果是防止基因組RNA殼體化的順式缺陷。但是，所得突變體仍然能夠指導(dǎo)所有varion蛋白質(zhì)的合成。
慢病毒(lentiviruses)是復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄病毒，其除了普通逆轉(zhuǎn)錄病毒基因gag、pol和env外還含有具有調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)功能的其他基因。在潛伏性感染過程中那樣，較高的復(fù)雜性能夠使慢病毒調(diào)節(jié)其生存周期。典型的慢病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)，AIDS的病原體。在體內(nèi)，HIV可以感染極少分裂的末端分化細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在體外，HIV可以感染單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDM)以及通過用aphidicolin或γ輻射處理而停滯在細(xì)胞周期中的HeLa-Cd4或T淋巴樣細(xì)胞的原代培養(yǎng)。細(xì)胞的感染取決于HIV整合前復(fù)合物通過目標(biāo)細(xì)胞的核孔的活性核輸入。這通過復(fù)合物中的多個(gè)部分冗余的分子決定子與目標(biāo)細(xì)胞的核輸入系統(tǒng)的相互作用產(chǎn)生。識(shí)別出的決定子包括gag基質(zhì)(MA)蛋白質(zhì)中的功能性核定位信號(hào)(NLS)、親核(karyophilic)病毒粒子相關(guān)蛋白、vpr和gag MA蛋白質(zhì)中的C-末端磷酸酪氨酸殘基。例如，在美國(guó)專利6,013,516和美國(guó)專利5,994,136中描述了使用反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行基因治療，其公開的內(nèi)容作為參考并入本文。
向細(xì)胞輸送DNA的其他方法不使用病毒進(jìn)行輸送。例如，可以使用陽離子兩親化合物輸送本發(fā)明的核酸。因?yàn)橛糜诖龠M(jìn)生物活性分子的細(xì)胞內(nèi)輸送的化合物必須與非極性和極性環(huán)境相互作用(在例如質(zhì)膜、組織液、細(xì)胞內(nèi)的隔室和生物活性分子本身之中或之上)，這類化合物通常被設(shè)計(jì)成含有極性和非極性結(jié)構(gòu)域。含有這兩種結(jié)構(gòu)域的化合物可以被稱作兩親物，且已經(jīng)被公開用于促進(jìn)這種細(xì)胞內(nèi)輸送的許多脂質(zhì)和合成脂質(zhì)(無論是用于體外還是體內(nèi)用途)符合這一定義。這些兩親物的一個(gè)特別重要的類型是陽離子型兩親物。一般而言，陽離子型兩親物具有能夠在生理pH值下帶正電荷的極性基團(tuán)，這種性質(zhì)在本領(lǐng)域中被認(rèn)為在確定兩親物與許多類型的生物活性(治療性)分子(包括，例如，帶負(fù)電荷的多聚核苷酸，例如DNA)如何相互作用時(shí)是重要的。
在例如美國(guó)專利5,049,386；US 5,279,833；US 5,650,096；US5,747,471；US 5,767,099；US 5,910,487；US 5,719,131；US 5,840,710；US 5,783,565；US 5,925,628；US 5,912,239；US 5,942,634；US 5,948,925；US 6,022,874；US 5,994,317；US 5,861,397；US 5,952,916；US 5,948,767；US 5,939,401和US 5,935,936中描述了使用含有陽離子兩親化合物的組合物進(jìn)行基因輸送，其公開的內(nèi)容作為參考并入本文。
此外，本發(fā)明的核酸可以使用“裸DNA”輸送。美國(guó)專利5,580,859；US 5,963,622；US 5,910,488描述了在不與轉(zhuǎn)染促進(jìn)蛋白質(zhì)、病毒粒子、脂質(zhì)體制劑、帶電脂質(zhì)和磷酸鈣沉淀劑結(jié)合的情況下，輸送編碼所需多肽或可連接到啟動(dòng)子上的肽的非傳染性、非整合的DNA序列的方法；其公開的內(nèi)容作為參考并入本文。
還報(bào)道了結(jié)合病毒和非病毒成分的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。Cristiano等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011548；Wu等人，(1994)J.Biol.Chem.26911542；Wagner等人，(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA896099；Yoshimura等人，(1993)J.Biol.Chem.2682300；Curiel等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；Kupfer等人，(1994)HumanGene Ther.51437和Gottschalk等人，(1994)Gene Ther.1185。在多數(shù)情況下，將腺病毒并入基因輸送系統(tǒng)以利用其溶內(nèi)體(endosomolytic)性質(zhì)。所報(bào)道的病毒和非病毒成分的組合通常涉及腺病毒共價(jià)連接到基因輸送復(fù)合物上或未結(jié)合的腺病毒與陽離子型脂質(zhì)DNA復(fù)合物的共同內(nèi)在化(co-internalization)。
為了向眼輸送DNA和蛋白質(zhì)，施用通常是局部的。這具有限制需要施用的DNA量和限制全身副作用的優(yōu)點(diǎn)?？梢允褂迷S多可能的輸送方式，包括但不限于通過基因槍在角膜上局部施用；結(jié)膜下注射、前眼房(intracameral)注射、經(jīng)眼滴到角膜上、通過termporal緣(limbus)注入前房、基質(zhì)內(nèi)注射、與電脈沖、角膜內(nèi)(intracorneal)注射、視網(wǎng)膜下注射、玻璃體內(nèi)注射和眼內(nèi)注射結(jié)合的角膜應(yīng)用?；蛘?，細(xì)胞可以離體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)并通過眼內(nèi)植入輸送。參見，Auricchio，Mol.Ther.6490-494，2002；Bennett，Nature Med.2649-654，1996；Borras，Experimental Eye Research 76643-652，2003；Chaum，Survey ofOphthalmology 47449-469，2002；Campochiaro，Expert Opinions inBiological Therapy 2537-544(2002)；Lai，Gene Therapy 9804-813，2002；Pleyer，Progress in Retinal and Eye Research，22277-293，2003。
可以以適用于特定疾病的動(dòng)物模型測(cè)試各種提出的治療劑和施用方式的效果。例如，可以如Smith，Investigative Ophthalmology & VisualScience，35101-111，1994中所述，在鼠中的氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病模型中測(cè)試早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。可以使用鼠中的激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管作為模型，用于在例如與年齡相關(guān)性黃斑變性的疾病中發(fā)生人類脈絡(luò)膜新生血管(CNV)。Tobe，American Journal of Pathology 1531641-1646，1998。已經(jīng)在靈長(zhǎng)動(dòng)物、大鼠、小種豬和兔子中開發(fā)出其他CNV模型。已經(jīng)在基因缺陷鼠中開發(fā)出年齡相關(guān)性黃斑變性的鼠模型。缺乏單核細(xì)胞趨化蛋白(chemoattractant)蛋白-1或C-C趨化因子受體-2的鼠發(fā)展出年齡相關(guān)性黃斑變性的特征。Ambati，Nature Med.91390-1397，2003。
盡管已經(jīng)參照具體實(shí)施例，包括本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以在如所述權(quán)利要求中所列的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)對(duì)上述系統(tǒng)和技術(shù)進(jìn)行許多變動(dòng)和重排。
實(shí)施例實(shí)施例1生成兩種構(gòu)建體第一種，含有多聚甘氨酸9-mer(9Gly)連接體的D2-9Gly-Fc，第二種，除9Gly連接體外具有相同序列的D2-Fc(圖1)。
我們使用序列分析程序Mac Vector 6.5.1.(IBI，New Haven，CT)的蛋白質(zhì)分析工具箱(Protein Analysis Toolbox)分析D2-9Gly-Fc和D2-Fc蛋白質(zhì)的氨基酸序列。D2-9Gly-Fc序列中的多聚甘氨酸9-mer連接體被確認(rèn)為是通過Karpus and Schultz(1985)Naturwiss，72212-213的柔韌性預(yù)測(cè)方法得出的柔韌性高于平均水平的區(qū)域。在D2-Fc序列中沒有檢出這樣的區(qū)域(圖1)。
實(shí)施例2我們測(cè)試了通過柔韌多聚甘氨酸9-mer連接體連接到IgG1 Fc區(qū)域上的分離的Flt-1 Flt-1 Ig樣結(jié)構(gòu)域2(D2-9Gly-Fc)。D2-9Gly-Fc融合蛋白能夠有效結(jié)合VEGF并抑制VEGF依賴型人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖。參見圖2。相反，當(dāng)Flt-1Ig樣結(jié)構(gòu)域2直接連接到IgG1重鏈(Fc)上以形成D2-Fc時(shí)，僅觀察到輕微的VEGF結(jié)合。參見圖2。通過IgG1 Fc的二聚和柔韌連接體的插入似乎促進(jìn)了VEGF結(jié)合到Flt-1結(jié)構(gòu)域2上。通過免疫印跡分析確定D2-9Gly-Fc和D2-Fc中二聚形式的存在。參見圖3。
實(shí)施例3對(duì)新生的(P0)或1天大(P1)C57BL/6的鼠施用AAV載體(在0.0005毫升體積中1×108至1×109個(gè)粒子)的玻璃體內(nèi)注射液。通過使P7幼畜和它們的看護(hù)母畜暴露在高氧中5天，在C57BL/6鼠中引發(fā)視網(wǎng)膜血管新生(NV)。使幼畜在P12回到室內(nèi)空氣并在P17安樂死(euthanized)(最高NV的時(shí)間)。(Smith LEH，Weslowski E，McLellan A，Kostyk SK，D’Amato R，Sullivan and D’Amore PA.Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse.Invest Opth Vis Sci.1994；35101-111.)將整個(gè)石蠟包埋的眼以5微米為間隔連續(xù)切片。通過在每隔100微米截取的切片中數(shù)出在內(nèi)界膜內(nèi)部的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，測(cè)定NV程度。
用編碼抗血管生成劑的AAV載體處理的動(dòng)物組與用編碼不相關(guān)轉(zhuǎn)基因的載體或用不編碼轉(zhuǎn)基因的載體處理的組進(jìn)行比較。將每一處理過的眼中內(nèi)皮細(xì)胞核的平均數(shù)與每一動(dòng)物的未處理的對(duì)側(cè)眼進(jìn)行比較。
實(shí)施例4D2-9Gly-Ex3/CH3的生成Flt-1的結(jié)構(gòu)域2已經(jīng)證實(shí)對(duì)于VEGF165結(jié)合是必不可少的。但是，已經(jīng)證明，F(xiàn)lt-1結(jié)構(gòu)域2單獨(dú)不能結(jié)合VEGF A(Davis-Smyth等人，1996)。VEGF A在作為二聚體存在時(shí)，通過酸性殘基(成熟蛋白質(zhì)的氨基酸63-67)結(jié)合到Flt-1上，這能夠?qū)崿F(xiàn)配體引發(fā)的受體二聚的可行機(jī)制(Keyt等人，1996)。
因此，F(xiàn)lt-1的結(jié)構(gòu)域2的二聚被用作恢復(fù)Flt-1的結(jié)構(gòu)域2與VEGFA的結(jié)合的對(duì)策。與IgG重鏈片段的融合可用于蛋白質(zhì)的二聚(Davis-Smyth等人，1996)。在此，我們證實(shí)，VEGF A(SEQ ID NO12)的氨基酸75-88(即PSCVPLMRCGGCCN；SEQ ID NO13)提高了sFlt-1雜交蛋白質(zhì)的生物活性。
首先，設(shè)計(jì)三種雜交蛋白質(zhì)D2-9Gly-Fc、D2-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3(圖4)。所有三種雜交蛋白質(zhì)含有與D2-9Gly-Fc相同的Flt-1結(jié)構(gòu)域D2。使用不含多聚甘氨酸9-mer(9Gly)連接體的D2-Fc，沒有觀察到VEGF結(jié)合。第三種蛋白質(zhì)，D2-9Gly-Ex3/CH3，含有多聚甘氨酸9-mer(9Gly)連接體和VEGF的多聚結(jié)構(gòu)域(aaPSCVPLMRCGGCCN；SEQ ID NO13；VEGF Ex3)，但其還含有人類IgG1重鏈Fc的CH3區(qū)(SEQ ID NO10的aa 371-477)。
蛋白質(zhì)D2-Fc在HUVEC增殖檢測(cè)(圖5)中沒有表現(xiàn)出有效的抑制活性，且暗示未有效結(jié)合到VEGF165上。但是，第三種雜交蛋白質(zhì)D2-9Gly-Ex3/CH3(其含有通過9Gly連接體和VEGF165的多聚區(qū)域(Ex3)融合到CH3區(qū)域上的Flt-1的結(jié)構(gòu)域2)在VEGF-依賴型HUVECs增殖檢測(cè)(圖5)種確實(shí)表現(xiàn)出抑制活性。這意味著，這種雜交蛋白有效結(jié)合到VEGF165上。
實(shí)施例5在Flt-1D2構(gòu)建體中使用連接體(Gly4Ser)3數(shù)種多聚甘氨酸連接體之前已經(jīng)被描述用于改進(jìn)蛋白質(zhì)特征(Mouz等人，1996；Qiu等人，1998)。對(duì)于下一種構(gòu)建體，我們已經(jīng)使用另一種連接體，15-mer(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(Huston等人，1988)。生成D2-(Gly4Ser)3-Fc蛋白質(zhì)，其含有Flt-1結(jié)構(gòu)域2、(Gly4Ser)3連接體和人類IgG1重鏈的Fc區(qū)域。
在HUVECs增殖檢測(cè)中進(jìn)一步表征D2-(Gly4Ser)3-Fc。通過HUVEC增殖的抑制測(cè)得的D2-(Gly4Ser)3-Fc的生物活性與D2-9Gly-Fc和D2-9Gly-Ex3/CH3的類似(圖6)。
通過免疫印跡法進(jìn)一步表征D2-(Gly4Ser)3-Fc構(gòu)建體并與D2-9Gly-Fc進(jìn)行比較(圖9)。這兩種構(gòu)建體均多數(shù)以二聚體形式存在，并在還原樣品分離后檢測(cè)單體形式。
實(shí)施例69Gly或VEGF Ex3在Flt-1(D2)構(gòu)建體中的作用為了調(diào)查9Gly連接體或VEGF二聚序列Ex3在可溶受體VEGF結(jié)合中的作用，生成三種其他構(gòu)建體D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2-Ex3/CH3(圖8)。生成所有三種構(gòu)建體，并與之前的構(gòu)建體類似地也置于CMV啟動(dòng)子的控制下。在HUVECs增殖檢測(cè)中評(píng)定它們的VEGF抑制活性(圖9)。
含IgG1的CH3區(qū)的蛋白質(zhì)的HUVEC增殖檢測(cè)已經(jīng)表明，D2-9Gly-CH3(無Ex3)和蛋白質(zhì)D2-Ex3/CH3(無9Gly連接體)與母體D2-9Gly-Ex3/CH3蛋白質(zhì)相比，具有類似的VEGF抑制效力。但是，在所有這些中，蛋白質(zhì)D2-CH3似乎是最弱的VEGF抑制劑(圖9中)。
來自轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的Flt-1 ELISA數(shù)據(jù)已經(jīng)表明了D2-9Gly-Ex3/CH3、D2-9Gly-CH3和D2-Ex3/CH3和D2-CH3的類似的Flt-1水平(70-90納克/毫升)，和D2-CH3的最低活性形式的略高水平(～150納克/毫升)。D2-9Gly-CH3和D2-CH3構(gòu)建體的免疫印跡(圖10)表明二聚體形式在未還原條件下的優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例7D2-9Gly-Fc結(jié)合VEGF優(yōu)于所有構(gòu)建體VEGF結(jié)合檢測(cè)使我們能夠比較我們的可溶VEGF受體在無細(xì)胞體系中的相對(duì)VEGF結(jié)合親合力。
簡(jiǎn)要地說，將含有已知濃度的可溶受體(濃度為0.29-150pM)的條件培養(yǎng)基連續(xù)稀釋并用10pM VEGF混合。然后通過ELISA測(cè)量未結(jié)合的VEGF的量。在0.001至大約0.2pM的受體濃度下，D2-9Gly-Fc以比所有其他構(gòu)建體高的親合力結(jié)合VEGF。D2-CH3具有最低的結(jié)合VEGF的親合力(圖11)。
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序列表格934140_3.TXT

934140_3.TXT

序列表<110>A·斯卡里P·佩漢S·沃茲沃思<120>多聚構(gòu)建體<130>003482.00025<150>60/658209<151>2005-03-04<150>60/608887<151>2004-09-13<160>34<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1077<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400> 1atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360ggtggaggtg gaggtggagg tcctaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 420ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat1020gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag 1077<210>2<211>358<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>2Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15
00025GENZ SEQCys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser65 70 75 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro115 120 125Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu130 135 140Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp145 150 155 160Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp165 170 175Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly180 185 190Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn195 200 205Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp210 215 220Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro225 230 235 240Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu245 250 255Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn260 265 270Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile275 280 285Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr290 295300Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys305 310 315 320Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys325 330 335Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu340 345 350Ser Leu Ser Pro Gly Lys355<210>3<211>1050<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>3atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aacccctaaa 360tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 420tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 480
00025GENZ SEQgtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 540gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 600acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 660tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 720gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 780accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 840gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 900gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 960caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag1020aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatag 1050<210>4<211>349<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>4Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser65 70 75 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys115 120 125Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu130 135 140Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu145 150 155 160Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys165 170 175Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys180 185 190Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu195 200 205Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys210 215 220Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys225 230 235 240Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser245 250 255Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys260 265 270Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln275 280 285Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly290 295 300Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln305 310 315 320Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn325 330 335
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<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>6Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser65 70 75 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro115 120 125Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn130 135 140<210>7<211>744<212>DNA<213>人工序列<220>
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0002 5GENZ SEQtgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gttgtatatg300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt attgtgcgag agagggtcgg360tgggtacgat atactacggt gactactatc ggatactact ttgactactg gggccaggga420accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc480tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc540cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc600ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc660agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag720gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca780gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc840ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac900cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag960ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 1320accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctCtccctgt ccccgggtaa atga 1434<210>10<211>477<212>PRT<213>人類<400>10Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Tyr Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Arg Trp Val Arg Tyr Thr Thr Val Thr115 120 125Thr Ile Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr130 135 140Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro145 150 155 160Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val165 170 175Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala180 185 190Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly195 200 205Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val yal Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly210 215 220Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys225 230 235 240Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys245 250 255Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu260 265 270
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<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>19
00025GENZ SEQMet Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser65 70 75 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu115 120 125Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys130 135 140Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser145 150 155 160Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp165 170 175Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser180 185 190Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala195 200 205Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220<210>20<211>717<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>20atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccccttcc 360tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc tgcaatcagc cccgagaacc acaggtgtac 420accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 480aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 540aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 600ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 660gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag717<210>21<211>238<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>21Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
00025GENZ SEQ1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Tle Pro Glu Tle Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Tle Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser65 70 75 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly115 120 125Gly Cys Cys Asn Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro130 135 140Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val145 150 155 160Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly165 170 175Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp180 185 190Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp195 200 205Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His210 215 220Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230 235<210>22<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>22atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360ggtggaggtg gaggtggagg tcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ag702<210>23<211>233<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>23
00025GENZ SEQMet Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser657075 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln115 120 125Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu138 135 140Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro145 150 155 160Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn165 170 175Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu180 185 190Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val195 200 205Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln210 215 220Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>24<211>1095<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>24atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360ggtggatcgg gtggaggtgg atcgggtgga ggtggatcgc ctaagagctg cgacaaaact 420cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 480cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 540gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 600gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 660agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 720tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 780cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 840agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 900aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 960ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc1020tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg1080tctccgggta aatag 1095<210>25<211>364
00025GENZ SEQ<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組融合蛋白或編碼相同的序列<400>25Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser20 25 30Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile35 40 45Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe50 55 60Pro Leu Asp Thr Leu Tle Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser65 70 75 80Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu85 90 95Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr100 105 110Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro130 135 140Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe145 150 155 160Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val165 170 175Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe180 185 190Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro195 200 205Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr210 215 220Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val225 230 235 240Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala245 250 255Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg260 265 270Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly275 280 285Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro290 295 300Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser305 310 315 320Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln325 330 335Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His340 345 350Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys355 360<210>26<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體
00025GENZ SEQ<400>26Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys1 5<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>27Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>28Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>29Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>30Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys1 5<210>31<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>31Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser1 5
00025GENZ SEQ<210>32<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>32Sir Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn1 5 10<210>33<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>33Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Cys1 5<210>34<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白的連接體部分<400>34Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Cys Val Pro Leu Met1 5 10 15Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn20
權(quán)利要求
1.式X-Y-Z的融合蛋白，其中X包含選自選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽；Y基本由5-25氨基酸殘基多肽構(gòu)成，Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中X包含細(xì)胞外受體，且所述受體選自酪氨酸激酶受體或絲氨酸蘇氨酸激酶受體。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中X包含細(xì)胞外受體，且所述受體是VEGF受體。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(FLT-1)的IgG-樣結(jié)構(gòu)域2。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中多肽Y是柔韌的。
6.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中多肽Y選自gly9(SEQ ID NO27)、glu9(SEQ ID NO28)、ser9(SEQ ID NO29)、gly5cyspro2cys(SEQ ID NO30)、(gly4ser)3(SEQ ID NO31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO32)、Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg CysGly Gly Cys Cys Asn(SEQ ID NO13)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQ ID NO26)或Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO34)。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Z是IgG1 CH3區(qū)域。
8.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中Z是IgG2 CH3區(qū)域。
9.包含權(quán)利要求1的融合蛋白的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種可藥用賦形劑或載體。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物是液體制劑。
11.權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物是凍干制劑。
12.包含一種或多種權(quán)利要求1的融合蛋白的組合物，其中所述組合物包含所述融合蛋白的多聚體。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物基本由形成同源多聚體的單種融合蛋白構(gòu)成。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述組合物基本由融合蛋白構(gòu)成，其中組合物中所述融合蛋白中的X部分是異源的。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中X部分是細(xì)胞外受體，且所述受體選自酪氨酸激酶受體或絲氨酸蘇氨酸激酶受體。
16.權(quán)利要求12的組合物，其中X部分是細(xì)胞外受體，且所述受體是VEGF受體或其部分。
17.權(quán)利要求12的組合物，其中X部分是VEGF-R1(FLT-1)的IgG-樣結(jié)構(gòu)域2。
18.權(quán)利要求12的組合物，其中Y是柔韌多肽。
19.權(quán)利要求12的組合物，其中Y選自gly9(SEQ ID NO27)、glu9(SEQID NO28)、ser9(SEQ ID NO29)、gly5cyspro2cys(SEQ ID NO30)、(gly4ser)3(SEQ ID NO31)、SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO32)、Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly CysCys Asn(SEQ ID NO13)、Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(SEQID NO26)或Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGly CysCysAsn(SEQ ID NO34)。
20.權(quán)利要求12的組合物，其中Z是CH3區(qū)域且所述區(qū)域是IgG1 CH3區(qū)域。
21.權(quán)利要求12的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種可藥用賦形劑或載體。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物是液體制劑。
23.權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物是凍干制劑。
24.式X-Y-Z的多肽，其中X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽；Y基本由提供5-25氨基酸殘基的空間隔離的連接體部分構(gòu)成；且Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)。
25.權(quán)利要求24的多肽，其中連接體部分是10-100個(gè)乙二醇單體殘基的低聚物。
26.式X-Y-Z的融合蛋白，其中X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽；Y基本由5-25氨基酸殘基多肽構(gòu)成；且Z是抗體分子的Fc部分。
27.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中Fc是IgG Fc。
28.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中IgG Fc是IgG1 Fc。
29.包含權(quán)利要求26的融合蛋白的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種可藥用賦形劑或載體。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中Z是抗體分子的Fc部分，其是IgG Fc。
31.權(quán)利要求29的組合物，其中Z是抗體分子的Fc部分，其是IgG1 Fc。
32.式X-Y-Z的融合蛋白，其中X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽；Y基本由提供5-25氨基酸殘基的空間隔離的連接體部分構(gòu)成；Z是抗體分子的Fc部分。
33.權(quán)利要求32的融合蛋白，其中Fc是IgG Fc。
34.權(quán)利要求33的融合蛋白，其中IgG Fc是IgG1 Fc。
35.權(quán)利要求32的融合蛋白，其中連接體部分是10-100個(gè)乙二醇單體殘基的低聚物。
36.包含權(quán)利要求32的融合蛋白的組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種可藥用賦形劑或載體。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中Z是抗體分子的Fc部分，其是IgG Fc。
38.權(quán)利要求36的組合物，其中Z是抗體分子的Fc部分，其是IgG1 Fc。
39.使多肽X多聚的方法，包括多肽X通過多肽Y連接到多肽Z上以形成多肽XYZ，其中X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽；Y基本由5-25氨基酸殘基多肽構(gòu)成，且Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)；由此多肽XYZ多聚。
40.權(quán)利要求39的方法，其中連接步驟包括構(gòu)建以單個(gè)開放閱讀框形式編碼各個(gè)X、Y和Z的核酸分子，其中所述多肽XYZ由宿主細(xì)胞中的核酸構(gòu)建體表達(dá)。
41.使多肽X多聚的方法，包括多肽X通過Y部分連接到多肽Z上以形成聚合物XYZ，X包含選自細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子或生長(zhǎng)因子的多肽；Y基本由提供5-25氨基酸殘基的空間隔離的連接體部分構(gòu)成，Z是IgG重鏈分子的CH3區(qū)；由此多肽XYZ多聚。
42.權(quán)利要求41的方法，其中連接體部分基本由10-100個(gè)乙二醇單體殘基的低聚物構(gòu)成。
43.編碼權(quán)利要求1的融合蛋白的核酸分子。
44.編碼權(quán)利要求26的融合蛋白的核酸分子。
45.權(quán)利要求43或44的核酸，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2。
46.權(quán)利要求43的核酸，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2，且融合蛋白包含選自SEQ ID NO8、21或23的序列。
47.權(quán)利要求44的核酸，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2，且融合蛋白包含選自SEQ ID NO2或25的序列。
48.權(quán)利要求1或26的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2。
49.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2，且融合蛋白包含選自SEQ ID NO8、21或23的序列。
50.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中X是VEGF-R1(Flt-1)的Ig樣結(jié)構(gòu)域2，且融合蛋白包含選自SEQ ID NO2或25的序列。
51.包含權(quán)利要求43或44的核酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
52.權(quán)利要求51的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其是人類細(xì)胞。
53.權(quán)利要求52的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其選自成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞或干細(xì)胞。
54.體外方法，包括將權(quán)利要求43或44的核酸分子輸送到分離的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以形成表達(dá)所述融合蛋白的細(xì)胞。
55.權(quán)利要求54的方法，其中融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。
56.權(quán)利要求54的方法，進(jìn)一步包括將表達(dá)所述融合蛋白的細(xì)胞輸送給哺乳動(dòng)物。
57.一種方法，包括將權(quán)利要求51的哺乳動(dòng)物細(xì)胞輸送給哺乳動(dòng)物。
58.一種方法，包括將權(quán)利要求43或44的核酸輸送給哺乳動(dòng)物，由此在哺乳動(dòng)物中表達(dá)所述融合蛋白。
59.權(quán)利要求58的方法，其中融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。
60.權(quán)利要求57的方法，其中哺乳動(dòng)物患有濕性年齡相關(guān)性黃斑變性或增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變。
61.權(quán)利要求58的方法，其中哺乳動(dòng)物患有癌癥。
62.權(quán)利要求58的方法，其中哺乳動(dòng)物患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
63.權(quán)利要求58的方法，其中哺乳動(dòng)物患有哮喘。
64.權(quán)利要求58的方法，其中哺乳動(dòng)物患有骨關(guān)節(jié)炎。
65.一種方法，包括將權(quán)利要求1或26的融合蛋白輸送給哺乳動(dòng)物。
66.權(quán)利要求65的方法，其中哺乳動(dòng)物患有濕性年齡相關(guān)性黃斑變性或增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變。
67.權(quán)利要求65的方法，其中哺乳動(dòng)物患有癌癥。
68.權(quán)利要求65的方法，其中哺乳動(dòng)物患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
69.權(quán)利要求65的方法，其中哺乳動(dòng)物患有哮喘。
70.權(quán)利要求65的方法，其中哺乳動(dòng)物患有骨關(guān)節(jié)炎。
71.權(quán)利要求65的方法，其中融合蛋白包含選自SEQ ID NO2、8、21、23或25的序列。
全文摘要
通過包涵體(inclusion)或連接體(linker)部分使Flt－1的Ig樣結(jié)構(gòu)域的多聚融合蛋白功能化。編碼融合蛋白的載體和表達(dá)融合蛋白的宿主細(xì)胞可以治療性地用于在患有與新血管形成有關(guān)的病理狀況的個(gè)體內(nèi)阻斷新血管形成。這類病癥包括年齡相關(guān)性黃斑變性、癌癥、牛皮癬、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、哮喘、葡萄膜炎、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。用于Flt－1的Ig樣結(jié)構(gòu)域的相同多聚手段，即連接體和多聚結(jié)構(gòu)域，可用于其他多肽，包括細(xì)胞外受體、抗體可變區(qū)、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101094688SQ200580038623
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月13日
發(fā)明者A·斯卡里, P·佩漢, S·沃茲沃思 申請(qǐng)人:建新公司