長到5mm左右，聯(lián)合應(yīng)用蛋白酶體抑制劑Bortezomib和細(xì)胞自■激活Rapamycin，檢測腫瘤生長情況。其中A和B是取裸鼠皮下生長起來腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測PTEN表達(dá)情況圖，A中PTEN表達(dá)為陽性，B中PTEN表達(dá)為陰性；C和D為兩例腫瘤的生長曲線圖。
【具體實施方式】
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[0048]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0049]蛋白酶體抑制劑MG132、Bortezomib、Carfilzomib、Oprozomib、Ixazomib，細(xì)胞自■激活劑 Metformin、Rapamycin、Doxorubin、Torin UBrefeldin A、Pifithrin-α 均購自Selleck 公司。
[0050]pSG5L-HA_PTEN質(zhì)粒購自Addgene ;對照腺病毒購自上海漢恒生物公司；腺病毒載體質(zhì)粒pDC316和骨架質(zhì)粒pBHG購自Microbix公司，連入PTEN基因的CDS后，包裝病毒。制備方法如下:
[0051 ] 根據(jù)腺病毒載體PDC316的多酶切位點序列，我們選取EcoR I和Hind III酶切位點作為重組質(zhì)粒的插入位點；設(shè)計相應(yīng)的引物從pSG5L-HA-PTEN質(zhì)粒中將PTEN的ORF擴(kuò)增出來，連入PDC316中。通過雙酶切鑒定出陽性克隆后，再進(jìn)行質(zhì)粒表達(dá)鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒PDC316-PTEN與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHG用jetPEI共轉(zhuǎn)至HEK-293A細(xì)胞，至細(xì)胞出現(xiàn)空斑，收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次收集病毒，以此病毒為Pi代病毒，以Pi代腺病毒感染293A細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行三代感染，至P4代進(jìn)行腺病毒的大量擴(kuò)增，待空斑形成后收集病毒并對病毒進(jìn)行體外純化和濃縮。病毒純化采用CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒。用適量的PBS重懸病毒沉淀，收集病毒，測定病毒滴度，分裝成小管后置于-80°C保存。
[0052]PTEN抗體購自CST公司，貨號9559。
[0053]膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810、RBE、QBC939、FRH-201，購自中科院細(xì)胞所。
[0054]實施例1:通過免疫組織化學(xué)方法檢測肝內(nèi)膽管癌患者手術(shù)切除術(shù)后石蠟包埋的癌及癌旁正常肝組織中PTEN的表達(dá)水平。
[0055]選取127例膽管癌患者的腫瘤組織的石蠟切片(肝癌組織切片均來自東方肝膽外科醫(yī)院，由2名病理科醫(yī)生確診為肝細(xì)胞癌)，采用免疫組化方法檢測PTEN蛋白在肝癌組織中的表達(dá)量并計算免疫組化評分，并結(jié)合患者臨床統(tǒng)計資料，以PTEN免疫組織化學(xué)檢測分析肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后情況。
[0056]抗原修復(fù)2分鐘，一抗使用單克隆兔源PTEN抗體1:75，4°C孵育過夜，以正常兔源IgG抗體1:75作為陰性對照；生物素標(biāo)記的二抗37°C孵育I小時，DAB顯色。根據(jù)免疫組化的方法檢測肝內(nèi)膽管癌患者的癌和癌旁肝組織標(biāo)本中PTEN的表達(dá)水平，進(jìn)行IRS評分系統(tǒng)(Wang Q, Tan YX, Ren YB, et al.Zinc finger protein ZBTB20express1n is increasedin hepatocellular carcinoma and associated with poor prognosis.BMC Cancer 2011 ；11:271)評分。方法如下:在所有標(biāo)本的每張切片隨機(jī)選擇五哥視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞；根據(jù)計數(shù)細(xì)胞的百分比，PTEN的表達(dá)被劃分4個等級:1分為1-25%，2分為26-50%，3分為51-75%，4分為76%以上；再根據(jù)細(xì)胞著色的前度PTEN的表達(dá)劃分為4個等級:0分為無著色，I分為淺黃色顆粒，2分為黃褐色顆粒，3分為深褐色顆粒。每張切片對應(yīng)一個百分比分?jǐn)?shù)和著色分?jǐn)?shù)，兩者相加即為該切片的最后得分。
[0057]圖1ABC顯示PTEN在肝管癌腫瘤組織中的染色情況，A為陰性，B和C為陽性；通過對127例膽管癌患者的腫瘤組織進(jìn)行PTEN的免疫組織化學(xué)評分，發(fā)現(xiàn)其中有63例樣本(50% )PTEN表達(dá)為陰性，這表明PTEN在膽管癌中缺失嚴(yán)重。結(jié)合臨床統(tǒng)計資料，以Kaplan-Meier法比較PTEN陰性/陽性表達(dá)的術(shù)后無瘤生存時間(圖1D所示)和總體生存時間(圖1E所示)，均體現(xiàn)出顯著差異，PTEN陽性的患者預(yù)后更好。這提示PTEN可以作為肝內(nèi)膽管癌評估預(yù)后的重要因素，同時干預(yù)PTEN的表達(dá)也可能是治療膽管癌的潛在靶點。
[0058]實施例2 =PTEN過表達(dá)腺病毒引起缺失型膽管癌細(xì)胞系死亡
[0059]將四種膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810，RBE, QBC939，F(xiàn)RH-201分別傳入6孔中，待細(xì)胞生長到80%的融匯度后，用150ul的IP裂解液(碧云天，P0013)收取細(xì)胞蛋白，超聲處理后12000轉(zhuǎn)離心15分鐘，定量后加入SDS高溫變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%的BSA封閉，一抗4 °C孵育過夜，再用二抗孵育，用Odyssey掃描檢測。
[0060]圖2A 顯示 HCCC-9810 中 PTEN 表達(dá)為陰性；RBE，QBC939，F(xiàn)RH-201 中 PTEN 為陽性。
[0061]為進(jìn)一步研究PTEN對膽管癌細(xì)胞的影響，我們將HCCC-9810和RBE傳入96孔板中，每孔4000個細(xì)胞。貼壁后每種細(xì)胞分別加入PTEN腺病毒或?qū)φ誈FP腺病毒，MOI為30，每組設(shè)3個副孔。6個小時后更換為正常培養(yǎng)基，設(shè)置為O時刻。分別在0、12、24、36、48、60、72h吸掉培養(yǎng)基，加入用DMEM稀釋的10%的CCK8檢測試劑，37°C孵箱孵育Ih后檢測450nm處的吸光度值。用各時間點所測的吸光度值繪制生長曲線。
[0062]用同樣的方法在HCCC-9810和RBE中加入PTEN和對照腺病毒，換液后培養(yǎng)36h，用0.5%胰酶消化細(xì)胞，離心后用PBS洗滌細(xì)胞后，加入PI對細(xì)胞進(jìn)行染色，10分鐘后離心，PBS液洗滌一次后用流式細(xì)胞儀檢測。
[0063]圖2B顯示PTEN腺病毒在感染的細(xì)胞系中有表達(dá)，HCCC-9810在過表達(dá)PTEN后PARP剪切明顯，提示細(xì)胞發(fā)生凋亡。C，D, E顯示PTEN腺病毒能抑制PTEN缺失的細(xì)胞系HCCC-9810的生長，促進(jìn)其凋亡，而對PTEN野生型的細(xì)胞系RBE無明顯影響。
[0064]實施例3:基因芯片分析肝管癌細(xì)胞系在PTEN過表達(dá)后的信號通路變化
[0065]在1cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中傳入膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE，達(dá)到50%融合度后分別加入PTEN及對照GFP腺病毒，6h后換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)30h，棄去培養(yǎng)基，用生理鹽水輕輕沖洗一次，加入Iml Trizol，提取細(xì)胞的RNA用于表達(dá)譜基因芯片分析。使用芯片為affymetrix 2.0人基因表達(dá)譜芯片，數(shù)據(jù)分析由上海其名信息技術(shù)有限公司完成。用倍數(shù)法對兩種細(xì)胞的對照組和實驗組進(jìn)行兩兩差異篩選(橫向和縱向)，得到差異的mRNA，對得到的差異mRNA根據(jù)2014年商業(yè)版KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行顯著性信號通路分析，找到和實驗相關(guān)的通路。
[0066]分析結(jié)果顯示，在HCCC-9810細(xì)胞中，過表達(dá)PTEN后基因表達(dá)改變顯著。其中，在下調(diào)的信號通路中，RBE和HCCC-9810的變化差異在于蛋白酶體(Proteasome)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)，在圖3A中有標(biāo)注；在上調(diào)的信號通路中，RBE和HCCC-9810的變化差異在于溶酶體(Iysosome)，在圖3B中有標(biāo)注。蛋白酶體(Proteasome)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)，溶酶體(Iysosome)這3條信號通路對細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要，打亂它們會導(dǎo)致導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我們推測，在PTEN之所以能引起缺失型膽管癌細(xì)胞HCCC-9810死亡，是由于下調(diào)了蛋白酶體(Proteasome)，泛素化降解(Ubiquitin mediated proteolysis)信號通路，并同時上調(diào)了溶酶體/自.(lysosome-autophagy)信號通路。
[0067]實施例4:不同種類蛋白酶體抑制劑和自噬激活劑對膽管癌細(xì)胞的生長影響
[0068]針對實施例3篩選出的信號通路一一泛素-蛋白酶體信號通路下調(diào)，溶酶體/自噬信號通路上調(diào)，我們設(shè)想運用小分子抑制劑或臨床藥物誘發(fā)上述過程，模擬PTEN在膽管癌細(xì)胞中引起的生物學(xué)效應(yīng)，檢測它們單獨使用或組合運用對腫瘤細(xì)胞的影響。
[0069]將膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810傳入96孔板中，每孔4