蛋白酶體抑制劑與細(xì)胞自噬激活劑聯(lián)合在膽管癌治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在膽管癌中檢測PTEN表達(dá)的方法，PTEN過表達(dá)非增值型腺病毒載體的構(gòu)建和包裝，以及蛋白酶體抑制劑和細(xì)胞自噬/溶酶體激活劑聯(lián)合在PTEN缺失型膽管癌治療中的運用。
【背景技術(shù)】
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[0002]膽管癌(carcinoma of bile duct，簡稱CC)指源于肝外膽管包括肝門區(qū)至膽總管下端的膽管的惡性腫瘤，是原發(fā)性肝癌中的一種，占原發(fā)性肝癌比例約為10% ;在臨床中表現(xiàn)為潛伏期長，惡性程度高，放化療抵抗，預(yù)后差等特點；流行病學(xué)顯示近年來膽管癌的發(fā)病率持續(xù)上升，給整個醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來極大的挑戰(zhàn)。隨著研究的深入，人們對參與膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制也有了更進(jìn)一步的認(rèn)識?；蚪M測序顯示，部分CC腫瘤組織中3p, 4q, 6q, 9p, 9q, 13q, 14q, 8p, 17p,及21q發(fā)生缺失，Iq和7p有增加。外顯子測序顯示P53，KRAS, SMAD4，IHD等是在膽管癌中常常突變或激活的基因JAK_Stat，MAPK,TGFP-SMAD, TOGF信號通路在膽管癌中經(jīng)常被激活或放大，促進(jìn)了膽管癌發(fā)生發(fā)展；這些分子機(jī)制的探索為膽管癌的診治提供了新的思路(Ong, C.K.et al.Exome sequencing ofliver fluke-associated cholang1carcinoma.Nat Genet, 2012，44，690-693)。目前，對于膽管癌的治療除手術(shù)外，化療是最主要的方式，使用藥物有吉西他濱(GEM)和順鉑(DDP)等，但它們都缺乏明確的分子分型靶標(biāo)，為腫瘤的治療帶來困難。
[0003]PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，即MMAC1)是一個重要的抑癌基因，其全稱是人10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物，其核苷酸Genebank ID號為5728。1997年被兩個獨立的課題組發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)，是繼P53之后發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因，在多種腫瘤中存在突變或缺失(Li, J.et al.PTEN, a putative proteintyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer.Science, 1997，275，1943-1947)。PTEN 通過自身脂質(zhì)磷酸酶活性，拮抗 PI3K-Akt_mT0R信號通路，調(diào)控細(xì)胞多種生理進(jìn)程，包括:存活，增殖，能量代謝，細(xì)胞骨架構(gòu)建以及細(xì)胞間相互識別(Song, M.S., Salmena, L.&Pandolfi, P.P.The funct1ns and regulat1nof the PTEN tumour suppressor.Nat Rev Mol Cell B1l, 2012，13，283-296)。因此，調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)和功能的機(jī)制，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中尤其重要。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中PTEN缺失與否直接關(guān)系著化療藥物的敏感性，有文章指出PTEN的缺失會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定性恰好適用于某些小分子抑制劑或化療藥物，從而可以實現(xiàn)以 PTEN 為基礎(chǔ)的個性化治療(Mason, J.M.et al.Funct1nal characterizat1n ofCF1-400945, a Polo-like kinase 4inhibitor, as a potential anticancer agent.Cancer Cell, 2014，26，163-176)。
[0004]蛋白酶體(proteasome)是在真核生物和古菌中普遍存在的結(jié)構(gòu)，主要作用是降解細(xì)胞不需要的或受到損傷的蛋白質(zhì)。抑制蛋白酶體的功能將引起蛋白降解的紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)病理性變化，嚴(yán)重時會引起細(xì)胞死亡。目前，臨床上應(yīng)用蛋白酶體抑制劑Bortezomib 治療多發(fā)性骨髓瘤，取得了 一定的療效(Ria, R., Reale, A.&Vacca, A.Novelagents and new therapeutic approaches for treatment of multiple myeloma.WorldJ Methodol, 2014，4，73-90)。
[0005]細(xì)胞自卩蜜(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出的，是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自■體(autophagosome)，與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。細(xì)胞自噬的現(xiàn)象在機(jī)體的生理或病理過程均能觀察到，所起的作用需要進(jìn)一步闡明。有研究報道m(xù)T0R(Mammalian target of rapamycin)的抑制劑Rapamycin，CC-223，AZD8055等可以激活細(xì)胞自噬，抑制HCC腫瘤細(xì)胞系增殖迀移等生物學(xué)過程，目前該類部分藥物已進(jìn)入二期臨床試驗。這提示我們干預(yù)自噬，打破細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，可以用于疾病的治療(Ashworth, R.E.&ffu, J.Mammalian target of rapamycin inhibit1n in hepatocellularcarcinoma.World J Hepatol, 2014，6，776-782)。
[0006]但不論是蛋白酶體的抑制劑，或是細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)劑，在臨床上應(yīng)用均較少。它們都是針對細(xì)胞最基本的生命過程，治療的靶向性較差；已經(jīng)上市的藥物適應(yīng)癥較為單一，目前還不能廣泛運用。因此，尋找新的適應(yīng)癥，根據(jù)分子分型進(jìn)行靶向性治療，是這一類藥物急需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種以PTEN為靶標(biāo)的膽管癌個性化治療方案；本發(fā)明的另一目的在于提供蛋白酶體抑制劑和細(xì)胞自噬激活劑新的醫(yī)藥用途，即聯(lián)合蛋白酶體抑制劑和細(xì)胞自噬/溶酶體激活劑可以用于治療PTEN缺失的膽管癌腫瘤。
[0008]為了更好地分析膽管癌的預(yù)后風(fēng)險因素，本發(fā)明提供了 PTEN在127例膽管癌石蠟組織切片中的免疫組化評分結(jié)果，用于評估膽管癌預(yù)后不良。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在這127例膽管癌患者的腫瘤組織中有63例樣本(50% )PTEN表達(dá)為陰性，表明PTEN在膽管癌中缺失嚴(yán)重。結(jié)合患者的臨床統(tǒng)計資料，以Kaplan-Meier法比較PTEN陰性/陽性表達(dá)的術(shù)后無瘤生存時間(DFS)和總體生存時間(OS)，均體現(xiàn)出顯著差異，PTEN陽性的患者預(yù)后存活更好。
[0009]本發(fā)明的第一方面，提供了人10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)可以作為肝內(nèi)膽管癌評估預(yù)后的分子標(biāo)記物。
[0010]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了 PTEN在制備膽管癌預(yù)后評估試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0011]所述的試劑為檢測生物樣品中PTEN表達(dá)量的試劑；所述的試劑盒包含檢測生物樣品中PTEN表達(dá)量的試劑。
[0012]所述的檢測生物樣品中PTEN表達(dá)量的試劑，選自:對PTEN具有檢測特異性的探針、基因芯片，或PCR引物等。
[0013]本發(fā)明的第二方面，提供了人10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)在制備治療膽管癌藥物中的應(yīng)用。
[0014]所述的藥物為提高PTEN表達(dá)量的的試劑。
[0015]所述的能夠提高PTEN表達(dá)量的的試劑，選自:PTEN分子、PTEN分子作為活性物質(zhì)的組合物，或含有PTEN分子的載體等。
[0016]所述的PTEN分子為PTEN基因或PTEN蛋白。
[0017]所述的含有PTEN分子的載體，可以是PTEN過表達(dá)的病毒載體，例如PTEN過表達(dá)的腺病毒載體，或PTEN過表達(dá)的慢病毒載體等。
[0018]本發(fā)明提供了一種PTEN過表達(dá)腺病毒載體在制備治療膽管癌藥物中的應(yīng)用；特別是針對PTEN缺失的膽管癌腫瘤。
[0019]所述的PTEN過表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建方法為:使用限制性內(nèi)切酶獲得線性化載體；通過PCR擴(kuò)增獲得PTEN cDNA，通過酶切獲得與表達(dá)載體相同的粘性末端；在連接酶的作用下，將cDNA與線性化的載體相連接，篩選連接成功的質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定。
[0020]本發(fā)明提供了在膽管癌細(xì)胞系中過表達(dá)PTEN后的芯片分析結(jié)果，所篩選出的信號通路可以作為藥物靶點