專利名稱：從全血中分離紅細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從人全血中分離紅細(xì)胞的方法，特別是一種涉及使用預(yù)包被 植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的含有磁性材料的聚合物微球分離人全血中的紅細(xì) 胞的方法。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于臨床檢驗和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究等大量使用人全血標(biāo)本 的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血液標(biāo)本是臨床和科研使用最多的標(biāo)本，但一般僅限于去除紅細(xì)胞的血清或 血漿，因此在很多情況下需要對全血標(biāo)本進(jìn)行從中分離出紅細(xì)胞的預(yù)處理。臨床 和科研上分離全血中的紅細(xì)胞的方法有多種，包括自然沉降、離心、排阻過濾和 吸附過濾等。這些方法各有特點，但都需要耗費較長的時間，操作較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種快速高效分離人全血紅細(xì)胞的方法，特別是提 供一種使用預(yù)包被植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的含有磁性材料的聚合物微球作 為載體，從人全血中分離紅細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種分離人全血紅細(xì)胞的裝置，特別是提供了一 種使用預(yù)包被植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的含有磁性材料的聚合物微球作為載 體，將該載體與全血標(biāo)本混合后，使用外置或內(nèi)置永磁體或電磁體提供的磁力吸 附作用，將吸附了紅細(xì)胞的磁性微球從全血中分離開出來的裝置。
本發(fā)明的分離方法包括以下步驟將預(yù)包被了植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的 磁性聚合物微球加到全血中并混合均勻達(dá)到均相互溶狀態(tài)，然后利用永磁體或電 磁體，將吸附了紅細(xì)胞的磁性微球從全血中分離開出來。本方法的特征在于使用 預(yù)包被植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的磁性聚合物微球，并使用磁力分相達(dá)到快速 分離的目的。本發(fā)明所說的"均相互溶狀態(tài)"是指紅細(xì)胞與全血中的其他成分處于均勻混 和的狀態(tài)。
本發(fā)明所說的"異相分離狀態(tài)"是指紅細(xì)胞在空間上富集在一起且與全血的 其他絕大部分成分分開，處于相對分離的狀態(tài)。
本發(fā)明提供一種快速高效分離人全血紅細(xì)胞的方法，特別是提供一種使用預(yù) 包被了植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的含有磁性材料的聚合物微球作為載體，借助 外加磁力從全血中分離出紅細(xì)胞的方法。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一個適于快速高效分離人 全血中紅細(xì)胞的方法，該方法包括(1)將植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體預(yù)包被于 磁性聚合物微球上；(2)將微球加到人全血中并混合均勻；(3)利用磁力吸附具 磁性的微球，吸附了紅細(xì)胞的微球在磁力作用下從均相互溶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楫愊喾蛛x 狀態(tài)，從而達(dá)到分離全血紅細(xì)胞的目的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的"人全血"是指從人體新鮮采 集的，未經(jīng)自然分離或人工分離的全血標(biāo)本。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的"植物凝集素"采用從紅豆中 提取的植物凝集素。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的"抗紅細(xì)胞抗體"是使用人紅 細(xì)胞免疫小鼠，常規(guī)制備的抗紅細(xì)胞單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的"磁性聚合物微球"是平均直 徑為10 — 20微米，摻入了四氧化三鐵的聚苯乙烯微球。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的"磁力"是由永磁鐵或電磁鐵 提供的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的植物凝集素來源于紅豆提取 物。將紅豆用純水洗凈并浸泡約24小時后機(jī)械粉碎成乳漿狀，然后離心(6000g， 30min)分離上清并使用飽和硫酸氨法進(jìn)一步提純。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以按下述方法使用凝集素或抗紅細(xì)胞抗 體包被磁性聚合物微球預(yù)先將磁性聚合物微球溶于PBS緩沖液(50mM, pH7.4)中(濃度為10%， m/v)，快速攪拌下加入凝集素或抗紅細(xì)胞抗體并室溫 攪動(100轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)30分鐘，然后加入牛血清白蛋白(BSA)至終濃度0.2%， 再次室溫下攪動(100轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)15分鐘，最后10000g離心20分鐘后棄上清，再用PBS緩沖液(50mM， pH7.4)重懸沉淀，即得到標(biāo)記好的磁性聚合物 微球溶液。
現(xiàn)針對本發(fā)明的幾個主要步驟，分別詳述如下
1. 將植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體預(yù)包被于磁性聚合物微球上
本發(fā)明采用的是優(yōu)化的包被方法首先優(yōu)化了包被pH值，比較了在pH5.0、 pH6.0、 pH7.0、 pH8.0、 pH9.0、 pH10.0時的包被效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH7-8時最好， 繼續(xù)優(yōu)化比較，發(fā)現(xiàn)pH7.4時包被效率最高，并將PBS緩沖液鹽濃度從lOmM 提高到50mM，有助于包被后的穩(wěn)定性，尤其是加入到全血樣品后的穩(wěn)定性，減 少植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的脫落，提高吸附效率。另外采用高磁性四氧化三 鐵制備的聚合物(聚苯乙烯、聚乙烯)微球，可以大大提高借助磁力分離的速度， 同時也比較了不同的微球直徑(40nm、 60nm、 100nm、 150nm、 200nm、 300nm) 的包被及分離效果，結(jié)果100nm的微球的包被和分離效率是最好的。
2. 利用磁力分離紅細(xì)胞 本發(fā)明采用的磁力來源可以是永磁體或電磁體，永磁體包括普通的磁鐵和高
磁力的合金磁鐵。其中優(yōu)選的是電磁體。電磁鐵可以控制磁力通斷，可在不移動 容器的情況下實現(xiàn)同位置分離紅細(xì)胞。磁體可置于容器的多個位置，包括底部、 側(cè)壁、頂端甚至容器內(nèi)部等，可以是一端，也可以環(huán)繞于容器。
如前所述，由于本發(fā)明采用了強(qiáng)磁性的聚合物微球和強(qiáng)磁力的永磁體，使得 磁力分離的速度大大加快。另外，本發(fā)明可采用各種磁體，便于設(shè)計不同成本和 性能的裝置，滿足不同應(yīng)用和需求，利于推廣應(yīng)用。


圖1顯示底端固定磁體的磁力分離裝置分離全血紅細(xì)胞的示意圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案。
實施例l:采用植物凝集素包被磁性顆粒分離紅細(xì)胞的方法
取100g紅豆，用純水洗凈，浸泡于200ml純水中24小時，用榨汁機(jī)將紅豆 打碎成豆乳漿，打碎過程中加入50ml純水以提高研磨效率，乳漿于6000g離心 30分鐘，保留上清并用飽和硫酸氨法進(jìn)一步提純，獲得植物凝集素純品備用。按照每毫升10%濃度的磁性聚合物微球(平均直徑lOOnm)溶液包被20ug 植物凝集素的比例，預(yù)先將磁性聚苯乙烯微球溶于PBS (50mM， pH7.4)緩沖 液中(濃度10%， m/v)，在快速攪拌的情況下加入植物凝集素，室溫下攪動(100 轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)30分鐘。然后加入BSA至終濃度0.2M，室溫下攪動(100轉(zhuǎn)/分 鐘)反應(yīng)15分鐘，最后10000g離心20分鐘后棄上清，用PBS (50mMpH7.4) 緩沖液重懸沉淀，獲得標(biāo)記好植物凝集素的磁性聚苯乙烯微球溶液(微球終濃度 10% (m/v)。
采集新鮮正常人全血樣本5ml，不加任何凝集素或其它試劑，備用。同時準(zhǔn) 備一個底部預(yù)置好磁鐵的試管架，按照每毫升全血加入0.2毫升微球溶液的比例 加入標(biāo)記好植物凝集素的磁性聚苯乙烯微球溶液，混勻后置于試管架上，靜置 IO分鐘后可見明顯的分層現(xiàn)象上層是清亮的血清/血漿，下層是紅色的紅細(xì)胞。
經(jīng)紅細(xì)胞計數(shù)檢測分離后的上清，計算得該方法分離紅細(xì)胞的效果達(dá)到99% 以上。
實施例2:采用抗紅細(xì)胞抗體包被磁性顆粒分離紅細(xì)胞的方法
取購自北京新創(chuàng)生物工程有限公司的抗紅細(xì)胞抗體lmg。按照每毫升10% 濃度的磁性聚乙烯微球(平均直徑100nm)溶液包被20ug抗紅細(xì)胞抗體的比例， 預(yù)先將磁性聚乙烯微球溶于PBS緩沖液(50mMpH7.4)中(濃度10%， m/v)， 在快速攪拌的情況下加入抗紅細(xì)胞抗體，室溫下攪動(100轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)30分 鐘，加入BSA至終濃度0.2%，室溫下攪動(100轉(zhuǎn)/分鐘)反應(yīng)15分鐘，最后 10000g離心20分鐘后棄上清，用PBS (50mM pH7.4)緩沖液重懸沉淀，獲得 標(biāo)記好抗紅細(xì)胞抗體的磁性聚乙烯微球溶液(微球終濃度10% (m/v))。采集新 鮮正常人全血樣本5ml，不加任何凝集素或其它試劑，備用。 準(zhǔn)備一個底部預(yù)置好磁鐵的試管架，按照每毫升全血加入0.2毫升磁性聚乙烯微 球溶液的比例加入標(biāo)記好植物凝集素的磁性聚合物微球溶液，混勻后置于試管架 上，靜置10分鐘后，可見明顯的分層現(xiàn)象上層是清亮的血清/血漿，下層是紅 色的紅細(xì)胞。
經(jīng)紅細(xì)胞計數(shù)檢測分離后的上清，計算得該方法分離紅細(xì)胞的效果達(dá)到99% 以上。
權(quán)利要求
1. 一種分離人全血紅細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(1)將植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體預(yù)包被于磁性聚合物微球上；(2)將微球加到人全血中混合均勻；(3)利用由永磁體或電磁體提供的磁力吸附具磁性的微球，將被微球吸附的紅細(xì)胞從均相互溶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楫愊喾蛛x狀態(tài)，從而達(dá)到分離全血紅細(xì)胞的目的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說磁性聚合物微球是摻入了磁性物質(zhì)的各種 聚合物微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型快速分離人全血中紅細(xì)胞的方法，特別是涉及使用預(yù)包被植物凝集素或抗紅細(xì)胞抗體的含有磁性材料的聚合物微球分離人全血中的紅細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方法可以快速且高效地從人全血標(biāo)本中分離紅細(xì)胞。
文檔編號C12N5/08GK101469323SQ20071030536
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者王言帥 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司