cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用，從石斑魚頭腎組織和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因和hLTF基因，將獲得的目的基因克隆到pDC315穿梭載體中，將含有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝獲得高滴度的重組腺病毒；評價cLYZ基因和hLTF基因在腺病毒介導(dǎo)下對奶牛乳房炎主要致病菌的聯(lián)合抑制作用。
【專利說明】
cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒 和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及構(gòu)建重組腺病毒的方法，具體說，是一種化YZ和化TF雙抑菌基因重組 腺病毒的構(gòu)建方法及重組腺病毒和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛乳房炎又被稱為奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到外界刺激或致病菌感染時所發(fā) 生的一種炎癥反應(yīng)。其不僅會引起奶牛產(chǎn)乳量的下降，縮短奶牛的更替周期，嚴(yán)重時甚至?xí)?造成患病奶牛泌乳能力的完全喪失。因此，奶牛乳房炎的臨床防治是一直困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè) 的一大難題。目前該病的防治主要通過提過規(guī)范化養(yǎng)殖管理及使用抗生素和化療藥物，但 由于不同地區(qū)致病菌的差異W及抗生素等的長期不規(guī)范使用，在治療過程中產(chǎn)生的細菌耐 藥性等問題常常給地方性奶牛乳房炎的治療帶來困難。為了應(yīng)對上述問題，臨床上亟需一 種新的研究策略來防治奶牛乳房炎。
[0003] 目前，隨著基因療法的日益興起，使用基因藥物代替常規(guī)抗生素預(yù)防和治療奶牛 乳房炎，已成為應(yīng)對抗生素濫用導(dǎo)致的細菌耐藥性增強等一系列問題的研究重點和熱點。
[0004] 與哺乳動物相比較，魚類的獲得性免疫系統(tǒng)較脆弱，固有免疫在抵抗外來病原入 侵中發(fā)揮著極其重要的作用，石斑魚的C型溶菌酶(C type Lysozyme,cLYZ)就是其體內(nèi)重 要的非特異性免疫因子之一，不僅能抑制革蘭氏陽性菌而且對革蘭氏陰性菌也有抑制作 用。人乳鐵蛋白化uman Lactof err in, hLTF)是主要存在于乳汁中的一種鐵結(jié)合性糖蛋白， 富含多種氨基酸，具有廣譜的抗菌性及免疫作用，抗氧化作用，抗炎癥，抗病毒，抗癌癥作用 等生物學(xué)功能。由于化TF具有強烈地馨合鐵離子的作用，而鐵元素是幾乎所有細菌生長不 可缺少的，因此，hLTF就可W阻止細菌利用鐵離子而起到抑菌殺菌的作用；其次，hLTF作為 蛋白酶，可W降解一些細菌的毒力，從而降低微生物的致病性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種cLYZ和化TF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu) 建方法及重組腺病毒和應(yīng)用。將化YZ基因的廣譜抑菌作用、hLTF基因廣泛高效抑菌的特性 和腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的優(yōu)勢結(jié)合起來，構(gòu)建出可W表達上述基因的重 組腺病毒，最終檢驗在腺病毒介導(dǎo)下cLYZ和化TF基因?qū)δ膛Ｈ榉垦字饕虏【穆?lián)合抑菌 作用。為進一步利用重組腺病毒在體內(nèi)外抑制奶牛乳房炎致病菌的生長及研制奶牛乳房炎 治療和預(yù)防疫苗奠定試驗基礎(chǔ)。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種化YZ和化TF雙抑菌基因 重組腺病毒的構(gòu)建方法，包括W下步驟：
[0007] 1)從石斑魚頭腎組織總RNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因序列GI: JQ-287658.1 和liLTF基因序列GI :AY-875691.1;
[000引所述的cLYZ基因和liLTF基因的擴增包括：W(：LYZ-F SEQ ID N0:1和化YZ-R沈Q ID N0:2為引物，W石斑魚頭腎組織總RNA為模版，擴增cLYZ基因序列；W化TF-F SEQ ID N0:3和化TF-R SEQ ID N0:4為引物，W人乳體細胞總RNA為模版，擴增化TF基因序列；
[0009] 2)將獲得的目的基因分別克隆到PDC315-MCS-EGFP穿梭載體中，與骨架載體 pBHGlox(delta)El，3Cre共轉(zhuǎn)染肥K293細胞，包裝獲得重組腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad- cLYZ-hLTFo
[0010] 所述的構(gòu)建cLYZ和化TF雙抑菌基因重組腺病毒的方法及制備的重組腺病毒。
[0011] 所述的構(gòu)建化YZ和化TF雙抑菌基因重組腺病毒的方法及制備的重組腺病毒在防 治奶牛乳房炎中細菌性疾病生物制品方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是:將化YZ的廣譜抑菌效應(yīng)、hLTF的廣泛抑菌特性和腺病毒載 體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的優(yōu)勢結(jié)合起來，構(gòu)建出包含上述基因的重組腺病毒，檢驗 在腺病毒介導(dǎo)下cLYZ和化TF基因?qū)δ膛Ｈ榉垦仔∈竽Ｐ椭饕虏【穆?lián)合抑菌作用。通過 檢測重組腺病毒在皿K293細胞中的表達蛋白對大腸桿菌化88)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳鏈球菌(ATCC 9809)和無乳鏈球菌等多株乳房炎 致病菌的抑菌活性和最小抑菌濃度(MIC)，綜合評價了重組腺病毒對奶牛乳房炎小鼠模型 主要致病菌的抑菌作用，研究結(jié)果顯示重組腺病毒在體外表達的目的蛋白可W有效抑制5 種試驗菌株。本發(fā)明最終研制出一種針對乳房炎動物模型細菌性疾病的廣譜疫苗。
【附圖說明】
[0013] 圖1是liLTF和Ec-cLYZ基因 RT-PCR擴增結(jié)果(M:DL 2502bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: liLTF基因 RT-PCR擴增產(chǎn)物；2 :Ec-cU^基因 RT-PCR擴增產(chǎn)物）。
[0014] 圖2是9]\?-江町和9]\陽-化了。質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果(M:DL 2502bp DNA Marker;l: pMD-hLTF經(jīng)化e巧日Sal I的雙酶切產(chǎn)物;2:9]\?-江町經(jīng)6(3〇1?巧日化e I的雙酶切產(chǎn)物）。
[0015] 圖3是目的片段與腺病毒穿梭載體的亞克隆結(jié)果(M:DL 2502bp DNA Marker;l: pDC315-江町的菌液PCR; 2: pDC315-hLTF的菌液PCR; 3: pDC315-cLYZ-hLTF的菌液PCR)。
[0016] 圖4是穿梭載體的雙酶切鑒定結(jié)果(M:DL 2502bp DNA Marker;l:pDC315-cLYZ經(jīng) EcoR I和Nhe I的雙酶切產(chǎn)物；2:ρ0〔315-Η；ΓΡ經(jīng)Nhe I和Sal I的雙酶切產(chǎn)物；3:pDC315- cLYZ-hLTF經(jīng)EcoR I和Sal I的雙酶切產(chǎn)物）。
[0017] 圖5是巧光檢測重組腺病毒在HEK 293細胞中的表達結(jié)果（10 X) (A:正常皿Κ 293 細胞圖；Β:重組腺病毒Ad-cLYZ感染皿Κ 293細胞后24h圖；C:重組腺病毒Ad-hLTF感染皿Κ 293細胞感染后2地巧光圖；D:重組腺病毒Ad-cLYZ-hLTF感染皿K 293細胞感染后7化圖；E: 重組腺病毒Ad-GFP感染HEK 293細胞感染后2地巧光圖）。
[0018] 圖6是目的基因在肥K293細胞中mRNA轉(zhuǎn)錄的RT-PCR檢測(M:DL2502DNA分子質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)；1: Ad-化YZ-hLTF轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)錄化YZ基因；2: Ad-化YZ-hLTF轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)錄化TF基因；3: Ad-cLYZ-hLTF轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)錄cLYZ-hLTF基因；4:Ad-cU^轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)錄cLYZ基因；5:Ad-hLTF 轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)錄化TF基因）。
[0019] 圖7是Western blotting檢測目的蛋白在肥K293細胞中的表達。
[0020]圖8是BCA定量方法測定重組腺病毒感染皿K293細胞后蛋白提取物濃度所繪制的 標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0021 ]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明：
[0022] 隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，基因治療現(xiàn)已成為疾病防治 研究的熱點。目前，腺病毒(adenovirus，Ad)載體療法是基因治療中最有前景的基因轉(zhuǎn)移方 法之一，它能有效的將外源基因傳遞到各種祀細胞或組織中，載體的構(gòu)建和操作簡單，宿主 范圍廣，感染性強，不整合入宿主染色體，在增殖和非增殖細胞中均可感染和表達多種目的 基因。
[0023] 魚類是脊椎動物亞口中最原始最低級的類群，雖具有特異性和非特異性免疫系 統(tǒng)，但與哺乳動物相比，其特異性免疫系統(tǒng)不發(fā)達。因此，魚類非特異性免疫系統(tǒng)主要擔(dān)負 著清除和降解入侵機體的病原微生物和有害物質(zhì)的角色，在機體抵抗外界病原菌時發(fā)揮極 其重要的作用。溶菌酶是固有免疫反應(yīng)中的重要參與者，主要通過破壞革蘭氏陽性菌細胞 壁中的N-乙酷胞壁酸和N-乙酷氨基葡糖之間的β-1，4糖巧鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解 成可溶性糖膚，導(dǎo)致細胞壁破裂。大量研究結(jié)果表明，石斑魚C型溶菌酶化pinephelus coioides C type Lysozyme,Ec-cLYZ)是其生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一，在抵 抗外來病原入過程中侵中發(fā)揮著重要作用。石斑魚C型溶菌酶是一種很穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，主要 存在于肝臟、頭腎、胃和免疫組織，具有較強的抗熱性，同時肩負著消化和防御兩大功能。當(dāng) 機體受到細菌、重金屬等外界刺激時，C型溶菌酶在體內(nèi)各組織中的表達量會發(fā)生變化，因 此，可W通過提高C型溶菌酶活性來降低重金屬和細菌等對石斑魚造成的傷害。此外，C型溶 菌酶還具有廣泛的抗菌活性和抗病毒作用，可W抑制虹彩病毒衣殼蛋白的合成，W及激活 宿主的免疫系統(tǒng)，具有抗腫瘤作用。
[0024] 人乳鐵蛋白（Human Lactofe;r;rin，hLTF)是一種分子質(zhì)量為78kDa的糖蛋白，hLTF W兩種形式存在:一種是不含鐵的人乳鐵蛋白，它主要具有殺菌和抑菌作用；另一種是鐵飽 和的人乳鐵蛋白，它主要作為人體的鐵源。乳鐵蛋白能通過阻止細菌利用鐵離子的途徑而 起到抑菌作用化llison R T et al.l991)。由于乳鐵蛋白具有強烈地馨合鐵離子的作用， 而鐵元素是幾乎所有細菌生長不可缺少的，故導(dǎo)致細菌停止生長或死亡。研究發(fā)現(xiàn)，母乳中 乳鐵蛋白通過與大腸桿菌爭奪鐵離子而對抗大腸桿菌感染;其次，乳鐵蛋白作為蛋白酶，可 W降解一些細菌的毒力，從而降低微生物的致病性。此外，乳鐵蛋白還具有抗腫瘤，抗病毒， 調(diào)節(jié)免疫等作用。
[0025] 因此，選擇上述兩個基因構(gòu)建重組腺病毒，利用腺病毒載體的高效表達活性，實現(xiàn) 目的蛋白對多種細菌的協(xié)同抑菌作用。
[00%] 本發(fā)明構(gòu)建Ec-cU^和化TF基因重組腺病毒的方法，包括W下步驟：
[0027] 1)石斑魚C型溶菌酶基因和人乳鐵蛋白基因的克?。?br>[0028] 2化c-cU^和化TF基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0029] 3化c-cU^和化TF基因重組腺病毒質(zhì)粒的包裝與鑒定；
[0030] 4)重組腺病毒介導(dǎo)殺傷奶牛乳房炎主要致病菌的體外抑菌效果評價。
[0031 ] 具體包括步驟如下：
[0032] 1)從石斑魚頭腎組織總RNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因序列GI: JQ-287658.1 和liLTF基因序列GI :AY-875691.1;
[0033] 所述的cLYZ基因和liLTF基因的擴增包括：W(：LYZ-F SEQ ID N0:1和化YZ-R沈Q ID N0:2為引物，W石斑魚頭腎組織總RNA為模版，擴增cLYZ基因序列；W化TF-F SEQ ID N0:3和化TF-R SEQ ID N0:4為引物，W人乳體細胞總RNA為模版，擴增化TF基因序列；
[0034] 2)將獲得的目的基因分別克隆到PDC315-MCS-EGFP穿梭載體中，含目的基因的穿 梭載體與骨架載體pBHGlox(delta化l，3Cre共轉(zhuǎn)染皿K293細胞，包裝獲得重組腺病毒Ad- cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-hLTF。
[0035] 所述的構(gòu)建cLYZ和化TF基因重組腺病毒的方法制備的重組腺病毒。
[0036] 所述的構(gòu)建化YZ和化TF基因重組腺病毒的方法制備的重組腺病毒在防治奶牛乳 房炎中細菌性疾病生物制品方面的應(yīng)用。
[0037] 也就是說:從石斑魚頭腎組織和人乳體細胞總RNA中分別擴增出化YZ基因和化TF 基因；將獲得的目的基因克隆到PDC315-MCS-EGFP穿梭載體后，將穿梭質(zhì)粒與骨架載體 pBHGlox(delta化l，3Cre經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染肥K293細胞，包裝獲得重組腺病毒；應(yīng)用RT-PCR、 Western blotting對重組腺病毒在皿K293細胞中表達情況進行鑒定;通過巧光顯微技術(shù)檢 測病毒感染皿K293細胞后的形態(tài)變化;利用腺病毒純化試劑盒純化病毒并測定其滴度;將 獲得的高滴度重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染肥K293細胞，通過組織活性蛋白提取試劑盒提取細胞內(nèi) 表達蛋白并通過BCA法測定蛋白濃度。分別通過紙片法和試管二倍稀釋培養(yǎng)法測定待測菌 株對蛋白提取液的敏感性及最小抑菌濃度(MIC)。最后根據(jù)測定的MIC檢測在該濃度下雙蛋 白對待測菌株的抑菌活性并與常用抗生素進行比較，評價在腺病毒載體介導(dǎo)下的cLYZ和 化TF對奶牛乳房炎主要致病菌的體外抑菌效果。
[0038] 本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，首次結(jié)合將石斑魚C型溶菌酶的廣譜抗菌效果、人乳鐵蛋 白的抑菌殺菌作用W及腺病毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的特性相結(jié)合，成功構(gòu)建共 表達上述基因的重組腺病毒，為且構(gòu)建的重組腺病毒可W在皿K293細胞中高效表達，目的 蛋白對試驗菌株表現(xiàn)出良好的抑菌活性，為臨床細菌性疾病的生物防治奠定了理論和試驗 基礎(chǔ)。
[0039] 下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步詳細說明：
[0040] 1材料與方法
[0041 ] 1.1江町基因和liLTF基因的擴增
[0042] 收集石斑魚小塊頭腎組織，加入ImL TriZ01試劑，按照產(chǎn)品說明書操作，提取總 RNA。根據(jù)GenBank中的石斑魚化YZ基因序列（JQ287658.1)，設(shè)計一對RT-PCR擴增引物，按 Takara公司PrimeScript? One Step RT-PCR kit說明書采用一步法進行cLYZ基因序列的 擴增，將擴增產(chǎn)物克隆至PMD19-T載體上，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-cLYZ，于-20°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 采用常規(guī)離屯、法，通過不同的離屯、力和離屯、時間分離并收集乳汁中的體細胞，加 入ImL Tr iZO1試劑，按照產(chǎn)品說明書操作，提取總RNA。根據(jù)GenBank中的化TF基因序列 (AY875691.1)，設(shè)計一對RT-PCR擴增引物，按Takara公司PrimeScript? One Step RT-PCR kit說明書采用一步法進行化TF基因序列的擴增，將擴增產(chǎn)物克隆至PMD19-T載體上，將鑒 定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-hLTF，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] RT-PCR擴增(反應(yīng)體系見表1)和T-A克隆(反應(yīng)體系見表2)，引物序列見下表3。
[0045] 表1 RT-PCR反應(yīng)體系
[0046]
[0047] 注：反應(yīng)程序：50 °C，化，94°C，5min; {94°C，30s; 58 °C，30s; 72 °C，45s} 35個循環(huán)，72 。(:延伸10miru4°C保存?zhèn)溆谩?br>[004引表2 T-A克隆連接體系 [0049]
[0052] 1.2亞克隆穿梭腺病毒載體的構(gòu)建
[0053]回收純化產(chǎn)物Ec-cLYZ基因片段，將其與穿梭載體PDC315-MCS-EGFP分別用EcoR I、Nhe I進行雙酶切。將雙酶切獲得的目的基因 cLYZ與PDC315-MCS-EGFP相連，16°C連接過 夜。連接反應(yīng)體系為10XT4DNA Ligase Buffer 2.化L，載體片段4.化L，目的片段10.0化， T4DNA Ligase 0.扣L。經(jīng)氨節(jié)霉素抗性篩選，菌液PCR、酶切及測序鑒定，構(gòu)建pDC315-cLYZ 重組穿梭質(zhì)粒。
[0054] 回收純化產(chǎn)物hLYZ基因片段，將其與載體PDC315-MCS-EGFP分別用Nhe I、Sal I進 行雙酶切。將雙酶切獲得的目的基因與PDC315-MCS-EGFP相連，16°C連接過夜。連接反應(yīng)及 后續(xù)鑒定參照上述，構(gòu)建pDC315-hLTF重組穿梭質(zhì)粒。
[0化5] 回收純化產(chǎn)物地LTF基因片段及載體pDC315-cLYZ分別用Nhe I、Sal I進行雙酶 切。將雙酶切獲得的目的基因與pDC315-cLYZ相連，16°C連接過夜。連接反應(yīng)及后續(xù)鑒定參 照上述，構(gòu)建pDC315-cLYZ-hLTF重組穿梭質(zhì)粒。
[0化6] 1.3重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的鑒定
[0057]對克隆的穿梭載體進行菌液PCR驗證、雙酶切鑒定W及測序鑒定，成功構(gòu)建的穿梭 載體命名為 pDC315-cLYZ、pDC315-hLTF 和 pDC315-cLYZ-hLTF。
[0化引1.4重組腺病毒的包裝
[0059] 重組腺病毒質(zhì)粒的質(zhì)粒提取按照Tiangen質(zhì)粒大提試劑盒說明書進行。穿梭質(zhì)粒2 yg和腺病毒骨架質(zhì)?；痝，由12.0化脂質(zhì)體LipoFiter?介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染肥K293細胞，包裝后獲得 重組腺病毒。利用RT-PCR檢測目的基因 mRNA轉(zhuǎn)錄，Western blotting檢測目的蛋白的表達， 通過巧光顯微鏡檢測重組腺病毒的細胞轉(zhuǎn)染情況，對重組腺病毒轉(zhuǎn)染肥K293細胞的情況進 行鑒定;采用純化試劑盒純化所擴增的病毒，參照TCIDso法進行病毒滴度測定。
[0060] 1.5重組腺病毒介導(dǎo)目的蛋白的體外抑菌試驗
[0061 ]為評價化YZ和化YZ雙基因表達蛋白的重組腺病毒在動物細菌性疾病基因防治中 的作用，本研究選擇了包括金黃色葡萄球菌等在內(nèi)的五種菌株為研究對象，分別為大腸桿 菌化88)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳鏈球菌(ATCC 9809)和無乳鏈球菌。將構(gòu)建成功的高滴度重組腺病毒感染皿K293細胞，通過組織活性蛋白 提取試劑盒提取細胞內(nèi)表達蛋白，觀察目的蛋白對待測菌株的體外抑菌活性。
[0062] 試驗中利用紙片法檢測待測菌株對目的蛋白的敏感性，通過組織活性蛋白提取試 劑盒獲得在肥K293中表達的目的蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取液的濃度。將 直徑為6mm的無菌圓濾紙片浸泡在細胞蛋白提取液中，過夜后自然風(fēng)干。將風(fēng)干的濾紙片按 照正Ξ角形貼于制備的含有待測菌株的瓊脂平板上，37°C恒溫恒濕培養(yǎng)16~1她后通過游 標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)抑菌圈的直徑來初步判定待測菌株對目的蛋白的 敏感性:抑菌圈直徑大于15mm為高度敏感;直徑在10~15mm為中度敏感;直徑小于10mm為低 度敏感;無抑菌圈則表示待測菌株不敏感。
[0063] 利用試管二倍稀釋培養(yǎng)法測定目的蛋白對待測菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibito巧concentration，MIC)，將倍比稀釋的蛋白提取液與無菌液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至無 菌試管中，各試管中加入1(Κ)化等濃度的待測菌液后37°C恒溫恒濕培養(yǎng)24h，不添加蛋白提 取液的無菌液體培養(yǎng)基作為空白對照。培養(yǎng)結(jié)束后分別檢測各菌液在620nm處的吸光值，與 對照組吸光值一致的菌液認定為無菌生長，用表示；吸光值大于對照組且目測有菌體 生長的認定為有細菌生長，用表示;液體培養(yǎng)基中沒有菌體生長的最低蛋白濃度即為其 最低抑菌濃度。
[0064] 為更好的評價目的蛋白的體外抑菌效果，采用紙片法測定MIC目的蛋白對待測菌 株的體外抑菌試驗，并與常用抗生素進行比較。目的蛋白藥敏紙片和含有待測菌株的瓊脂 平板的制備方法如上所述。37°C恒溫恒濕培養(yǎng)24h后通過游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑，記錄 數(shù)值并進行比較。
[00化]2結(jié)果與分析
[0066] 2.1石斑魚c型溶菌酶基因和人乳鐵蛋白基因的克隆與序列分析
[0067] 利用特異性引物，分別W石斑魚頭腎組織和人乳體細胞總RNA為模板，通過RT-PCR 方法，分別擴增出47化P的Ec-cLYZ基因片段和2172bp的化TF基因片段，條帶大小與位置均 與預(yù)期相符(見圖1)。
[006引分別對pMD-cLYZ和pMD-hLTF進行雙酶切鑒定，分別得到47化p、2900bp和2172bp、 2900bp的基因片段，表明目的基因成功連至PMD19-T載體(見圖2)。
[0069] 測序結(jié)果與GeneBank中的數(shù)據(jù)進行Blast分析，表明Ec-cU^和化TF基因序列同源 性均為99 % W上。
[0070] 2.2亞克隆穿梭腺病毒載體的構(gòu)建
[0071] 分別對pMD-cLYZ、pMD-hLTF和腺病毒穿梭質(zhì)粒PDC315-MCS-EGFP進行雙酶切，膠回 收目的片段，WT4DNA連接酶連接，得到亞克隆質(zhì)粒pDC315-cLYZ和pDC315-hLTF。對pMD- 化TF和pDC315-cLYZ進行雙酶切，膠回收目的片段，WT4DNA連接酶連接，得到亞克隆質(zhì)粒 pDC315-cLYZ-hLTF。對W上亞克隆質(zhì)粒進行菌液PCR鑒定，分別得到47化p、2172bp和2643bp 的目的片段，表明穿梭載體的亞克隆成功(見圖3)。
[0072] 分別對亞克隆質(zhì)粒pDC315-cLYZ、pDC315-hLTF和pDC315-cLYZ-LYZ進行雙酶切鑒 定，分別得到47化p、2172bp和2643bp的目的片段，表明重組穿梭載體構(gòu)建成功(見圖4)。
[0073] 2.3 cLYZ、化TF和雙基因重組腺病毒的構(gòu)建
[0074] 將構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹后，轉(zhuǎn)染皿K293細胞，置于 371：5%(：〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞變化，約第7(1，經(jīng)4(1-(31^￥2、八(1- hLTF、Ad-cLYZ-化TF和Ad-GFP轉(zhuǎn)染的皿K293細胞出現(xiàn)腫脹、圓縮等典型病毒感染病變 (CPE)。在巧光顯微鏡下可見重組腺病毒感染細胞出現(xiàn)綠色巧光，而未感染組細胞未見變化 (見圖5)dRT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，47化p、217化P和2643bp處分別出現(xiàn)特異性擴增條帶 (見圖7) eWestern blotting結(jié)果顯示，含有目的基因的重組腺病毒感染細胞后均檢測到相 應(yīng)的目的蛋白條帶：其中化YZ為16.OkDa，化YZ為78.OkDa，Ad-GFP無相應(yīng)蛋白表達，與預(yù)期 結(jié)果相符(見圖7)。
[0075] 收集純化后的重組腺病毒病毒，W50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCI化0)測定重組腺 病毒的病毒滴度，按照Ka巧er法計算出重組腺病毒Α(1-^ΥΖ、Α(1-}ι1；ΓΡ、Α(1-^ΥΖ-}ι1；ΓΡ和Ad- GFP 的滴度分別為：l〇9'54TCID50/mL、l〇9'25TCID50/mL、l〇9'87TCID50/血和 l〇9'i6TCID50/mL， 符合下一步試驗所需滴度要求。
[0076] 2.4重組腺病毒介導(dǎo)目的蛋白對待測菌株的體外抑菌效果
[0077] 為評價所構(gòu)建構(gòu)建重組腺病毒在動物細菌性疾病基因防治中的作用，本研究選擇 了包括金黃色葡萄球菌等在內(nèi)的五種菌株為研究對象，分別為大腸桿菌化88)、金黃色葡萄 球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳鏈球菌(ATCC 9809)和無乳鏈球 困。
[007引用10M0I的重組腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-liLTF分別感染皿K293細胞， 4化后收取細胞，通過組織活性蛋白提取試劑盒提取細胞內(nèi)表達蛋白，通過BCA蛋白定量試 劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖8)，并測得蛋白濃度分別為2.481mg/mL、2.675mg/mL和3.228mg/mL。 將上述蛋白溶液調(diào)整至統(tǒng)一濃度后浸泡直徑為6mm的無菌圓濾紙片，過夜后風(fēng)干置于含有 待測菌株的瓊脂平板上培養(yǎng)16~1她。游標(biāo)卡尺測量抑菌圈結(jié)果顯示3種重組腺病毒感染 皿K293細胞后表達的目的蛋白均對5種試驗菌株具有抑制作用，且雙基因蛋白有更強的抑 菌作用，而對照組沒有抑菌作用(見表4)。
[0079] 通過試管二倍稀釋培養(yǎng)法測定Ad-cLYZ-化TF蛋白提取物對各待測菌株的最低抑 菌濃度，生理鹽水作為空白對照，結(jié)果顯示無乳鏈球菌、停乳鏈球菌(ATCC 9809)、金黃色葡 萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)和大腸桿菌化88)的MIC分別為37.5μ g/mL、75yg/mL、37.5yg/mL、37.5yg/ni 和 150yg/mL(見表 5)。
[0080] 表4是待測菌株對各重組腺病毒感染HEK293細胞后蛋白提取物的敏感性測定結(jié)果
[0081]
[0082] 表5是重組腺病毒Ad-cLYZ-hLTF感染皿K293細胞后蛋白提取物對各待測菌株最小 抑菌濃度的測定結(jié)果
[0083]
[0084] 為進一步評價腺病毒介導(dǎo)表達的外源蛋白對待測菌株的抑制作用W及臨床應(yīng)用 價值，本研究通過紙片法檢測了最低抑菌濃度的Ad-cLYZ-化TF蛋白提取物對各待測菌株的 抑菌效果，紙片的制備和效果檢測方法如上所述。同時，和常用抗生素對各待測菌株的抑菌 效果進行比較。結(jié)果顯示，與17種常用抗生素相比，外源蛋白對待測菌株都具有良好的抑制 作用，抑菌效果與常用抗生素持平，甚至更優(yōu)。
[00化]表6是MIC重組腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物對大腸桿菌化88)的抑菌效果評價
[0086]
[0087] 表7是MIC重組腺病毒Ad-cLYZ-化TF蛋白提取物對停乳鏈球菌(ATCC9809)的抑菌 效果評價 [008引
[0090] 表8是MIC重組腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物對無乳鏈球菌的抑菌效果評價
[0091]
[0092] 表9是MIC重組腺病毒Ad-cLYZ-化TF蛋白提取物對表皮葡萄球菌(ATCC 12228)的 抑菌效果評價
[0093]
[0094] 表10是MIC重組腺病毒Ad-cLYZ-化TF蛋白提取物對金黃色葡萄球菌（CMCC(B) 26001)的抑菌效果評價
[0095]
[0096」3結(jié)論
[0097] 3.1分別從石斑魚頭腎組織和人乳體細胞中擴增得到化ΥΖ基因和化ΥΖ基因，并分 別成功連接到PMD19-T載體上，通過PCR檢巧U、酶切鑒定和序列檢測，證實擴增所得目的片段 與已發(fā)表序列的同源性達到99 %。
[009引 3.2將目的基因片段江￥2和化￥2分別亞克隆至穿梭載體口0〔315-1〔5斗6。？中，得到 穿梭載體pDC315-cLYZ和pDC315-hLTF。將目的基因 liLTF亞克隆至pDC315-cLYZ得到重組穿 梭載體pDC315-cLYZ-LYZ。將W上重組穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染肥K293細胞，包裝獲得重 組腺病毒4(1-江￥2、4(1-化了。、4(1-江￥2-化了。和對照腺病毒4(1-6。？;經(jīng)腳斗〔時正實重組腺病毒 質(zhì)粒成功導(dǎo)入皿K293細胞中；經(jīng)Western blotting可檢測到目的蛋白的表達，表明構(gòu)建成 功的重組腺病毒具有良好的感染性;上述重組腺病毒經(jīng)純化后，應(yīng)用TCID50法檢測其病毒 滴度，分別為 109'54tCID50/血、109'25tcID50/血、l09'87TCID50/m 巧 Pl09'i6TCID50/mL，表明腺 病毒介導(dǎo)外源基因感染有效，收獲的較高滴度和感染性的重組腺病毒符合下一步試驗的要 求。
[0099] 3.3重組腺病毒4(1-化￥2、4(1-化了。和4(1-化￥2-化了。分別感染皿1(293細胞后提取細 胞內(nèi)活性蛋白經(jīng)BCA定量測定蛋白提取物濃度分別為2.481mg/mL、2.675mg/mL和3.228mg/ mL。通過紙片法分別檢測待測菌株對各蛋白提取物的敏感性，結(jié)果顯示巧巾重組腺病毒感染 皿K293細胞后表達的目的蛋白均對5種試驗菌株具有抑制作用，且雙基因蛋白有更強的抑 菌作用，而對照組沒有抑菌作用。
[0100] 3.4通過試管二倍稀釋培養(yǎng)法測定Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物對各待測菌株的最低 抑菌濃度，生理鹽水作為空白對照，結(jié)果顯示無乳鏈球菌、停乳鏈球菌(ATCC 9809)、金黃色 葡萄球菌(〔10：(8)26001)、表皮葡萄球菌^了0： 12228)和大腸桿菌化88)的]\0(：分別為37.5 yg/mL、75yg/mL、37.5yg/mL、37.5yg/mL和150yg/mL。為進一步評價腺病毒介導(dǎo)表達的外源 蛋白對待測菌株的抑制作用W及臨床應(yīng)用價值，紙片法分別測定MIC蛋白提取物對各待測 菌株的抑制效果，并與17種常用抗生素進行比較。結(jié)果顯示與17種常用抗生素相比，外源蛋 白對除大腸桿菌之外的待測菌株都具有良好的抑制作用，抑菌效果與常用抗生素持平，甚 至更優(yōu)。
[0101] 本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，首次將化YZ廣譜抑菌作用、hLYZ廣泛抑菌的特性和腺病 毒載體系統(tǒng)高效穩(wěn)定表達外源基因的優(yōu)勢結(jié)合起來，成功構(gòu)建出共表達上述基因的重組腺 病毒。通過檢測重組腺病毒在體外肥K293細胞中的擴增、轉(zhuǎn)錄和外源基因的表達，W及細胞 內(nèi)活性蛋白提取物對金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳 鏈球菌(ATCC 9809)、無乳鏈球菌和大腸桿菌化88)等5種菌株的MIC和抑菌活性等，綜合評 價了重組腺病毒對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用，闡明了重組腺病毒在體外細胞中的 表達規(guī)律及介導(dǎo)外源蛋白殺傷細菌的生物學(xué)效應(yīng)，證明了構(gòu)建的重組腺病毒介導(dǎo)外源蛋白 抑制細菌的作用及基因治療動物細菌性疾病的臨床應(yīng)用前景。
[0102] W上所述的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi) 的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)W實施，不能僅W本實施例來限定本發(fā)明的專利范 圍，即凡對本發(fā)明所掲示的創(chuàng)意所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 從石斑魚頭腎組織總RNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因序列GI: JQ-287658.1 和hLTF基因序列GI: ΑΥ-875691 · 1; 所述的cLYZ基因和hLTF基因的擴增包括：以cLYZ-F SEQ ID N0:1和cLYZ-R SEQ ID N0:2為引物，以石斑魚頭腎組織總RNA為模版，擴增cLYZ基因序列；以hLTF-F SEQ ID N0:3 和hLTF-R SEQ ID NO:4為引物，以人乳體細胞總RNA為模版，擴增hLTF基因序列； 2) 將獲得的目的基因分別克隆到PDC315-MCS-EGFP穿梭載體中，與骨架載體pBHGlox (delta)El，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝獲得重組腺病毒Ad-cLYZ-hLTF。2. 如權(quán)利要求1所述的cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病 毒。3. 如權(quán)利要求1所述cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構(gòu)建方法制備的重組腺病毒 在防治奶牛乳房炎中細菌性疾病生物制品方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK106011088SQ201610622268
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】金天明, 弓建芳, 張東超, 李小慧, 高珂珂, 林靜, 孟佳麗, 尚翠玲, 李昕
【申請人】天津農(nóng)學(xué)院