人miR-183基因簇生物敲減元件、構(gòu)建方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人miR?183基因簇生物敲減元件、構(gòu)建方法及應(yīng)用，其序列如SEQ ID NO：1所示。由于多種腫瘤細胞中存在miR?183基因簇的異常表達，且該家族參與細胞增殖、凋亡、遷移相關(guān)基因通路的調(diào)控，通過設(shè)計基因簇敲減元件，可以有效調(diào)控基因簇在膀胱癌細胞中的表達，不僅便于科學研究，也有利于控制腫瘤惡性表型和生物學行為。
【專利說明】
人miR-183基因簇生物敲減元件、構(gòu)建方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請涉及一種人miR-183基因簇生物敲減元件、構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA，長度為約22個核苷酸。miRNA通常與其靶 基因 mRNA的3'非翻譯區(qū)（3' untranslated region, 3' UTR)結(jié)合負向調(diào)控其表達。miRNAs 可以調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡。所以，miRNA的發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)病機制的研究提供了新的思 路，為腫瘤診斷和治療提供了新的策略。
[0003] miR-183基因簇（miR-183家族）是一個高度保守的基因簇，包括定位于7號染色 體的miR-183、miR-182和miR-96。研究表明，多種腫瘤細胞中存在miR-183基因簇的異常 表達，且該家族參與細胞增殖、凋亡、遷移相關(guān)基因通路的調(diào)控。因此，開發(fā)一種有效調(diào)控 miR-183/96/182在腫瘤細胞中的表達活性的生物元件，將可以更好地控制腫瘤惡性表型和 生物學行為。
[0004] 雖然傳統(tǒng)觀點認為miRNA可以下調(diào)靶基因的表達，但最新研究提示，靶基因也可 以反過來抑制miRNA的表達/活性。例如，在果蠅和人類細胞中，擁有與miRNA廣泛互補位 點的非編碼RNA可以有效促發(fā)miRNA從3'到5'端的水解反應(yīng)。這提示，含有與miRNA廣 泛互補序列的非編碼RNA都可能具有特異降解miRNA表達的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種新的人miR-183基因簇生物敲減元件、構(gòu)建方法及應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種人miR-183基因簇生物敲減元件，其序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0007] -種人miR-183基因簇生物敲減元件的構(gòu)建方法，所述生物敲減元件的序列如 SEQ ID N0 :1所示，包括如下步驟：
[0008] a)體外化學合成經(jīng)設(shè)計的人miR-183、96、182的反義序列各兩個拷貝；
[0009] b)在所述反義序列之間加入連接序列，形成六個拷貝的串聯(lián)序列；
[0010] c)在所述串聯(lián)序列的上下游分別引入酶切位點Xhol和Notl。
[0011] 與各反義序列的第9~12位對應(yīng)的堿基突變，所述連接序列是CTTC。
[0012] -種所述的生物敲減元件在治療膀胱癌藥物中的應(yīng)用。
[0013] -種所述的生物敲減元件在膀胱癌細胞中調(diào)控mir-183基因簇表達的應(yīng)用。
[0014] 生物敲減元件的調(diào)控包括：降低膀胱癌細胞中mir-183基因簇的表達活性、抑制 膀胱癌細胞的增殖、促進膀胱癌細胞的凋亡和抑制膀胱癌細胞的遷移。
[0015] 所述膀胱癌細胞是T24和UM-UC-3。
[0016] -種所述的生物敲減元件在膀胱癌細胞中檢測mir-183基因簇表達的應(yīng)用。
[0017] 檢測時，可以將生物敲減元件表達載體轉(zhuǎn)染入膀胱癌細胞T24和UM-UC-3。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：由于多種腫瘤細胞中存在miR-183基因簇的異常表達，且 該家族參與細胞增殖、凋亡、遷移相關(guān)基因通路的調(diào)控，通過設(shè)計基因簇敲減元件，可以有 效調(diào)控基因簇在膀胱癌細胞中的表達，不僅便于科學研究，也有利于控制腫瘤惡性表型和 生物學行為。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本實施方式人miR-183基因簇生物敲減元件的構(gòu)建示意圖；
[0020] 圖2是攜帶miR-183基因簇生物敲減元件的熒光素酶載體對細胞系T24和 UM-UC-3內(nèi)miR-183基因簇的應(yīng)答圖，其中，林表示與對照組相比，p值小于0. 01，白色長條 指對照組，黑色長條指敲減元件；
[0021] 圖3是顯示miR-183基因簇生物敲減元件有效抑制膀胱癌細胞增殖的檢測結(jié)果 圖，其中，**表示與對照組相比，P值小于0. 01 ;*表示與對照組相比，P值小于0. 05,實線 指對照組，虛線指敲減元件；
[0022] 圖4是顯示miR-183基因簇敲減元件有效誘導膀胱癌細胞凋亡的檢測結(jié)果圖；
[0023] 圖5是顯示miR-183基因簇生物敲減元件對膀胱癌細胞遷移運動能力的抑制的檢 測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0025] 技術(shù)與方法：
[0026] 1.細胞培養(yǎng)
[0027] 膀胱癌細胞系 T24 和 UM-UC-3 購自 American Type Culture Col lection (ATCC, Manassas, USA)，細胞培養(yǎng)液由 90 % 的 DMEM (Invitrogen, CA)，10 % 的胎 牛血清（Invitrogen)，1% -2%的谷氨酰胺和0· 5% -1%的雙抗配成。
[0028] 2. miR-183/96/182基因簇生物敲減元件的構(gòu)建
[0029] 體外化學合成經(jīng)設(shè)計的人miR_183、96、182的反義序列各兩個；并在這些反義序 列之間加入連接序列，最終構(gòu)成六個拷貝的敲減元件。引入酶切位點Xhol和Notl于該元件 的上下游，同時用Xhol和Notl酶切psiCHECKTM-2雙熒光素酶表達載體。經(jīng)T4DNA連接酶 將二者連接6小時，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞，搖菌、涂板、挑選陽性克隆，并提純質(zhì)粒。
[0030] 3.細胞轉(zhuǎn)染
[0031] 轉(zhuǎn)染前一天，4-5 X 104個細胞接種在24孔板上，加入0. 5ml培養(yǎng)基，放在37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)。生長24小時后，細胞匯合度達到70%，在50ul的無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入lug 重組質(zhì)粒，柔和混勻。在50ul無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入lul Lipofectamin2000 (Invitrogen, CA) 試劑，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的質(zhì)粒和Lipo2000輕柔混勻，室溫放置20分鐘， 以便形成質(zhì)粒/lipofectamin復合物。將質(zhì)粒/lipofectamin混合物加入24孔板內(nèi)，輕柔 搖晃24孔板。放入培養(yǎng)箱內(nèi)，4-6小時后更換培養(yǎng)基，48小時后收集細胞，準備下一步實驗。
[0032] 4.總 RNA 提取
[0033] 使用美國nvitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA。使用紫外分光光度計和2% 瓊脂糖凝膠檢測提取的總RNA質(zhì)量。定量后于-80°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0034] 5.實時定量PCR
[0035] 實時定量PCR檢測選用U6(snRNA U6)作為內(nèi)源對照基因。使用All-in-〇neTM miRNA qRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, MD, USA)進行實時逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 和 定量PCR驗證。先進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為總RNAlyl，2. 5U/ μ 1 Poly A Polymerasel μ 1, RTase Mixl μ 1, 5x Reaction buffer5 μ 1, dd H20(RNase-/ DNase free)17yl。瞬時離心，37°C孵育60min，然后，85°C酶滅活5min。實時定量PCR總 反應(yīng)體系為 20 μ 1，包括 10 μ 12xAll-in-〇neTM qPCR Mix, 2 μ 1 Universal Adaptor PCR Primer (2 μ M), 2 μ 1 All-in-〇neTM qPCR Primer (2 μ M), 2 μ 1 First-Strand cDNA (diluted ini: 5)，50x ROX Reference DyeO. 4 μ 1 和 3. 6 μ 1 雙蒸水。使用 ABI PRISM7000Fluorescent Quantitative PCR System (Applied Biosystems, CA, USA)進行 qPCR 反應(yīng)和分析。PCR 反應(yīng)均設(shè)3個重復。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：（1) 95 °C預(yù)變性15min ;⑵40個循環(huán)，每 包括 95 °C xl5s，55 °C x20s，70 °C x30s。All-in-〇ne?miRNA qPCRPrimer 貨號為： miR-96，HmiRQP0852 ;miR-182，HmiRQP0239 ;miR-183，HmiRQP0244 ;snRNA U6，HmiRQP9001。 取3個重復的中值計算相對miRNA表達量（Λ Ct = Ck edianmiRNA _ CtmediansnRNAU6) 〇 表達倍數(shù)用 2 "ct 法。
[0036] 6.熒光素酶活性檢測
[0037] 用 Promega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 檢測樣品 Luciferase活性。按上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染48h后，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次， 每孔細胞加入100 μ 1的Passive Lysis Buffer (PLB)，室溫輕微振搖15min。收集細胞裂解 液于 1. 5ml Eppendorf 管中；向 Eppendorf 管中加入 100 μ 1 的 Luciferase Assay Reagent II (LAR II);將細胞裂解液12, 000g離心lmin，取上清50 μ 1加入1. 5ml Eppendorf管中并 吹打均勻：用閱讀儀測量可見光強度l〇s (此時所讀光為psiCHECK-2載體上轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生 的螢火蟲Luciferase所發(fā)出的）；取出Eppendorf管，加入100 μ 1 Stop&Glo Reagent,吹打 均勻；用閱讀儀測量可見光強度l〇s(此時所讀光為psiCHECK-2載體上轉(zhuǎn)錄翻譯出的海腎 Luciferase所發(fā)出的）將所得到的數(shù)據(jù)，標準化后進行分析。
[0038] 7.細胞增殖檢測
[0039] 使用 3_ [4, 5-dimethy 1 thiazo l-2-y 1 ] _2，5-dipheny 1 _tetrazo 1 ium bromide(MTT)，即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽檢測細胞增殖。用含 10 %胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5000個細胞接種到96孔板，每孔體積 200μ1。分別于轉(zhuǎn)染后24, 48和72h，取相應(yīng)的孔做檢測。每個樣本設(shè)3個復孔。每孔加 MTT溶液（5mg/ml) 10 μ 1。孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100 μ 1 DMS0， 振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，用酶標儀（Bio-Rad，美國）測定各孔吸 光值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
[0040] 8.細胞凋亡檢測
[0041] 貼壁細胞經(jīng)輕吹打收集到l〇ml的離心管中，沒脫壁的細胞用0. 02%的EDTA消化 使之脫壁，每樣本細胞數(shù)為（1~5) X 106, 500~1000r/min離心5min棄去培養(yǎng)液。用孵 育緩沖液洗1次，500~1000r/min離心5min。用100 μ 1的標記溶液重懸細胞，室溫下避 光孵育10~15min。500~1000r/min離心5min沉淀細胞，孵育緩沖液洗1次。加入熒光 溶液4°C下孵育20min，避光并不時振動。流式細胞儀（EPICS，XL-4, Beckman，CA，USA)分析 細胞凋亡率。
[0042] 9.細胞遷移檢測
[0043] 細胞遷移運動能力由細胞劃痕實驗檢測。先用marker筆在6孔板背后，用直尺比 著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5~lcm-道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加 入約5X10 5個細胞，長滿后用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕。用PBS洗細胞3 次，去處劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37度5% C02培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0, 24小時取 樣，拍照。
[0044] 10.統(tǒng)計學分析
[0045] 數(shù)據(jù)分析使用SPSS17. 0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用x±s表示。兩組間比較， 采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準以P〈0. 05表示差別具有統(tǒng)計學意義。
[0046] 實驗結(jié)果：
[0047] 1. miR-183/96/182簇生物敲減元件的構(gòu)建
[0048] 針對11^1?-183、96、182，首先設(shè)計它們的反義序列各2拷貝；其中，將與每個1^1^^ 第9~12位對應(yīng)的堿基突變以增強二者的結(jié)合穩(wěn)定性，再在這些反義序列之間加入連接 序列，最終構(gòu)成6個拷貝的敲減元件。序列以接頭相連。另外設(shè)置對照組：6個拷貝長度為 22bp的重復序列，此序列不與任何已知的人miRNA配對。在敲減元件兩端分別加入Xhol 和Notl酶切位點，定向亞克隆到psiCHECK?-2質(zhì)粒hRluc基因下游，如圖1所示。相關(guān)序 列請見表1。
[0049] 表1敲減元件和陰性對照序列表

[0052] 表1中，斜體字部分為限制性酶切位點，橫線部分為連接序列，粗體字部分為突變 序列。
[0053] 2. psicheck-2載體熒光素酶相對表達活性在膀胱癌細胞中明顯降低
[0054] 將構(gòu)建好的miR-183/96/182簇敲減生物元件表達載體及其陰性對照載體分別轉(zhuǎn) 染入膀胱癌細胞系T24和UM-UC-3,48小時后檢測熒光素酶相對表達活性：相比于陰性對照 組，miR-183/96/182簇敲減元件轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達受到了明顯的限制，如圖2所示，說 明該熒光素酶報告系統(tǒng)對細胞內(nèi)源性的miR-183/96/182簇產(chǎn)生了有效的應(yīng)答。
[0055] 3. miR-183/96/182簇生物敲減元件可以有效降低膀胱癌細胞系miR-183/96/182 簇表達量
[0056] 將構(gòu)建好的miR-183/96/182簇敲減生物元件表達載體及其陰性對照載體分別轉(zhuǎn) 染入膀胱癌細胞系T24和UM-UC-3,48小時后檢測miR-183/96/182簇的相對表達量：相比 于陰性對照組，miR-183/96/182簇敲減元件轉(zhuǎn)染組的miR-183/96/182簇表達受到了明顯 的抑制，如表2所示，說明該元件可以有效敲減細胞內(nèi)源性的miR-183/96/182簇。
[0057] 表2miR-183基因簇生物敲減元件對細胞內(nèi)源性miR-183基因簇表達量的影響
[0058]
[0059] 表2中，a :與對照組相比，p值小于0. 01。
[0060] 4、miR-183/96/182簇生物敲減元件可以有效抑制膀胱癌細胞系的增殖
[0061] 將構(gòu)建好的miR-183/96/182簇敲減生物元件表達載體及其陰性對照載體分別轉(zhuǎn) 染入膀胱癌細胞系T24和UM-UC-3, 24、48、72小時后檢測細胞的增殖活力：相比于陰性對照 組，miR-183/96/182簇敲減元件轉(zhuǎn)染組的細胞增殖受到了明顯的抑制，如圖3所示，說明該 元件可以通過降低致癌性miR-183/96/182簇分子來有效抑制癌細胞的生長。
[0062] 5、miR-183/96/182簇生物敲減元件可以有效促進膀胱癌細胞的凋亡
[0063] 為了進一步證實miR-183/96/182簇生物敲減元件抑制膀胱細胞生長是通過促進 細胞凋亡實現(xiàn)的，將構(gòu)建好的miR-183/96/182簇敲減生物元件表達載體及其陰性對照載 體分別轉(zhuǎn)染入膀胱癌細胞系T24和UM-UC-3,48小時后檢測細胞的凋亡率：相比于陰性對照 組,miR-183/96/182簇敲減元件轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率明顯增加，如圖4所示,說明該元件可 以通過降低致癌性miR-183/96/182簇分子來有效誘導癌細胞的凋亡。
[0064] 6、miR-183/96/182簇生物敲減元件可以有效抑制膀胱癌細胞的遷移
[0065] 將構(gòu)建好的miR-183/96/182簇敲減生物元件表達載體及其陰性對照載體分別轉(zhuǎn) 染入膀胱癌細胞系T24和UM-UC-3,24小時后檢測細胞的遷移距離：相比于陰性對照組， miR-183/96/182簇敲減元件轉(zhuǎn)染組的細胞遷移過程明顯受到抑制，如圖5所示，說明該元 件可以通過降低致癌性miR-183/96/182簇分子來有效抑制癌細胞的遷移運動能力。
[0066] 一種人miR-183基因簇（miR-183/96/182)生物敲減元件，其序列如SEQ ID N0 :1 所示。該生物敲減元件能夠應(yīng)用在治療膀胱癌藥物中。該生物敲減元件能夠在膀胱癌細胞 中調(diào)控mir-183基因簇表達。該生物敲減元件能夠在膀胱癌細胞中檢測mir-183基因簇表 達。
[0067] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā) 明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
【主權(quán)項】
1. 一種人miR-183基因簇生物敲減元件，其特征在于，其序列如SEQ ID NO : 1所示。2. -種人miR-183基因簇生物敲減元件的構(gòu)建方法，其特征在于，所述生物敲減元件 的序列如SEQ ID NO :1所示,包括如下步驟： a) 體外化學合成經(jīng)設(shè)計的人miR-183、96、182的反義序列各兩個拷貝； b) 在所述反義序列之間加入連接序列，形成六個拷貝的串聯(lián)序列； c) 在所述串聯(lián)序列的上下游分別引入酶切位點Xhol和Notl。3. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，與各反義序列的第9~12位對應(yīng)的堿 基突變，所述連接序列是CTTC。4. 一種權(quán)利要求1所述的生物敲減元件在治療膀胱癌藥物中的應(yīng)用。5. -種權(quán)利要求1所述的生物敲減元件在膀胱癌細胞中調(diào)控mir-183基因簇表達的應(yīng) 用。6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膀胱癌細胞是T24和UM-UC-3。7. -種權(quán)利要求1所述的生物敲減元件在膀胱癌細胞中檢測mir-183基因簇表達的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12N15/113GK105886504SQ201410208519
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年5月16日
【發(fā)明人】黃衛(wèi)人, 劉宇辰, 韓永華, 蔡志明
【申請人】深圳市第二人民醫(yī)院