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檢測(cè)牛腺病毒的試劑盒及其應(yīng)用

文檔序號(hào):9560627閱讀:1053來(lái)源:國(guó)知局
檢測(cè)牛腺病毒的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及用于檢測(cè)各血清型牛腺病毒的靶序 列、熒光定量PCR引物和探針,本發(fā)明還涉及利用該靶序列進(jìn)行牛腺病毒檢測(cè)的方法和試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛腺病毒(Bovine adenovirus, BAV)屬腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬,為雙鏈DNA 病毒,可導(dǎo)致牛犢的呼吸道、消化道感染。BAV的感染較為普遍,許多國(guó)家從病牛及外表健康 的犢牛的分泌物及糞便中分離發(fā)現(xiàn),BAV不僅感染牛,還能使羊和鹿發(fā)病。BAV分為兩個(gè)群, 9個(gè)血清型,其中血清3型的感染較為普遍,研究最多。牛血清是生物制品行業(yè)不可缺少的 原材料,外源因子的污染嚴(yán)重影響生物制品的質(zhì)量,因此,對(duì)生物制品中牛病毒的檢測(cè)非常 重要,其中包括對(duì)牛腺病毒的檢測(cè)。
[0003] 目前生物制品行業(yè)各生產(chǎn)廠家普遍采用細(xì)胞培養(yǎng)法,血吸附法,免疫熒光法進(jìn)行 檢測(cè),但這些方法存在敏感度低,檢測(cè)周期長(zhǎng),檢測(cè)精度低,結(jié)果判定易受多種因素影響,客 觀性不足,勞動(dòng)量大等問題;常規(guī)PCR檢測(cè)法雖然敏感性、穩(wěn)定性、特異性較好,但容易污 染,造成假陽(yáng)性結(jié)果;已有的熒光定量PCR法雖然克服了上述方法的缺陷,但是僅能檢測(cè)牛 腺病毒3型,具有檢測(cè)的局限性,并且僅能夠進(jìn)行牛腺病毒的定性檢測(cè),無(wú)法定量,檢測(cè)特 異性、靈敏度、檢測(cè)范圍等參數(shù)均未經(jīng)驗(yàn)證。因此迫切需要一種能夠同時(shí)檢測(cè)各血清型的牛 腺病毒的方法,以降低生物制品企業(yè)的生產(chǎn)成本,提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)各血清型牛腺病毒的特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的方 法以及檢測(cè)試劑盒。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的牛腺病毒基因序列比對(duì),搜 索到牛腺病毒3型全基因序列,序列號(hào)為AF030154. 1,GI: 2935210,使用NCBI在線BLAST中 的conserved domains分析功能,基因組606_1348bp為保守區(qū)基因序列E1A,該序列在牛腺 病毒所有血清型中高度保守,找到了牛腺病毒各血清型特異性的保守靶序列,其核苷酸序 列如SEQ ID N0. 4所示,該靶序列是檢測(cè)各血清型牛腺病毒的遺傳標(biāo)記物。此外,本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,該序列的特異性片段也可以作為檢測(cè)牛腺病毒的遺傳標(biāo)記物。該基因組 保守區(qū)的遺傳標(biāo)志物在牛腺病毒各個(gè)血清型中高度同源,本發(fā)明根據(jù)該保守序列,通過(guò)反 復(fù)對(duì)比、篩選,設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)該遺傳標(biāo)志物的特異性引物對(duì)和探針。本發(fā)明引物和探針不 但適用于3型牛腺病毒的檢測(cè),還適用目前已知的其他8個(gè)血清型牛腺病毒的檢測(cè)。
[0006] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,優(yōu)選的特異性引物對(duì)的序列為:
[0007] 上游引物序列為:5'-GAAGAGGATGAGTGTCTGAATGC-3'
[0008] 下游引物序列為:5'-TCTATCCACGGTTCTGGAGACAT-3'
[0009] 熒光探針序列為:
[0010] (FAM)5, -CTGTTTCCTGATCCCTGGCTAAATGCAG-3'(TAMR A)。
[0011] 本發(fā)明提供了在制備檢測(cè)牛腺病毒試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步地,本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對(duì)的試劑盒。
[0013] 含有上述特異性引物對(duì)的試劑盒,可通過(guò)普通PCR方法實(shí)現(xiàn)對(duì)各血清型牛腺病毒 的特異、快速檢測(cè),當(dāng)擴(kuò)增的目的條帶為120bp左右時(shí)(如圖1所示),將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 基因測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與該保守區(qū)基因序列(SEQ ID N0. 4)進(jìn)行同源性比對(duì),若與該保守 區(qū)基因序列一致(如圖2所示),則說(shuō)明待測(cè)樣品含有牛腺病毒。
[0014] 含有上述特異性引物對(duì)的試劑盒,可通過(guò)SYBR Green法熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)對(duì)各血 清型牛腺病毒的特異、快速檢測(cè)。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,SYBR Green法熒光定量PCR檢測(cè)牛腺病毒的50μ1反 應(yīng)體系為:反轉(zhuǎn)錄酶,2μ1 ;擴(kuò)增酶和底物混合物,25μ1 ;10μΜ上、下游引物,各2μ1 ;R0X Dye II,1 μ 1 ;Rnase free ddH20,14 μ 1,病毒基因組模板:4 μ 1。然后采用AB 7500熒光定 量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng),設(shè)置SYBR Green熒光信號(hào)采集條件,循環(huán)程序:42°C反轉(zhuǎn)錄5min, 95°C預(yù)變性lOsec,1個(gè)循環(huán);95°C變性5sec,60°C退火延伸34sec(收集熒光信號(hào)),40個(gè) 循環(huán);熔解曲線分析,95°C,15sec ;60°C,lmin ;95°C,15seC(收集熒光信號(hào))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品 擴(kuò)增結(jié)果建立定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。陽(yáng)性組擴(kuò)增曲線的CT值應(yīng)小于30,熔解曲線峰形單一, 且熔解曲線峰值高于80°C,證明引物特異性較好,無(wú)非特異性擴(kuò)增;陰性對(duì)照組和空白對(duì) 照組擴(kuò)增曲線CT值均大于30,熔解曲線出現(xiàn)雙峰且峰值低于80°C,則為陰性擴(kuò)增。
[0016] 進(jìn)一步地,本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對(duì)和熒光探針的試劑盒。
[0017] 含有上述特異性引物對(duì)和熒光探針的試劑盒可通過(guò)Taqman法熒光定量PCR實(shí)現(xiàn) 對(duì)各血清型牛腺病毒的特異、快速檢測(cè)。
[0018] 具體地,該試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對(duì)待測(cè)樣本提取基因組DNA后以其 為模板,利用SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2所示的特異性引物對(duì)和SEQ ID N0. 3所示的熒光 探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)待測(cè)樣本中的牛腺病毒。
[0019] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中,Taqman法熒光定量PCR檢測(cè)牛腺病毒的50 μ 1反應(yīng) 體系為:反轉(zhuǎn)錄酶,2μ1 ;擴(kuò)增酶和底物混合物,25μ1 ;10μΜ上、下游引物,各ΙμL ;10uM 熒光探針,2 μ 1 ;R0X Dye II,1 μ 1 ;Rnase free ddH20,14 μ 1 ;病毒基因組模板,4 μ 1。然后 采用ΑΒ 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng),設(shè)置5'端FAM熒光信號(hào)采集,3'端TAMRA熒光 信號(hào)采集,循環(huán)程序:42°C反轉(zhuǎn)錄5min,95°C預(yù)變性10sec,l個(gè)循環(huán);95°C變性5sec,60°C 退火延伸34sec (收集熒光信號(hào)),40個(gè)循環(huán),建立定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品擴(kuò)增曲線判 定結(jié)果。
[0020] 在對(duì)照有效擴(kuò)增的情況下,樣品檢測(cè)結(jié)果可信,否則試驗(yàn)需要重復(fù);在檢測(cè)中兩種 對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí),樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:
[0021] Ct值小于40的標(biāo)本為陽(yáng)性結(jié)果;
[0022] Ct值大于40或無(wú) CT值的標(biāo)本為陰性結(jié)果;
[0023] Ct值在35-40之間的標(biāo)本需要重復(fù),重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于40判定為陽(yáng)性擴(kuò) 增,超過(guò)40或無(wú) CT值判定為陰性擴(kuò)增。
[0024] 本發(fā)明提供了上述兩種試劑盒在生物制品質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)生物制品中牛腺病毒的方法,對(duì)待測(cè)生物制品樣本提取基 因組DNA后以其為模板,利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的特異性引物對(duì)和SEQ ID NO. 3所不的9?光探針進(jìn)彳丁 Taqman 9?光定量PCR,檢測(cè)待測(cè)生物制品樣本中的牛腺病毒;
[0026] 或?qū)Υ郎y(cè)生物制品樣本提取基因組DNA后以其為模板,利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的特異性引物對(duì)進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR,檢測(cè)待測(cè)生物制品樣本中的牛腺 病毒。
[0027] 本發(fā)明提供的試劑盒,還包括熒光定量反應(yīng)液,陰性模板和陽(yáng)性模板,所述陰性模 板為無(wú)菌水,所述陽(yáng)性模板為牛腺病毒基因組DNA。
[0028] 本發(fā)明對(duì)基于上述兩種熒光定量PCR方法的試劑盒的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了研究:實(shí) 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的特異性引物對(duì)和/或探針運(yùn)用Taqman熒光定量PCR和SYBR Green熒 光定量?〇?檢測(cè)牛腺病毒,檢測(cè)范圍為102-108拷貝/^1,靈敏度均能達(dá)到102拷貝/^1。
[0029] 現(xiàn)有技術(shù)中采用SYBR Green法熒光定量PCR檢測(cè)牛腺病毒的特異性較差,檢測(cè)時(shí) 常有非特異性擴(kuò)增,由引物二聚體、引物發(fā)卡結(jié)構(gòu)等造成,容易造成假陽(yáng)性,無(wú)法保證檢測(cè) 的準(zhǔn)確性。本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物經(jīng)普通PCR檢測(cè),無(wú)引物二聚體等結(jié)構(gòu)。進(jìn)行SYBR Green法 熒光定量PC
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