一種人類(lèi)全血白細(xì)胞中dna提取試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒，所述試劑盒中包括紅細(xì)胞裂解液和DNA提取液，且所述紅細(xì)胞裂解液包含以下組分：4.5～5.5mmol/L的氯化鈉、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羥甲基氨基甲烷。本發(fā)明解決了現(xiàn)有全血核酸提取試劑盒的缺陷，提供一種操作快速簡(jiǎn)單、提取效率高、使用安全、制造成本低的人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA快速提取試劑盒。應(yīng)用該試劑盒，可以對(duì)用于PCR技術(shù)檢測(cè)的臨床全血樣本白細(xì)胞中DNA進(jìn)行快速提取，提取得到全血中的白細(xì)胞DNA和白細(xì)胞內(nèi)病毒的DNA。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]自PCR技術(shù)在上世紀(jì)八十年代問(wèn)世以來(lái)，其在分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。尤其是近年來(lái)，隨著人們對(duì)臨床診斷精度靈敏度要求的提高，以及個(gè)體化醫(yī)療概念的提出和推廣，PCR技術(shù)憑借其在臨床診斷中快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)迅速?gòu)V泛的應(yīng)用到了臨床診療，通過(guò)檢測(cè)患者樣本中的基因，從而幫助醫(yī)生確定用藥和治療方案。
[0003]而樣本DNA提取是PCR技術(shù)運(yùn)用的前提，人類(lèi)外周血在人體內(nèi)免疫反應(yīng)及代謝中發(fā)揮著重要作用，可用于血液系統(tǒng)及其他眾多系統(tǒng)疾病的分子監(jiān)測(cè)，由于其在臨床上取樣簡(jiǎn)單易得，在臨床診斷或研究中應(yīng)用最為廣泛。
[0004]目前全血DNA提取方法主要有苯酚-氯仿法、離心柱法、磁珠法。其中苯酚-氯仿法操作復(fù)雜且含有大毒性的有機(jī)溶劑已少有使用；離心柱法仍然是目前使用最廣泛的全血DNA提取方法，但其需要特殊的硅膠膜層析柱，且需要反復(fù)的離心清洗后才能洗脫獲得DNA ;磁珠法采用磁珠吸附、清洗洗脫獲得DNA ;這些方法操作過(guò)程中需要多次離心、換管、磁棒分離過(guò)程，操作復(fù)雜，提取時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)操作要求較高，不利于臨床診療或研究應(yīng)用。
[0005]目前國(guó)內(nèi)外已有多種用于全血基因提取的試劑盒可以應(yīng)用于臨床。這些試劑盒所提供的全血DNA提取方法有很多缺點(diǎn):如DNA提取過(guò)程復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)；處理時(shí)，樣本中的DNA存在不同程度的耗損，尤其對(duì)于高濃度樣本，裂解不充分，富集不完全，造成DNA丟失而使樣本定量偏低；處理步驟多，需要多次開(kāi)蓋換管、離心、漂洗多次，磁棒分離過(guò)程，易造成樣本間交叉污染和環(huán)境氣溶膠污染。提取過(guò)程需要多種儀器或特殊器材，制造成本較高，對(duì)操作要求高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種人類(lèi)全血DNA快速提取試劑盒及其從人類(lèi)全血白細(xì)胞中提取DNA的方法，解決現(xiàn)有全血核酸提取試劑盒的缺陷，提供一種操作快速簡(jiǎn)單、提取效率高、使用安全、制造成本低的人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA快速提取試劑盒。應(yīng)用該試劑盒，可以對(duì)用于PCR技術(shù)檢測(cè)的臨床全血樣本白細(xì)胞中DNA進(jìn)行快速提取。
[0007]因此，本發(fā)明提供一種人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒，所述試劑盒中包括紅細(xì)胞裂解液和DNA提取液，且所述紅細(xì)胞裂解液包含以下組分:4.5~5.5mmol/L的氯化鈉、0.8 ~1.2% (v/v)的曲拉通 100,300 ~340mmol/L 的葡萄糖和 0.008 ~0.012mol/L 的三羥甲基氨基甲烷。
[0008]優(yōu)選的，在所述紅細(xì)胞裂解液中，所述氯化鈉的濃度為5mmol/L，所述曲拉通100的濃度為1.0% (v/v)，所述葡萄糖的濃度為320mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.01mol/L,余量為無(wú)菌水，且使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值使得所述紅細(xì)胞裂解液的PH值為7.8~8.6，優(yōu)選8.0~8.4，更優(yōu)選8.2。[0009]在本發(fā)明一種【具體實(shí)施方式】中，所述DNA提取液包含0.6~1.0mol/L的氯化鉀，0.4~0.8mol/L的乙二胺四乙酸，0.8~1.2% (m/v)的十二烷基硫酸鈉，余量為無(wú)菌水，且使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值使得所述DNA提取液的pH值為7.8~8.6，優(yōu)選8.0~
8.4，更優(yōu)選8.2。
[0010]在本發(fā)明的另一種【具體實(shí)施方式】中，所述DNA提取液包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1%。
[0011]本發(fā)明還提供一種如上所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟，步驟A，去除紅細(xì)胞:向全血中加入紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，得到混合物，對(duì)其進(jìn)行離心分離，去上清，留下白色沉淀物；步驟B，提取白細(xì)胞中DNA:向步驟A中所得白色沉淀物中加入所述DNA提取液，用移液器吹打混勻，靜置使白細(xì)胞充分裂解而釋放出其中的DNA，得到用于PCR擴(kuò)增的DNA溶液。
[0012]在上述方法中，優(yōu)選地，重復(fù)步驟A兩次；即對(duì)步驟A中的白色沉淀物再加入紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，使沉淀重新懸浮而得到混合液，對(duì)其進(jìn)行離心分離，去上清，留下白色沉淀物。
[0013]優(yōu)選地，步驟A中全血體積在100微升以上，且全血與紅細(xì)胞裂解液的體積比為1:1~5。優(yōu)選步驟A中離心分離的轉(zhuǎn)速為10000~13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的時(shí)間為I~3分鐘。
[0014]優(yōu)選地，步驟A中全血與步驟B中DNA提取液的體積比為1:0.25~I。
[0015]本發(fā)明還提供一種如上所述的試劑盒在熒光PCR檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明的試劑盒中含有獨(dú)特的紅細(xì)胞裂解液，其使得全血樣本中的紅細(xì)胞特異性裂解，分離出全血中的有核細(xì)胞；再在DNA提取液的作用下得到全血中的白細(xì)胞DNA和白細(xì)胞內(nèi)病毒的DNA。通過(guò)使用本發(fā)明中的試劑盒，能極大地避免提取過(guò)程中DNA的損失，大大增加了全血DNA的提取效率；本發(fā)明使用較少的操作步驟，減少管間交叉污染和對(duì)環(huán)境的污染；本發(fā)明提取步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需加熱，僅需進(jìn)行一次或兩次離心去除上清液，再加入DNA提取液，即可完成整個(gè)提取，大大縮短了提取時(shí)間，有利于臨床診斷工作效率的提高。本發(fā)明的試劑盒制造成本低廉，無(wú)需特殊物料或儀器，僅需離心機(jī)和移液器，使用安全。本發(fā)明能同時(shí)抑制Dnase和Rnase活性，且對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生影響。本發(fā)明的提取效率高于常見(jiàn)全血DNA提取方法。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
[0018]1、人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒及其中試劑的配制方法:
[0019]①紅細(xì)胞裂解液的配制:先在容量瓶中加入少量無(wú)菌水，稱(chēng)取并加入使?jié)舛茸罱K為5mmol/L的氯化鈉,加入體積比最終為1%的曲拉通溶液，加入最終濃度為320mmol/L的葡萄糖，加入最終濃度為0.01mol/L的三羥甲基氨基甲烷；加入無(wú)菌水定容至所需體積，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至8.2 ;高壓滅菌10分鐘。
[0020]②DNA提取液的配制:先在容量瓶中加入少量無(wú)菌水，稱(chēng)取并加入使?jié)舛茸罱K為
0.8mol/L的氯化鉀，加入最終濃度為0.6mol/L的乙二胺四乙酸，加入最終濃度為1%的十二烷基硫酸鈉(質(zhì)量體積比)；加入無(wú)菌水定容至所需體積，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至8.2 ;高壓滅菌15分鐘。
[0021]2、試劑盒的應(yīng)用:
[0022]試劑盒的應(yīng)用對(duì)象為100例全血樣本。應(yīng)用的具體操作步驟為:向每例200微升全血中加入800微升紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻10秒，得到紅色透明清亮混合物；對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為I分鐘，去上清，留白色沉淀物；在上述沉淀物中再加入800微升紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，使沉淀重新懸浮而得到混合液；對(duì)上述混合液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為I分鐘，去上清，留白色沉淀物；向所述沉淀物中加入100微升DNA提取液，用移液器吹打混勻數(shù)次，靜置10分鐘，使白細(xì)胞充分裂解，釋放出DNA，得到可用于PCR擴(kuò)增的DNA溶液。
[0023]3、對(duì)試劑盒應(yīng)用的效果檢測(cè)和評(píng)價(jià):
[0024]使用β-Actin管家基因檢測(cè)試劑對(duì)上述DNA溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果是，采用本發(fā)明中的試劑盒提取100例全血樣本DNA后檢測(cè)其中的β -Actin管家基因，100例均有擴(kuò)增曲線(xiàn)，說(shuō)明本發(fā)明提供的試劑盒能有效提取得到全血樣本中白細(xì)胞的DNA。
[0025]另外，本發(fā)明的試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)中的商售離心柱法提取試劑盒對(duì)同一全血樣本進(jìn)行DNA提取，用β-Actin管家基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)同樣100例樣本進(jìn)行處理本發(fā)明較離心柱法節(jié)約2小時(shí)，且提取的檢測(cè)結(jié)果靠前1-4個(gè)Ct，可見(jiàn)本發(fā)明的試劑盒較離心柱法操作更簡(jiǎn)便，且有更高提取效率。
[0026]實(shí)施例2
[0027]1、人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒及其中試劑的配制方法:
[0028]①紅細(xì)胞裂解液的配制:同實(shí)施例1。
[0029]②DNA提取液的配制:先在`容量瓶中加入少量無(wú)菌水，稱(chēng)取并加入使?jié)舛茸罱K為
0.lmol/L的氯化鉀，加入最終濃度為0.2mmol/L的莎梵婦(surfactin),加入最終濃度為
0.5%的十二烷基磺酸鈉(質(zhì)量體積比)和加入最終濃度為0.2%的乙醇；加入無(wú)菌水定容至所需體積，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至8.2 ;高壓滅菌15分鐘。
[0030]2、試劑盒的應(yīng)用:
[0031]試劑盒的應(yīng)用對(duì)象為含EB病毒DNA濃度為IXlO4IU的全血樣本。應(yīng)用的具體操作步驟為:向200微升全血中加入800微升紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻10秒，得到紅色透明清亮混合物；對(duì)上述混合物進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為I分鐘，去上清，留白色沉淀物；在上述沉淀物中再加入800微升紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，使沉淀重新懸浮而得到混合液；對(duì)上述混合液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時(shí)間為I分鐘，去上清，留白色沉淀物；向所述沉淀物中加入50微升DNA提取液，用移液器吹打混勻數(shù)次，靜置10分鐘，使白細(xì)胞充分裂解，釋放出DNA，得到可用于PCR擴(kuò)增的DNA溶液。
[0032]3、對(duì)試劑盒應(yīng)用的效果檢測(cè)和評(píng)價(jià):
[0033]使用商售的EB病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒對(duì)上述DNA溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果是，采用本發(fā)明中的試劑盒6次重復(fù)提取全血樣本DNA后檢測(cè)其中的濃度為IXlO4IU的EB病毒DNA,從擴(kuò)增曲線(xiàn)看，基線(xiàn)平整，指數(shù)區(qū)明顯，同一樣本6次檢測(cè)的Ct值的變異系數(shù)〈2%，濃度變異系數(shù)〈50%，重復(fù)性好。說(shuō)明本發(fā)明提供的試劑盒能夠有效收集到白細(xì)胞中的病毒DNA。
【權(quán)利要求】
1.一種人類(lèi)全血白細(xì)胞中DNA提取試劑盒，所述試劑盒中包括紅細(xì)胞裂解液和DNA提取液，且所述紅細(xì)胞裂解液包含以下組分:4.5~5.5mmol/L的氯化鈉、0.8~1.2% (v/v)的曲拉通100、300~340mmol/L的葡萄糖和0.008~0.012mol/L的三羥甲基氨基甲烷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，在所述紅細(xì)胞裂解液中，所述氯化鈉的濃度為5mmol/L，所述曲拉通100的濃度為1.0%(v/v)，所述葡萄糖的濃度為320mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.01mol/L，余量為無(wú)菌水，且使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值使得所述紅細(xì)胞裂解液的pH值為7.8~8.6，優(yōu)選8.0~8.4，更優(yōu)選8.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液包含0.6~ 1.0mol/L的氯化鉀,0.4~0.8mol/L的乙二胺四乙酸,0.8~1.2% (m/v)的十二烷基硫酸鈉，余量為無(wú)菌水，且使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值使得所述DNA提取液的pH值為7.8~8.6，優(yōu)選8.0~8.4，更優(yōu)選8.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液包含莎梵婷(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2% 和乙醇 0.05 ~1%。
5.一種如權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟， 步驟A，去除紅細(xì)胞:向全血中加入紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，得到混合物，對(duì)其進(jìn)行離心分離，去上清，留下白色沉淀物； 步驟B，提取白細(xì)胞中DNA:向步驟A中所得白色沉淀物中加入所述DNA提取液，用移液器吹打混勻，靜置使白細(xì)胞充分裂解而釋放出其中的DNA，得到用于PCR擴(kuò)增的DNA溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，重復(fù)步驟A兩次；即對(duì)步驟A中的白色沉淀物再加入紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，使沉淀重新懸浮而得到混合液，對(duì)其進(jìn)行離心分離，去上清，留下白色沉淀物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟A中全血體積在100微升以上，且全血與紅細(xì)胞裂解液的體積比為1:1~5。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟A中離心分離的轉(zhuǎn)速為10000~13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的時(shí)間為I~3分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟A中全血與步驟B中DNA提取液的體積比為1:0.25~I。
10.權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)所述的試劑盒在熒光PCR檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103710338SQ201310744462
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】戴立忠, 唐瑤, 吳康, 鄧中平 申請(qǐng)人:湖南圣湘生物科技有限公司