專利名稱：一株對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案涉及一種通過分子生物學(xué)手段，利用代謝工程改造的細(xì)菌， 具體的說是一株對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌菌株、構(gòu)建方法及其在檢測(cè)氧還循環(huán)反 應(yīng)劑的生物傳感器研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
研究顯示，氧化應(yīng)激參與了神經(jīng)退行性變、癌癥和衰老等的發(fā)生過程。其中，主要因素 之一就是氧還循環(huán)反應(yīng)劑(redox cycling reagents),這類物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過氧化還原循環(huán)反應(yīng) 產(chǎn)生活性氧簇(ROS)而參與上述疾病的發(fā)生發(fā)展。氧還循環(huán)反應(yīng)劑在一些酶的催化下，被 還原當(dāng)量NADH/NADPH所還原發(fā)生單電子傳遞反應(yīng)，將電子傳遞給分子氧生成超氧陰離子 (見圖1)。超氧陰離子產(chǎn)生的過程是(l)在硫辛酸脫氫酶的催化下，氧還循環(huán)反應(yīng)劑(RW) 被還原(R+); (2)被還原的氧還循環(huán)反應(yīng)劑(R+)將電子傳遞給分子氧生成超氧陰離子，而 本身又被重新氧化為原來的狀態(tài)(R++)。硫辛酸脫氫酶是一類普遍存在的黃素酶，在大腸桿 菌中至少有三種這類酶，其中的兩種酶已經(jīng)被鑒定，它們是硫氧還蛋白還原酶和NADPH: 鐵氧還蛋白還原酶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞這類酶主要包括微粒體NADPH-細(xì)胞色素P-450還原、 黃素嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶。上述網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)就是在硫辛酸脫氫酶和氧還循環(huán)反應(yīng)劑的催 化下，NADPH迅速氧化分子氧生成超氧陰離子?？傊?xì)胞暴露在氧還循環(huán)反應(yīng)劑下有兩 個(gè)主要的后果1)細(xì)胞內(nèi)大量還原當(dāng)量NAD(P)H的消耗；2)細(xì)胞內(nèi)過氧化物的大量生成。
氧還循環(huán)反應(yīng)劑是主要的工農(nóng)業(yè)污染物之一，對(duì)于工農(nóng)業(yè)污染物的監(jiān)測(cè)已經(jīng)發(fā)展了一些 物理化學(xué)方法，質(zhì)譜儀、氣相色譜儀及其它現(xiàn)代化的儀器無疑為污染物的精確監(jiān)測(cè)提供了強(qiáng) 有力的技術(shù)，但是，這些物理化學(xué)方法需要昂貴的儀器和專門的實(shí)驗(yàn)室，更重要的是，這些 技術(shù)雖說能夠精確定量污染物，但是不能提供這些污染物的生物有效度、細(xì)胞內(nèi)潛在的修飾/ 去毒作用以及體內(nèi)的協(xié)同/拮抗效應(yīng)等生物學(xué)關(guān)鍵信息。因此，有必要發(fā)展一種生物傳感器來 對(duì)這些有毒物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。在過去的十幾年里，利用生物檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)特殊污染物的研究 引起了廣泛的關(guān)注，生物檢測(cè)技術(shù)的基本原理即是利用模式生物對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的分子反應(yīng)
機(jī)理。對(duì)于生物檢測(cè)技術(shù)而言需要三種必需的元件1)針對(duì)特定或具有相似性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì) 的感應(yīng)器；2)由感應(yīng)器控制的啟動(dòng)子；3)受此啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因。在設(shè)計(jì)生物檢測(cè)技 術(shù)時(shí)，由于細(xì)菌具有在環(huán)境中大量存在、生長(zhǎng)快速、低成本及易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn)而受到研究人員 普遍親睞。至今，己經(jīng)研發(fā)了一系列針對(duì)特定有機(jī)物和無機(jī)化合物如重金屬、甲苯及其衍 生物和其它物質(zhì)檢測(cè)的生物傳感器?，F(xiàn)在己經(jīng)比較清楚大腸桿菌針對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑反應(yīng)的分子機(jī)理。兩種氧還反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因 子，SoxR和OxyR，主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的反應(yīng)。SoxR包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域N 端螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋DNA結(jié)合域和C端的調(diào)節(jié)域。SoxRC端的四個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)作為鐵 硫中心(2Fe-2S)的配體。純化的SoxR是一同源二聚體，每一單體包含一個(gè)鐵硫中心(2Fe-2S)。 在普通培養(yǎng)條件下，細(xì)菌中SoxR (2Fe-2S)處于還原狀態(tài),無任何轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)在培養(yǎng)基中加 入氧還循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目標(biāo)基因^xS的表達(dá)。其產(chǎn)物SoxS是 Ara-C相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活子，能誘導(dǎo)36種基因的表達(dá)，其中包括含有Mn-超氧化物歧化酶(SODA)、 核酸內(nèi)切酶IV、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、延胡索酸酶C、烏頭酸酶A和NADPH-鐵氧還蛋白氧化 還原酶等基因。
OxyR是大腸桿菌中另一種主要的氧還轉(zhuǎn)錄因子。與SoxR不同，OxyR含有兩個(gè)氧還活性 半胱氨酸殘基(Cysl99和Cys208)。 OxyR氧化和還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示這兩個(gè)氧 還活性半胱氨酸殘基之間大約相隔17A。在氧化狀態(tài)下，二硫鍵的形成導(dǎo)致OxyR調(diào)節(jié)域結(jié)構(gòu) 的顯著改變。OxyR二硫鍵可逆的形成被認(rèn)為代表細(xì)胞內(nèi)感受過氧化氫的一種機(jī)制，然而，也 有人認(rèn)為OxyR有其它的激活機(jī)制。因?yàn)椴糠钟裳踹€循環(huán)反應(yīng)劑刺激細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子被 轉(zhuǎn)化為過氧化氫，所以O(shè)xyR在大腸桿菌內(nèi)也被氧還循環(huán)反應(yīng)劑所激活?；罨腛xyR刺激一 大類基因的表達(dá)，其中包括過氧化氫酶I a^G)、谷氨酰氧還蛋白I (grxj)、烷基過氧化氫還 原酶大亞單位(fl/y F)和鐵氧還蛋白2 (RjcC)等基因。
研究人員巳嘗試應(yīng)用大腸桿菌wx&:/acZ融合基因、sox&:/wxOX4AE融合基因、 M^4::/^CZX4S五融合基因檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑。但是，這些融合基因建構(gòu)對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑 的檢測(cè)受到很大的限制，因其敏感度不高，不能用于環(huán)境中氧還循環(huán)反應(yīng)劑的檢測(cè)。
新的研究焦點(diǎn)集中在增加對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑生物檢測(cè)的靈敏度上來，在我們的研究中， 提出這樣一個(gè)假設(shè)限制檢測(cè)敏感性的主要因素是大腸桿菌對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的快速生物反 應(yīng)，即氧還循環(huán)反應(yīng)劑刺激細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子和過氧化氫被相關(guān)基因編碼的酶類迅速降 解，使得啟動(dòng)融合基因的報(bào)告基因產(chǎn)生的信號(hào)不夠強(qiáng)，導(dǎo)致了檢測(cè)靈敏度不高。
研究顯示，負(fù)責(zé)分解大腸桿菌中超氧化物的酶有三種Mn-超氧化物岐化酶(MflL4)， Fe-超氧化物岐化酶(wc/B)和Cu/Zn-超氧化物岐化酶(卵dC)。 Fe-超氧化物岐化酶為組成性表 達(dá)，負(fù)責(zé)內(nèi)源性超氧化物的清除。Mn-超氧化物岐化酶的表達(dá)分別受到轉(zhuǎn)錄因子Fur (鐵吸收 調(diào)節(jié))和wd5 (有氧呼吸控制)系統(tǒng)的抑制，但是，氧還循環(huán)反應(yīng)劑通過wjd S調(diào)節(jié)系統(tǒng)誘 導(dǎo)其高表達(dá)。Cu/Zn-超氧化物岐化酶只在靜止期的大腸桿菌內(nèi)積聚，并分泌到外周胞質(zhì)中。 然而Cu/Zn-超氧化物岐化酶對(duì)早期靜止期的細(xì)胞生長(zhǎng)重要，細(xì)胞溶質(zhì)中的Mn-超氧化物岐化酶 和Fe-超氧化物岐化酶主要負(fù)責(zé)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)超氧化物轉(zhuǎn)化成氧和過氧化氫。研究顯示敲除 wt^和^K^能增加大腸桿菌對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，但不會(huì)顯著影響在豐富培養(yǎng)基中的 需氧生長(zhǎng)。大腸桿菌中還有兩類主要的催化酶過氧化氫酶I/催化酶(& 5)和垸基過氧化氫還原酶 (a/y^和a/^C)，它們負(fù)責(zé)將過氧化氫轉(zhuǎn)化成氧和水。烷基過氧化氫還原酶對(duì)過氧化氫的親 合力要強(qiáng)于過氧化氫酶I，是內(nèi)源性過氧化氫主要的清除者。另一方面，過氧化氫酶I (to/G) 性質(zhì)更加活躍，主要負(fù)責(zé)高濃度時(shí)過氧化氫的清除。
敲除這些基因(w^4、 ^c^、 "/^cF和;t^G)將會(huì)顯著增加大腸桿菌對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑
的敏感性?，F(xiàn)在己有TOcJL4和soc^雙突變株(JI312)和)fc^G突變株(JI361)的商品供應(yīng)， 但是這些突變株都是通過轉(zhuǎn)座子致基因干擾制備而得的，其中一些還帶有抗生素抗性標(biāo)記。 為避免大腸桿菌內(nèi)導(dǎo)入額外的缺失/突變和表達(dá)質(zhì)粒，我們?cè)跇?gòu)建多基因缺失株時(shí)不導(dǎo)入任何 DNA標(biāo)志。需氧生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫。因此，大腸桿 菌內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫的本底水平將會(huì)限制其對(duì)由氧還循環(huán)反應(yīng)劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的 檢測(cè)敏感度。
研究顯示一種不需氧末端氧化酶一延胡索酸還原酶是有氧生長(zhǎng)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源 性過氧化物和過氧化氫的主要催化酶。編碼延胡索酸還原酶基因一/raL4BCD的失活基本不影 響其需氧生長(zhǎng)能力，但能顯著減少內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生。大腸桿菌延胡索酸還 原酶由四個(gè)亞單位組成，其中兩個(gè)亞單位，黃素結(jié)合蛋白(FrdA)和鐵蛋白(FrdB),構(gòu)成 催化延胡索酸還原成琥珀酸的可溶性結(jié)構(gòu)域。其余兩個(gè)亞單位(FrdC和FrdD)是跨膜多肽， 涉及膜上與甲萘醌的電子傳遞。與琥珀酸脫氫酶不同，延胡索酸還原酶有一特殊性質(zhì)，即其 黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)成份具很高的電子密度，這些性質(zhì)使得延胡索酸還原酶比琥珀 酸脫氫酶更易與氧反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物和過氧化氫。其結(jié)構(gòu)信息與早期的觀察表明，是延胡索 酸還原酶，而不是琥珀酸酰氫酶，是有氧生長(zhǎng)條件下大腸桿菌產(chǎn)生的內(nèi)源性過氧化物和過氧 化氫主要的催化酶。
為了使大腸桿菌內(nèi)源性過氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生保持在最低水平，編碼延胡索酸還原 酶的/hi4SCD基因應(yīng)被敲除。因此，上述相關(guān)基因的敲除構(gòu)建一株穩(wěn)定的多基因突變株作為 檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的反應(yīng)宿主，能夠解決生物檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)細(xì)菌本 身靈敏度不高的問題，為研發(fā)高敏感性檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器打下良好的基礎(chǔ)， 經(jīng)檢索本研究構(gòu)建的多基因突變菌株在國內(nèi)外均無文獻(xiàn)報(bào)道及專利授權(quán)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建對(duì)氡還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿 菌菌株，以解決生物檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)細(xì)菌本身敏感性不高的問題。
本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用技術(shù)方案:構(gòu)建一株多基因缺失的大腸埃希氏菌^^/ieWc;H'fl
CO//WMC-001,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址中國北 京，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2006年11月22日，保藏編號(hào)CGMCCNo: 1867。用于本發(fā)明￡.co// WMC-001菌株基因敲除工作的工具是條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV，其構(gòu)建的 打耙載體包括pKOV-TOflL4、 pKOV—otffi、 pKOV-fe^G、 pKOV國a/z; CF及pKOV-/raL45CI>，其 中以載體pKOV-/"MSCD為例構(gòu)建(見圖3 )。
本發(fā)明的Eco//WMC-001菌株的構(gòu)建方法是利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作為工具，利用 同源重組原理，通過基因敲除技術(shù)將細(xì)菌基因組中編碼分解超氧化物的酶(m^4和wc^)和 分解過氧化物和過氧化氫的酶和fl/y CF)及生成內(nèi)源性超氧化物和過氧化氫的酶 (/raL45CZ))全部敲除，其中以/^45CD基因的敲除為例說明敲除的方法，利用聚合酶鏈反 應(yīng)(PCR)技術(shù)將大腸桿菌基因組中與目的基因/^L45CD兩側(cè)相連DNA片段N和C進(jìn)行擴(kuò) 增。按照我們的經(jīng)驗(yàn)，需要較大的DNA片段N和C (每段DNA長(zhǎng)度為 500bp)才能利用宿 主重組酶系統(tǒng)成功進(jìn)行重組。對(duì)于DNA片段N，引物No被設(shè)計(jì)成含有內(nèi)切酶位點(diǎn)，引 物Ni5'端含有33bp長(zhǎng)度的拖尾；DNA片段C的引物Co被設(shè)計(jì)成含有S"/I內(nèi)切酶位點(diǎn)，引 物Ci 5'端也含有33bp長(zhǎng)度的拖尾，序列與引物Ni 5'端拖尾互補(bǔ)。從兩PCR反應(yīng)中合成的 DNA產(chǎn)物通過交叉PCR連接形成不含有目的基因/^^50)的一段DNA片段。
/rcW^CD基因敲除的合成DNA片段被克隆進(jìn)pKOV質(zhì)粒的Wort、 &/I內(nèi)雙酶切位點(diǎn)。 克隆的質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入重組頻繁的大腸桿菌株MC4100。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氯 霉素/LB平板并置42。C孵育。平板上存活的菌落指示重組pKOV質(zhì)粒巳成功整合進(jìn)入基因組 DNA，因?yàn)橛坞x質(zhì)粒不會(huì)在非允許溫度下復(fù)制增殖。存活的菌落將會(huì)立即被置于含5%(W/V) 蔗糖的平板上置3(TC培養(yǎng)以選擇發(fā)生第二次重組事件的大腸桿菌克隆。對(duì)蔗糖抵抗且對(duì)氯霉 素敏感的細(xì)菌克隆被挑選用作進(jìn)一步分析。
如果插入及整合事件全發(fā)生在目的基因/W^SCZ)的同一側(cè)的話，將會(huì)產(chǎn)生象親代一樣的 大腸菌株。另一方面，如果插入與整合發(fā)生在目的基因/^MBCD的不同側(cè)的話，就會(huì)刪除基 因/n"5CZ)。因此，陽性克隆通過針對(duì)目的基因/nWSCD兩側(cè)序列的引物的PCR方法加以確 證。此基因替換方法實(shí)現(xiàn)在不導(dǎo)入基因組中任何抗生素抗性DNA標(biāo)志的情況下實(shí)現(xiàn)精確基 因刪除。使用不同的打靶載體進(jìn)行重復(fù)操作，將另外四個(gè)基因敲除，就獲取具有卵W、 wd5、 itoG、 a/^CF及/raL450)五個(gè)基因缺失的Eco/; WMC-001菌株。
本發(fā)明的有益效果是這個(gè)菌株對(duì)于典型氧還循環(huán)反應(yīng)劑VitK3、 PMS和PQ的敏感性 明顯高于野生菌MC4100，并且在幾個(gè)突變菌株中五.co/!'WMC-001的敏感性是最高的。利用 本發(fā)明提供的Eco/z'WMC-001菌株作為檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的反應(yīng)宿主菌，可 以使其對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性明顯增加，利用本發(fā)明提供的菌株作為宿主菌可以在環(huán)境 污染物一氧還循環(huán)反應(yīng)劑的檢測(cè)中得到應(yīng)用。


下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
圖1:氧還循環(huán)反應(yīng)劑(11++)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子 圖2: /AYi4^:Z)基因片段交叉PCR反應(yīng) 圖3:打靶載體pKOV-/raL4SCZ)的構(gòu)建 圖4: ./^4SCD基因敲除的流程圖
圖5:五個(gè)基因缺失的大腸桿菌模式圖 圖6:突變菌生長(zhǎng)曲線
圖7:突變菌對(duì)VitK3敏感性(終點(diǎn)法) 圖8:突變菌對(duì)VitK3敏感性圖(生長(zhǎng)曲線法)
圖9:突變菌對(duì)PMS敏感性圖(生長(zhǎng)曲線法) 圖10:突變菌對(duì)PQ敏感性圖(生長(zhǎng)曲線法)
圖ll:突變菌對(duì)VitK3敏感性圖(MIC法)
圖12:突變菌對(duì)PMS敏感性圖(MIC法)
圖13:突變菌對(duì)PQ敏感性圖(MIC法)
圖14: PQ藥液稀釋 圖中標(biāo)號(hào)說明 A: MflL4突變株； G: A加G突變株； C: a/^CF突變株； B: mc^突變株； F: /rd^8CZ)突變株； BF: wc/S、 /W/^CD雙突變株； AB: mW、 too^雙突變株；
CBF: a一CF、 mo 仏/r^4BCD三突變株； GCBF: to,G、 a/z; CF、 toc/5、々aL45CD四突變株；
AGCBF: GCBF: torG、 a/ipCF、 soc^、/ra^5CZ)五突變株￡.co//WMC-001 。
PQ:百草枯。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。 實(shí)施例l
將通過兩步PCR擴(kuò)增出包含基因/^i4BCD兩端各500bp左右不含該基因lkb左右的PCR 片斷，克隆到pKOV條件復(fù)制質(zhì)粒，構(gòu)建？&0^/ ^^^)打靶載體(見圖2、 3);將該重組 子轉(zhuǎn)化入高重組率的大腸桿菌MC4100中，通過溫度及蔗糖的選擇，發(fā)生兩次同源重組，最 后將基因/raL45Ci)替換，得到基因/^4SCD缺失的大腸桿菌，同樣原理利用w^、卵必、 ferfG和a/^CF四個(gè)基因的打靶載體，可以依次敲除這些基因，從而得到了/raL45CD、 soW、 m必、tofG和a/^CF五個(gè)基因缺失的大腸桿菌突變株。
實(shí)施例2
用于本發(fā)明的對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑超敏感的大腸桿菌的構(gòu)建具體方法如下
第一部分打靶載體的制備
一、目的基因的獲得
(一) 引物信息及合成
根據(jù)Harvard Molecular Technology Group & Lipper Center for Computational Genetics網(wǎng)站 提供的引物序列，聯(lián)合Primer5.0及DNAMAN軟件對(duì)引物作適當(dāng)改動(dòng)，/raL4BCD，網(wǎng)站所給 的序列是單個(gè)基因，這里是需要把四個(gè)基因一起刪除，所以要選用/^i4及^r/D兩個(gè)外側(cè)基因 的外側(cè)引物作為PCR的引物，引物由大連寶生物公司合成。用無菌去離子水將引物溶解，配 成濃度為10 pmol/L。
(二) 兩步PCR反應(yīng)
第一步擴(kuò)增兩個(gè)同源臂
用接種針挑取LB平板五.co/z' MC4100 —單個(gè)菌落少許，混于取含15 pL無菌水的200 nL PCR反應(yīng)管中，沸水煮10 min， 1,2000 rpm離心3~5 min把凝結(jié)在蓋子上的水滴離到管底。 取以下配好體系5iaL加入該管中，混勻。 _
ReagentsVolume(|oL)
dNTP Mixture (2.5 mM)2
尸戶6e5f DN A Polymerase (5 U/pL)0.09
ra《ai a 7i^ (5U/(jL)0.03
Primer No or Co0.4
Primer Ni or Ci0.4
10xbuffer(plus Mg2+)2
Total~5
PCR反應(yīng)條件如下94°C 1 min; 88°C4 min; 94°C 10 sec， 66°C3 min， 25個(gè)循環(huán)；72°C 10 min， 4。C保存。取5)iL產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純 化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的TE或ddH20溶解洗脫備用。 第二步交叉PCR
體系如下
ReagentsVolume(|jL)
dNTP Mixture (2.5 mM)2
尸戸6eW DNA Polymerase (5 U/|iL)0.09
ra《(5U/(jL)0.03
N端同源臂PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5
C端同源臂PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5
Primer No0.4
Primer Co0.4
lOxbuffer(plus Mg2+)2
ddH2014
Total20
PCR反應(yīng)條件同第一步PCR。
(三) PCR產(chǎn)物加A反應(yīng)
在上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中按每50 加入5 U的比例加入￡x Tfl^^聚合酶，72°C 10 min。
(四) PCR片斷純化回收
加A反應(yīng)產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的TE或ddH20溶解洗脫備用。
(五) 、目的片段與pMD18-T simple載體連接
按TaKaRa公司的pMD18-T simple Vector試劑盒說明書進(jìn)行T載體與目的基因的連接。
連接反應(yīng)體系
ReagentsVolume((jL)
pMD18-T simple Vector1
回收產(chǎn)物1
ddH203
Ligation Solution5
Total10
連接反應(yīng)于16'C過夜。
(六) 轉(zhuǎn)化
通過冷CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細(xì)胞中。
(七) 測(cè)序
挑選一個(gè)經(jīng)外側(cè)引物No、 CoPCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定證實(shí)的單克隆送大連寶生物公司 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中被刪除基因兩端同源臂與NCBI上提供的標(biāo)準(zhǔn)參考序列比對(duì)。
(八) 重組克隆pMD18T-/ni45a 的雙酶切和目的片段/ni4BO)的回收1. 堿裂解法小量質(zhì)粒DNA的制備
2. pMD18TV^^SCD質(zhì)粒的雙酶切和目的片段//yMSC"的回收
提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，其反應(yīng)體系如下37°C，酶切3h。目的片段々^4BCD的
切膠回收酶切反應(yīng)后產(chǎn)物行0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，在長(zhǎng)波紫外燈下切割目的DNA
片段，以TaKaRa公司膠回收試劑盒進(jìn)行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析儀對(duì)回收產(chǎn)物定
量(見圖4)。 _
_Reagents _Volume(|jL)
pMD18T-/r雄CZ) 10 淑I (10U/|aL) 1 &/I (而"L) 1 10xHBuffer 2 0.1%BSA 2
_ddH20_^_
_ Total 20
二 pKOV載體片段的制備
(一) 堿裂解法中量制備pKOV載體
因?yàn)橘|(zhì)粒pKOV是低拷貝的(5-10個(gè)/ce11)，為了得到足夠的量就選用質(zhì)粒中量提取法。
(二) pKOV質(zhì)粒的雙酶切及其回收
體系及酶切條件同質(zhì)粒，回收純化載體片段。 三、打耙載體pKOV-/ni4fiCi)的構(gòu)建及保存
(一) 目的片斷與載體的連接反應(yīng)_
_R6ag6nts_Volume((xL)
pKOV載體 2 /W^BCD片斷 3 T4 DNA連接酶 2 lOxbuffer 2.5
ddH20_10.5
Total 20 —
連接反應(yīng)于16'C過夜。
(二) 將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH-5a感受態(tài)細(xì)胞中
(三) 陽性克隆的鑒定 1. PCR鑒定
用接種針挑取LB CM+平板單個(gè)菌落少許，混于取含14 無菌水的200 pLPCR反應(yīng)管 中，沸水煮10min， 1,2000 rpm離心3 5 min把蓋子上的水蒸氣離到管底。取以下體系加入 該管中，混勻。dNTP Mixture (2.5 mM)
MgCl2 (25 mM) 7k^i a7^ (5U/|aL) Primer No or Co Primer Ni or Ci lOxbuffer(plus Mg2+) Total
Volutne([xL)
1.5 0.1 0.4 0.4 2
說明書第9/15頁
PCR反應(yīng)條件如下94°C 1 min; 88°C 4 min; 94°C 10 sec, 66°C 3 min， 25個(gè)循環(huán)； 72°C 10min， 4。C保存。取5 產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。 電泳顯示PCR片斷長(zhǎng)度在lkb左右的原被克隆挑選出，進(jìn)行下面的質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。 2.質(zhì)粒雙酶切鑒定
1) 上述克隆質(zhì)粒的中量提取(同上述)
2) 體系及酶切條件同pMD18T-/^^a)質(zhì)粒。酶切反應(yīng)后產(chǎn)物行0.8%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電 泳鑒定。酶切片斷在lkb左右證實(shí)打靶載體構(gòu)建成功，菌種置含甘油15。/。的LBCM+中，-70 'C保存，備用。
四、打耙載體pKOV-soflL4、 pKOV-sorf5、 pKOV-Aflrt 和pKOV-flA/;CF的構(gòu)建及保存
利用同樣操作程序，構(gòu)建另外四個(gè)打靶載體pKOV-5oW、 pKOV—oc^、 pKOV-toW和 pKOV-a/z/7CF轉(zhuǎn)化入DH-5a中，菌種置含甘油15%的LB CM+中，-70°。保存，備用。
第二部分Ecd'WMC-001菌株的構(gòu)建
一、/nW50)基因的敲除
(一) 同源重組率高的MC4100感受態(tài)細(xì)胞的制備
(二) 打靶載體pKOV-yhi45CZ)轉(zhuǎn)化入Eco/Z MC4100感受態(tài)細(xì)胞
1. DH-5a中pKOV-y^45CD打耙載體的提取(試劑盒法TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.2.0)
2. 打靶載體pK0V-/^45O)轉(zhuǎn)化
(三) 第一步同源重組(//vM5CD整合到大腸桿菌的基因組中) 1. 30°C LBCM+平板生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落PCR鑒定
用接種針挑取LB CM+平板單個(gè)菌落少許，混于取含14 ^il無菌水的200 ^ PCR反應(yīng)管中， 沸水煮10 min， 1，2000 rpm離心3~5 min把蓋子上的水蒸氣離到管底。取以下配好體系6.4 pl 加入該管中，混勻。_Reagents_Volume(|jL)
dNTP Mixture (2.5 mM) ^ MgCl2 (25 mM) 1.5 7^幽7^ (5U/^iL) 0.1 Primer No or Co 0.4 Primer Ni or Ci 0.4
lOxbuffer(plus Mg2+)_2
Total 6.4
PCR反應(yīng)條件如下94°C 1 min; 88。C4min; 94°C 10 see, 66°C 3 min， 25個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min， 4'C保存。取5 pi產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。
2. PCR結(jié)果為約lkb的原菌落取3 5個(gè)克隆稀釋于42'C預(yù)熱lmlLB培養(yǎng)基中，按10倍、 100倍稀釋，并各取0.1mL分別涂于42。C預(yù)熱的LBCM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒 置培養(yǎng)皿，42'C過夜。
(四) 第二步同源重組(質(zhì)粒與基因組分離并丟失)
1. 42°C LBCM+平板生長(zhǎng)的單個(gè)菌落的PCR鑒定(方法同上)
2. PCR產(chǎn)物為兩條帶，其亮度相當(dāng)(約lkb和長(zhǎng)片斷4kb左右的長(zhǎng)度)證明已經(jīng)發(fā)生了第一 步同源重組，片斷及質(zhì)粒已經(jīng)整合到基因組上。選取這樣的菌落3 5個(gè)克隆，分區(qū)劃線于42 。C預(yù)熱的LBCM+的平板上，42。C培養(yǎng)18-20 h，長(zhǎng)出單個(gè)菌落。
3. 選取上述菌落3 5個(gè)稀釋于3(TC預(yù)熱lmLLB培養(yǎng)基中，按103、 104、 105倍稀釋，并各 取O.l mL分別涂于3(TC預(yù)熱的LB 5%蔗糖的平板上。待菌液完全吸收后，倒置培養(yǎng)皿，30 'C過夜。
(五) 氯霉素(CM+)平板的負(fù)篩選
用接種針挑取30'C， LB 5%蔗糖的平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落，分別接種于LB CM+平板上 和LB 5%蔗糖平板上，3(TC過夜培養(yǎng)。
(六) 合格菌落的PCR篩選
30°C LBCM+平板不生長(zhǎng)，LB5。/。蔗糖平板上生長(zhǎng)的菌落作PCR鑒定(方法見上述)
PCR產(chǎn)物約為lkb的菌落初步證實(shí)為已經(jīng)敲除掉基因的陽性菌落。
PCR進(jìn)一步鑒定證實(shí)敲除成功。 二、 sorf5、 fl/^CF、 Aa,G和sodL4基因的順序敲除
利用同樣的方法，依次敲除wcffi、 a/^CF、 fe^G和M^4四個(gè)基因，獲得最終菌株 MC4亂實(shí)施例3
為了檢測(cè)五個(gè)基因突變菌株￡.co// MC4100對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，我們選擇具有 代表性的氧還循環(huán)反應(yīng)劑VitK3、 PMS和PQ做氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)施如下
一、 突變菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定
1. 種子液制備
取LB平板上的單個(gè)新鮮菌落，接種于2mlLB液體培養(yǎng)基，200 rpm， 37'C振蕩過夜， 培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。
2. 調(diào)整起始菌液的OD6oo值
(1) 吸取飽和菌液200nl加入到含有LB液體培養(yǎng)基1,800 pl的比色皿中吹吸混勻，用空白LB 液體培養(yǎng)基調(diào)零，測(cè)定OD,值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD6oo值。
(2) 按照公式V4 / 0D6()()，計(jì)算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液 OD6oo值約為0.02
(3) 按照計(jì)算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時(shí)分別吸取菌液 2ml加入到比色皿中測(cè)定OD6oo值(作為0hOD畫值)。
(4) 分裝將上述稀釋好的培養(yǎng)，按照2mL/管加入到無菌試管中。
3. 標(biāo)記編號(hào)
五個(gè)基因突變株，按照2h、 4h、 6h、 8h、 10 h、 12 h、 14 h、 16h標(biāo)記； 野生型菌株按照lh、 2h、 3h、 4h、 5h、 6h標(biāo)記。
4. 培養(yǎng)
將上述試管在37'C下振蕩培養(yǎng)。然后分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間將試管取出，立即放冰箱中貯存， 待培養(yǎng)結(jié)束時(shí)一同測(cè)定OD值。
5. 生長(zhǎng)量測(cè)定
將未接種的LB培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)零點(diǎn)，作為 空白對(duì)照，并對(duì)不同時(shí)間培養(yǎng)液從Oh起依次進(jìn)行測(cè)定，對(duì)濃度大的菌懸液用未接種的LB液 體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其OD值在0.10-0.65以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測(cè)得的OD值要乘以稀釋 倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的OD值。
6. 結(jié)果
以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD6oo值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。
二、 突變菌株對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性實(shí)驗(yàn)
(一)突變菌株對(duì)VitK3、 PMS及PQ的敏感性實(shí)驗(yàn)(生長(zhǎng)曲線法) 1.種子液的準(zhǔn)備
取LB平板上的單個(gè)新鮮菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基，200rpm， 37。C振蕩過夜，
培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。2. 調(diào)整起始菌液的OD6oo值
(1) 吸取飽和菌液200nl加入到含有LB液體培養(yǎng)基l,800pl的比色皿中吹吸混勻，用空白LB 液體培養(yǎng)基調(diào)零，湖!l定OD6oo值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD6oo值。
(2) 按照公式V4 / OD6(K)，計(jì)算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液 OD6oo值約為0.02。
(3) 按照計(jì)算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時(shí)分別吸取菌液 2ml加入到比色皿中測(cè)定OD6(K)值(作為0hOD,值)。
(4) 將三角燒瓶放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37。C振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。
3. 加入氧還循環(huán)反應(yīng)劑
WT培養(yǎng)lh取出，以每20ml分裝入含有不同量氧還循環(huán)反應(yīng)劑的50ml無菌離心管中，充 分混勻，然后，以每管2ml再分裝，以時(shí)間作為標(biāo)記。
MT培養(yǎng)2h取出，以每20ml分裝入含有不同量氧還循環(huán)反應(yīng)劑的50ml無菌離心管中，充 分混勻，然后，以每管2ml再分裝，以時(shí)間作為標(biāo)記。
將分裝好的試管放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37'C振蕩培養(yǎng)
4. OD6oo值測(cè)定
WT每隔1 h取出相應(yīng)的試管測(cè)定OD6oo值。 MT每隔2 h取出相應(yīng)的試管測(cè)定OD6(K)值。
5. 數(shù)據(jù)處理
繪制不同濃度氧還循環(huán)反應(yīng)劑影響兩種菌株的生長(zhǎng)曲線。 (二)突變菌株對(duì)VitK3、 PMS及PQ的敏感性實(shí)驗(yàn)(終點(diǎn)法)
1. 種子液的準(zhǔn)備
取平板上的單個(gè)菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基，200 rpm， 37。C振蕩培養(yǎng)至飽和狀態(tài)。
2. 氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性試驗(yàn)流程 (1)調(diào)整起始菌液的OD6oo值
1) 吸取飽和菌液200nl加入到含有LB液體培養(yǎng)基1，800 pl的比色皿中吹吸混勻，用LB調(diào)零， 測(cè)定OD6oo值，結(jié)果乘10即為飽和菌液的OD6oo值。
2) 按照公式V4 /OD6Q()，計(jì)算出需加入到50mlLB液體培養(yǎng)基中的菌液量，使起始菌液00600 值約為0.02
3) 按照計(jì)算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，同時(shí)分別吸取菌液2ml 加入到比色皿中測(cè)定OD6oo值(作為OhOD6oo值)，lm咖入到一支無菌1.5mlEP管中(4°C 保存，用于CFU的測(cè)定)。
4) 將三角燒瓶及試管同時(shí)放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37'C振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。(2) 加入氧還循環(huán)反應(yīng)劑
WT培養(yǎng)lh， MT培養(yǎng)2h取出，以每3ml分裝入含有不同量的氧還循環(huán)反應(yīng)劑的無菌試管中， 混勻。
(3) 將分裝好的試管放入振蕩培養(yǎng)箱，200rpm， 37'C振蕩培養(yǎng) WT菌株培養(yǎng)至6h取出試管(時(shí)間從0h即OD60()值0.02時(shí)開始計(jì)算)每支取200pl測(cè)定
OD,值(方法同種子液的測(cè)定)剩余取l ml加入到一支無菌1.5 mlEP管中(4'C保存，用于CFU 的測(cè)定)。MT菌株培養(yǎng)12h (以下同上) 3. CFU測(cè)定
WT取0h、 6h的菌液用無菌0.9。/。 (150mM)生理鹽水(NS)稀釋至106、 107和108倍， (根據(jù)OD值確定選用哪個(gè)稀釋倍數(shù)作為涂板用，原則按照lOD60() lxl09 cells/ml)吸取200pl 涂在LB固體平板上，37'C過夜培養(yǎng)，次日觀察細(xì)菌個(gè)數(shù)，計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原菌液的 活細(xì)菌數(shù)。
MT取0h、 12h的菌液按照上述處理 (三)瓊脂稀釋法測(cè)定VitK3、 PMS和PQ對(duì)各種菌株的最低抑菌濃度MIC 1.實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作
(1) 配制所需的培養(yǎng)基 LB固體液體
(2) 藥物原液配制
1) 0,1 MVitK3配制
準(zhǔn)確稱取VitK3粉末0.17128 g溶于無水乙醇并定容至10 ml用，0.22 pm濾菌器過濾除 菌，-20匸避光保存。
2) 0.1 MPMS
準(zhǔn)確稱取PMS粉末0.30634 g溶于超純水并定容至10 ml，用0.22 pm濾菌器過濾除菌， -20°。避光保存。
3) 0.1 MPQ
瓶裝PQ(100mg)全量溶解在2mL超純水，并最終定容在3.889mL，用0.22 pm濾菌 器過濾除菌，-2(TC避光保存。(3) 藥液稀釋見圖14
(4) 種菌
將實(shí)驗(yàn)菌選用經(jīng)過平板新鮮培養(yǎng)并分純后的單個(gè)菌落接種于2 ml LB液體試管中37°C 200 rpm過夜
2. 實(shí)驗(yàn)當(dāng)n
(1) 將培養(yǎng)基融化放置57"C水浴中備用
(2) 加藥將稀釋好的不同濃度的氧還循環(huán)反應(yīng)劑對(duì)應(yīng)終濃度按量加入平板中
(3) 倒平板用無菌15ml離心管(帶刻度)量取10ml培養(yǎng)基，倒入加好藥液的平皿中，
充分與其混勻。
(4) 將凝固好的固體平皿放置37i:溫箱中30min，去掉水汽。
(5) 稀釋菌用微量加樣器吸取原始菌液100 pl加入到800 ^ LB液體培養(yǎng)基中，五個(gè)基因 和四個(gè)基因突變株做10—'稀釋，其它菌株做10—2稀釋，使菌液達(dá)到約107CFU/ml。
(6) 將稀釋后菌液取1 nl滴加在含不同濃度VitK3的平皿上，以野生菌做為對(duì)照，放置溫箱 37°C 18 24h。
3. 記錄結(jié)果
試驗(yàn)第二天，觀察細(xì)菌有無生長(zhǎng)，以未見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
敲除fi:個(gè)基因后，細(xì)菌在有氧環(huán)境下生長(zhǎng)緩慢(見圖8)，但是對(duì)于VkK3、 PMS和PQ 的敏感性顯著高于野生型大腸桿菌MC4100 (見圖7、 8、 9、 10);并且對(duì)于VitK3、 PMS和
PQ的敏感性在所有構(gòu)建的菌株中是最高的(見圖11、 12、 1)。我們之前提出的假設(shè)是細(xì)菌 屮本身存在的 些基因限制了其對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性，經(jīng)過敲除這些基因后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌
的敏感性確實(shí)顯著增加，這就證明我們的假設(shè)是成立的。這個(gè)敏感菌株的構(gòu)建，解決了用于 檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器中宿主菌本身靈敏度不高的問題，用這個(gè)菌株作為生物傳感器的宿主來檢測(cè)污染物氧還循環(huán)反應(yīng)劑將會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度，以解決現(xiàn)階段存在的生物 檢測(cè)環(huán)境中的氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性不高的問題，為靈敏地檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感 器的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1. 一種對(duì)于氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感的大腸桿菌菌株，其特征在于，名稱為E.coli WMC-001，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)，普通微生物中心，編號(hào)CGMCC No.1867。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)于氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌菌株WMC-OOl，其特 征在于，該菌為多基因突變株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述多基因突變菌株，其特征在于，利用基因敲除技術(shù)，敲除五.co/ZMC4100 基因組中編碼分解超氧化物的酶和wd5)和分解過氧化物和過氧化氫的酶(fe^G和 a/y CF)及生成內(nèi)源性超氧化物和過氧化氫的酶(/raL4BCXO。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，利用條件復(fù)制質(zhì)粒pKOV作 為工具，重組頻繁的MC4100為研究對(duì)象，通過同源重組的方法順序敲除/W^BCZ)、
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，重組片斷的構(gòu)建利用交叉PCR 擴(kuò)增出含有基因兩端同源臂的PCR片斷，/^WSCZ) PCR片斷構(gòu)建。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述五個(gè)基因的敲除的方法，其特征在于，用于基因敲除的打靶載體，包 括pKOV-wdL4 、 pKOV-soii 5 、 pKOV-to〖G 、 pKOV-a/^CF及pKOV-/raL4BC￡>,,其中以 pKOV:/^45CD為例其載體構(gòu)建。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，基因敲除的步驟以々WSCD 的敲除為例將權(quán)利要求5所述打靶載體pKOV-/^L^CD轉(zhuǎn)化入￡.co// MC4100，通過兩次同 源重組，最后將/^4i5CD替換。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3、 4、 5、 6、 7所述多基因突變株的構(gòu)建方法，其特征在于，利用同樣的原 理，依次將/ra^flOX m必、"一CF、 to G和^i4敲除，最終形成/raL45CD、 w必、a—CF、 to/G和卵W五個(gè)基因缺失的多基因突變菌株，命名為￡co// WMC-OOl。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述構(gòu)建的多基因突變株E.co// WMC-OOl，其特征在于，這個(gè)菌株對(duì)于典 型氧還循環(huán)反應(yīng)劑百草枯(paraquat, PQ)、維生素K3 (vitamin K-3， VitK3)和吩嗪硫酸甲 酯(phenazinemethosulfate, PMS)的敏感性明顯高于野生菌MC4100，并且在幾個(gè)突變菌株 中WMC-001的敏感性是最高的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述對(duì)于氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感突變菌株￡.co/z' WMC-001 ，其特征在于， 這個(gè)敏感菌株的構(gòu)建解決了生物監(jiān)測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)細(xì)菌本身靈敏度不高的問題，能夠在 靈敏地檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的生物傳感器的研究中得到應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑高敏感的大腸桿菌菌株、構(gòu)建方法及其在對(duì)污染物，氧還循環(huán)反應(yīng)劑檢測(cè)中的應(yīng)用，菌株名稱為E.coli WMC-001，敲除親本株E.coli MC4100基因組中影響細(xì)菌對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑敏感性的基因分解超氧化物的酶(sodA和sodB)和分解過氧化物和過氧化氫的酶(katG和ahpCF)及生成內(nèi)源性超氧化物和過氧化氫的酶(frdABCD)的基因。此方法在不添加細(xì)菌基因組中任何DNA標(biāo)志的前提下，將目的基因精確敲除，形成比較穩(wěn)定的多基因突變株E.coli WMC-001，它對(duì)氧還循環(huán)反應(yīng)劑的敏感性明顯增加，從而解決了生物檢測(cè)氧還循環(huán)反應(yīng)劑時(shí)細(xì)菌本身靈敏度不高的問題。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101469317SQ20071030538
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日
發(fā)明者呂建新 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院