體腔積液抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供體腔積液抑制劑，其有效對抗施用利尿劑不能獲得治療效果的體腔積液，并且即使當全身施用時其也可以發(fā)揮治療效果。本發(fā)明提供體腔積液抑制劑，其包含干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物作為活性成分。
【專利說明】體腔積液抑制劑

【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及體腔積液抑制劑。

【背景技術】
[0002]動物體內存在大量的水，而主要充滿在組織間或體腔、導管或循環(huán)系統(tǒng)內的空間的細胞外液(例如組織液、體腔液、血液或淋巴液)被稱為“體液”。特別是，存在于體腔中的液體被稱為“體腔液”(例如胸腔積液、腹水或心包積液)。雖然健康人中存在少量的體腔液，已知在患有例如肝臟疾病、腎臟疾病、心臟疾病、癌癥或炎性疾病的患者的體內保持有大量的體腔液。隨著體腔積液的發(fā)展，發(fā)生例如胸部疼痛、腹部疼痛、飽脹感和呼吸困難的癥狀。由于這些癥狀極大地降低患者的生活質量(QOL)，有必要在早期進行除去體腔液的治療。
[0003]雖然體腔積液的主流治療方法是施用利尿劑的藥物治療，在癥狀嚴重的情況將管子插入到體腔中，通過抽吸直接除去體腔液。在臨床研究中，高劑量的干擾素_α或干擾素_β被局部施用到患有例如消化系統(tǒng)癌癥或卵巢癌的患者的體腔中，力圖抑制癌性(或惡性)胸腔積液或腹水的積聚(非專利文獻1-3)。但是，還未獲得可用于臨床應用的抑制體腔積液的效果。
[0004]就被用作病毒介導的肝臟疾病、多發(fā)性硬化或癌癥的治療劑的干擾素而言，已經開發(fā)了干擾素制備物，其通過干擾素和聚乙二醇的共價結合獲得提高的體內可持續(xù)性(專利文獻1-6和非專利文獻4和5)。
[0005]引用文獻列表專利文獻:
專利文獻1:美國專利N0.4，917，888 專利文獻2:國際公開WO 1987/00056 專利文獻3:國際公開WO 1999/55377 專利文獻4:國際公開WO 2000/23114 專利文獻 5:JP Η9-25298 A (1997)
專利文獻 6:JP Patent N0.4，850，514 非專利文獻:
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非專利文獻 5:Bailon 等，B1conjugate Chemistry, (2001) Vol.12, pp.195-202。
[0006]發(fā)明簡述發(fā)明要解決的問題
然而，為治療體腔積液的目的使用利尿劑具有引起被施用該利尿劑的患者電解質失衡，從而引起不舒服感的風險。在該情況下，存在的問題是如果排尿變得困難，則體腔積液加重。此外，在腹膜擴散或腹水的情況下，利尿劑對于體腔積液去除的效果是不夠的，而且其治療效果是有限的。盡管由于穿刺使巨大的負擔被加諸于患者身上，通過直接抽吸去除體腔液僅具有暫時性的效果，而且另外還有個問題是由于白蛋白和球蛋白的喪失，它使營養(yǎng)狀況或免疫狀況惡化。
[0007]還有，在惡性胸腔積液和腹水的情況下，干擾素-β的單次施用(非專利文獻3)、干擾素-α的間歇施用(非專利文獻I)、或干擾素-α的腹腔內(即局部)施用都不會導致以臨床顯著的水平抑制體腔液量。在惡性腹水的情況下，進一步，每周三次局部施用6，000, 000單位的干擾素(這也被應用于其它適應癥)，不產生任何實質的治療效果。進一步，以18，000，000單位的劑量進行每天和局部施用僅導致低至少于50%的反應率(非專利文獻2)。即使當干擾素被連續(xù)地局部施用到體腔中時，相應地，也不可能獲得可用于臨床應用的抑制體腔積液的效果。
[0008]相應地，本發(fā)明的目的是提供體腔積液抑制劑，其對抵抗利尿劑施用的體腔積液具有藥效，并且能夠通過全身施用發(fā)揮治療效果。
[0009]解決問題的方法
本發(fā)明人進行了集中的研究以解決該問題。結果，他們發(fā)現干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物對于體腔積液具有非常好的抑制效果，并完成了本發(fā)明。
[0010]特別地，本發(fā)明提供體腔積液抑制劑，其包含，作為活性成分的，干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物。
[0011]聚亞烷基二醇優(yōu)選為聚乙二醇。
[0012]干擾素優(yōu)選為I型干擾素或干擾素-λ，并且在I型干擾素的各種類型中，干擾素-α或干擾素-β是特別優(yōu)選的。
[0013]體腔積液抑制劑優(yōu)選抑制胸腔積液或腹水的積聚，并且胸腔積液或腹水優(yōu)選是難治性的由于癌癥、肝硬化或腎衰竭而積聚的胸腔積液或腹水。
[0014]特別地，在大部分難治性胸腔積液或腹水的情況中，利尿劑施用的效果是無法預料的，因此認為使用體腔積液抑制劑進行的治療具有顯著的臨床意義。
[0015]體腔積液抑制劑可以被局部施用到體腔中，但優(yōu)選用于全身施用。在該情況下，全身施用更優(yōu)選是選自由皮下施用、皮內施用、肌內施用、靜脈施用和動脈施用組成的組中的一種。
[0016]通過全身施用，可以減少對體腔內的局部施用過程中對內臟器官的不正確穿刺、腔內感染、以及在體腔中存在癌細胞的情況下加速轉移的風險。與腔內施用相比，可以進行全身施用的醫(yī)療設備和衛(wèi)生保健專業(yè)人員的范圍被擴大了。此外，肌內施用或皮下施用可以通過自我注射進行。
[0017]雖然體腔積液抑制劑可以以每天一次或兩次的間隔每天施用，優(yōu)選以每兩天或更多天一次的間隔進行間歇施用，更優(yōu)選以每兩天至一個月一次的間隔進行間歇施用，進一步優(yōu)選以每周一次或兩次至每月一次的間隔進行間歇施用，以及特別優(yōu)選的是以每周一次或兩次的間隔進行間歇施用。
[0018]進一步，體腔積液抑制劑與抗腫瘤劑的組合使用是有效的。在該情況下，抗腫瘤劑優(yōu)選是選自由5-FU、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美拉西-奧特拉西和卡培他濱組成的組的至少一種抗腫瘤劑。
[0019]發(fā)明效果
根據本發(fā)明的體腔積液抑制劑能夠抑制體腔積液并通過全身施用以及通過局部施用除去體腔液。因此，根據本發(fā)明的體腔積液抑制劑可以對體腔積液發(fā)揮治療效果并減輕由于體腔積液導致的胸部疼痛、腹部疼痛、強烈的飽脹感和呼吸困難。
[0020]附圖簡述
圖1顯示了在胃癌腹膜轉移小鼠模型中觀察到的干擾素-β與聚乙二醇的共價綴合物的腹膜內施用用于抑制腹水積聚的效果。
[0021]圖2顯示了在胃癌腹膜轉移小鼠模型中觀察到的干擾素-β與聚乙二醇的共價綴合物的皮下施用用于抑制腹水積聚的效果。
[0022]圖3顯示了在胃癌腹膜轉移小鼠模型中觀察到的干擾素-α與聚乙二醇的共價綴合物的皮下施用用于抑制腹水積聚的效果。
[0023]圖4顯示了在胃癌腹膜轉移小鼠模型中觀察到的干擾素-β與聚乙二醇的共價綴合物的腹腔內施用用于抑制腹水積聚的復發(fā)(即腹水穿刺術后的再積聚)的效果。
[0024]圖5顯示了在胃癌腹膜轉移小鼠模型中觀察到的干擾素-β與聚乙二醇的共價綴合物的皮下施用用于抑制腹水積聚的復發(fā)(即腹水穿刺術后的再積聚)的效果。
[0025]圖6顯示了在卵巢癌腹膜轉移小鼠模型中觀察的干擾素-β與聚乙二醇的共價綴合物的皮下施用用于提高存活率的效果。
[0026]用于實施發(fā)明的實施方案
根據本發(fā)明的體腔積液抑制劑的特征在于它包含，作為活性成分的，干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物。
[0027]—分子、兩分子或更多分子的聚亞烷基二醇可以與一分子的干擾素結合。與一分子干擾素結合的聚亞烷基二醇分子的總分子量優(yōu)選為5，000至240，000，更優(yōu)選為10，000至80，000，且進一步優(yōu)選為39，000至45，000。在本文中，當兩分子聚亞烷基二醇(每個的分子量為20，000)與一分子干擾素共價結合時，這意味著具有40，000分子量的聚亞烷基二醇與一分子干擾素共價結合。
[0028]一分子、兩分子或更多分子的干擾素可以與一分子聚亞烷基二醇結合。即使是在這種情況下，一個聚亞烷基二醇分子的分子量優(yōu)選為5，000至520，000，更優(yōu)選為10，000至200，000,且進一步優(yōu)選為 39，000 至 45，000。
[0029]一個聚亞烷基二醇分子由很多重復單元組成，且聚亞烷基二醇的分子量通常隨單個分子而不同。因此，聚亞烷基二醇的分子量被表示為平均分子量。在本說明書中，相應地，聚亞烷基二醇的分子量是指平均分子量。
[0030]作為聚亞烷基二醇，可優(yōu)選使用可被接受作為藥物載體的，無活性的或對于活體具有極低活性的以及無毒性的或者具有極低毒性的聚合物。
[0031]干擾素的實例包括與天然存在的干擾素具有相同氨基酸序列的蛋白質(以下稱“天然存在的干擾素”)，具有來源于天然存在的干擾素的氨基酸序列并通過缺失、取代或添加一個或幾個氨基酸獲得的氨基酸序列并具有干擾素的生物學活性(以下稱“干擾素活性”)的氨基酸突變干擾素，具有由天然存在的干擾素修飾的糖鏈部分的干擾素，以及沒有糖鏈部分的干擾素。
[0032]干擾素的實例還包括通過在天然存在的干擾素的氨基酸序列或核苷酸序列的基礎上通過基因工程方法制備的重組干擾素。
[0033]干擾素可以通過傳統(tǒng)技術例如從組織中提取，通過基因工程方法進行蛋白質合成，或者用表達干擾素的天然或重組細胞進行生物學生產獲得?？缮虡I(yè)獲得的干擾素也可以被用作干擾素。
[0034]干擾素優(yōu)選是I型干擾素或干擾素-λ。I型干擾素的實例包括干擾素-α、干擾素-β、干擾素-ω、干擾素-ε和干擾素-K，并且干擾素-α或干擾素-β是更優(yōu)選的。
[0035]術語“干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物”指一分子、或兩分子或更多分子的聚亞烷基二醇與一分子干擾素共價結合并具有干擾素活性的綴合物，或者一分子、或兩分子或更多分子的干擾素與一分子聚亞烷基二醇共價結合并具有干擾素活性的綴合物。一分子、或兩分子或更多分子聚亞烷基二醇與一分子干擾素共價結合并具有干擾素活性的綴合物是優(yōu)選的。干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物可以是干擾素與聚亞烷基二醇直接結合的綴合物，或者干擾素與聚亞烷基二醇通過接頭等結合的綴合物。
[0036]干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物的劑量可以用干擾素滴度(單位；以下顯示為“U”)或質量(g)表示。相比與聚亞烷基二醇共價結合之前的干擾素，干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物優(yōu)選保留至少10%的干擾素比活性(即單位重量的干擾素活性)。
[0037]在本說明書中，聚合物與蛋白質的結合也被稱為化學修飾或者用聚合物對蛋白質的修飾。干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物也被稱為用聚亞烷基二醇化學修飾的干擾素或者簡單稱為修飾的干擾素。特別地，干擾素與聚乙二醇(以下簡稱為“PEG”)的共價綴合物也被稱為PEG-修飾的干擾素，聚乙二醇化干擾素或PEG-結合的干擾素。
[0038]干擾素在例如干擾素的氨基、硫醇基、N-末端、C-末端或糖鏈上與聚亞烷基二醇共價結合?；蛘撸ㄟ^已知的基因工程技術被引入到干擾素中的非天然存在的氨基酸可以被用作共價結合的位點。
[0039]干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物的干擾素活性可以通過已知的生物學測定技術測定。特別地，為確定干擾素活性，可以用包含干擾素的分析物處理對干擾素高度敏感的細胞(例如FL細胞)，可以向被處理的細胞加入給定量的感染性辛德畢斯病毒{Sindbisvirus)、水皰性口炎病毒{Vesicular stomatitis virus,縮寫為“VSV”)等以感染細胞，并可以測定由干擾素誘導的對病毒的抗性程度(以下稱為“抗病毒活性”)。使用病毒生長的抑制作為指標測定抗病毒活性，且它可以表示為干擾素滴度(U)，所述干擾素滴度基于抑制50%的病毒生長導致的破壞細胞的細胞病變作用(縮寫為“CPE”)的分析物的稀釋倍數(Shigeyasu Kobayashi 等，uMenneki Seikagaku Jikkenhou in Zoku Seikagaku JikkenKoza 5 (Successive Course on B1chemical Experiment 5: Experimental Approachesin Immunob1chemistry)), Japanese B1chemical Soc.ed., Tokyo Kagaku Dojin,(1986) p.245)。
[0040]干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物可以通過已知的技術產生。例如，在美國專利N0.4，917，888和國際公布的WO 1987/00056中描述了聚亞烷基二醇與干擾素的氨基共價結合的方法。在國際公布的WO 1999/55377中描述了聚亞烷基二醇與干擾素的硫醇基共價結合的方法。在國際公布的WO 2000/23114和JP H09-25298 A (1997)中描述了聚合物與干擾素的N末端共價結合的方法。在Macromolecular Chemistry (1978) Vol.179,p.301和美國專利N0.4，101，380和4，179，337中描述了聚亞烷基二醇與干擾素的糖鏈共價結合的方法。在 B10rganic & Medicinal Chemistry Letters (2004) Vol.14, pp.5743-5745中描述了聚亞烷基二醇與被引入到干擾素中的非天然存在的氨基酸共價結合的方法。聚亞烷基二醇與干擾素C末端的共價結合可以通過將半胱氨酸或非天然存在的氨基酸引入到C末端或其附近來實現。
[0041]有必要使聚亞烷基二醇的末端活化以發(fā)生共價結合反應，該反應依賴于在干擾素和聚亞烷基二醇之間成鍵的方法。包含用羥基琥珀酰亞胺酯、硝基苯磺酸酯、馬來酰亞胺、正吡啶基二硫化物、乙烯砜、馬來酰亞胺、碘乙酰胺、羧酸、疊氮化物、膦或胺結構活化的末端的聚亞烷基二醇衍生物可以用于干擾素與聚亞烷基二醇的共價結合，并且這種聚亞烷基二醇衍生物可以用已知技術合成。
[0042]干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物優(yōu)選是干擾素與PEG的共價綴合物。在優(yōu)選的干擾素與PEG的共價綴合物中，分子量為5，000至240，000，優(yōu)選10，000至80，000，且更優(yōu)選39，000至45，000的一個PEG分子與一個干擾素分子共價結合。
[0043]干擾素與PEG的共價綴合物的優(yōu)選實例是人干擾素-β與PEG的共價綴合物，其可以通過例如日本專利N0.4，850，514中描述的方法制備。PEG優(yōu)選在人干擾素-β的氨基酸序列的位置19或134的賴氨酸的氨基上與人干擾素-β結合，而且一個PEG分子在該位點上與人干擾素-β共價結合的共價綴合物是更優(yōu)選的。一個特定的實例是分子量為40，000或更高(優(yōu)選42，000)的一個PEG分子與人干擾素-β在其氨基酸序列的位置134的賴氨酸的氨基上共價結合的共價綴合物。
[0044]本文中所使用的術語“人干擾素-β的氨基酸序列的位置134的賴氨酸”指位于從人干擾素-β的氨基酸序列的N末端氨基酸(甲硫氨酸；指定為位置I)起的位置134的氨基酸賴氨酸，所述人干擾素-β由166個氨基酸組成(SEQ ID NO:1)。在本文中，干擾素中氨基酸殘基的位置表示為相對于被指定為位置I的干擾素N末端氨基酸的位置編號。
[0045]干擾素與PEG的共價綴合物的另一個優(yōu)選實例是人干擾素-α與PEG的共價綴合物。特定的實例包括干擾素- α與PEG的共價綴合物，其中分子量為大約40，000的一個分枝型PEG分子與人干擾素-a-2a在一個賴氨酸殘基(主要位點:位置31，121, 131和134)上通過酰胺鍵共價結合的共價綴合物(通用名:聚乙二醇干擾素a-2a);以及干擾素- α與PEG的共價綴合物，其中分子量為大約12，000的一個甲氧基-PEG分子與人干擾素a -2b在一個氨基酸殘基(位置I上的半胱氨酸，位置7上的組氨酸，位置31上的賴氨酸，位置34上的組氨酸，位置49上的賴氨酸，位置83上的賴氨酸，位置112上的賴氨酸，位置121上的賴氨酸，位置129上的酪氨酸，位置131上的賴氨酸，位置133上的賴氨酸，位置134上的賴氨酸，位置163上的絲氨酸或位置164上的賴氨酸)上通過羰基共價結合的共價綴合物(通用名:聚乙二醇干擾素a_2b)。
[0046]術語“體腔”指動物體中相對其外部以隔離狀態(tài)形成的空間，其包括胸腔、腹腔和心包腔。術語“體腔液”指存在于體腔中的液體，存在于胸腔、腹腔或心包腔中的液體分別被稱為胸腔積液、腹水或心包積液。
[0047]術語“體腔積液”指在體腔中存在大于正常量的體腔液。術語“體腔積液抑制劑”指具有抑制體腔液積聚并除去體腔液的效果的藥物。
[0048]體腔積液抑制劑對于體腔積液的的體腔積液抑制效果可以使用引起體腔積液的基礎疾病(例如癌癥)的疾病模型來檢測。這種疾病模型的實例包括胃癌腹膜轉移小鼠模型(Cancer Science, (2003) Vol.94，pp.112-118)和卵巢癌腹膜轉移小鼠模型(Molecular cancer therapeutics, (2007) Vol.6, pp.2959-2966)。
[0049]體腔積液抑制劑可用于預防或治療體腔液的積聚，而且它還可以用于抑制體腔積液物理清除之后的其復發(fā)。體腔積液抑制劑優(yōu)選可用于對抗胸腔積液和腹水的積聚。
[0050]引起體腔積液的基礎疾病的實例包括癌癥、傳染病(例如細菌、結核、真菌、非典型性肺炎、病毒或寄生蟲感染)、炎性疾病(例如胰腺炎、結節(jié)病或石棉肺)、結締組織疾病(例如風濕病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、韋格納氏肉芽腫病或Churg-Strauss綜合征)、內分泌性疾病(例如粘液性水腫)、肝臟疾病(例如肝硬化)、腎臟疾病(例如腎病綜合征)和心臟疾病(例如充血性心力衰竭)。體腔積液抑制劑可以對由這些疾病引起的體腔積液發(fā)揮治療效果。
[0051]此外，體腔積液抑制劑對于難治性體腔積液也可以發(fā)揮治療效果，它特別優(yōu)選用于對抗難治性胸腔積液和腹水的積聚。術語“難治性體腔積液”指通過例如利尿劑的治療難以控制的體腔積液(即利尿劑-抵抗的或利尿劑-耐受的)，包括例如由癌癥、肝硬化或腎衰竭引起的胸腔積液和腹水的積聚。
[0052]在難治性胸腔積液或腹水中，特別地，由于癌癥引起的胸腔積液和腹水分別被稱為癌性(惡性)胸腔積液和癌性(惡性)腹水，而且已知它們的癥狀是嚴重的。但是體腔積液抑制劑對于惡性胸腔積液或惡性腹水的積聚也具有治療效果。惡性胸腔積液或惡性腹水是由于癌癥的胸內轉移或腹膜轉移或癌癥引起的胸膜炎或腹膜炎導致的。
[0053]體腔積液抑制劑特別優(yōu)選用于治療或預防難治性胸腔積液或難治性腹水中的惡性胸腔積液或惡性腹水。
[0054]為了補充或增強抑制體腔積液的效果或減少劑量，體腔積液抑制劑可以以足夠的量與其它試劑混合使用，或者與其它試劑組合使用。
[0055]可以與體腔積液抑制劑組合使用的藥物的實例包括那些通常用于治療引起體腔積液的基礎疾病的藥物。當要抑制癌性體腔積液時，例如，抑制劑可以與抗腫瘤劑組合使用。優(yōu)選的組合使用的抗腫瘤劑的實例包括分子靶向試劑、烷化劑、抗代謝物、微管抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、鉬藥物和抗癌抗生素。抗腫瘤試劑的更優(yōu)選的實例特別是順鉬、卡鉬、鹽酸伊立替康、5-FU、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美拉西-奧特拉西、卡培他濱、紫杉醇、泰索帝、伊馬替尼和舒尼替尼。替加氟-吉美拉西-奧特拉西鉀(商品名:TS-D是特別優(yōu)選的替加氟-吉美拉西-奧特拉西的形式。與抗腫瘤試劑組合使用的體腔積液抑制劑可以與抗腫瘤劑同時施用。為了增強抑制腹水的效果，可替代地，抑制劑還可以與抗腫瘤劑分別施用，在抗腫瘤劑治療之前或之后施用。
[0056]根據本發(fā)明的體腔積液抑制劑可以與抗腫瘤劑以混合制備物的形式施用到單一部位?；蛘?，這些試劑可以分別施用到相同的部位或不同的部位。
[0057]根據受試者的年齡、體重和癥狀，劑型，施用途徑等充分地確定體腔積液抑制劑施用的劑量(滴度)和頻率。試劑可以以10，000 U-18, 000, 000 U/劑量的劑量以每天一次或兩次的間隔每天施用給人受試者。間歇施用優(yōu)選以每兩天或更多天一次的間隔，更優(yōu)選以每兩天至一個月一次的間隔，更優(yōu)選以每周一次或兩次至每月一次的間隔，以及特別優(yōu)選以每周一次或兩次的間隔進行。
[0058]體腔積液抑制劑可用作用于針對哺乳動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、狗、猴、牛、羊或人)的體腔積液的治療和預防的藥物。
[0059]在臨床環(huán)境中，干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物可以直接使用，或者它可以與已知的藥學可接受的載體、賦形劑等混合，以藥物組合物的形式使用。
[0060]體腔積液抑制劑可以全身地或局部地施用。在本文中，局部施用指在希望產生直接效果的部位；即體腔液將要積聚或已經積聚的部位施用。例如，針對腹水積聚的體腔積液抑制劑的腹腔內施用屬于局部施用的類別。全身施用指施用的方式允許藥物通過消化系統(tǒng)或者除消化系統(tǒng)以外的途徑吸收，并提供遍及全身的(非局部的)效果，在希望產生直接效果的部位以外的部位；即體腔液將要積聚或已經積聚的部位以外的部位。全身施用的實例包括口服施用、腹腔內施用(不包括腹水積聚的情況)、皮下施用、皮內施用、肌內施用、靜脈施用和動脈施用。應當注意針對腹水積聚的體腔積液抑制劑的腹腔內施用對應局部施用。優(yōu)選體腔積液抑制劑被全身施用，且更優(yōu)選該抑制劑被皮下、皮內、肌內、靜脈或動脈施用。
[0061]體腔積液抑制劑的優(yōu)選實例包括包含作為活性成分的干擾素與PEG的共價綴合物的，并且其使用是以兩天或更多天的間隔進行全身施用和間歇施用的體腔積液抑制劑。在更優(yōu)選的實例中，體腔積液抑制劑包含，作為活性成分的，干擾素-α或干擾素與PEG的共價綴合物，并且其使用是以兩天或更多天的間隔進行全身施用和間歇施用。在更優(yōu)選的實例中，體腔積液抑制劑包含，作為活性成分的，干擾素-α或干擾素與PEG的共價綴合物，并且其使用是以兩天或更多天的間隔進行皮下施用和間歇施用。在特別優(yōu)選的實例中，體腔積液抑制劑包含，作為活性成分的，干擾素-α或干擾素與PEG的共價綴合物，并且其使用是以每周一次或兩次的間隔進行皮下施用，而且用于抑制難治性胸腔積液或腹水的積聚。
[0062]用于口服施用的體腔積液抑制劑的劑型的實例包括片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑和混懸劑。劑型可以根據已知技術生產，并包含藥物領域通常使用的載體或賦形劑。用于片劑的載體和賦形劑的實例包括乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和硬脂酸鎂。
[0063]用于腸胃外施用的體腔積液抑制劑的劑型的實例包括注射制劑、滴眼劑、軟膏劑、泥敷劑、栓劑、經鼻吸收劑、經肺吸收劑、經皮吸收劑和控釋局部試劑，它們可以根據已知技術生產。液體制劑可以通過，例如，將干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物溶解于用于注射制劑的無菌水溶液中，或者將該綴合物懸浮于提取液中并乳化以使該綴合物鑲嵌到脂質體中來制備。固體制劑可以通過例如將賦形劑如甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖或葡萄糖加入到干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物中并制備凍干產物來制備。進一步，該凍干產物可以被制成粉末并使用?；蛘?，粉末可以與聚乳酸或乙醇酸混合，且得到的混合物可以被固化并使用。凝膠劑可以通過將干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物溶解于增稠劑或多糖，例如甘油、PEG、甲基纖維素、羧甲基纖維素、透明質酸或硫酸軟骨素中來制備。
[0064]穩(wěn)定劑，例如人血清白蛋白、人免疫球蛋白、α 2巨球蛋白或氨基酸可以被添加到任何上述制劑中，并且可以添加分散劑或吸收促進劑，例如乙醇、糖醇、離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑，條件是干擾素活性不被破壞。視情況還可以添加痕量的金屬或有機酸鹽。
實施例
[0065]本發(fā)明結合下述實施例進行更詳細描述，雖然本發(fā)明的技術范圍并不局限于這些實施例。
[0066][實施例1]干擾素與PEG的共價綴合物的制備
根據日本專利N0.4，850，514的實施例6中描述的方法，制備“干擾素-β與PEG的共價綴合物”，其中分子量為42，000的一個PEG分子與重組人干擾素-β (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的位置134的賴氨酸的氨基共價結合。特別地，乙二醇(終濃度:20%)被加入到溶解于100 mM含有0.5 M氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH 5.0)的重組人干擾素-β (終濃度:200 yg/ml)中，并用I M磷酸氫二鈉溶液調節(jié)pH為7.6。羥基琥珀酰亞胺酯活化的PEG(分子量:42，000 ;產品編號61G99122B01 ；N0F Corporat1n)被加入到其中并混合，在4°C進行結合反應過夜。向該結合反應溶液中加入大于其體積5倍的量的10 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)，生成物被應用于用10 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)平衡的陽離子交換柱(ToyoPearl CM 650 (S) ; Tosoh Corporat1n)。用下述的展開劑對蛋白進行洗脫并分級。
[0067]<展開劑>
溶劑A: 10 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)
溶劑B:含有I M氯化鈉的10 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)
當允許溶劑A和溶劑B的混合物以柱樹脂量的40倍量通過陽離子交換柱時，用于液體遞送的溶劑B的比例從0%連續(xù)增加到65%以進行洗脫。洗脫的級分被應用于SP-5PW柱(Tosoh Corporat1n)并分離“干擾素-β與PEG的共價綴合物”(以下稱為“PEG-1FN-β ”)，其中分子量為42，000的一個PEG分子與重組人干擾素-β (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的位置134的賴氨酸的氨基共價結合。
[0068]用與PEG-1FN-β的制備方法同樣的方式，制備“小鼠干擾素-β與PEG的共價綴合物”(以下稱為“PEG-mIFN-β ”)，其中分子量為42，000的一個PEG分子與重組小鼠干擾素-β共價結合。
[0069]根據Nucleic Acid Research, 1980, Vol.8, pp.4057-4074 中描述的方法制備重組人干擾素-β，并根據 Journal of Interferon Research, 1986, Vol.6, pp.519-526中描述的方法制備重組小鼠干擾素-β。
[0070][實施例2]PEG-1FN-β通過局部施用抑制腹水積聚的效果
產生胃癌腹膜轉移小鼠模型，并根據Nakanishi等(Cancer Science, 2003, Vol.94，pp.112-118)的方法評價PEG-1FN-β通過局部施用抑制腹水積聚的效果。
[0071]在37°C和5% CO2的培養(yǎng)箱中用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并維持通過將 pEGFP-Cl 質粒(Clontech)引入到得自 Cell Bank, RIKEN B1Resource Center 的GCIY人胃癌細胞(N0.RCB0555)中制備獲得的GCIY-EGFP細胞。用胰蛋白酶/EDTA收集GCIY-EGFP細胞并用Hank’ s平衡鹽溶液(HBSS)洗滌以制備GCIY-EGFP細胞懸液。GCIY-EGFP細胞懸液(2.5 X 16個細胞/小鼠)腹膜內移植到雄性KSN裸鼠(得自ShizuokaLaboratory Animal Center),并在第二天根據 Ohashi 等(Internat1nal Journal ofOncology, (2005) Vol.27，pp.637-644)的方法確認 GCIY-EGFP 細胞是否被植入。確認植入GCIY-EGFP細胞的小鼠用作胃癌腹膜轉移小鼠模型進行實驗。
[0072]天然存在的人干擾素_β (Feron?; Toray Industries, Inc.)或實施例1中制備的PEG-1FN-β以5，000, 000 U/小鼠/劑量的量腹膜內(即局部地)施用給胃癌腹膜轉移小鼠模型(η = 8)。在移植的第二天開始施用，并每周一次，進行4周。最后一次施用之后一周在麻醉條件下從胃癌腹膜轉移小鼠模型收集腹水，并測量液體體積。
[0073]結果顯示于圖1?？v軸代表腹水的量(中值；mL)。在橫軸上，“IFN-β ”代表天然存在的人干擾素-β局部施用組的結果，且“PEG-1FN-β ”代表PEG-1FN-β局部施用組的結果。
[0074]結果是，在天然存在的人干擾素局部施用組中，由胃癌細胞腹膜轉移引起的腹水的積聚未被抑制，而在PEG-1FN-β局部施用組中，腹水的積聚被抑制至正常水平。這證明未修飾的干擾素-β每周一次間歇施用未顯示出抑制腹水積聚的效果，即使是當其以5，000, 000 U/小鼠/劑量的高劑量被局部施用至胃癌細胞轉移到的腹腔中時，而干擾素-β與PEG的共價綴合物進行同樣的間歇施用日程安排時顯示出顯著的抑制腹水積聚的效果。
[0075]結果表明干擾素_β與聚亞烷基二醇的共價綴合物具有抑制腹水積聚的效果，并且能夠通過局部施用顯著抑制體腔積液。
[0076][實施例3]PEG-1FN-β通過全身施用抑制腹水積聚的效果
用與實施例2相同的方式，通過將人胃癌細胞，GCIY-EGFP細胞，腹膜內移植到雄性KSN裸鼠產生胃癌腹膜轉移小鼠模型。
[0077]天然存在的人干擾素_β (Feron?; Toray Industries, Inc.),或實施例1中制備的PEG-1FN-β或PEG-mIFN-β以5，000 U/小鼠/劑量的量皮下施用到胃癌腹膜轉移小鼠模型(η = 6)的背部區(qū)域(即通過全身施用)。在移植的第二天開始施用，每周兩次，進行4周。磷酸鹽緩沖液(PBS)以同樣的方式施用給對照組。最后一次施用之后2周在麻醉條件下從胃癌腹膜轉移小鼠模型收集腹水，并測量液體體積。
[0078]結果顯示于圖2?？v軸代表腹水的量(中值;mL)。在橫軸上，“對照(PBS) ”代表磷酸鹽緩沖液(PBS)全身施用組(對照組)的結果，“IFN-β ”代表天然存在的人干擾素-β全身施用組的結果，“PEG-1FN-β ”代表PEG-1FN-β全身施用組的結果，“PEG-mlFN-β ”代表PEG-mIFN-β全身施用組的結果。
[0079]結果是，在天然存在的人干擾素全身施用組中，發(fā)現腹水的量比磷酸鹽緩沖液(PBS)全身施用組中的多，因此在前者組中，由胃癌細胞腹膜轉移引起的腹水的積聚未被抑制，而在PEG-1FN-β全身施用組和PEG-mIFN-β全身施用組中，腹水積聚均被顯著抑制。這證明未修飾的干擾素_β通過全身施用未顯示出任何抑制腹水積聚的效果，而干擾素-β與PEG的共價綴合物通過全身施用顯示出顯著的抑制腹水積聚的效果。
[0080]該結果表明干擾素_β與聚亞烷基二醇的共價綴合物能夠顯著抑制體腔積液，甚至是當其以臨床劑量以間歇性日程安排進行全身施用時。
[0081][實施例4]干擾素-α與PEG的共價綴合物通過全身施用抑制腹水積聚的效果用與實施例2相同的方式，通過將人胃癌細胞，GCIY-EGFP細胞，腹膜內移植到雄性KSN
裸鼠產生胃癌腹膜轉移小鼠模型。
[0082]TS-1? Capsule (以下簡稱為 “TS-1 ”)(Taiho Pharmaceutical C0., LTD.)以0.5 mg替加氟/小鼠/天的劑量口服施用給胃癌腹膜轉移小鼠模型。在移植的第二天開始施用，每天進行，共4周。
[0083]同時，聚乙二醇干擾素-a _2a (干擾素-α與PEG的共價綴合物，其中分子量為大約40，000的一個分支PEG分子與重組人干擾素-a -2a的一個賴氨酸殘基位點通過酰胺鍵共價結合)(Pegasys? 用于皮下注射，Chugai Pharmaceutical C0.Ltd.)以 5，000 U/小鼠/劑量的量被皮下施用到胃癌腹膜轉移小鼠模型(η = 6)的背部區(qū)域(即通過全身施用)。在移植的第二天開始施用，每周兩次，進行4周。作為對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)被皮下施用(即全身地)到胃癌腹膜轉移小鼠模型，每周兩次，進行4周，從移植的第二天開始。
[0084]最后一次施用之后2周在麻醉條件下從胃癌腹膜轉移小鼠模型收集腹水，并測量液體體積。
[0085]結果顯示于圖3?？v軸代表腹水的量(中值；mL)。在橫軸上，“TS-1+PBS”代表TS-1和磷酸鹽緩沖液(PBS)組合施用組(即TS-1+PBS組)的結果，且“TS-l+PEG-1FN-α 2a”代表TS-1和聚乙二醇干擾素-a -2a組合施用組(即TS_1+ PEG-1FN- a 2a組)的結果。
[0086]結果是，在TS-1+PBS組中，由胃癌細胞的腹膜轉移引起的腹水的積聚被抑制，且在TS-l+PEG-1FN-a2a組中，腹水的積聚以更顯著的程度被抑制。這證明抗腫瘤劑通過作用于已經轉移到腹腔的胃癌細胞發(fā)揮對腹水積聚的抑制效果，且TS-1和干擾素-α與PEG的共價綴合物組合并同時施用具有顯著的抑制腹水積聚的效果。
[0087]該結果表明干擾素-α與聚亞烷基二醇的共價綴合物能夠顯著抑制體腔積液，甚至是當其以間歇性日程安排進行全身施用時，且該綴合物與抗腫瘤劑組合并同時施用具有更顯著程度的抑制腹水積聚的效果。
[0088][實施例5]PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β通過局部施用獲得的抑制腹水再積聚的效果
使用人胃癌細胞，GCIY細胞(RIKEN)，產生胃癌腹膜轉移小鼠模型。在37°C和5% CO2的培養(yǎng)箱中用含有15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并維持GCIY細胞。
[0089]與實施例2中以相同方式制備的GCIY細胞懸液(I x 17個細胞/小鼠)腹膜內移植到雄性KSN裸鼠以產生胃癌腹膜轉移小鼠模型。GCIY細胞懸液移植后5周從單個小鼠收集腹水(“初次腹水穿刺術”)。通過在麻醉條件下用有翼的靜脈針(18-規(guī)格)穿刺到腹腔中進行腹水穿刺術，并通過該針收集腹水。
[0090]將實施例1中制備的PEG-1FN- β和PEG_mIFN- β混合在一起，得到的混合物(以下稱“PEG-1FN-β s”)進行腹腔內施用(局部)，其劑量使得PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β每種以10，000 U/小鼠/劑量的量施用，且在初次腹水穿刺術的當天開始施用。以每隔一天的間隔進行施用，其等同于對人進行每周一次的施用，施用總共進行三次(η = 4)。在對照組中，用相同體積的含有150 mM氯化鈉的20 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)代替PEG-1FN-β s，以同樣的方式施用(η = 5)。
[0091]在最后一次施用的第二天，在麻醉條件下通過腹水穿刺術從PEG-1FN- β s組和對照組的單個小鼠收集初次腹水穿刺術之后再積聚的腹水，并測量液體重量(第二次腹水穿刺術)。被收集腹水的單個小鼠在麻醉條件下進行剖腹手術，用鉗子和剪刀移除已轉移到腹腔的腫瘤物質，并測量腫瘤重量。
[0092]在兩組，即對照組和PEG-1FN_i3s組之間進行統(tǒng)計學分析，在方差齊性檢驗(F-檢驗)的基礎上選擇和進行Student’s t_檢驗或Welch檢驗。根據統(tǒng)計學分析，當P值小于0.05時，確定結果有統(tǒng)計學意義。
[0093]結果顯示于圖4。圖4A的縱軸代表第二次腹水穿刺術獲得的腹水的重量(η =4-5 ;平均值土SE)，且圖4Β的縱軸代表腫瘤重量(η = 4-5 ;平均值土SE)、在橫軸上，“對照”代表含有150 mM氯化鈉的20 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)局部施用組(對照組)，且“PEG-1FN-Ps”代表PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β混合物局部施用組。圖中的星號表示PEG-1FN-β局部施用組的數據與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。
[0094]結果是，在PEG-1FN- β s局部施用組和對照組之間沒有觀察到轉移到腹腔的腫瘤重量有顯著差別(圖4B)，但在PEG-1FN-β s局部施用組中，與對照組相比，由腹膜轉移引起的腹水的再積聚被顯著抑制(圖4A)。這表明干擾素-β與PEG的共價綴合物通過抑制腹水積聚的復發(fā)，也具有治療效果，即使當其在胃癌細胞腹膜轉移引起腹水積聚的晚期被局部施用時。
[0095]已知干擾素具有抑制癌細胞生長的效果(以下稱“抗腫瘤效果”)。但是，在未觀察到其有足夠的抗腫瘤效果的情況下，觀察到通過PEG-1FN-β s施用抑制腹水再積聚的效果。這強烈表明抑制腹水再積聚的效果并不是由于干擾素抗腫瘤效果的副效應，而是獨立于抗腫瘤效果的。
[0096]該結果表明在除去體腔液之后，干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物，通過局部施用，顯示出抑制體腔液再積聚的效果，而且這種效果獨立于抗腫瘤效果。
[0097][實施例6]PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β通過全身施用抑制腹水再積聚和提高生存率的效果檢查干擾素-β與PEG的共價綴合物通過全身施用對惡性腹水積聚和生存率的治療效果O
[0098]根據Huynh 等(Molecular cancer therapeutics, (2007) Vol.6, pp.2959-2966)的方法，產生卵巢癌腹膜轉移小鼠模型，并以此評價PEG-1FN-β通過全身施用抑制腹水再積聚的效果。
[0099]在37°C和5% CO2的培養(yǎng)箱中用含有15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并維持人卵巢癌細胞0V-90 (CRL-11732 ;美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollect1n))。用胰蛋白酶/EDTA收集0V-90細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以制備0V-90細胞懸液。得到的0V-90細胞懸液(5 X 16個細胞/小鼠)腹膜內移植到雌性SCID小鼠(C.B.-17/lcr-scid/scid-jcl; CLEA Japan Inc.)。
[0100]細胞懸液移植后46天從單個小鼠收集腹水(初次腹水穿刺術)。通過在清醒狀態(tài)下用有翼的靜脈針(18-規(guī)格)穿刺到腹腔中進行腹水穿刺術，并通過該針收集腹水。測量腹水重量(g)，且觀察到腹水為0.1 g或更多的單個小鼠被用于進行下述實驗。
[0101]將實施例1中制備的PEG-1FN- β和PEG_mIFN- β混合在一起，得到的混合物(以下稱“PEG-1FN- β s”)進行皮下施用(全身性)，其劑量使得PEG-1FN- β和PEG-mlFN- β每種以50，000 U/小鼠/劑量的量施用，并在初次腹水穿刺術的當天開始施用。以每隔一天的間隔進行施用，其等同于對人進行每周一次的施用(η = 6)。在對照組中，用相同體積的含有150 mM氯化鈉的20 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)代替PEG-1FN-β s，以同樣的方式施用(η = 7)。
[0102]在第三次施用結束的第二天(即初次施用后5天)，在清醒狀態(tài)下通過腹水穿刺術從PEG-1FN-β s組和對照組的單個小鼠收集初次腹水穿刺術之后再積聚的腹水，并測量液體重量(第二次腹水穿刺術)。
[0103]第二次腹水穿刺術之后，進行后續(xù)施用，每隔一天皮下施用(即全身地)三次，且共施用六次。從開始施用當天開始至之后的12天檢查每組的存活率。
[0104]結果顯示于圖5和圖6。圖5的縱軸代表第二次腹水穿刺術獲得的腹水的重量(η=6-7 ;平均值土SE)，圖6的縱軸代表存活率，并且橫軸代表開始施用當天(第O天)之后經過的天數。圖5和圖6中橫軸上的“對照”代表含有150 mM氯化鈉的20 mM乙酸鹽緩沖液(pH 4.5)皮下施用組(對照組)，且“PEG-1FN-β s”代表PEG-1FN-β和PEGiIFN-β混合物皮下施用組。
[0105]結果是，在PEG-1FN-β s全身施用組中，腹膜轉移導致的腹水再積聚被抑制。這表明當干擾素-β與PEG的共價綴合物在卵巢癌細胞腹膜轉移引起腹水積聚的晚期全身施用時，抑制腹水積聚的復發(fā)。
[0106]PEG-1FN-β s全身施用組中所有的小鼠存活到開始施用后12天。但在對照組中，在開始施用后8天首次觀察到小鼠死亡，并且開始施用后12天存活率小于50%。這表明當干擾素-β與PEG的共價綴合物在由于卵巢癌細胞腹膜轉移引起腹水積聚的晚期全身施用時，抑制全身狀況的惡化并提高存活率。
[0107]這些結果表明干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物，甚至是通過全身施用時，顯示出抑制體腔液去除后的體腔液再積聚的效果。它們還表明當該共價綴合物在具有體腔積液的癌癥晚期全身施用時，抑制全身狀況的惡化并提高存活率。
[0108]上述實施例證明干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物(優(yōu)選干擾素-α或干擾素-β與PEG的共價綴合物)能夠抑制難治性腹水積聚，而這用干擾素-α或干擾素無法實現。更特別地，其表明干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物(優(yōu)選干擾素-α或干擾素-β與PEG的共價綴合物)通過全身施用例如皮下施用或以每兩天至更多天一次的間隔進行施用的間歇日程安排進行局部施用，具有抑制惡性腹水積聚的效果。進一步，其表明所述抑制效果不是抗腫瘤效果的副效應，而且這種效果的發(fā)揮與癌癥類型無關。其還表明，與每天干擾素施用的傳統(tǒng)治療相比，將干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物以間歇日程安排進行施用的治療對于惡性腹水顯示出增強的治療效果。
[0109]工業(yè)實用性
本發(fā)明可在藥物領域中用作體腔積液的抑制劑。
[0110]序列表
SEQ ID NO:1:人干擾素-β的氨基酸序列。
【權利要求】
1.體腔積液抑制劑，其包含，作為活性成分的，干擾素與聚亞烷基二醇的共價綴合物。
2.根據權利要求1的體腔積液抑制劑，其中所述聚亞烷基二醇是聚乙二醇。
3.根據權利要求1或2的體腔積液抑制劑，其中所述干擾素是I型干擾素或干擾素-λ。
4.根據權利要求3的體腔積液抑制劑，其中所述I型干擾素是干擾素-α或干擾素_β。
5.根據權利要求1-4任一項的體腔積液抑制劑，其抑制胸腔積液或腹水的積聚。
6.根據權利要求5的體腔積液抑制劑，其中所述胸腔積液或腹水是由于癌癥、肝硬化或腎衰竭積聚的難治性胸腔積液或腹水。
7.根據權利要求1-6任一項的體腔積液抑制劑，其用于全身施用。
8.根據權利要求7的體腔積液抑制劑，其中所述全身施用選自皮下施用、皮內施用、肌內施用、靜脈施用和動脈施用。
9.根據權利要求1-8任一項的體腔積液抑制劑，其與抗腫瘤劑組合使用。
10.根據權利要求9的體腔積液抑制劑，其中所述抗腫瘤劑是選自5-FU、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美拉西-奧特拉西和卡培他濱的至少一種抗腫瘤劑。
【文檔編號】A61P43/00GK104136038SQ201380011413
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權日:2012年2月29日
【發(fā)明者】成見英樹, 池原早苗 申請人:東麗株式會社