一種帕金森的診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體涉及一種帕金森的診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用,更具體 的涉及FAM102A在制備帕金森診療試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森?。≒arkinson's disease,PD)是一種慢性進(jìn)展性疾病,目前無法治愈,它 于1817年被英國(guó)人Parkinson首先描述,隨著對(duì)的研究進(jìn)展,我們對(duì)這個(gè)疾病也有了更 深的了解,它在臨床上表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)性癥狀如靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙 及非運(yùn)動(dòng)性癥狀如便秘、睡眠障礙、精神行為異常等。目前ro的發(fā)病機(jī)制還不清楚,可能與 遺傳因素、線粒體功能缺陷、氧化應(yīng)激、免疫異常、細(xì)胞凋亡、環(huán)境因素等有關(guān)。在ro中,約 10%的患者為家族型ro患者,具有明顯的遺傳特性,剩下的90%為散發(fā)性ro患者。現(xiàn)在許 多研究認(rèn)為,ro是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,而對(duì)ro致病基因的研究是目前對(duì) ro發(fā)病機(jī)制研究的一大熱點(diǎn)。迄今為止,己經(jīng)發(fā)現(xiàn)與遺傳性ro相關(guān)的基因有SNCA,LRRK2, DJ-1,PINK-1,Parkin等,這些致病基因還需進(jìn)一步研究,且遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需求。對(duì) 于ro患者,提前發(fā)現(xiàn)提前制定有針對(duì)性的個(gè)性化治療方案及最適合患者的療法,從而改善 左旋多巴類藥物的治療狀況和最大限度提高患者的生存質(zhì)量,減輕患者的痛苦、減少家庭 和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),這就需要提供更多的分子標(biāo)記以便能及早診斷出帕金森病。
[0003] 為解決目前帕金森分子標(biāo)記稀缺的問題,發(fā)明人對(duì)15例帕金森外周血樣本及9例 健康人對(duì)照外周血樣本進(jìn)行高通量測(cè)序,結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選,挑選出候選 基因FAM102A。現(xiàn)有的報(bào)道表明FAM102A基因和由RSV感染引起的兒科重癥呼吸道合胞病 毒毛細(xì)支氣管炎有關(guān)。進(jìn)一步,本發(fā)明進(jìn)行了分子生物學(xué)方法證實(shí)了 FAM102A與帕金森病 的關(guān)系:FAM102A在帕金森患者外周血中低表達(dá),與帕金森病具有很好的相關(guān)性,可用于制 備帕金森輔助診療制劑,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供FAM102A基因和/其表達(dá)產(chǎn)物在制備帕金森診斷劑中的應(yīng) 用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明首先通過高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因FAM102A,進(jìn)一步通過分子生物學(xué)方法驗(yàn)證了 FAM102A與帕金森的關(guān)系:FAM102A在帕金 森患者外周血中低表達(dá),與帕金森病具有很好的相關(guān)性,可用于制備治療帕金森制劑和/ 或帕金森診斷制劑,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供FAM102A基因在制備帕金森診斷制劑中的應(yīng)用。
[0007] 進(jìn)一步,所述的帕金森的診斷制劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測(cè) 帕金森外周血中FAM102A基因的表達(dá)。
[0008] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn),極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過程,而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn),使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率,反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0009] 基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray),可分為三種主要類型:1)固定在 聚合物基片(尼龍膜,硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段,通常用同位素標(biāo)記 的靶基因與其雜交,通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列,通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列,與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?;蛐酒鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù),應(yīng)用于疾病的診斷,其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面:一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性;二 是快速簡(jiǎn)便;二是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0010] 所述的用于熒光定量PCR方法檢測(cè)帕金森中FAM102A基因的產(chǎn)品含有一對(duì)特異性 擴(kuò)增FAM102A基因的引物;所述的基因芯片包括與FAM102A基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供FAM102A基因表達(dá)產(chǎn)物在制備帕金森診斷制劑中的應(yīng)用。 進(jìn)一步,所述的帕金森的診斷制劑包括用免疫方法檢測(cè)FAM102A蛋白的表達(dá)。優(yōu)選所述免 疫檢測(cè)方法檢測(cè)帕金森中FAM102A蛋白表達(dá)的為western blot和/或ELISA和/膠體金 檢測(cè)方法。
[0012] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等,具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷 酸酶(AP)。
[0013] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù):(1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或外周血 切片,可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色,也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上,以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo) 記,使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面,可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。(2) 免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或外周血超薄切 片結(jié)合,然后進(jìn)行負(fù)染??捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。(3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微 孔濾膜作載體,先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上,封閉后加待檢樣本,洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體 檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。(4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜 上,膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上,當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的 樣本墊上后,通過毛細(xì)作用向前移動(dòng),溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng),當(dāng)移動(dòng) 至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí),待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截 留,聚集在檢測(cè)帶上,可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條,使用十 分方便。
[0014] 進(jìn)一步,所述檢測(cè)FAM102A蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒 中的抗體可采用市售的FAM102A單克隆抗體,優(yōu)選abeam抗體(Human FAM102A full length protein,貨號(hào)abl66482)。進(jìn)一步,所述的試劑盒包括:包被FAM102A單克隆抗體的固相載 體,酶標(biāo)二抗,酶的底物,蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,陰性對(duì)照品,稀釋液,洗滌液,酶反應(yīng)終止液等。
[0015] 進(jìn)一步,所述檢測(cè)FAM102A蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒,所述的抗體可采 用市售的FAM102A單克隆抗體。進(jìn)一步,所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技 術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步,所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)(T)噴點(diǎn) 有抗FAM102A單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)帕金森的熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所 述試劑盒檢測(cè)基因FAM102A,采用特異的上游引物和下游引物,上游引物序列為SEQ ID NO. 1,下游引物序列為SEQ ID NO. 2。
[0017] 進(jìn)一步,該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀, 靈敏度高,定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好,具有良好的應(yīng)用前景。
[0018] 進(jìn)一步,上述熒光定量PCR試劑盒組分包括:特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物,上游引物序列為SEQ ID N0. 1, 下游引物序列為SEQ ID N0.2。所述內(nèi)參引物為P-actin內(nèi)參引物,上游引物序列為SEQ ID NO. 3,下游引物序列為SEQ ID NO. 4。
[0019] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。優(yōu)選康為世紀(jì)血液RNA提取試劑盒進(jìn)行樣本 RNA提取。
[0020] 本發(fā)明還檢測(cè)了本試劑盒靈敏性,結(jié)果顯示本試劑盒檢測(cè)范圍為106-10 2C〇pieS/ y 1,最小檢出濃度為lOOcopies/ y 1。
[0021] 本發(fā)明目的是提供了一種帕金森檢測(cè)試劑盒,所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FAM102A蛋 白。進(jìn)一步的,所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0022] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)帕金森的基因芯片,所述的基因芯片包括與 FAM102A基因的核酸序列雜交的探針。
[0023] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療帕金森制劑,所述治療帕金森制劑促進(jìn)FAM102A 基因的表達(dá)。進(jìn)一步,所述的治療帕金森制劑中含有促進(jìn)FAM102A基因表達(dá)的載體。
[0024] 進(jìn)一步,所述治療帕金森制劑是指可以促進(jìn)FAM102A基因的表達(dá)的制劑。本領(lǐng)域 人員熟知促進(jìn)基因的表達(dá)通??梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N和/或幾種:通過DNA水平調(diào) 控目的基因:包括但不限于增加FAM102A基因的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)染含F(xiàn)AM102A基因的過表達(dá)載 體;通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FAM102A基因:包括但不限于激活FAM102A基因的表達(dá)、激活調(diào)控 FAM102A基因表達(dá)的啟動(dòng)子、抑制負(fù)調(diào)控FAM102A基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、采用RNA干擾技術(shù) 對(duì)抑制FAM102A基因表達(dá)的抑制子進(jìn)行干擾;通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控FAM102A基因:包括但 不限于抑制促進(jìn)FAM102A基因mRNA降解的microRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)、導(dǎo)入促進(jìn)FAM102A基因表 達(dá)的microRNA ;通過翻譯后水平調(diào)控FAM102A基因:包括但不限于導(dǎo)入促進(jìn)目的基因編碼 蛋白的分子、抑制負(fù)調(diào)控FAM102A基因表達(dá)的蛋白、促進(jìn)FAM102A基因表達(dá)的因子及蛋白的 表達(dá)。
[0025] RNA干擾(RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象,是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達(dá),促使mRNA降解,使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計(jì)完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達(dá)載體,制備好的siRNA可以通過磷酸 ?丐共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
【附圖說明】
[0026] 圖1 FAM102A基因在帕金森外周血及健康人外周血中相對(duì)表達(dá)量圖
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明,僅用于解釋本發(fā)明,而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型,本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0028] 實(shí)施例1高通量測(cè)序及分析
[0029] 樣本來源于北京協(xié)和醫(yī)院,均征得試驗(yàn)對(duì)象知情同意。分別收集15例帕金森病 例外周血樣本及9例健康人對(duì)照外周血樣本,進(jìn)行RNA提取,RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳, 從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否,是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分 析。進(jìn)而通過NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的提取情況,RNA-seq測(cè)序的樣品要 求:0D260/0D280 為 1. 8-2. 2。
[0030] 測(cè)序平臺(tái)為Illumina公司的HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái),進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深 度測(cè)序,測(cè)序后我們運(yùn)用Fast-QC
[0031] (http://www.bioinformatics,babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測(cè) 序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估,包括堿基的質(zhì)量值分布,質(zhì)量值的位置分布,GC含量,PCR dup