專利名稱：快速分離人Foxp3+Treg細胞的方法和試劑盒的制作方法
快速分離人Foxp3+ Treg細胞的方法和試劑盒本發(fā)明涉及從樣品中分離人forkhead box P3 (Foxp3+) CD4+調(diào)節(jié)性T細胞(在本 文稱作Foxp3+ Treg細胞)的方法，所述樣品含有(i)外周血單個核細胞(PBMC)，(ii)含 有淋巴細胞的液體或者(iii)含有淋巴細胞的組織；本發(fā)明還涉及分離人Foxp3+ Treg細 胞的試劑盒以及抗⑶49d抗體在分離人Foxp3+ Treg細胞中的應用。
背景技術：
Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞或者“Treg”是控制多種免疫應答的基礎，其中Treg可迅速 抑制其它免疫細胞的活性。特別地，Treg通過下調(diào)對自身和非自身抗原的非所需免疫應答 而對于維持耐受性是至關重要的(見例如Fontenot，J.D.& Rudensky，Α. Y. Nat Immunol 6， 331-7(2005) ；Sakaguchi，S.，Annu Rev Immunol 22，531-62 (2004))。例如，在多發(fā)性硬化 癥(MS)、1型糖尿病(TlD)、銀屑病、重癥肌無力(MG)及其它自身免疫疾病的患者中已發(fā)現(xiàn) Treg缺陷(Baecher-Allan，C. & Hafler，D. A.，Immunol Rev 212，203-16 (2006))。在特異反 應性和過敏性疾病中也存在類似關聯(lián)(Robinson, D. S.，Larche, M. & Durham, S. R.，J Clin Invest 114，1389-97 (2004))。對于所有這些疾病均存在指向患者Treg細胞的降低的體外 免疫抑制的報道。這已導致對于在治療或者預防慢性感染、自身免疫疾病、過敏和移植相關 并發(fā)癥如移植物排斥或者移植物抗宿主疾病的免疫治療中使用Treg的可能性的日益增長 的興趣(GvHD)(見 Roncarolo，M. G. & Battaglia，M.，Nat Rev Immunol 7，585-98 (2007)中 的綜述)。在人和嚙齒動物中，Treg細胞組成了大約2-10%的⑶4+ T細胞并組成性表達 ⑶25、CTLA-4和GITR以及參與其發(fā)育和功能的轉錄因子Foxp3。Treg細胞的特征性標記 是Foxp3。用于分離人Foxp3+ Treg細胞的方法是已知的。例如，Hoffmann，P. et al. Biol Blood Marrow Transplant 12，267-74 (2006)中描述了在優(yōu)質生產(chǎn)規(guī)范(GMP)條件下通過 使用兩步磁性細胞分離方案從標準白細胞采集物(leukapheresis)產(chǎn)物中分離具有調(diào)節(jié) 功能的CD4+CD25+T細胞。所產(chǎn)生的細胞產(chǎn)物含有平均49. 5%的Foxp3+ Treg細胞。而且， 商業(yè)試劑盒如Miltenyi Biotec的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分離試劑盒或者Invitrogen 的Dynal CD4+CD25+Treg試劑盒也是可用的。迄今為止所描述的所有分離人Foxp3+ Treg細胞的方法均使用基于Treg細胞 表面標記的對Foxp3+ Treg細胞的陽性選擇(見例如Seddiki，N. etal.，J Exp Med203， 1693-700(2006))。也就是說，通過使用與Treg相關的細胞表面標記主要是⑶25的抗體來 分離Foxp3+ Treg細胞。但是大多數(shù)Treg細胞表面標記如CD4和CD25并非局限于Treg。 例如，常用的⑶25并不是在所有Foxp3+ Treg細胞上均存在，其在效應和記憶⑶4+ T細胞 上也表達(見例如 Baecher-Allan, C, Brown, J. A. , Freeman, G. J. & Hafler,D. A. ,JImmunol 167,1245-53(2001))。因此，上述這些陽性選擇方法不能分離占Foxp3+ Treg細胞大多數(shù) 的均一細胞群；Hoffmann，P.等獲得平均49. 5%的Foxp3+ Treg細胞。目前方法的另一缺點是分離的Treg亞群中有效應T細胞的污染。后者代表有害 反應的固有風險，因其通過分泌細胞因子如IFN-γ或者IL-17來驅動促炎免疫反應。當采用標記如⑶25時，這些污染可以嚴重到高達一半的所分離的⑶4+細胞群包括效應T細胞 (Hoffmann, P.et al. Biol Blood MarrowTransplant 12，267-74(2006))。另外，在細胞治療中，對于基于Treg細胞表面標記的陽性選擇而分離的Foxp3+ Treg細胞的應用會造成嚴重問題。首先，基于細胞表面標記如⑶25對Foxp3+ Treg細胞的 分離導致Foxp3+ Treg細胞群或多或少地被其它細胞如代表Treg抑制的主要靶的CD4+效 應細胞所嚴重污染。因此，如果這種陽性選擇的Foxp3+ Treg細胞被應用于細胞治療中，將 會存在高風險，因其可導致所治療的患者的免疫系統(tǒng)被潛在地致命性激活。這種致命性的 免疫應答最近在“Tegenero”實驗的失敗中有記載，其中預期使Treg細胞擴展的抗體導致 效應細胞激活(Suntharalingam,G. et al.，N Engl J Med355,1018-28 (2006))。其次，已經(jīng) 用抗體標記的陽性選擇的FoXp3+Treg細胞可呈現(xiàn)出受損的功能。例如，用抗體標記的細胞 被潛在地預先激活，可經(jīng)受補體_或者細胞_介導的耗竭或者呈現(xiàn)出改變的歸巢(homing) 和遷移模式。因此，在其分離期間被抗體定靶向的Foxp3+ Treg細胞在治療性的應用中并 不合意，而這不僅僅是出于安全原因。正如所討論的那樣，上述方法和試劑盒對于分離Foxp3+ Treg細胞顯示出主要缺 點。首先，目前分離免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞的方法不能有效地去除污染CD4+效應和 記憶T細胞。這是因為目前使用的技術和標記如基于⑶25的Foxp3+ Treg的分離不能將 這些污染⑶4+效應和記憶T細胞與免疫抑制性Foxp3+ Treg細胞區(qū)分。例如，⑶25是也存 在于這些污染⑶4+細胞上的標記。此外，至少若干這些污染⑶4+細胞甚至不能通過細胞 內(nèi)Foxp3染色區(qū)分，因為激活的人⑶4+效應細胞已知可瞬時表達Foxp3 (Allanet al.，Int Immunol. 19 :345_54 (2007))。因此，即使通過目前方法所分離的高純度的CD25highCD4+T 細胞群也含有相當部分的可產(chǎn)生細胞因子的促炎效應細胞(Dieckmarm et al. , J. Exp Med. 193，1303-1310 (2001))，即分離的Foxp3+ Treg細胞明顯被CD4+效應和記憶T細胞所 污染。此外，目前還沒有通過陰性選擇獲取Foxp3+ Treg細胞的方法，即保留無標記/抗 體的Foxp3+ Treg細胞。由前述可知，對于用于分離幾乎不含⑶4+效應和記憶T細胞的Foxp3+Treg細胞 的方法和試劑盒/組合物特別需要。對于不需要陽性選擇FoXp3+Treg細胞的方法也是特 別需要的。因此，本發(fā)明的一個目的是提供避免上述現(xiàn)有技術缺點的方法。特別地，本發(fā)明的 一個目的是提供分離免疫抑制性F0Xp3+ Treg細胞的方法，這種方法可以有效除去產(chǎn)生細 胞因子的⑶4+細胞，包括瞬時表達Foxp3的⑶4+效應細胞，其污染目前基于⑶25的Treg 制品。此外，本發(fā)明進一步的一個目的是提供分離Foxp3+ Treg細胞的試劑盒。并且，通過 采用導入可以從Foxp3+ Treg細胞中區(qū)分產(chǎn)生細胞因子的效應T細胞的新標記，相對于通 過其它方法獲得的制品，本發(fā)明的方法和試劑盒提供了改善Treg制品的質量的新途徑，特 別是由于其對產(chǎn)生細胞因子的效應T細胞的去除。發(fā)明描述本發(fā)明是基于Foxp3+ Treg細胞的特異性細胞表面標記與非調(diào)節(jié)性⑶4+ T細胞 的細胞表面標記之間相關性的結果。特別地，檢驗細胞表面標記CD49d。在本發(fā)明的實驗 中，可以示出所述表面標記⑶49d在大多數(shù)Foxp3+ Treg細胞中缺失。在本發(fā)明中，可以示出人Foxp3+ Treg細胞可通過使用針對⑶49d的抗體來分離。此外，所分離的Foxp3+ Treg細胞的阻抑物活性已被本發(fā)明的實驗所確認。所述分離的Foxp3+ Treg細胞能夠在 阻抑檢驗中阻抑效應T細胞的增殖，在體外強烈抑制混合淋巴細胞反應(MLR)以及在基于 Rag2-/" Y C-/"小鼠的GvHD模型中在體內(nèi)防止轉移的人PBMC的致命攻擊。在本發(fā)明的第一個方面，其目的之一可以由從樣品中分離人FoXp3+Treg細胞的 方法所解決，所述樣品含有⑴外周血單個核細胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋巴細胞的液 體，或者(iii)含有淋巴細胞的組織，所述方法包括如下步驟(a)用抗⑶49d抗體處理該樣品；(b)分離 Foxp3+ Treg 細胞。如本發(fā)明所用的術語“處理樣品”應特別意指樣品中含有的細胞以所述抗體可與 被靶向的細胞相互作用的方式而與該抗體直接物理接觸。換言之，在本發(fā)明的方法中，將 外周血單個核細胞(PBMC)、含有淋巴細胞的液體或含有淋巴細胞的組織與抗CD49d抗體接 觸，并分離Foxp3+ Treg細胞。如本文所用的術語“分離”是指用物理手段或者從其它細胞類型如CD4+效應細胞 中取出一種細胞類型如Foxp3+ Treg細胞，或者從FoXp3+Treg細胞中去除所有非調(diào)節(jié)性 ⑶4+ T細胞，從而保留富集的Foxp3+ Treg細胞群。也應注意所述分離可以在一個或多個步 驟中進行，所述多個步驟也可以連續(xù)進行，即在第一次用一或多種抗體處理樣品之后可以 進行第一次分離，然后可以用一或多種抗體對分離自第一次分離的樣品進行另一次處理， 再緊接著另一次分離等等。關于分離技術的更詳細的描述見P.T.SharpeJethods of Cell Separation，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology, Vol.18， ELSEVIER(1988) VX R . Fisher, G. E. Francis, D. Rickwood(Eds.)， Cell Separation :A Practical Approach, Oxford UniversityPress (1999)所述。如本發(fā)明所用的術語“樣品”是指含有外周血單個核細胞或者“PBMC”或者淋巴細 胞的體液或組織。如本發(fā)明所用的術語“含有淋巴細胞的液體”是指含有淋巴細胞的任何液體，如滑 液。如本發(fā)明所用的術語“含有淋巴細胞的組織”是指含有淋巴細胞的任何組織，如脾、胸 腺、淋巴結、骨髓、淋巴集結和扁桃體。正如上文及在其它術語中所述，本發(fā)明通過簡便、高度可靠及可重復的分離 Foxp3+ Treg細胞的方法解決了所述技術問題。特別地，如上所述，現(xiàn)有技術方法依賴于 FoXp3+Treg細胞的細胞表面標記，例如⑶25。然而正如所解釋的那樣，所述方法僅可以允 許有明顯⑶4+效應和記憶T細胞污染的Foxp3+ Treg細胞的分離。此外，由于目前所有方 法均基于CD25，因此所有分離的Foxp3+ Treg細胞均是標記的，即由針對Foxp3+ Treg細 胞的細胞表面標記之一的抗體所標記。再者，所述方法需要至少兩個分離步驟(i)耗竭 (depletion)非⑶4細胞；(ii)通過陽性分選分離⑶25+細胞。與此相反，本發(fā)明的方法首 先允許在單一步驟中分離Foxp3+ Trego這是因為本發(fā)明的方法利用可以區(qū)分效應T細胞 與Foxp3+ Treg細胞的⑶49d作為標記。⑶49d存在于大多數(shù)⑶4+效應和記憶T細胞上， 而在免疫阻抑性Foxp3+ Treg細胞上缺失。因此，其可用于從Foxp3+ Treg制品中去除污 染細胞，如產(chǎn)生細胞因子的效應T細胞。CD49d+細胞的衰竭除去了幾乎所有產(chǎn)生細胞因子 的⑶4+細胞，包括瞬時表達Foxp3的效應細胞，其污染基于⑶25的Treg制品。這種方法適用于全體CD4+細胞，更引人注目地是適用于CD25+細胞的常規(guī)制品。因此，使用本發(fā)明的方法分離Foxp3+ Treg細胞更快、更簡單并且尤其是在對于占 樣品中所含F(xiàn)oxp3+ Treg細胞的大多數(shù)的均一細胞群的分離時更有效。換言之，應用本發(fā) 明方法分離Foxp3+ Treg細胞可產(chǎn)生幾乎沒有污染⑶4+效應和記憶T細胞的免疫阻抑性 Foxp3+ Treg細胞群。最后，本發(fā)明的方法可以是自動化的，因此進一步增加該方法的易于 應用性。優(yōu)選地，本發(fā)明分離Foxp3+ Treg細胞的方法包括(a)用抗⑶49d抗體處理含有 Foxp3+ Treg細胞的樣品；以及(b)通過抗⑶49d抗體耗竭樣品的⑶49d+細胞，從而分離 Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞，其中所述樣品是(i)外周血單個核細胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋 巴細胞的液體，或者(iii)含有淋巴細胞的組織。根據(jù)本發(fā)明獲得的最鼓舞人心的結果是發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中，通過組合(相繼 或者同時)使用抗⑶49d抗體和抗⑶127抗體也可以獲得高純度不受影響(untouched)的 Foxp3+ Treg細胞，即幾乎沒有污染⑶4+效應和記憶T細胞，所述抗⑶49d抗體和抗⑶127 抗體靶向兩個細胞表面標記⑶127和⑶49d，其與Foxp3的表達反向相關。通過本發(fā)明的方 法獲得的分離的Foxp3+ Treg細胞是完全功能性的，這已被其體外抑制混合的淋巴細胞反 應以及體內(nèi)防止致死xeno-GvHD應答的能力而證實。迄今為止，所分離的Foxp3+ Treg細胞 中非調(diào)節(jié)性CD4+細胞如效應和記憶CD4+細胞的污染是Foxp3+ Treg細胞分離方法中的主 要缺點。相當大量的非調(diào)節(jié)性CD4+細胞存在于通過基于Treg細胞表面標記的陽性選擇而 分離的 Foxp3+ Treg 細胞群中。例如，Hoffmann，P. et al. Biol Blood Marrow Transplant 12，267-74 (2006)在GMP條件下使用陽性選擇所分離的Foxp3+ Treg細胞群中平均50%以 上的細胞是非調(diào)節(jié)性CD4+細胞。自然，這種相當大量的非所需非調(diào)節(jié)性CD4+細胞妨礙了 這種Foxp3+ Treg細胞群例如在上述的免疫治療中的應用。優(yōu)選在本發(fā)明的方法中，步驟(a)和(b)可以同時進行。此外，步驟(a)和(b)也 可以重復進行，即在進行第一次步驟(a)和第一次步驟(b)后，接著進行第二次步驟(a)和 第二次步驟(b)，任選接著分再別進行第三次、第四次等的步驟(a)和(b)。值得注意的是， 如果重復進行步驟(a)和(b)，對每個隨后步驟(即第二次步驟(a)或(b)，第三次步驟(a) 或(b)等)的各自樣品應個別且獨立于任何其它樣品進行處理和分離。因此，例如如果在 第一次步驟(a)中用抗⑶49d處理樣品，隨后是第一次Foxp3+ Treg細胞的分離步驟(b)， 例如通過使用選自離心、細胞淘析、磁性分離、熒光激活細胞分選術、免疫分離、粘附、補體 溶解或者熒光激活細胞分選術的熟知的分離方法進行，然后在第二次步驟(a)中，第一次 步驟(b)的這些Foxp3+ Treg細胞可以用例如抗⑶25抗體和/或抗⑶127抗體處理，接著 進行第二次分離步驟(b)例如使用磁性細胞分離法分離⑶25+Foxp3+ Treg細胞。同時進行步驟(a)和(b)的優(yōu)勢在于Foxp3+ Treg細胞的分離更加省力、簡便、快 速且更具成本效益。重復進行步驟(a)和(b)的優(yōu)勢在于不同的細胞標記例如陽性標記如 ⑶4、⑶25或者陰性標記如⑶127可用于分離，而且攜帶這些特定標記的細胞可以在隨后的 分離步驟中分離或者除去。因此可以分離出具有特定性質如特定細胞表面受體的單一細胞 群。在本發(fā)明的方法中，步驟(a)可另外包括用抗CD25抗體處理樣品。優(yōu)選將使用抗 CD49d抗體分離的Foxp3+ Treg細胞用抗CD25抗體處理，隨后分離CD25+Foxp3+ Treg細胞。優(yōu)選本發(fā)明分離Foxp3+ Treg細胞的方法包括(a)用抗CD49d和抗CD25抗體處 理含有Foxp3+ Treg細胞的樣品；(b)通過抗⑶49d抗體耗竭樣品的⑶49d+細胞，從而分離 Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞，其中所述樣品是(i)外周血單個核細胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋 巴細胞的液體，或者(iii)含有淋巴細胞的組織。任選地，步驟(b)可另外包括通過抗CD25 抗體對CD25+細胞的陽性選擇。如本發(fā)明所用的術語“陽性選擇”意指通過標記/捕獲所期望的細胞，而使不期望 的細胞保持無標記，從而從細胞所有組成部分中取出所期望的細胞。再者，在本發(fā)明方法中，步驟(a)可另外包括用抗CD127抗體處理樣品。優(yōu)選本發(fā)明的分離Foxp3+ Treg細胞的方法包括(a)用抗CD49d和抗CD127抗 體處理含有Foxp3+ Treg細胞的樣品；(b)通過抗⑶49d抗體或者抗⑶127抗體耗竭樣品 的⑶49d+⑶127+細胞，從而分離Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞，其中所述樣品是(i)外周血單個核 細胞，或者“PBMC”，(ii)含有淋巴細胞的液體，或者(iii)含有淋巴細胞的組織。再者，在本發(fā)明方法中，步驟(a)可另外包括從樣品中分離非CD4+ T細胞。從樣品中另外分離非⑶4+ T細胞的優(yōu)勢在于更高效地除去非⑶4+ T細胞，并且 其結果是所獲得細胞群的純度更高。在本發(fā)明方法中，可以通過使用抗⑶4抗體的陽性選擇從樣品中分離非⑶4+ T細 胞。再者，在本發(fā)明方法中，可以使用允許特異性耗竭樣品的非CD4+ T細胞的一或多 種抗體通過陰性選擇從樣品中分離非CD4+ T細胞。如本發(fā)明所用的術語“陰性選擇”是指通過標記/捕獲不需要的細胞，而使感興趣 的細胞保持無標記，從而從細胞所有組成成分中除去所述不需要的細胞。通過耗竭來從樣品中分離非⑶4+ T細胞的優(yōu)勢在于⑶4+ T細胞得以保持未受污 染且未受影響。本發(fā)明優(yōu)選這樣的方法，其中用于特異性耗竭樣品的非CD4+ T細胞的一或多種抗 體可選自包含抗⑶8抗體、抗⑶10抗體、抗⑶14抗體、抗⑶15抗體、抗⑶16抗體、抗⑶19 抗體、抗⑶35抗體、抗⑶36抗體、抗⑶49b抗體、抗⑶56抗體、抗⑶66a抗體、抗⑶66b抗 體、抗CD66c抗體、抗CD66d抗體、抗CD89抗體、抗CDw92抗體、抗CD93抗體、抗CDlll抗體、 抗⑶112抗體、抗⑶123抗體、抗⑶141抗體、抗⑶156a抗體、抗⑶170抗體、抗TCRg/d抗 體、抗⑶235a抗體、抗⑶282抗體以及抗CDw329抗體、抗β 7-整聯(lián)蛋白抗體或者其混合物 的組。本發(fā)明優(yōu)選使用抗⑶14抗體、抗⑶15抗體、抗⑶16抗體和/或抗⑶66b抗體特 異性耗竭樣品的非⑶4+ T細胞。使用選自抗⑶14抗體、抗⑶15抗體、抗⑶16抗體和抗⑶66b抗體的一或多種抗 體特異性耗竭非CD4+ T細胞的優(yōu)勢是這種抗體亞群比一些可商業(yè)途徑獲得的亞群要小。本發(fā)明的方法進一步優(yōu)選使用抗⑶14抗體和/或抗⑶16抗體和/或抗⑶66b抗 體特異性耗竭樣品的非CD4+ T細胞。本發(fā)明優(yōu)選的進一步方法，其步驟(a)中使用的至少一種抗體是標記或固定化 的。
如本發(fā)明所用的術語“標記的”意指分子如抗體與標記綴合?？梢耘c抗體綴合的 許多不同標記為本領域技術人員所熟知。例如，放射性同位素如32p、35s或者3H ；熒光或者 發(fā)光標記，如熒光素(FITC)、羅丹明、德克薩斯紅、藻紅蛋白(PE)、別藻藍蛋白、6-羧基熒光 素(6-FAM)、2'，7' -二甲氧基-4'，5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE)、6_羧基-X-羅丹 明(ROX)、6-羧基-2'，4'，7'，4，7-六氯熒光素(冊幻、5-羧基熒光素(5呼六1)或者隊 N, N' ,N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；抗體或者抗體片段，如F (ab) 2片段；親和標 記，如生物素、抗生物素蛋白、瓊脂糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、基質結合型(matrix bound)、 半抗原；以及酶或者酶底物，如堿性磷酸酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP)。如本發(fā)明所用的術語“固定化的”是指抗體可與其連接且保持其活性的任何支持 物。優(yōu)選所述支持物可以是基質如尼龍基質的表面；微量滴定板或者類似的固體塑料支持 物；珠，例如瓊脂糖或者磁珠。固定化的抗體在例如US 4，615，985及其引用的參考文獻中 描述。使用標記的或者固定化的抗體相對于未標記的抗體的優(yōu)勢是標記的或者固定化 的抗體可易于與標準設備使用，也有利于對標準分離技術的適應。本發(fā)明優(yōu)選在步驟中(a)使用的至少一種抗體是固定化的。在本發(fā)明方法中優(yōu)選在步驟(a)中使用的至少一種抗體被固定于尼龍基質上。將抗體固定于尼龍基質上的優(yōu)勢在于在尼龍基質上的固定非常有效，且允許 靈活、容易、快速、簡便及低成本地基于柱的細胞分離。在尼龍基質上的固定在例如US 4，615，985 中描述。本發(fā)明的方法進一步優(yōu)選在步驟(a)中使用的抗體可以是均一標記的。均一標記抗體的優(yōu)勢在于可以同時檢測所有抗體。在本發(fā)明的方法中優(yōu)選所述標記可選自包含同位素、熒光或者發(fā)光標記、抗體或 者抗體片段、親和標記以及酶或酶底物的組。本發(fā)明的方法優(yōu)選抗CD25抗體可以用生物素、熒光素(FITC)或者藻紅蛋白(PE)標記。本發(fā)明的方法優(yōu)選抗CD127抗體可以用生物素、熒光素(FITC)或者藻紅蛋白(PE)標記。本發(fā)明的方法優(yōu)選抗CD49d抗體可以用生物素、熒光素(FITC)或者藻紅蛋白(PE)標記。本發(fā)明的方法優(yōu)選步驟(b)可以通過使用離心特別是密度梯度離心、細胞淘析、 磁性分離、熒光激活細胞分選術、免疫分離、粘附、補體溶解或者流式細胞術進行。本發(fā)明的方法優(yōu)選步驟(b)可以通過使用磁性細胞分離、熒光激活細胞分選術或 者基于柱的免疫分離進行。術語“基于柱的免疫分離”是指分選細胞的方式，其中本發(fā)明方法中使用的抗體可 以附著于層析柱的樹脂且用于結合具有該特異性抗體識別的抗原的細胞。本發(fā)明的方法優(yōu)選抗⑶45R0抗體可用作步驟(a)中額外的抗體，且分離的Foxp3+ Treg細胞是CD45RA+ T細胞。使用抗CD45R0抗體作為步驟(a)中額外的抗體的優(yōu)勢在于特異的Foxp3+ Treg 細胞亞群即CD45RA+ T細胞能夠以高度有效的方式及極高純度被分離。
本發(fā)明的方法優(yōu)選抗CD45RA抗體可用作步驟(a)中的額外的抗體，且分離的 Foxp3+ Treg 細胞是 CD45R0+ T 細胞。使用抗CD45RA抗體作為步驟(a)中額外抗體的優(yōu)勢在于特異的FoXp3+Treg細胞 的亞群即CD45R0+ T細胞能夠以高度有效的方式及極高純度被分離。在本發(fā)明的第二個方面，其目的之一可以由分離人Foxp3+ Treg細胞的試劑盒解 決，所述試劑盒包含抗⑶49d抗體和抗⑶25抗體或者抗⑶49d抗體和抗⑶127抗體。再者，本發(fā)明的試劑盒可包含抗⑶49d抗體、抗⑶25抗體和抗⑶127抗體。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒可另外包含一或多種選自如下組的抗體抗⑶8抗體、抗 ⑶10抗體、抗⑶14抗體、抗⑶15抗體、抗⑶16抗體、抗⑶19抗體、抗⑶35抗體、抗⑶36抗 體、抗⑶49b抗體、抗⑶56抗體、抗⑶66a抗體、抗⑶66b抗體、抗⑶66c抗體、抗⑶66d抗 體、抗CD89抗體、抗CDw92抗體、抗CD93抗體、抗CDlll抗體、抗CDl 12抗體、抗CD123抗體、 抗CD141抗體、抗CD156a抗體、抗CD170抗體、抗TCRg/d抗體、抗CD235a抗體、抗CD282抗 體以及抗CDw329抗體、抗β 7-整聯(lián)蛋白抗體或者其混合物。再者，本發(fā)明的試劑盒可含有至少一種固定化的抗體。此外，本發(fā)明的試劑盒可含有至少一種標記的抗體。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒可含有均一標記的抗體。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選可含有標記的抗體，其中所述標記可選自包含同位素、熒光 或者發(fā)光標記、抗體或者抗體片段、親和標記以及酶或者酶底物的組。優(yōu)選所述試劑盒可含有可以用生物素、FITC或者PE標記的抗⑶127抗體、抗⑶25 抗體和/或抗⑶49d抗體。在本發(fā)明第三個方面，其目的之一可通過使用(i)抗⑶49d抗體，(ii)抗⑶49d抗 體組合抗⑶25抗體和/或抗⑶127抗體，或者(iii)本發(fā)明用于分離人Foxp3+ Treg細胞 的試劑盒解決。特別地，抗⑶49d抗體、抗⑶49d抗體組合抗⑶25抗體和/或抗⑶127抗 體或者本發(fā)明的試劑盒可用于從樣品中分離人Foxp3+ Treg細胞，所述樣品含有(i)外周 血單個核細胞(PBMC)，(ii)含有淋巴細胞的液體，或者(iii)含有淋巴細胞的組織。優(yōu)選本發(fā)明的應用的特征在于人Foxp3+ Treg細胞的分離可以通過從Foxp3+ Treg細胞中分離⑶49d+ PBMC (包括非調(diào)節(jié)性⑶4+ T細胞)而實現(xiàn)，其中所述分離通過離 心、細胞淘析、磁性分離、熒光激活細胞分選術、免疫分離、粘附、補體溶解或者流式細胞術 進行。再者，本發(fā)明的應用的特征在于使用至少一種選自包含如下的組的抗體耗竭樣品 的非⑶4+ T細胞抗⑶8抗體、抗⑶10抗體、抗⑶14抗體、抗⑶15抗體、抗⑶16抗體、抗 ⑶19抗體、抗⑶35抗體、抗⑶36抗體、抗⑶49b抗體、抗⑶56抗體、抗⑶66a抗體、抗⑶66b 抗體、抗CD66c抗體、抗CD66d抗體、抗CD89抗體、抗CDw92抗體、抗CD93抗體、抗CDlll抗 體、抗⑶112抗體、抗⑶123抗體、抗⑶141抗體、抗⑶156a抗體、抗⑶170抗體、抗TCRg/d 抗體、抗⑶235a抗體、抗⑶282抗體以及抗CDw329抗體、抗β 7-整聯(lián)蛋白抗體或者其混合 物。附圖簡述

圖1 :CD127禾口 CD49d與Foxp3表達的反向相關性。將人PBMC針對CD4、CD25、 CD127、CD49d和Foxp3染色，并通過FACS分析。a.人PBMC針對CD4和CD25的雙重染色。示出總PBMC中CD4+細胞的百分比。b.⑶25、CD127和CD49d與Foxp3表達的相關性。將 人PBMC針對⑶4、⑶25、⑶127、⑶49d和Foxp3染色，并通過FACS分析。示出根據(jù)圖Ia門 控(gated)獲得的⑶4+細胞的Foxp3與⑶25 (左圖)、⑶127 (中間)及⑶49d的共染色。 數(shù)字表示每個象限中細胞的百分比。圖 2 :CD49d 區(qū)分 Foxp3+ Treg 細胞與 Foxp3_ CD127-細胞。a. Foxp3 在 CD4+T 細 胞的CD127/CD49d亞群中的表達。將人PBMC針對CD4、CD25、CD127、CD49d和Foxp3染色 并針對⑶4+細胞門控選擇。上圖⑶49d和⑶127的共染色。示出三個主要細胞群的門 (gate)和百分比。下圖示出對于⑶127+細胞(左側)、CD49d_CD127-細胞(中間圖)和 CD49d+CD127-細胞(右側)的CD25與Foxp3共染色。百分比表示指定象限中CD25+Foxp3+ Treg細胞數(shù)。b.通過FACS分選分離CD49d-CD127-和CD49d+CD127-細胞。將用商購的 MACS-耗竭試劑盒從PBMC中分離的未受影響的⑶4+細胞用α -⑶49d和α -⑶127染色 (左圖)，并且由FACS分選出CD49d-CD127-(中間圖)和CD49d+CD127_亞群(右圖)。數(shù) 字表示每個象限中細胞的分數(shù)。c.阻抑能力。如圖3b所示，兩個分離的細胞亞群對于增 殖應答的抑制作用由基于FACS的阻抑測定來確定。CD4+細胞的增殖由a-CD3抗體誘導， 以1 2比率加入阻抑細胞。阻抑作用以“ ％抑制”表示，并通過分裂的細胞相對于分裂的 α -⑶3刺激的⑶4+細胞數(shù)目的分數(shù)來計算。圖3 通過MACS從CD4+ T細胞中分離未受影響的Foxp3+ Treg細胞。由商購 ⑶4分離試劑盒通過MACS分離的人PBMC未受影響的⑶4+細胞在⑶127/⑶49d表達細胞 的第二步中被MACS耗竭。a.耗竭的細胞的FACS分析。示出耗竭之前(左圖)⑶4+細胞 群以及⑶49d/⑶127耗竭之后留下的細胞(右圖)的FACS圖。所示數(shù)據(jù)為染色⑶49d對 比⑶127(上圖)和⑶25對比Foxp3(下圖)。百分比是指每個象限中細胞數(shù)。b.阻抑能 力。已耗竭⑶49d/⑶127+細胞的⑶4+ T細胞在基于FACS的體外測定中被用作阻抑細胞 (Treg)。將通過衰竭除去的⑶4+效應細胞用CFDA標記，并用作應答物(responder)細胞。 圖中示出無任何刺激(上圖)、與α-CD3溫育后(中間圖)或者在存在未受影響的1 1 比率的Treg細胞的條件下與α-⑶3溫育之后(下圖)的⑶4+細胞的CFDA染色。數(shù)字表 示分裂的⑶4效應細胞的百分比。圖4 從PBMC中分離未受影響的Treg細胞。Treg細胞通過MACS-耗竭從總PBMC 中分離。a.僅用α -⑶49d/ α -⑶127來耗竭。如圖3所述使用α -⑶49d和α -⑶127進 行人PBMC的耗竭，不同之處是使用總PBMC而不是純化的⑶4+細胞。b.使用α -⑶49d/ α -⑶127組合⑶4+ T細胞分離試劑盒的一步耗竭。為了增加純度，將α -⑶127和α -⑶49d 加入商購CD4+T細胞分離試劑盒的抗體混合物中。圖中示出耗竭之前PBMC(左圖)以及耗 竭之后所得珠陰性級分(右圖)的⑶49d對比⑶127和⑶25對比Foxp3的染色。數(shù)字表 示每個象限中細胞的百分比。圖5 體外對混合淋巴細胞反應(MLR)的抑制及體內(nèi)對GvHD的防止。通過如圖4 所述一步⑶127/⑶49d耗竭法從人PBMC中分離未受影響的Treg細胞。a. MLR的抑制。示 出三個不同供體的MLR反應。在每個反應中將IO5個PBMC與相同數(shù)目的單元型錯配的另一 個供體(異源(allogen))的經(jīng)輻射的PBMC—起溫育。通過加入在一步MACS耗竭中分離 的2. 5 X IO4自體Treg細胞(異源& Treg)來抑制該反應。增殖可通過參入3H-胸苷來確 定，并以“每分鐘計數(shù)(cpm)”來表示。b.急性GvHD的防止。通過將30X 106⑶25耗竭的人PBMC(CD25-PBMC)過繼轉移至Rag2_/_ y c-/_小鼠中來誘導急性異種_GvHD。疾病的進 展通過確定體重降低(左圖)記錄。一組僅接受⑶25-PBMC(實心圓)，第二組在共轉移中 接受⑶25-PBMC以及0. 5 X IO6未受影響的自體Treg細胞(空心圓)。使用每組6只小鼠； 相對于實驗開始時體重確定平均相對體重，并以“體重降低百分比”表示。臨床跡象(皺褶 的毛皮，背部躬曲姿勢以及不活動)和死亡的發(fā)生率在右圖示出。圖6 通過α -⑶49d耗竭純化⑶25+ Treg細胞。a.⑶49d表達與細胞因子分泌的 分離。分泌細胞因子的⑶4+細胞表達⑶49d。在體外用PMA/離子霉素刺激⑶4+ T細胞，并 在6h后通過FACS分析。示出總⑶4+細胞(上圖)和Foxp3+⑶4+細胞(下圖)針對⑶49d 對比IL-17(左上圖)或者⑶49d對比IFN-Y (右上圖)的染色。總⑶4+細胞的百分比是 指每個象限的細胞數(shù)。Foxp3門控的CD4+細胞的百分比是指CD49d+或者CD49d-細胞的分 數(shù)，在虛線門中分泌細胞因子的細胞的百分比參照⑶49d+細胞數(shù)。b.⑶49d從⑶25high Treg 制品中除去Thl-和Thl7_樣細胞。人Treg細胞的特征在于⑶25high表達。使用α -⑶4、 α -⑶25和α -⑶49d對PBMC染色，并通過FACS將其分選為⑶4+亞群⑶49d+⑶25high和 ⑶49d-⑶25high。分選的細胞亞群用PMA/離子霉素激活，并且針對IFN- γ和IL-17進行胞 內(nèi)染色。百分比表示指定象限中細胞數(shù)。圖7 通過耗竭人CD4+ T細胞中的CD49d+細胞富集Foxp3+ Trego人CD4+細胞 被⑶49d耗竭，并通過FACS分析⑶25和Foxp3表達。左圖總⑶4+細胞；右圖⑶49d耗 竭的⑶4+細胞。示出⑶25對比Foxp3(上方)和Foxp3對比⑶49d(下方)的染色。數(shù)字 表示每個門控中細胞的百分比。圖8 從⑶127- Treg制品中去除產(chǎn)生細胞因子的效應細胞。如圖2a所述進行實 驗，不同之處是在用PMA/離子霉素分選之后刺激純化的CD4+T細胞亞群以測量細胞因子產(chǎn) 生。如圖2a所述進行FACS分析，不同之處細胞使用α-IFN-γ和α-IL-17進行胞內(nèi)染色。本發(fā)明現(xiàn)將通過如下非限制性的關于附圖的實施例進一步描述。對于本發(fā)明的目 的，本文引用的所有參考文獻均以其全部內(nèi)容援引加入。此外，本發(fā)明基于對源自志愿者的 生物學樣本所進行的科學實驗。志愿者已給出許可在本發(fā)明所公開的研究中使用所述樣 本。
實施例在實施例中使用的特定方法和材料抗體和試劑特異于CD4(RPA-T4)、CD25(MA251)和 CD127 (hIL_7R_M21)的抗體購自 BD Bioscience?？?IFN-γ 購自 Miltenyi Biotech (45-15)?？笴D49d(BU49)得自 ImmunoTools。 α -CD3 (UCHT-I)由 MDC 生產(chǎn)。α Foxp3 (PCH101)禾口 α-IL-17 (eBio64CAP17)購 自 eBioscience，胞內(nèi)染色根據(jù)廠商推薦進行。CFDA得自Molecular Probes，3H-胸苷得自GE Healthcare。流式細胞術和細胞制備人PBMC得自健康志愿者。單個核細胞通過Ficoll梯度離心(GEHealthcare)分 離。FACS 分析在 FACSCalibur 或者 LSR II 設備(BD Bioscience)上進行。使用 FACSDiva 軟件(BD Bioscience)、CellQuest (BD Bioscience)或者 Flowjo 軟件(Treestar)分析數(shù)據(jù)。細胞因子檢測將細胞用PMA和離子霉素刺激4-6小時，并且在最后3_4小時有布雷菲德菌素 A(brefeldin Α)存在。細胞因子分泌通過使用MACS-或者FACS-分選的CD4+ T細胞亞群 用a-IL-17和α-IFN-γ進行胞內(nèi)染色來確定。細胞是新鮮使用或者在刺激之前在補加 了 50U/ml IL-2的RPMI中維持過夜。Treg 分離使用MACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotech)進行磁性細胞分選，F(xiàn)ACS分選使用FACSAria 設備(BD Bioscience)。Α)通過CD49d耗竭進行Treg富集將分選的MACS (hCD4_分離 試劑盒 II/Miltenyi Biotech)與 α-CD49d_FITC 在 4_8°C溫育 10 分鐘。用 MACS 緩沖液 在4_8°C洗滌10分鐘之后，將每IO7個細胞與10 μ 1 α-FITC-磁珠(Miltenyi Biotech) 在4-8°C溫育15分鐘。用MACS緩沖液洗滌后，使用LD-柱(Miltenyi Biotech)分離細 胞。B)不受影響的兩步MACS流程未受影響的人CD4+ T細胞首先用hCD4-分離試劑盒 II(Miltenyi Biotech)從PBMC中分離。在第二個步驟中，將該細胞與α-CD49d_FITC和 a-CD127-生物素在4-8°C溫育10分鐘。用MACS在4-8°C洗滌10分鐘后，將每IO7個細 胞與 10 μ 1 a -FITC-和 20 μ 1 a -生物素-磁珠(Miltenyi Biotech)在 4_8°C溫育 15 分 鐘。用MACS緩沖液洗滌后，使用LD-柱(Miltenyi Biotech)分離細胞。C)不受影響的一 步MACS流程將人PBMC與FITC-標記的α -⑶49d、生物素標記的α -⑶127以及生物素 標記的人⑶4+T細胞分離試劑盒II的抗體混合物在4-8°C溫育10分鐘。用MACS緩沖液 洗滌后，將每IO7個細胞與10 μ 1 a -FITC-和25 μ 1 a -生物素磁珠在4_8°C溫育15分鐘。 用MACS緩沖液洗滌后，使用LD-柱分離細胞。D)不受影響的一步MACS流程(僅CD49d和 CD127耗竭)將人PBMC與FITC-標記的a -⑶49d、生物素標記的a-CD127在4-8°C溫育 10分鐘。用MACS緩沖液洗滌后，將每IO7個細胞與15 μ 1 a -FITC-和20 μ 1 a -生物素磁 珠在4-8°C溫育15分鐘。用MACS緩沖液洗滌后，使用LD-柱分離細胞。E)FACS-分選未 受影響的0)4+1~細胞使用人0)4+11細胞分離試劑盒11(1^1丨61^1 Biotech)從人PBMC中獲 得。將細胞用a -CD49d-FITC和a -CD127-PE在4_8°C染色10分鐘。用MACS緩沖液洗滌 后，將細胞重懸浮于MACS緩沖液中，并在細胞分選儀上分選。未受影響的Treg細胞通過 使用針對CD49d-CD127-細胞的分選門(sorting gate)而獲得。對于CD25+細胞的FACS 分選，將人PBMC用α -⑶49d、α -⑶4和α -⑶25在4_8°C染色10分鐘。用MACS緩沖液洗 滌后，將細胞重懸浮于MACS緩沖液中并在細胞分選儀上使用針對⑶4+⑶25highCD49d+或者 ⑶4+⑶25highCD49d-細胞的分選門分選。死亡細胞通過碘化丙錠(Sigma)排除?；贑FDA的增殖測定如前(Kleinewietfeld，M.et al. Blood 105，2877-86 (2005))所述，用 0. 5μΜ5-羧基二乙酸熒光素(CFDA ；Molecular Probes)標記CD4+效應細胞。將CD4+效應 T細胞(25，000個細胞/孔)與經(jīng)照射的⑶4-耗竭的PBMC (50，000個細胞/孔；3000rad) 以及10 μ g/ml抗CD3 (UCHT-I)在96孔V形底平板(Costar)中溫育3_4天。對于T細胞 阻抑，以指定比率加入Treg細胞。⑶4+T細胞的增殖情況通過FACS分析?；旌狭馨图毎磻?MLR)人PBMC 的 MLR 如(Ebert，L.M.& McCoIl，S.R.J Immunol 166，4870—8 (2001))所述進行。將人PBMC (100. 000個細胞/孔)與經(jīng)照射的(3. OOOrad)同種異體PBMC (100. 000 個細胞/孔)在RPMI/10% FCS(Invitrogen)中溫育5天。對于增殖的阻抑，以指定比率 加入分離的自體Treg細胞。增殖情況通過額外的10-15小時培養(yǎng)的3H-胸苷參入(1 μ Ci/ 孔)來監(jiān)測，并使用平板讀數(shù)儀(Wallac)來確定。異種移棺物抗宿主疾病(X-GvHD)一種急性形式的GvHD可在Rag2_/_ y c_/_小鼠(購自Taconic)中如先前所述 9 被誘導。簡而言之，PBMC 由 a-CD25 微珠(Miltenyi Biotech)使用 LD 柱(Miltenyi Biotech)耗竭。Treg細胞可使用一步流程從健康供體PBMC中獲得。在轉移前一天，小鼠 經(jīng)靜脈內(nèi)接受0. 2ml含有氯膦酸鹽/酯的脂質體。在轉移細胞之前4小時，對小鼠進行照 射(350rad)。靜脈內(nèi)注射30 X IO6⑶25耗竭的PBMC，其單獨使用或者在PBS/0. 人血清 白蛋白中與0.5X IO6Treg細胞以混合物的形式使用。在整個實驗期間測定小鼠的體重和 臨床癥狀；所述疾病的臨床跡象是皺褶的毛皮、背部躬曲姿勢和受損的運動。實施例1 :CD127和CD49d與Foxp3反向相關根據(jù)供體情況，大約30-60 %的人PBMC是⑶4+ T細胞(圖la)，這些細胞中 大約3-10%是Treg細胞。雖然大多數(shù)的人Treg細胞表達高水平的IL-2受體α-鏈 ⑶25(⑶25high)，但是這個標記不能如在小鼠中那樣明確分離Treg細胞群與非調(diào)節(jié)性⑶4+ 細胞。一些效應和記憶⑶4+細胞也表達較少的量的⑶25(⑶251 )，由此其細胞群部分地 與 CD25highTreg 亞群重疊(Baecher-Allan，C, Brown, J. Α.，F(xiàn)reeman, G. J. & Hafler，D. Α.， J Immunol 167，1245-53 (2001))。因此基于這個標記的Treg分離物具有被這些細胞所污 染的固有風險。與一些其它基因一樣，Treg細胞上的⑶25表達由Foxp3直接驅動(Hori， S.，Nomura，Τ· & Sakaguchi，S.，Science 299，1057-61 (2003))。因此用 Foxp3 對比染色表 示對⑶25high細胞的接近線性的相關性，其中表達最高量Foxp3的細胞對于⑶25也是最亮 染色(圖lb，左圖)。與CD25相反，IL-7受體(CD127)的α -鏈與Foxp3表達反向相關(Liu, W. et al.， J Exp Med 203，1701-11 (2006) ；Seddiki, N. et al.，J Exp Med 203，1693-700 (2006)) (圖lb，中間圖)。此處所述相關性也接近線性，但是具有最高水平Foxp3的細胞具有最低 的⑶127表達水平。然而，此分離并不完全。在圖Ib(中間圖)所示實例中，大約2/3的 CD127-細胞也是Foxp3-。因此對于Treg細胞鑒別，CD127總是與CD25組合使用(Liu，W. et al. , J ExpMed203,1701-11(2006) ；Seddiki, N. et al.，J Exp Med203，1693-700(2006))。我們自己的研究鑒定出了第二種在大多數(shù)Treg細胞上缺失的表面標記。⑶49d是 整聯(lián)蛋白VLAKad1)的α-鏈。且在此處的共分離也是不完全的(圖lb，右圖)。然 而，正如對⑶127所觀測到的，與Foxp3的反向線性相關顯然并不存在。而雙重染色顯示了 在Foxp3+細胞中不依賴于Foxp3表達水平的⑶49d的缺失。實施例2 :CD49d 區(qū)分 Foxp3+ Treg 細胞與 Foxp3_CD127-細胞雖然這兩個標記與Treg細胞的分離都不完全，但是組合使用⑶127和⑶49d可彼 此互補。用α-⑶127和α-⑶49d雙重染色可將⑶4+細胞群分為三個主要細胞群⑶127+、 CD49d+CD127-和 CD49d_CD127-細胞(圖 2a，上圖)。用 α -CD25 禾Π α -Foxp3 染色證實絕 大多數(shù)⑶127+細胞是非調(diào)節(jié)性⑶25-Foxp3-細胞(圖2a，左下圖)。更重要的是，⑶49d將 CD127-亞群分為兩個幾乎等大的亞群。大多數(shù)CD49d+CD127-細胞是Foxp3-，僅18%以下的細胞是CD25+Foxp3+(圖2a，右下圖)。相反，CD49d_CD127-細胞群幾乎只由Foxp3+細 胞組成。83%以上的細胞是表達高水平Foxp3的CD25+Foxp3+ Treg(圖2a，中下圖)。為了證實⑶49d-⑶127-表型與阻抑能力相關，通過FACS分選從⑶4+PBMC中分 離CD49d+CD127-和CD49d_CD127-細胞(圖2b)。幾乎無抑制作用可在CD49d+CD127_亞 群觀測到(圖2c)。相反，僅基于缺失⑶49d和⑶127所分選的⑶4+細胞有效地防止激活 的⑶25-⑶4+細胞的擴增。因此，使用⑶49d可區(qū)分非阻抑性⑶127-細胞與功能性Foxp3+ Treg細胞。實施例3 通過MACS純化未受影響的Foxp3+ Treg細胞FACS分選實驗的結果表明通過MACS組合耗竭具有由α -⑶127和α -⑶49d的 CD4+ T細胞應產(chǎn)生未受影響Treg細胞的干凈細胞群。為了驗證這種方法的可應用性，將從 人PBMC分離的未受影響的⑶4+細胞用α-⑶127和α -⑶49d標記并通過MACS使用常規(guī)磁 珠標記抗體使其耗竭(圖3)。FACS分析表明所述耗竭產(chǎn)生純度> 95%的⑶49d-⑶127-細 胞群(圖3a，上圖)。⑶25和Foxp3的染色證實了 92%以上的這些細胞是⑶25+Foxp+細 胞，另外2%是⑶25-Foxp3+(圖3a，下圖)。為了證實分離的Treg細胞的功能性，所述細胞 在基于FACS的體外阻抑測定中檢測(圖3b)。將⑶4+效應細胞用CFDA標記以監(jiān)測增殖情 況。沒有任何刺激時，所述細胞不分裂(圖3b，上圖)；但是用a-CD3刺激則觸發(fā)增殖性應 答，其由大約45%的細胞的CFDA熒光降低表明(圖3b，中間圖)。MACS純化的Treg細胞 的加入將增殖抑制至14%，其中大多數(shù)在單一復制周期之后已經(jīng)終止擴增(圖3b，下圖)。 因此，通過用α -⑶127和α -⑶49d的MACS耗竭分離的未受影響的Treg細胞在體外完全 能夠阻抑自體⑶4+效應細胞。實施例4 通過MACS經(jīng)單一步驟從PBMC中純化未受影響的Foxp3+ Treg細胞當使用總PBMC而不是預先純化的⑶4+細胞時，⑶49d的選擇性特別顯著(圖4)。 與在幾乎一半的PBMC上缺失的⑶127相反，絕大多數(shù)非⑶4+ T細胞仍表達⑶49d(圖4， 左圖)。在總 PBMC 中，40-50%是 CD49d+CD127-，而僅大約 2-4% 的 CD49d_CD127-。因此僅 ⑶49d+/⑶127+細胞的耗竭已經(jīng)足以直接從PBMC中獲得未受影響的Foxp3+細胞，其純度> 75% (11. 8% CD25-Foxp3+，64. 3% CD25+Foxp3+ ；圖 4a)。將 α -CD49d/α -CD127 加入商購 CD4+T細胞分離試劑盒的抗體混合物中時，該純度可進一步提高(圖4b)。耗竭后對PBMC級 分的 FACS 分析表明> 90%是Foxp3+細胞(76. 2% CD25+Foxp3+，14. 1 % CD25-Foxp3+)。因 此通過一步PBMC耗竭獲得的細胞的純度與用預先分離的CD4+T細胞獲得的純度相當(比 較圖3)。實施例5 在體外和體內(nèi)抑制同種反應/異種反應為了證實通過直接PBMC耗竭分離的Treg細胞的功能和生存力，阻抑能力在混合 淋巴細胞反應(MLR)中檢測。MLR是GvHD的體外相關反應。其基于“外來"MHC分子對T細 胞的同種激活，在混合兩個不同供體的PBMC之后顯現(xiàn)。為了確定Treg細胞是否能控制同 種反應應答，將其加入與單元型錯配供體的經(jīng)照射的PBMC混合的未經(jīng)照射的自體PBMC中 (圖5a)。在這些實驗中，證實根據(jù)實施例4從PBMC純化的Treg細胞(圖4b)是同種應答 的有效阻抑物。如對于三個不同供體所示，Treg細胞的存在強有力地阻抑自體PBMC的增 殖。因此，未受影響的PBMC衍生的Foxp3+細胞是能體外控制同種免疫應答的完全功能性 Treg細胞。
MLR實驗明確證明了分離的Treg細胞在體外的阻抑能力。然而關于未來治療應 用，關鍵是證明未受影響的Treg細胞也可以在體內(nèi)阻抑破壞性免疫應答。一個急性GvHD 體內(nèi)模型被用于此目的，該模型基于將⑶25-耗竭的人PBMC轉移至Rag2-/_ γ α -/-小鼠 中(Mutis, Τ. et al. , Clin Cancer Res 12，5520-5 (2006))。從轉移的細胞群中消除 Treg 細胞可以刺激該疾病的一種特別有攻擊性的形式，其經(jīng)常導致動物死亡。用a-CD25微珠 通過MACS耗竭PBMC中的Treg細胞，在單一步驟中未受影響的Treg細胞可通過組合使用 α -⑶127/ α -⑶49d以及商購⑶4+分離試劑盒再次分離(如實施例4所述，圖4b)。接受 30 X IO6⑶25耗竭的PBMC的所有小鼠在實驗的前幾天均呈現(xiàn)出較顯著或不太顯著的體重降 低(圖5b)。6只小鼠中有4只發(fā)展出臨床癥狀，其中2只小鼠在實驗期間死亡。與先前的 出版物一致，當共轉移自體Treg細胞時，PBMC誘導的GvHD的嚴重程度降低(Mutis，Τ. et al. , ClinCancer Res 12，5520-5 (2006))。在這個情況中，0. 5 X IO6 未受影響的 Treg 細胞 足以完全消除體重降低，治療組的所有小鼠在整個實驗期間均保持無癥狀出現(xiàn)。因此，通過 CD127/CD49d耗竭分離的未受影響的Treg細胞是能體外和體內(nèi)控制破壞性免疫應答的有 效阻抑物細胞。實施例6 從⑶25high Treg制品中分離污染效應細胞⑶25由Treg細胞(⑶25high)高水平表達。然而，在人體內(nèi)這個標記也由促炎細胞 包括效應和記憶 CD4+ T 細胞(Baecher-Allan et al.，J Immunol. 167 1245-53 (2001))以 及瞬時表達 Foxp3 的激活的 CD4+ T 細胞(Allan et al.，Int Immunol. 19 345-54 (2007)) 少量表達。與Treg細胞相反，這些效應細胞能分泌促炎細胞因子如IFN-Y或者IL-17。如 圖6a所示，⑶49d的表達是與分泌細胞因子的能力相分離的。這既適用于全部⑶4+細胞也 適用于Foxp3+細胞亞群。因此，⑶49d可用于從基于⑶25分離的Treg制品中除去可分泌 細胞因子的污染效應細胞。在FACS-分選的情況中(圖6b)，可通過對⑶49d-⑶25highCD4+ 亞群的門控(gating)獲得純Treg細胞；對于MACS-分選，在包括用a_⑶25陽性分離的分 選流程之前用α-⑶49d耗竭細胞。實施例7 單獨用⑶49d耗竭產(chǎn)生Treg富集的⑶4細胞制品由于⑶49d在大多數(shù)Foxp3+ Treg細胞上缺失，因此其可以通過從總⑶4+ T細胞 中耗竭⑶49d+細胞而被顯著富集。通過MACS使人⑶4+ T細胞的所有⑶49d+細胞耗竭， 并分析其Foxp3表達且與總⑶4+ T細胞對比。如圖7所示，通過從人⑶4+ T細胞中耗竭 ⑶49d+細胞，F(xiàn)oxp3+ Treg已經(jīng)可以被富集直至4_5倍。更重要的是，大多數(shù)產(chǎn)生細胞因子 的細胞從這個亞群中被除去，因為細胞因子分泌與這個標記相分離(圖6a)。實施例8 ⑶49d+細胞的耗竭除去污染⑶127- Treg制品的產(chǎn)生細胞因子的⑶4+ 效應細胞組合⑶49d與⑶127可以分離未受影響的Treg細胞(圖2)。此外，⑶49d與細 胞因子生產(chǎn)之間的分離也使得可以不僅除去Foxp3-細胞，也除去污染⑶127-Treg制品 的Thl-或者Thl7-樣細胞。如圖8所示，根據(jù)其⑶49d和⑶127表達分選的⑶4+細胞亞 群的激活清楚地顯示產(chǎn)生IFN- γ或者IL-17的細胞在⑶49d-⑶127-亞群中缺失，但是在 CD49d+CD127-亞群中存在。工業(yè)實用性本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)勢
1)安全性。對用于人體治療中的試劑的管理是非常嚴格的。這特別適用于在治 療期間施用的化合物。通過陽性分選產(chǎn)生的細胞在其表面攜帶外源抗體?？贵w的固有風險 難以確定，且“人源化”也未必可以防止不利作用，如最近在超拮抗性α-⑶28的戲劇性失 敗中所記載的(Suntharalingam，G. et al.，N Engl J Med 355，1018-28 (2006) ；Sharpe, A. H. & Abbas, A. K.，N EnglJ Med 355，973-5 (2006))。當使用僅用耗竭抗體純化的未受影 響的Treg細胞時可以避免這一風險。此外，⑶49d在潛在危險的分泌細胞因子的效應T細 胞上存在，但是在Foxp3+ Treg細胞上缺失。因此，常規(guī)所得的Treg細胞的安全性可以通 過除去⑶49d+細胞而增加。2)細胞存活性和功能狀態(tài)。與陽性分選的細胞相比，未受影響的細胞的另一優(yōu)勢 是在體內(nèi)具有存活性?？贵w標記的細胞趨于衰竭。在細胞表面上的抗體可以結合補體，或者 根據(jù)抗體亞型而附著于NK細胞或者巨噬細胞表面上的Fc受體。這種相互作用的結果通常 是由于補體介導的裂解或者抗體依賴性細胞介導的胞毒性(ADCC)而使細胞死亡。與抗體 包被的珠的結合也可以導致較大的細胞簇形成，其由受體(recipient)的非特異性吸收機 制消除。結果，轉移的細胞的主要部分會在其可顯示有益作用之前被清除。此外，在純化期 間抗體與細胞表面受體的結合也會改變其功能狀態(tài)。在Treg細胞的陽性分選時被靶向的 分子是⑶25。作為IL-2受體的α-鏈，其對于Treg細胞的存活和功能至關重要。阻斷會 消除擴增和阻抑功能(Thornton,Α. Μ. ,Donovan,Ε. Ε. ,Piccirillo,C. Α. & Shevach,Ε. Μ.，J Immunol 172,6519-23 (2004) ；Fontenot, J. D. , Rasmussen, J. P. , Gavin, Μ. Α. & Rudensky, Α. Y. , NatImmunol 6,1142-51 (2005) ；Kohm, Α. P. et al. , JImmunol 176，3301-5(2006); McNeill, Α. ， Spittle, Ε· & Backstrom， B. Τ. ， Scand J Immunol 65,63-9 (2007)),而另 一方面IL-2受體與抗體的交聯(lián)可導致過早激活(Barnard，A. L.，Igakura, Τ.，Tanaka, Y.，Taylor, G. P. & Bangham，C. R.，Blood 106，988-95 (2005) ；vonBonin, Α.，Huhn, J. & Fleischer, B.，Immunol Rev 161，43-53 (1998))，潛在的并發(fā)癥在使用未受影響的Treg細 胞時可被簡單地避免。3)時間與成本。與標準方法相比，本發(fā)明的新方法是有成本效益且快速的。CD49d/ ⑶127可適于所有通用的分離方法。例如，可以僅使用單一MACS柱進行該方法。因此，分離 不需要昂貴的設備且比常規(guī)的基于MACS的方法更快速及更簡便。4)純度及GMP相容性?；诹魇郊毎g的細胞分選儀目前未經(jīng)優(yōu)質生產(chǎn)規(guī)范 (GMP)許可。對于臨床試驗，供體細胞的分離必須經(jīng)由磁珠技術來進行。然而，在GMP條件 下分離Treg細胞的最初嘗試產(chǎn)生的平均純度低于50% (Hoffmann, P. et al.，Biol Blood Marrow Transplant 12，267-74 (2006))。因為 MACS 純化基于對 CD25+細胞的陽性選擇， 污染細胞主要是⑶4+⑶251 效應和記憶細胞，當轉移到免疫缺陷患者體內(nèi)時會造成觸發(fā) GvHD的固有風險。作為基于MACS的方法，本發(fā)明的新方法是GMP相容的。獲得>70%、> 80%,>90%,>95%或者甚至> 98 %的明顯較高純度的Treg細胞，而幾乎沒有污染⑶4+ 效應細胞。此外，Treg細胞是不受影響的被分離的，這進一步提高了該流程與GMP的相容 性。因此，本發(fā)明的方法提供了簡便且有成本效益的分離人Foxp3+ Treg細胞的方式。 此外，該方法中的細胞“未受影響的”狀態(tài)、高純度及GMP相容性使得該方法可廣泛應用于 不同情況中。因此這個新方法可用于獲取“未受影響的”人Treg細胞用于研究和開發(fā)、診斷并且為其在生產(chǎn)免疫治療藥物中的常規(guī)應用提供了新的前景。參考文獻Fontenot, J. D. & Rudensky, A. Y. A well adapted regulatory contrivance regulatory T cell development and the forkhead family transcription factorFoxp3. Nat Immunol 6，331-7 (2005) ·Sakaguchi, S. Natural Iy arising CD4+ regulatory T cell for immunoIogicself-tolerance and negative control of immune responses.Annu Rev Immunol 22，531—62 (2004).Baecher-Allan, C. & HafIer, D. A. Human regulatory T cell and their role inautoimmune disease. Immunol Rev 212，203-16 (2006)Robinson, D. S.，Larche, Μ. & Durham，S. R. Tregs and allergic disease. JClin Invest 114，1389-97 (2004)Roncarolo, M. G. & Battagl ia, Μ. Regulatory T-cell immunotherapy fortolerance to self antigens and alloantigens in humans. Nat Rev Immunol 7， 585-98(2007)Hoffmann，P. et al. Isolation of CD4+CD25+ regulatory T cell for clinicaltrials. Biol Blood Marrow Transplant 12，261-14(2006)Seddiki，N· et al. Expression of interleukin(IL)_2 and IL-7 receptorsdiscriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med 203，1693-700 (2006)Baecher-Allan，C，Brown, J. A.，F(xiàn)reeman，G. J. & Hafler, D. A. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood. J Immunol 167，1245-53 (2001). Suntharalingam，G. et al. Cytokine storm in a phase 1 trial ofthe anti_CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 355，1018-28 (2006)Liu, W. et al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 andsuppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med 203，1701-11 (2006) ·Hori，S. ,Nomura，T. & Sakaguchi,S. Control of regulatory T celldevelopment by the transcription factor Foxp3.Science 299，1057-61 (2003)Mutis，T. e t a 1 . Human regulatory T cell control xenogeneicgraft-versus-host disease induced by autologous T cell in RAG2-/-gammac-/-immunodeficient mice. Clin Cancer Res 12，5520-5 (2006)Sharpe，A. H. & Abbas , A. K. T-cell costimulation —— biology， therapeuticpotential，and challenges. N Engl J Med 355，973-5 (2006)Thornton, Α. Μ. , Donovan, Ε. Ε. , Piccirillo, C. A. & Shevach, Ε. M. Cutting edge IL-2 is critically required for the in vitro activation ofCD4+CD25+ T cell suppressor function. J Immunol 172，6519-23 (2004) ·Fontenot，J. D.，Rasmussen, J. P.，Gavin, M. A. & Rudensky, A. Y. Afunction for interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells. Nat Immunol 6， 1142-51(2005).
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權利要求
從樣品中分離人Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Foxp3+Treg細胞)的方法，所述樣品含有(i)外周血單個核細胞(PBMC)，(ii)含有淋巴細胞的液體，或者(iii)含有淋巴細胞的組織；所述方法包括步驟(a)用抗CD49d抗體以及如下抗體處理所述樣品(i)抗CD25抗體，或者(ii)抗CD127抗體；及(b)分離Foxp3+Treg細胞。
2.權利要求1的方法，其中同時進行步驟(a)和(b)。
3.權利要求1或2的方法，其中步驟(a)包括用抗⑶25抗體和抗⑶127抗體處理樣品O
4.權利要求1-3任一項的方法，其中步驟(a)另外包括從樣品中分離非CD4+T細胞。
5.權利要求4的方法，其中允許特異性耗竭樣品中非CD4+T細胞的一或多種抗體用于 從樣品中分離非⑶4+T細胞。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中步驟(a)中使用的至少一種抗體是標記或固定化的。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中步驟(b)通過耗竭樣品中的如下細胞來進行(i)通過抗⑶49d抗體耗竭⑶49d+細胞；或者(ii)通過抗⑶127抗體耗竭⑶127+細胞；或者(iii)通過抗CD49d和/或抗CD127抗體耗竭CD49d+CD127+細胞。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中步驟(b)通過使用離心、細胞淘析、磁性分離、熒光 激活細胞分選術、免疫分離、粘附、補體溶解或者流式細胞術進行。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中步驟(b)通過使用磁性細胞分離、熒光激活細胞分 選術或者基于柱的免疫分離進行。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中抗CD45RO抗體在步驟(a)中用作額外的抗體，且 其中分離的Foxp3+Treg細胞是CD45RA+T細胞。
11.權利要求1-9任一項的方法，其中抗CD45RA抗體在步驟(a)中用作額外的抗體，且 其中分離的Foxp3+Treg細胞是CD45RO+T細胞。
12.分離人FoXp3+Treg細胞的試劑盒，其包含抗⑶49d抗體和抗⑶25抗體或者抗 ⑶49d抗體和抗⑶127抗體。
13.權利要求12的試劑盒，其中所述試劑盒包含抗⑶49d抗體、抗⑶25抗體和抗⑶127 抗體。
14.抗⑶49d抗體組合抗⑶25抗體和/或抗⑶127抗體、或者權利要求12或13的試 劑盒在分離人FoXp3+Treg細胞中的應用。
15.權利要求14的應用，其特征在于通過離心、細胞淘析、磁性分離、熒光激活細胞 分選術、免疫分離、粘附、補體溶解或者流式細胞術從FoXp3+Treg細胞分離包括非調(diào)節(jié)性 CD4+T細胞的CD49d+PBMC而實現(xiàn)人Foxp3+Treg細胞的分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及從樣品中分離人forkhead box P3(Foxp3+)CD4+調(diào)節(jié)性T細胞(在本文稱作Foxp3+Treg細胞)的方法，所述樣品含有(i)外周血單個核細胞(PBMC)，(ii)含有淋巴細胞的液體或者(iii)含有淋巴細胞的組織；本發(fā)明還涉及分離人Foxp3+Treg細胞的試劑盒以及抗CD49d抗體用于分離人Foxp3+Treg細胞的應用。
文檔編號C12N5/00GK101883844SQ200880118525
公開日2010年11月10日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權日2007年10月12日
發(fā)明者K·法爾克, M·克萊因維特菲爾德, O·倫特茲什科 申請人:分子醫(yī)學馬克斯德爾布呂克中心