專利名稱：人β-防御素-2植物高效表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組基因工程領(lǐng)域，尤其涉及人卩-防御素基因重組植物高效表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
防御素最重要的生物學(xué)活性就是其廣譜高效的抗菌和抗病毒活性，并且未發(fā)現(xiàn)有耐藥菌 株產(chǎn)生，從進(jìn)化角度看，動(dòng)物應(yīng)用這些分子來(lái)對(duì)抗微生物感染歷經(jīng)千百萬(wàn)年仍顯出強(qiáng)大的效 力，是一類天然有效的抗感染物質(zhì)。因此，人們把防御素看作了一個(gè)對(duì)付細(xì)菌耐藥的可能的 突破口對(duì)其投入了較大的關(guān)注，其中最引人注目的就是p-防御素。
人P-防御素-2(Human Beta-Defensin-2, hBD_2)在機(jī)體粘膜防御中具有重要的作用，由 于來(lái)自人體本身，作為藥用不易引起過(guò)敏反應(yīng)，因此hBD-2作為新型抗感染藥物資源的潛在開(kāi) 發(fā)價(jià)值日益受到重視。但因其在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)甚微，難以通過(guò)直接分離純化大量獲得；人工 合成不僅價(jià)昂貴且空間結(jié)構(gòu)難以與天然hBD-2完全一致；而且在原核細(xì)胞中表達(dá)往往會(huì)引起宿 主菌"自殺"性死亡， 一般原核生物不適為其生物反應(yīng)器等原因?qū)е耯BD-2規(guī)?；a(chǎn)的研究 進(jìn)程緩慢。
轉(zhuǎn)基因植物生物發(fā)生器是利用分子生物學(xué)技術(shù)把重組的目的基因?qū)胫参铮⑹怪参锬?夠大量表達(dá)重組蛋白的一類生物技術(shù)。越來(lái)越多證據(jù)表明應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物或農(nóng)作物作為生 物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)高附加值的藥用重組蛋白質(zhì)，其技術(shù)可行、成本低廉、效益顯著，具有 廣闊的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建高效表達(dá) hBD-2的植物生物反應(yīng)器，以解決在體外規(guī)模化生產(chǎn)具有生物活性的hBD-2的新途徑。
目前蔡紹輝等2003年在《四川大學(xué)學(xué)報(bào)》34 (3) : 385 — 389上發(fā)表的重組人p-防御素一 2的植物表達(dá)載體的建立是在pCAMBIA1304植物表達(dá)載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建，其構(gòu)建的表達(dá)載體中 目的基因連接了六個(gè)組氨酸(His)作為報(bào)告基因，便于表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離，但該報(bào)告基
因影響了表達(dá)產(chǎn)物人p防御素-2的一級(jí)結(jié)構(gòu)和正確空間結(jié)構(gòu)的形成，而人e防御素-2必須形
成正確的空間結(jié)構(gòu)才具有抗菌生物功能。
pCAMBIA1300是帶有的花椰菜花病毒(CaMV) 35S RNA啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，可用于農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或直接轉(zhuǎn)化，載體中T-DNA左右邊界內(nèi)帶有多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)記Hyg基 因,Hyg基因是植物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中廣泛使用的標(biāo)記基因，編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，適于植物轉(zhuǎn)化 后用化學(xué)試劑潮霉素進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)化體、多克隆位點(diǎn)處可插入外源基因，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，植物表達(dá)載體T-DNA左右邊界內(nèi)的序列，包括外源基因和篩選標(biāo)記基因部分，發(fā)生轉(zhuǎn)移并 進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，用篩選試劑潮霉素可有效篩選出整合有外源基因的轉(zhuǎn)化體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是將人P—防御素一2構(gòu)建成植物表達(dá)載體質(zhì)粒，再將該載體質(zhì)粒導(dǎo)入 植物中，旨在植物體中生產(chǎn)空間結(jié)構(gòu)與天然hBD—2完全一致、抗菌活性高的防御素，然后 從轉(zhuǎn)基因植物中提取hBD—2，以降低hBD—2的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的目的之二是利用人hBD—2基因構(gòu)建植物表達(dá)載體質(zhì)粒，再將該載體質(zhì)粒通過(guò) 轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入植物中，使植物具有抗細(xì)菌、病毒及(或)真菌的特點(diǎn)，從而培育出作#|、林 木、果蔬以及花卉等植物抗病新品種，為農(nóng)林果木業(yè)生產(chǎn)以及減少農(nóng)藥污染作出貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明是人e—防御素-2植物高效表達(dá)質(zhì)粒載體，含有啟動(dòng)子、
人P—防御素-2基因、終止子和兩個(gè)篩選基因卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，在 pCAMBIA1300植物表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，用基因重組的方法連接Nos終止子和一個(gè)CaMV 35S啟 動(dòng)子，并將人3 —防御素-2基因插入CaMV 35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間，得到重組人P — 防御素-2植物表達(dá)載體rp1300-hBD2，該基因表達(dá)載體含有兩個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子。
rpl300-hBD2經(jīng)序列測(cè)定連接是正確的。為該重組基因能有效地轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，進(jìn)而被 導(dǎo)入植物細(xì)胞并高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的重組人6-防御素-2植物表達(dá)載體rpl300-hBD2含有兩個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子，能 高效表達(dá)目的基因，即高效地在各種類型的植物細(xì)胞中啟動(dòng)基因的表達(dá)；載體中含有卡那霉 素抗性基因，可對(duì)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選；含有潮霉素抗性基因，適于植物轉(zhuǎn)化后 用化學(xué)試劑潮霉素進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體篩選。由于不含報(bào)告基因可表達(dá)具有正確空間結(jié)構(gòu)和生物 活性的人P防御素-2。
重組人e防御素-2植物表達(dá)載體rp1300-hBD2的具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。 本發(fā)明將重組人e防御素-2植物表達(dá)載體rp1300-hBD2轉(zhuǎn)入煙草后，經(jīng)PCR、 RT-PCR以及
Northern-Blot檢測(cè)證實(shí)，人P防御素-2基因已進(jìn)入煙草，并在mRNA水平正確表達(dá)；經(jīng)
Western-Blot檢測(cè)證實(shí)，轉(zhuǎn)化煙草能夠正確表達(dá)人P防御素-2蛋白；轉(zhuǎn)化煙草葉的上清液對(duì)
金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌都具有較強(qiáng)的抗菌活性，說(shuō)明轉(zhuǎn)化煙草不僅能表達(dá)人P防御素-2
而且還具有較強(qiáng)抗菌生物活性，完全可用于具有生物活性的人e防御素-2的規(guī)模化生產(chǎn)和純化，具有廣闊的應(yīng)用前景。 本發(fā)明的有益效果為-
1、 重組人e—防御素-2植物表達(dá)載體rpl300-hBD2含有兩個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子，能高效 地在各種類型的植物細(xì)胞中啟動(dòng)基因的表達(dá)。
2、 不含報(bào)告基因可表達(dá)具有正確空間結(jié)構(gòu)和生物活性的人e防御素-2。
3、 rpl300-hBD2空間結(jié)構(gòu)與天然hBD—2完全一致、抗菌活性高。
4、 由于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，尤其是膜結(jié)構(gòu)的差異，rpl300-hBD2只會(huì)毒殺微生 物而不會(huì)毒殺植物本身。
4、生產(chǎn)成本低，可用于具有生物活性的人e防御素-2的規(guī)?；a(chǎn)和純化，具有廣闊的
應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明重組人P —防御素-2植物表達(dá)載體rpl300-hBD2的結(jié)構(gòu)示意圖 圖2為人P -防御素-2基因的分子克隆策略示意圖 圖3為重組植物表達(dá)載體rpl300-hBD-2的構(gòu)建策略示意圖 圖4為三個(gè)宮頸癌患者的新鮮腫瘤組織總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果圖 圖5為RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果圖
圖6為重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-hBD-2限制性酶切分析結(jié)果圖
圖7為人p-防御素hBD-2 cDNA測(cè)序圖
圖8為重組質(zhì)粒rp1300-hBD-2的限制性酶切分析結(jié)果圖
圖9為轉(zhuǎn)化人e -防御素2 (hBD2)煙草的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖
圖10為轉(zhuǎn)化人P -防御素2 (hBD2)煙草RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖 圖ll為Northern Blot檢測(cè)結(jié)果 圖12為Western-Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株hBD-2蛋白表達(dá)結(jié)果 圖13為人P _防御素2 (hBD2)殺菌活性結(jié)果圖 圖14a為Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗金黃色葡萄球菌活性圖14b為Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗銅綠假單胞菌活性
具體實(shí)施方式
1.材料
1. 1植物材料
實(shí)驗(yàn)材料選用煙草(NicotianatabacumL.),由蘭州大學(xué)細(xì)胞生物研究所提供。煙草無(wú)菌 苗生長(zhǎng)在常規(guī)組織培養(yǎng)間，溫度20'C， 16小時(shí)光照以及8小時(shí)黑暗。轉(zhuǎn)化苗和對(duì)照苗移入土 后置于玻璃室溫，生長(zhǎng)條件相同。 1.2質(zhì)粒
A. pGEM-Teasy克隆質(zhì)粒購(gòu)自promega公司。
B. pWEN142質(zhì)粒由蘭州大學(xué)細(xì)胞生物研究所提供。
C. pCAMBIA1300質(zhì)粒由蘭州大學(xué)細(xì)胞生物研究所提供。 1.3菌株
A. 大腸桿菌DH5a由蘭州大學(xué)病理生理研究所提供。
B. LBA4404由蘭州大學(xué)細(xì)胞生物研究所提供。
C. 金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、綠膿桿菌(ATCC 27853)標(biāo)準(zhǔn)菌株由蘭州大學(xué)病理生理 研究所提供。
1.4人體組織宮頸癌患者新鮮腫瘤組織由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。
2. 方法
2.1人e-防御素-2基因的分子克隆
克隆策略如下圖示見(jiàn)圖2。 2.1.1組織宮頸癌患者新鮮腫瘤組織由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。
2. 1. 2設(shè)計(jì)引物根據(jù)GeneBank中hBD2 cDNA核苷酸序列(登錄號(hào)NM-004942)設(shè)計(jì)特異
性引物Pl: 5' —3， TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCAT P2: 5' —3， TGGACACCATAGTTTAATTTGG，
產(chǎn)物長(zhǎng)311bp。引物由TaKaRa公司合成。
2.1.3宮頸癌組織總RNA提取
取人宮頸新鮮組織80mg，在DEPC處理的PBS緩沖液中沖洗三次，剪碎后分別置勻漿管 中，加入lml TRIZOL試劑(Gibco公司)，在冰浴中勻漿一分鐘，將勻漿液倒入1. 5ml離心 管，室溫放置10分鐘；加0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15秒，室溫放置5分鐘，10400轉(zhuǎn)/分4'C 離心15分鐘；轉(zhuǎn)移上清液至另一新的1. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇，搖勻，室溫置 IO分鐘，4°C 10400轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；棄上清加lml 75%乙醇，渦旋振蕩片刻，4'C 8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄上清，干燥10分鐘，加50^1經(jīng)DEPC處理的雙蒸水溶解，取3pl在1. 5 %瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)所提取RNA，其余貯存于-2(TC備用。
2.1.4 RT-PCR擴(kuò)增
以所提取人宮頸組織總RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增[TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)]。按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)體系
(1) RNase Free distilled H20 一l
(2) 25mMMgcl2 ，
(3) 10xone step RNA PCR Buffer 5^1
(4) 10mMdNTP 5pl
(5) RNase Inhibitor (40units/nl) 1^1
(6) P1、 P2各2^1
(7) AMV RT XL(5units4d) 1 nl
(8) AMV-optimized Taq(5units/pl) ljxl
(9) RNA樣品 2^1 反應(yīng)液總體積為50jil
按以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)5(TC保溫30min，使mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA: 94°C預(yù)變性 2min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)94。C30s、 56。C30s、 68°C45s;最后68。C繼續(xù)延伸7minL反 應(yīng)結(jié)束后，每管各取6^1擴(kuò)增反應(yīng)液在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
2.1.5 RT—PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及擴(kuò)增片段的克隆 2.1. 5.1 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化
重復(fù)上述RT-PCR反應(yīng)過(guò)程，獲10(^1擴(kuò)增產(chǎn)物，用PCR純化試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物純化(按 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行)，各得5(^1純化擴(kuò)增產(chǎn)物,取3pl樣品在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定 純化效果。
2.1.5.2擴(kuò)增片段的連接
根據(jù)pGEM-T Easy載體系統(tǒng)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)建立如下連接反應(yīng)10xT4 DNA連接反應(yīng)緩沖液 lpl， pGEM-T載體lnl (50ng)純化的RT-PCR擴(kuò)增片段3|xl， T4 DNA連接酶lpl(3U),加雙 蒸水至總體積為l(Hil，于16'C連接2小時(shí)。 2.1.5.3制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
用接種環(huán)從平板上挑取大腸桿菌DH5 a單個(gè)菌落接種于3ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基 中，37'C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液0.5ml轉(zhuǎn)種于50ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng) 基中，繼續(xù)于37'C振搖4小時(shí)，然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，冰浴10分鐘，于4'C以4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷CaCl2(0. lmol/L)溶液重懸菌體，冰浴20分鐘，于4 。C以4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去上清，加lml冰浴的CaCl2溶液(0. lmol/L)輕輕混勻，分裝 到1.5ml離心管中，冰浴2小時(shí)后，放4'C貯存?zhèn)溆谩?2.1.5.4 轉(zhuǎn)化
取200pl DH5a感受態(tài)細(xì)胞菌液于L5ml離心管中，加入2 連接反應(yīng)物，輕輕混勻， 冰浴20分鐘，放入42'C水浴中45秒，取出離心管迅速放入冰浴2分鐘，加不含抗生素的SOC 液體培養(yǎng)基800^1， 37'C振搖(150轉(zhuǎn)/分)l小時(shí)，取轉(zhuǎn)化后的菌液100 pl鋪于LB平板上(含 氨芐青霉素100嗎/ml，表層鋪有40nl 20mg/ml X-gal及4pl 200mg/ml IPTG) 37。C培養(yǎng)過(guò) 夜。
2.1.6重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 2.1.6.1 a-互補(bǔ)及顏色篩選
將轉(zhuǎn)化后37'C過(guò)夜培養(yǎng)的平板置于4'C4小時(shí)，使藍(lán)白色菌落充分顯現(xiàn)，根據(jù)質(zhì)粒載體 pGEM-T Easy LacZ基因a-互補(bǔ)特性，白色菌落可能含陽(yáng)性重組質(zhì)粒。 2.1.6.2質(zhì)粒DNA的提取及初步鑒定
從轉(zhuǎn)化平板隨機(jī)挑取白色菌落，接種于3ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振搖
14小時(shí)，根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒(UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒，上海生工)操作指南提 取質(zhì)粒DNA，得到50^1質(zhì)粒DNA，取3^1于1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA。操作步驟 如下
(1) 提取一個(gè)白色菌落接種于一個(gè)裝有2ml含有Amp的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37°C 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
(2) 吸取培養(yǎng)好的菌液1.5ml加入Eppendorf管中，12000rmp離心15s，棄上清；
(3) 加入的Solution I ，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌；
(4) 加入20(M的SolutionII，立即上下顛倒5 10次，使細(xì)菌裂解，室溫放置2min;
(5) 加入350W的SolutionIII，立即上下顛倒5 10次，使之充分中和，室溫放置2min;
(6) 12000rmp離心5min;
(7) 將步驟(6)中上清轉(zhuǎn)移到套放于2. Oml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，以10000rmp室 溫離心15s;
(8) 棄收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一收集管中，吸取50(M的Wash Solution 到UNIQ-10柱，訓(xùn)00rmp室溫離心30s;
(9) 重復(fù)步驟(8);
(10) 棄收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一支收集管中，lOOOOrmp室溫離心30s
8以徹底去除Wash Solution;
(11) 將UNIQ-10柱放入新的潔凈1. 5mlEppendorf管中，加入50W的Elution Buffer, 室溫放置2min后，lOOOOrmp室溫離心lmin， Eppendorf管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA;
(12) 取3pl于1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA。
2.1.6.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定
將所得重組質(zhì)粒DNA lOpl，加入離心管中，加10x反應(yīng)緩沖液2nl， EcoRI lnl(10U/nl)， 加純水至2(^1， 37。C水浴3小時(shí)，取10pl酶切后的反應(yīng)混合物于1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢 測(cè)酶切效果。
2.1.6.4重組質(zhì)粒的PCR鑒定
以所提重組質(zhì)粒DNA為模板，以P,、P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下10xBuffer 2. 5^1， dNTP 2^1 (0.2mM/L), TaqDNA聚合酶2^1 (1U)，重組質(zhì)粒DNA 1^1，引物各1^1,加 純水至25pl。于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下94。C預(yù)變性5分鐘，然后94。C變 性30秒，56。C復(fù)性30秒，72。C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)，72。C繼續(xù)延伸7分鐘。取6nl擴(kuò)增 反應(yīng)物于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)結(jié)果。 2. 1. 6. 5 cDNA序列測(cè)定
DNA序列測(cè)定由大連TaKaRa生物技術(shù)公司應(yīng)用ABI PRISM 3730 DNA自動(dòng)測(cè)序儀完成。 2. 2重組植物表達(dá)載體rpl300-hBD-2的構(gòu)建
表達(dá)載體構(gòu)建策略見(jiàn)圖3。
由于所得質(zhì)粒pCAMBIA1300 (圖B)沒(méi)有Nos terminaeor序列，需要增加該序列，將質(zhì) 粒pWEN142 (圖A)用Pst I和EcoR I雙酶切得到Nos terminaeor片段和CaMV 35S啟動(dòng)子， 同時(shí)也用Pst I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA1300(圖C)，用T4-DNA連接酶將Nos terminaeor 片段和CaMV 35S啟動(dòng)子插入質(zhì)粒pCAMBIA1300，得到含有Nos terminaeor的質(zhì)粒pl300-Nos, 并鑒定重組質(zhì)粒p1300-Nos (圖D)。
用Xho I和Sac I酶切已測(cè)定含有hBD2正確序列的克隆載體pGEM-T-hBD2 (圖F)得到 hBD2基因片段。同時(shí)用Xho I和Sac I酶切重組質(zhì)粒pl300-Nos (圖E)，用T4-DNA連接酶將 hBD2基因片段插入質(zhì)粒pl300-Nos，得到重組產(chǎn)物p1300-hBD2，鑒定重組產(chǎn)物p1300-hBD2， 命名為rpl300-hBD2 (圖G)。 2.3農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備以及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
2. 3.1從28'C培養(yǎng)48小時(shí)的新鮮平板中挑取LBA4404單菌落，轉(zhuǎn)到20mlLB液體培養(yǎng)基
(rifl00mg/L)中，于28°C 250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 2. 3. 2冰浴20min，將菌液5ml離心管中，再冰浴10min。2. 3. 3 4000rpm4。C離心10min。
2. 3. 4每管加入1 ml預(yù)冷的20mMCaCl2重懸菌體。
2. 3.5 4000rpm4。C離心10min，棄上清。
2. 3. 6每管加入300^1的20mMCaCl2，重懸菌體并分裝于1.5ml離心管中。 2. 3. 7每管加入6^1重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴5min，再放入液氮5min。 2. 3. 8 37'C5min，每管加入400^1 YEB培養(yǎng)基于28。C溫育2小時(shí)使得細(xì)菌復(fù)蘇，并表達(dá)卡那 霉素抗性基因。
2. 3. 9取200^1轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌均勻涂于含卡那霉素和利福平的YEB固體選擇培養(yǎng)基平板上，
室溫下靜置半小時(shí)后，于28'C培養(yǎng)。 2.3.10設(shè)負(fù)對(duì)照，只有感受態(tài)細(xì)胞沒(méi)有外源DNA，抗性平板上不生長(zhǎng)，無(wú)抗性平板上生長(zhǎng)。 2.4煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
2. 4. 1無(wú)菌培養(yǎng)的煙草在1/2MS培養(yǎng)基上快繁。
2. 4. 2 YEB+Kan50mg/L+Rifl00mg/L+Stre50mg/L的液體培養(yǎng)基中28。C振蕩培養(yǎng)含有hBD2 表達(dá)載體的LBA4404。
2.4.3取新長(zhǎng)出的約1-2咖2大小煙草葉子，切成0.4-0.7ci^大小，切除大的葉脈，中間用尖 頭鑷子打孔。
2.4.4將切好的葉片置于用MSO(MS+30g/Lsucrose)稀釋的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中3-5分鐘，中間振 搖幾次。
2.4.5夾出葉片在無(wú)菌濾紙上吸干多余菌液，置于MSl(MS+30g/L sucrose+lmg/L 6BA)培養(yǎng) 基上，共培養(yǎng)兩天。
2. 4. 6將共培養(yǎng)兩天后的葉片轉(zhuǎn)至MS2(MS+30g/L sucrose+lmg/L 6BA+500mg/L CB+15mg/L
Hyg)上，培養(yǎng)20天誘導(dǎo)芽的生長(zhǎng)。 2.4.7轉(zhuǎn)移至MS3(MS+30g/Lsucrose+lmg/L6BA+250mg/LCB+15mg/LHyg)上繼續(xù)誘芽，
待芽長(zhǎng)至lcm大小，切下幼芽轉(zhuǎn)移至MS4(MS+30g/L sucrose+250mg/L CB+15mg/L Hyg)
上生根。
2.4.8將轉(zhuǎn)基因煙草幼苗兩天后轉(zhuǎn)入土中，繼續(xù)生長(zhǎng)。 2. 5轉(zhuǎn)化植株的鑒定 2. 5. 1 PCR鑒定
2. 5.1. 1煙草的DNA提取方法如下
①取材(三株轉(zhuǎn)化、三株野生)置于液氮中充分研磨，加入lysis buffer 0.6ml， lysis buffer的組成為50mMtris-Cl,pH8.0;42gUrea;10ml 20% Sarkosyl(十二烷基肌氨酸鈉)；10ml 0.5MEDTA。 42。C水浴10min。
② 37。C搖10min，加入酚氯仿異戊醇(100: 100: 1)混勻30sec， 37。C搖10min。
③ 10000Xg離心10min，取上清，每500W上清液中加入50 plNaAc(pH5.0)和600 nl異丙醇。
④ 混勻，離心lmin，棄上清，加入500^170%乙醇。
⑤ 離心30sec，棄上清，加入30nlTE重懸沉淀，儲(chǔ)存于-20。C。
2.5.1.2 PCR鑒定用引物為Pl: 5， 一3， TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCATP2: 5， 一3' TGGACACCATAGTTTAATTTGG;按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94。C預(yù)變 性2min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)，94。C變性30sec， 56。C退火30sec， 72。C延伸45sec， 最后72。C延伸5min。 2. 5. 2轉(zhuǎn)化植株的mRNA表達(dá)檢測(cè) 2. 5. 2. 1煙草總RNA的提取
取轉(zhuǎn)化煙草葉片50mg，在DEPC處理的PBS緩沖液中沖洗三次，剪碎后置勻漿管中，加 入lml TRIZOL試劑，在冰浴中勻槳一分鐘，將勻漿液倒入1. 5ml離心管，室溫放置10分鐘； 加0. 2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15秒，室溫放置5分鐘，10400轉(zhuǎn)/分4'C離心15分鐘；轉(zhuǎn)移上 清液至另一新的1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇，搖勻，室溫置10分鐘，4'C 10400轉(zhuǎn) /分離心10分鐘；棄上清加lml 75%乙醇，渦旋振蕩片刻，4°C 8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄 上清，干燥10分鐘，加50 pl經(jīng)DEPC處理的去離子水溶解，貯存于-20。C備用。 2. 5. 2. 2 RT-PCR擴(kuò)增
以上述所提取組織總RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。按下列組成配制RT-PCR反應(yīng)
液
(1 )RNase Free distilled H20 16^1
(2) 25mM Mgcl2 15^1
(3) 10x。ne step RNA PCR Buffer 5pl
(4) 10mM dNTP 5^1
(5) RNase Inhibitor (40units/pl) 1^1
(6) 上游引物、下游引物各2nl
(7) AMV RT XL(5units4U) 1^1
(8) AMV陽(yáng)optimized Taq(5units/pl) 1jj1(9)RNA樣品2^1 反應(yīng)液總體積為
按以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)50'C保溫30min，使mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA: 94°C預(yù)變性 2min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)94。C30s， 68。C45s;最后68。C繼續(xù)延伸7min.反應(yīng)結(jié)束后， 每管各取6" 1擴(kuò)增反應(yīng)液在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。 2. 5. 2. 3 Northern Blot 2.5.2.3.1甲醛-瓊脂糖凝膠電泳
(1) 用36ml DEPC處理H20溶解0. 75克瓊脂糖，冷卻至60 °C，加5ml 10x MOPS電泳 緩沖液(O. 4mol/L MOPS, pH7. 4， 0. 5mol/L NaAc, 0. 01 mol/L EDTA)和9ml 12. 3mol/L甲醛。
(2) 鋪制凝膠，加入足夠的lx MOPS電泳緩沖液使能淹沒(méi)凝膠面lmm左右。
(3) 在3個(gè)EP管中各加入5|til 10x MOPS電泳緩沖液，9pl 12. 3M甲醛，25^1甲酰胺； 第一管、第二管分別加入所提取轉(zhuǎn)化煙草RNAllpl，第三管加入野生株煙草RNAllpl?；靹?， 短暫離心，在55'C保溫15分鐘。
(4) 加入10^1甲醛加樣緩沖液[lmmol/L EDTA, p朋.0， 0. 25% (w/v)溴酚藍(lán)，0. 25% (w/v) 二甲苯青，50% (v /v)甘油]。
(5) 每孔加樣60pl，在5V/cm電壓下電泳2小時(shí)。
(6) 取出凝膠用20xSSC(3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)洗兩次，每次 15分鐘。
(7) 取大小合適的尼龍膜，用DEPC處理的水浸泡5分鐘。
(8) 用真空轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移RNA:于真空轉(zhuǎn)移儀上依次放置濾紙、尼龍膜、凝膠，排除氣泡， 加20xSSC，轉(zhuǎn)移3小時(shí)(真空負(fù)壓10 cmHg)。
(9) 將膜取出，置12(TC烤箱中烤30分鐘后，4X:保存。 2. 5. 2. 3. 2 cDNA探針標(biāo)記
(1) 模板cDNA的純化取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物100^1用PCR純化試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物純化(按 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行)，各得50^1純化產(chǎn)物，取3pl樣品在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定純化 效果，并估計(jì)cDNA濃度。
(2) cDNA探針標(biāo)記取純化cDNA 15pl (含DNA約3pg)煮沸變性10分鐘，立即置冰上； 力口入以下試齊U: 2^1 hexanucleotide mix, 2pl d, Mixture, l^il Klenow enzyme;混勻稍 離心，置37。C60分鐘；加2jil 0. 2M EDTA (PH8. 0)終止反應(yīng)；加2. 5pl 4M LiCl和75pl預(yù) 冷乙醇，混勻沉淀標(biāo)記DNA;置-20 °C2小時(shí)；10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，用50|il預(yù)冷乙醇洗滌、干燥，溶于50pl TE中備用。
2.5.2.3.3預(yù)雜交將尼龍膜放入雜交袋，加入5ml雜交液(7%SDS， 50%甲酰胺，5xSSC， 50mM Sodium phosphate, PH7. 0， 0. l%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 2 %blocking reagent (試劑盒提供))，置5(TC預(yù)雜交4小時(shí)。
2.5.2.3.4雜交在3ml雜交液中加入探針25^1，排出雜交袋中氣泡，雜交16小時(shí)。 2. 5. 2. 3. 5洗膜檢測(cè)取出尼龍膜，置用DEPC處理過(guò)的容器中，用洗液I (2xSSC， 0. 1%SDS) 室溫洗滌兩次，每次5分鐘，用洗液II (0. lxSSC，O. 1%SDS) 68。C洗滌兩次，每次15分鐘， 用沖洗緩沖液[馬來(lái)酸緩沖液，O. 3% Tween 20(v/v)]洗滌2分鐘；置尼龍膜于100ml Blocking solution [1% (w/v) Blocking試劑溶解于馬來(lái)酸緩沖液(0. 1M馬來(lái)酸，0. 15MNaCl， pH7. 5)] 中30分鐘；取anti-DIG-AP到Blocking溶液中使其濃度達(dá)150mU/ml，將膜放在50ml含抗 體的Blocking溶液中30分鐘；用沖洗緩沖液洗兩次，每次15分鐘；置膜于檢測(cè)緩沖液(O. 1M Tris-HC1, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2， pH9. 5)中兩分鐘；將膜置于10 ml顯色溶液中(10 ml檢測(cè) 緩沖液，200^1 NBT/BCIP)，密封塑料袋置暗處；充分顯色，取出浸入水中漂洗10分鐘，干 燥照像。
2.6.轉(zhuǎn)化植株hBD2蛋白表達(dá)檢測(cè) 2.6.1植物蛋白樣品制備
(1) 將500mg煙草組織置于2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
(2) 加400nl單去污劑裂解液(50mmol/LTris 'HClpH8.0， 150mmol/LNaCl， l%TritonX —100， 100pg/mlPMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿，然后置于冰上。
(3) 幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
(4) 裂解30 min后，用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4'C下12000rpm 離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于一20'C保存。
2. 6. 2 Trjs—Tricine電泳
由于目的蛋白大小只有4.5kDa，用SDS—PAGE電泳得不到很好的分離效果，因此采用 一種修改的緩沖系統(tǒng)的Tris—Tricine方法，可使SDS和多肽得到分離，從而改善分離度。
(1) 檢査電泳裝置，清洗玻璃板。
(2) 灌膠與上樣
① 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。
② 按以下方法配Tricine分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml 槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到所需高度時(shí)即可，然后膠上加一層水。Tricine多肽分離凝膠配方貯液分離膠濃縮膠
30%丙烯酰胺/0.8%亞甲雙丙烯酰9.80ml1.62ml
Tris Cl,pH8.4510.00ml3.10ml
H207.03ml7.78ml
甘油3.17ml—
10% (w/v)過(guò)硫酸銨25^1
TEMED10pl5pl
明書(shū)第12/17頁(yè)
③ 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上 層水并用吸水紙將水吸干。
④ 按上面的方法配Tricine濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃 縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕 將其拔出。
⑤ 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。
⑥ 取制備好的樣品至0.5ml離心管中，加入2XTricine上樣緩沖液(0.1mol/L Tris， 24% 甘油，8%SDS， 0.2mol/LDTT， 0.02%考馬斯亮藍(lán)G-250)，沸水中煮5min使蛋白變性。
⑦ 加足夠的電泳液后上樣。 陽(yáng)極緩沖液的配制
121.1gTris堿 500ml H20
用濃鹽酸調(diào)校至pH8.9 用H20稀釋至5L ，于4'C保存?zhèn)溆谩?陰極緩沖液的配制 12.11gTris堿 17.92g Tricine lgSDS
用H20稀釋至1L，于4'C保存?zhèn)溆谩?(3)電泳
電壓為40V，電泳5h，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。2. 6. 3轉(zhuǎn)膜
切1張6.0x8.0cm大小的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h，另準(zhǔn)備6張和分離膠大小相同 的濾紙。安裝轉(zhuǎn)移電泳槽，并加入轉(zhuǎn)移緩沖液。待電泳完畢，根據(jù)電泳槽使用指南，將濾紙、 分離膠和準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜正確放置。在冷卻條件下60V，轉(zhuǎn)膜2h。轉(zhuǎn)膜完畢，拆卸轉(zhuǎn) 膜裝置，取出轉(zhuǎn)印膜，并在膜上剪一小角作為定位標(biāo)記，準(zhǔn)備免疫檢測(cè)。 轉(zhuǎn)移緩沖液的配制-
甘氨酸(MW75.07) 2.9g
Tris (MW121.14) 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸餾水至 1000ml
溶解后室溫保存 2. 6. 4免疫檢測(cè) . 2. 6. 4. 1免疫反應(yīng)
(1) 將膜用TBS (100mmol/LTris'HClpH7.5， 150mmol/LNaCl)從下向上浸濕后，移至含 有封閉液(含0.2%酪蛋白的丁丁85緩沖液)的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉lh。
(2) 將一抗用TTBS[含0.1X (v/v) Tween20的TBS緩沖液]稀釋至1: 500;撕下適當(dāng)大小 的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮 膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜 四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育2h后，用TTBS在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min; 再用TBS洗一次，10min。
(3) 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液(1: 5000)并與膜接觸，室溫下孵育2h后，用TTBS在 室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min;再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
一抗(羊抗人P-defensin2， sc-10854，為Santa Cruz產(chǎn)品) 二抗(抗羊IgG-HRP， sc-2020，為Santa Cruz產(chǎn)品) 2.6.4.2化學(xué)發(fā)光，顯影，定影
(1 )將A和B兩種試劑(購(gòu)自北京中山公司，為Santa Cruz產(chǎn)品)在保鮮膜上等體積混合； lmin后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；lmin后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液， 包好，放入X-光片夾中。
(2)在暗室中，將1X顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X—光片，用
15切紙刀剪裁適當(dāng)大小(比膜的長(zhǎng)和寬均需大lcm);打開(kāi)X-光片夾，把X—光片放在膜的蛋 白面上，關(guān)上X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；曝光時(shí)間為15min;曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間為2min(20 25'C);顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間為5 10min，以膠片透明為止； 用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。 2.6.4.3將膠片掃描照相。 2. 7生物活性檢測(cè) 2. 7.1樣品提取
取轉(zhuǎn)染hBD2和野生新鮮煙草的葉片，在研缽中研磨后，4°C， 5000rpm離心10min，取 上清于4'C保存?zhèn)溆谩?2. 7. 2殺菌活性檢測(cè) 2. 7. 2. 1瓊脂糖彌散法測(cè)定殺菌活性
將細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌)于37。C大豆胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)中培養(yǎng)過(guò)夜， 取50 nl該菌液接種到50ml新鮮TSB中，37。C培養(yǎng)3h，以獲得中度對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)菌。將該 菌液于4。C， 900Xg離心10min，然后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(NAPB)清洗后，再重懸于該 緩沖液中，使細(xì)菌濃度達(dá)到107個(gè)/加1。取該菌液100^1于10ml含10mM NAPB的己滅菌并 42t:溫浴的TSB培養(yǎng)基液中，混勻，使菌濃度為1()S個(gè)/ml 。倒該培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中(膠厚 為l，25mm)，待凝固后，在培養(yǎng)基上打直徑為3mm的孔，分別加野生煙草上清液、轉(zhuǎn)化煙草 上清液、兩倍濃縮轉(zhuǎn)化煙草上清液各50^11于含有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌培養(yǎng)基的三個(gè)孔 中。37'C孵育3h后，倒入頂層培養(yǎng)基(含6。/。TBS， 1%瓊脂糖，消毒并42。C孵育)，待膠凝 固后置37'C培養(yǎng)18小時(shí)。測(cè)量加樣孔周圍細(xì)菌清除環(huán)的直徑，清除環(huán)的直徑以單位表示 (O.lmm為1個(gè)單位)。 2. 7. 2. 2 Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌活性
分別取野生煙草上清液、轉(zhuǎn)化煙草上清液、兩倍濃縮轉(zhuǎn)化煙草上清液，將滅菌6mm濾紙 片放入上述液體中浸泡12h備用。采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法檢測(cè)重組hBD-3的抗菌活性， 操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下將金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)標(biāo)準(zhǔn)菌株 室溫解凍后涂布于LB平板上，37 'C孵育過(guò)夜。次日，分別挑取LB平板上的單菌落1個(gè)，接 種于LB液體培養(yǎng)基的試管中，37'C振蕩培養(yǎng)10h。然后用PBS洗滌細(xì)菌,并使其濃度達(dá)到 105/ml ,均勻涂布到LB平板。放置lOmin待平板表面稍干后放置上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液浸泡過(guò) 的濾紙。37'C過(guò)夜孵育，次日觀察和記錄抑菌環(huán)大小。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1組織總RNA的提取
提取的三個(gè)宮頸癌患者新鮮腫瘤組織(A、 B、 C)總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有三個(gè)明 顯條帶(28s、 18s和5.8s)，基本無(wú)降解，無(wú)DNA殘留(圖4)。 3.2 6-防御素基因的RT-PCR擴(kuò)增
以提取RNA為模板用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所獲得的RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)約310bp大小的條帶，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小相符，表明引物設(shè)計(jì)合乎 要求，可擴(kuò)增出相應(yīng)hBD-2 cDNA片段(圖5)。圖中A: hBD-2、 B: DL-2000 DNA標(biāo)記。 3. 3重組質(zhì)粒的篩選及鑒定
PGEM-T Easy與hBD2cDNA的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a后，在氨卞青霉素和IPTG 及X-gal的選擇平板上培養(yǎng)過(guò)夜，出現(xiàn)16個(gè)白色菌落，挑選白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基(含 氨卞青霉素)培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRl酶切圖譜分析證實(shí)，含有插入的 目的片段(圖6)。以重組質(zhì)粒為模板行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示得到的基因片段與目的片段大小 相符(圖6)。圖中A:pGEM-TEasy-rBD-l的hBD-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、B:EcoRI酶切后的pGEM-T Easy-hBD-2、 C: pGEM-T Easy-hBD-2、 M: DL-2000 DNA標(biāo)記。 3.4 DNA序列測(cè)定
所提質(zhì)粒送大連TaKaRa公司做DNA序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果顯示，所獲得的克隆重組體中含 有hBD-2cDNA序列，與Genebank中報(bào)道的結(jié)果完全一致，序列覆蓋hBD-2 cDNA全長(zhǎng)，能夠 用于構(gòu)建植物表達(dá)載體(圖7)。 3. 5重組植物表達(dá)載體的篩選與鑒定
重組植物表達(dá)載體rpl300-hBD-2經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I和xho I酶切圖譜分析證實(shí)，含有 插入的目的片段(圖8)。以重組質(zhì)粒為模板行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示得到的基因片段與目的片 段大小相符(圖8)。圖中A: rpl300-hBD-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、B: Sac I和xho I酶切后的 rpl300-hBD-2、 C: pl300-hBD-2、 M: PCR標(biāo)記。 3. 6轉(zhuǎn)化hBD-2煙草的PCR鑒定
提取3株轉(zhuǎn)化rpl300-hBD-2煙草的DNA和3株未轉(zhuǎn)化rpl300-hBD-2煙草的DNA，分別 以這六種DNA為模板，Pl、 P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，3株轉(zhuǎn)化rpl300-hBD-2的煙 草DAN都擴(kuò)增出大小約310bp的片段，而3株未轉(zhuǎn)化rpl300-hBD-2的煙草DNA則未見(jiàn)特異條 帶出現(xiàn)。前三株轉(zhuǎn)rP1300-hBD-2的煙草都含hBD2基因，說(shuō)明根癌農(nóng)桿菌己把hBD_2基因?qū)?入煙草細(xì)胞(圖9)。圖中A、 C、 E:轉(zhuǎn)化hBD-2煙草；B、 D、 F:未轉(zhuǎn)化hBD-2煙草；M:PCR標(biāo)記。
3.7轉(zhuǎn)化植株的mRNA表達(dá)檢測(cè)
提取PCR鑒定陽(yáng)性的三株煙草總RNA (A、 B、 C)，分別為模板，以Pl、 P2為引物進(jìn) 行PT-PCR，結(jié)果顯示，三個(gè)模板都擴(kuò)增出大小相符的條帶，并且亮度較強(qiáng)(圖IO)。說(shuō)明三 株轉(zhuǎn)化了 hBD-2的煙草都能在較高水平進(jìn)行hBD-2基因的mRNA表達(dá)。圖中M為DL—2000 DNA 標(biāo)記。
3. 8轉(zhuǎn)化植株的Northern-Blot檢測(cè)
將兩株轉(zhuǎn)化煙草(A、 B)和一株未轉(zhuǎn)化煙草(C)的總RNA進(jìn)行Northern-Blot檢測(cè)， 結(jié)果顯示，兩株轉(zhuǎn)化的煙草RNA呈陽(yáng)性，而未轉(zhuǎn)化煙草RNA為陰性(圖ll)。進(jìn)一步肯定 了轉(zhuǎn)化的煙草不僅將hBD-2基因?qū)爰?xì)胞，而且都有hBD-2基因在mRNA水平的較強(qiáng)表達(dá)。 3.9轉(zhuǎn)化煙草的hBD-2蛋白表達(dá)檢測(cè)
將兩株轉(zhuǎn)化煙草(A、 B)和一株未轉(zhuǎn)化煙草(C)的蛋白提取物進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)， 結(jié)果顯示，兩株轉(zhuǎn)化煙草的蛋白提取物呈陽(yáng)性反應(yīng)，而未轉(zhuǎn)化煙草的蛋白提取物呈陰性，說(shuō) 明轉(zhuǎn)化煙草蛋白提取物中含有hBD-2，證實(shí)該轉(zhuǎn)化hBD-2基因的煙草能夠表達(dá)表達(dá)hBD-2。 因此該hBD-2植物表達(dá)系統(tǒng)rpl300-hBD-2的構(gòu)建是成功的(圖12)。 3.10瓊脂糖彌散法測(cè)定hBD-2殺菌活性
將野生煙草上清液(1)、轉(zhuǎn)化煙草上清液(2)、兩倍濃縮轉(zhuǎn)化煙草上清液(3)各50pl 分別加入含有金黃色葡萄球菌(A)、綠膿桿菌(B)培養(yǎng)基的三個(gè)孔中，18小時(shí)培養(yǎng)后，加 入轉(zhuǎn)化煙草上清液、兩倍濃縮轉(zhuǎn)化煙草上清液的兩個(gè)孔都出現(xiàn)了明顯的殺菌環(huán)，而加入野生 煙草上清液的孔則無(wú)殺菌環(huán)出現(xiàn)(圖13)。經(jīng)測(cè)量在含有金黃色葡萄球菌的平板上加入轉(zhuǎn)化 煙草上清液的殺菌環(huán)為60單位、加入兩倍濃縮轉(zhuǎn)化煙草上清液的殺菌環(huán)為100單位，在含有 綠膿桿菌的平板上加入轉(zhuǎn)化煙草上清液的殺菌環(huán)為70單位、加入兩倍濃縮轉(zhuǎn)化煙草上清液的 殺菌環(huán)為120單位。說(shuō)明該轉(zhuǎn)化hBD-2基因的煙草不僅能表達(dá)hBD-2，而且表達(dá)的產(chǎn)物具有 較強(qiáng)的抗菌活性。
3.11 Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法檢測(cè)抗菌活性
檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化hBD-2的煙草上清液對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌 (ATCC 27853)均可形成抑菌環(huán)，直徑平均值分別為19、 17mm，而未轉(zhuǎn)化hBD-2的煙草上清液并 無(wú)陽(yáng)性抑菌環(huán)形成(〈10mm均認(rèn)定為陰性)(圖14)。結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)化hBD-2基因的煙草不僅 能表達(dá)hBD-2，而且表達(dá)的產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗菌活性。說(shuō)明我們構(gòu)建的該hBD-2生物反應(yīng)器不 僅能高效表達(dá)hBD-2，而且能很好地完成翻譯后的修飾加工，使其表達(dá)產(chǎn)物具有天然hBD-2的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其較強(qiáng)抗菌活性的生物特性。
本試驗(yàn)結(jié)果表明重組hBD-2基因的植物表達(dá)載體rp1300-hBD-2已構(gòu)建成功并誘導(dǎo)根癌農(nóng) 桿菌LBA 4404遺傳轉(zhuǎn)化，而且通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)已將此組hBD-2基因的植物表達(dá)載體進(jìn)入 了煙草幼胚愈傷組織。該轉(zhuǎn)化hBD-2基因的煙草不僅能表達(dá)hBD-2，而且表達(dá)的產(chǎn)物具有較強(qiáng) 的抗菌活性。說(shuō)明我們構(gòu)建的該hBD-2生物反應(yīng)器不僅能高效表達(dá)hBD-2，而且能很好地完成 翻譯后的修飾加工，使其表達(dá)產(chǎn)物具有天然hBD-2的特性，并能發(fā)揮其較強(qiáng)抗菌作用的生物 活性。這為建立高效穩(wěn)定hBD-2植物表達(dá)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步解決在體外規(guī)?；a(chǎn) 具有生物活性的人防御素提供新途徑。
權(quán)利要求
1、人β—防御素-2植物高效表達(dá)質(zhì)粒載體，含有啟動(dòng)子、人β—防御素-2基因、終止子和兩個(gè)篩選基因卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，其特征在于在pCAMBIA1300植物表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，用基因重組的方法連接Nos終止子和一個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子，并將人β—防御素-2基因插入CaMV 35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間，得到重組人β—防御素-2植物表達(dá)載體rp1300-hBD2，該基因表達(dá)載體含有兩個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明為人β-防御素-2基因重組植物高效表達(dá)載體，涉及基因重組領(lǐng)域，蔡紹輝等在《四川大學(xué)學(xué)報(bào)》上發(fā)表重組hBD2植物表達(dá)載體含有報(bào)告基因，影響hBD2的一級(jí)結(jié)構(gòu)和正確空間結(jié)構(gòu)的形成。為此本發(fā)明提供了一種人β-防御素-2基因重組植物高效表達(dá)質(zhì)粒載體，含有啟動(dòng)子、人β-防御素-2基因、終止子和篩選標(biāo)記基因，在pCAMBIA1300植物表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，用基因重組的方法連接Nos終止子和一個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子，并將人β-防御素-2基因插入CaMV 35S啟動(dòng)子和Nos終止子之間，得到重組人β-防御素-2植物表達(dá)載體rp1300-hBD2，該基因表達(dá)載體含有兩個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子，兩個(gè)篩選基因卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。具有空間結(jié)構(gòu)與天然hBD-2完全一致、抗菌活性高的有益效果。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101469334SQ20071030698
公開(kāi)日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者令亞琴, 恒 劉, 昕 劉, 勇 張, 濤 景, 娟 李, 青 李, 李培強(qiáng), 潘興斌, 牟長(zhǎng)軍, 虹 王, 王晶宇, 鄭國(guó)锠, 陳新年, 彧 雒, 儉 韓 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)