專利名稱：雷莫拉寧的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種分離雷莫拉寧的方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素在抗感染治療上的大量應(yīng)用，臨床耐藥問題日益突出。雷莫拉寧(RAM0PLANIN)作為一類新型廣譜抗革蘭氏陽性菌抗生素，目前主要是作為外用和治療胃腸 道粘膜表面感染性疾病藥物進(jìn)行研究開發(fā)。雷莫拉寧由一種游動(dòng)放線菌屬菌種(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫保存，代碼ATCC33076)制得。 雷莫拉寧傳統(tǒng)的分離方法是將雷莫拉寧發(fā)酵菌株發(fā)酵出來的發(fā)酵液先調(diào)PH到3. 5，離心得 到菌絲體和發(fā)酵液，其中菌絲體用有機(jī)溶劑浸泡半小時(shí)后離心去上清液，將上清液真空濃 縮，再用正丁醇萃取多次，合并萃取液后再反復(fù)用石油醚對(duì)其進(jìn)行沉淀并分離出來，真空干 燥得到粗品，發(fā)酵液也同樣制得粗品。將粗品預(yù)處理后再濕法上硅膠柱純化，用不同極性的 溶劑作為流動(dòng)相洗柱子，得到純度較高的雷莫拉寧純品。USP4328316報(bào)道的雷莫拉寧的分離方法主要是用硅膠柱層析，通過調(diào)整展開劑的 極性來分離得到高純度的雷莫拉寧，但此法的缺點(diǎn)是操作過程繁瑣，硅膠柱層析速度較慢， 樣品處理量少，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)并同時(shí)保持 其高收率和高純度的雷莫拉寧的分離方法。本發(fā)明的雷莫拉寧的分離方法依次包括如下步驟a)雷莫拉寧上柱液上大孔離子交換吸附樹脂；b)用水沖洗；c)用甲醇水溶液洗脫；d)用含酸的甲醇水溶液洗脫。本發(fā)明所述的由保藏號(hào)為ATCC33076的發(fā)酵菌株進(jìn)行發(fā)酵的過程如下斜面培養(yǎng)條件斜面及平板培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0，酪蛋白10.0，可溶淀粉 24. 0，葡萄糖1.0，瓊脂22.0，滅菌前pH 7. 0，121°C滅菌30min。菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于 30°C培養(yǎng)5-9天。種子培養(yǎng)條件二級(jí)發(fā)酵種子培養(yǎng)條件為牛肉膏3. 0，酪蛋白5. 0，酵母粉5. 0，燕 麥粉30.0，碳酸鈣4.0，自來水配制，用2mol/L的氫氧化鈉(或者鹽酸)調(diào)pH至7.0，121°C 滅菌30min。種子培養(yǎng)基裝量為100ml/750ml，于28°C，250rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)72h。發(fā)酵培養(yǎng)條件為淀粉50.0，葡萄糖20.0，黃豆粉30.0，碳酸鈣10.0，L-Leu5.0，自 來水配制，用2mol/L的氫氧化鈉(或者鹽酸)調(diào)pH至7.0，121°C滅菌30min。接種量6%， 裝量100ml/750ml，于25°C，旋轉(zhuǎn)式搖床250rpm培養(yǎng)5天。將發(fā)酵產(chǎn)物先用草酸調(diào)pH到3. 5，離心得到菌絲體和發(fā)酵液，其中發(fā)酵液直接濃縮得到濃縮液，而菌絲體用有機(jī)溶劑浸泡半小時(shí)后離心去上清液，將上清液濃縮后得到濃 縮液。本發(fā)明所述的雷莫拉寧濃縮液可以是上述兩種濃縮液的任意一種或其混合物。取大孔離子交換吸附樹脂(對(duì)于此類型的樹脂可以通用)，再生好后裝入層析柱， 將雷莫拉寧濃縮液加水稀釋制成雷莫拉寧上柱液。加水的標(biāo)準(zhǔn)是含水量大于50%即可。 然后將雷莫拉寧溶液中等流速上柱，上柱后先用大量(優(yōu)選柱體積的8倍或以上) 的水(優(yōu)選去離子水或蒸餾水)沖洗，除去大量的鹽；再用甲醇水溶液中等流速進(jìn)行洗脫， 在此條件下，大量的極性色素和其他雜質(zhì)被洗下，而雷莫拉寧被保留在柱上；再用含酸的甲 醇水溶液中等流速進(jìn)行洗脫，此時(shí)大量的雷莫拉寧被洗脫下來，而極性較低的雜質(zhì)仍然被 留在柱上，取純度大于80%的部分。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述大孔離子交換吸附樹脂為YPR II型或DoWeX50型。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述甲醇水溶液的濃度為甲醇水=2 1 3 1，優(yōu) 選使用70%的甲醇水溶液。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述含酸的甲醇水溶液為含鹽酸、醋酸或硝酸的甲醇水 溶液，優(yōu)選所述含酸的甲醇水溶液為含鹽酸的甲醇水溶液。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述含酸的甲醇水溶液中酸的濃度優(yōu)選為0. IN 0.5N， 優(yōu)選0. 2N。一般來說，酸的濃度在0. OlN以上，都能達(dá)到與硅膠法相當(dāng)?shù)男Ч?，但從收率?純度綜合考慮，優(yōu)選將酸的濃度定在0. IN 0. 5N的范圍。本發(fā)明的雷莫拉寧的分離方法用可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大孔離子交換樹脂來代替硅 膠，通過吸附洗脫條件的摸索，建立了一條穩(wěn)定的分離純化工藝，將雷莫拉寧的純度大幅度 的提高。由于所用樹脂價(jià)格便宜，再生性能好，完全能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 2考察洗脫時(shí)甲醇水溶液濃度的影響實(shí)施例1取按上述方法制得的雷莫拉寧上柱液520ml，其中雷莫拉寧約為1800ug/ml，取 80ml的YPR II樹脂，將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫 拉寧溶液以中等流速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用2 1的甲醇水 溶液通過層析柱，分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用2 1的含鹽酸0.2N 的甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件 的收集液，其最終純度為90. 1%，收率為85%。實(shí)施例2取按上述方法制得的雷莫拉寧上柱液520ml，其中雷莫拉寧約為1800ug/ml，取 80ml的YPR II樹脂，將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫 拉寧溶液以中等流速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用3 1的甲醇水 溶液通過層析柱，分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用3 1的含鹽酸0.2N 的甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件 的收集液，其最終純度為94.3%，收率為79%。實(shí)施例1和2說明，洗脫時(shí)甲醇含量越高，越有利于最終純度的提高，但是甲醇含 量越高，其收率也相應(yīng)降低。
實(shí)施例3 5考察洗脫時(shí)鹽酸濃度的影響實(shí)施例3取按上述方法制得的雷莫拉寧上柱液486ml，其中雷莫拉寧約為1596ug/ml，取80ml的YPR II樹脂，將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫 拉寧溶液以中等流速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的 水溶液通過層析柱，分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. IN鹽 酸的水溶液的進(jìn)行洗脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件 的收集液，其最終純度為93%，收率為76%。實(shí)施例4取按上述方法制得的雷莫拉寧上柱液486ml，其中雷莫拉寧約為1596ug/ml，取 80ml的YPR II樹脂，將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫 拉寧溶液以中等流速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的 水溶液通過層析柱，分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70 %甲醇0. 5N鹽 酸的水溶液的進(jìn)行洗脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件 的收集液，其最終純度為89 %，收率為91 %。實(shí)施例5取雷莫拉寧上柱液493ml，其中雷莫拉寧約為1523ug/ml，取80ml的YPR II樹脂， 將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等流 速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析柱， 分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N鹽酸的水溶液的進(jìn)行洗 脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最終純 度為94%，收率為89%。實(shí)施例3、4和5說明，洗脫時(shí)鹽酸濃度越高，雷莫拉寧洗脫下來的收率也越大，但 是純度會(huì)相應(yīng)的下降，因?yàn)楸緛肀粯渲降碾s質(zhì)也被洗下。且鹽酸含量高不利于雷莫拉 寧的穩(wěn)定。實(shí)施例7 8考察不同種類的酸對(duì)洗脫效果的影響實(shí)施例7取雷莫拉寧上柱液572ml，其中雷莫拉寧約為1422ug/ml，取80ml的YPR II樹脂， 將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等流 速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析柱， 分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N鹽酸的水溶液的進(jìn)行洗 脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最終純 度為95%，收率為88%。實(shí)施例8取雷莫拉寧上柱液572ml，其中雷莫拉寧約為1422ug/ml，取80ml的YPR II樹脂， 將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等流 速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析柱， 分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N醋酸的水溶液的進(jìn)行洗 脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最終純度為96%，收率為79%。實(shí)施例9 10考察不同樹脂對(duì)洗脫效果的影響實(shí)施例9取雷莫拉寧上柱液450ml，其中雷莫拉寧約為1502ug/ml，取80ml的YPR II樹脂，將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等流 速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析柱， 分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N醋酸的水溶液的進(jìn)行洗 脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最終純 度為93%，收率為88%。實(shí)施例10取雷莫拉寧上柱液450ml，其中雷莫拉寧約為1502ug/ml，取80ml的D0WEX50樹 月旨，將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等 流速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析 柱，分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N醋酸的水溶液的進(jìn) 行洗脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最 終純度為90%，收率為81%。實(shí)施例11 12考察去離子水和蒸餾水對(duì)洗脫效果的影響實(shí)施例11取雷莫拉寧上柱液684ml，其中雷莫拉寧約為1409ug/ml，取80ml的YPR II樹脂， 將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等流 速通過層析柱，再用大量的去離子水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析柱， 分步收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N醋酸的水溶液的進(jìn)行洗 脫，分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最終純 度為94%，收率為85%。實(shí)施例12取雷莫拉寧上柱液684ml，其中雷莫拉寧約為1409ug/ml，取80ml的YPR II樹脂， 將其再生好后填入層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，將配好的雷莫拉寧溶液以中等流速 通過層析柱，再用大量的蒸餾水洗脫樹脂，之后再用含70%甲醇的水溶液通過層析柱，分步 收集洗脫液，一直洗到色素基本被除去，最后用70%甲醇0. 2N醋酸的水溶液的進(jìn)行洗脫， 分步收集流出液，HPLC檢測(cè)，取純度> 80%的部分，合并符合條件的收集液，其最終純度為 93%，收率為86%。對(duì)比例1 硅膠法分離雷莫拉寧取硅膠約5g，干法填到層析柱(柱高*直徑30cm*3cm)中，取雷莫拉寧初提液，其 中含雷莫拉寧約0. 7g，濃縮到體積盡量小，置于硅膠頂端進(jìn)行層析，層析液按順序用丙酮， 含70%甲醇的水溶液，含70%甲醇的0. IN鹽酸溶液，流速控制在lml/min，HPLC進(jìn)行檢測(cè)， 收集含量達(dá)到80 %以上的洗脫液，收率為75 %，純度為86 %。
權(quán)利要求
雷莫拉寧的分離方法，其特征在于，依次包括如下步驟a)雷莫拉寧上柱液上大孔離子交換吸附樹脂；b)用水沖洗；c)用甲醇水溶液洗脫；d)用含酸的甲醇水溶液洗脫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，a)步驟中所述大孔離子交換吸附樹脂為 YPR II 或 Dowex50。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，b)步驟中所述水為去離子水或蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述去離子水或蒸餾水的用量為大孔 離子交換吸附樹脂體積的8倍或以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，c)步驟和d)步驟中所述甲醇水溶液的濃 度為甲醇水=2 1 3 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的濃度為70%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，d)步驟中所述酸為鹽酸、醋酸或硝酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述酸為鹽酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，d)步驟中所述酸的濃度為0.1N 0. 5N。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述酸的濃度為0.2N。
全文摘要
本發(fā)明公開一種雷莫拉寧的分離方法，其特征在于，依次包括如下步驟a)雷莫拉寧上柱液上大孔離子交換吸附樹脂；b)用水沖洗；c)用甲醇水溶液洗脫；d)用含酸的甲醇水溶液洗脫。本發(fā)明用可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大孔離子交換樹脂來代替硅膠，建立了一條穩(wěn)定的分離純化工藝，將雷莫拉寧的純度大幅度的提高。由于所用樹脂價(jià)格便宜，再生性能好，完全能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K9/00GK101838315SQ20091004772
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者盧亮, 張宏宇, 李繼安 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院