專利名稱：：新型植物表達(dá)構(gòu)建物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用核酸分子以控制植物中的基因表達(dá)，所述核酸分子具體是新型植物啟動(dòng)子。
背景技術(shù)：
：植物遺傳工程的一個(gè)目標(biāo)是產(chǎn)生具有重要農(nóng)學(xué)特征或性狀的植物。遺傳工程的最近發(fā)展已經(jīng)提供了產(chǎn)生包含和表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物的必要工具(Kahl等，WorldJ.ofMicrobiol.Biotech.11:449-460,1995)。對(duì)于植物遺傳工程尤其需要的目的性狀或品質(zhì)包括但不限于昆蟲抗性、真菌病抗性、對(duì)其它害蟲和病原體的抗性、除草劑耐性、更高的穩(wěn)定性或更長的保存期、更高產(chǎn)量、環(huán)境耐性以及營養(yǎng)強(qiáng)化(nutritionalenhancement)。才直物轉(zhuǎn)^b和再生領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)使得研究者能夠從異源來源或天然來源提取外源DNA(如一個(gè)基因或多個(gè)基因)，然后將所述外源DNA摻入植物基因組。在一種方法中，通常不在特定植物或特定植物組織中表達(dá)的新型基因的表達(dá)可能賦予所需的表型效應(yīng)。在另一種方法中，以反義取向的基因或基因部分的轉(zhuǎn)錄可能通過防止或抑制內(nèi)源基因的表達(dá)而產(chǎn)生所需效應(yīng)。為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，將包括異源基因序列的構(gòu)建物引入植物細(xì)胞，所述異源基因序列當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)賦予所需表型。所述構(gòu)建物還包括有效連接所述異源基因序列的植物啟動(dòng)子，該植物啟動(dòng)子通常在一般情況下不與所述異源基因連接。將所述構(gòu)建物引入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后將所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生為轉(zhuǎn)基因植物。所述啟動(dòng)子控制該啟動(dòng)子有效連接的所引入DNA序列的表達(dá)，并因此影響所述DNA序列所賦予的所需特性。利用多種啟動(dòng)子定制基因表達(dá)可能是有利的，以便一個(gè)基因或多個(gè)基因在植物生長和發(fā)育的恰當(dāng)時(shí)間、在所述植物中的最佳位點(diǎn)并且以產(chǎn)生所需效應(yīng)所必需的量有效轉(zhuǎn)錄。例如，基因產(chǎn)物的組成型表達(dá)在植物的一個(gè)位點(diǎn)可能是有利的，但在該植物的另一部分就不是那么有利。在其它情況下，在植物某個(gè)發(fā)育階段或在應(yīng)答某些環(huán)境或化學(xué)刺激時(shí)產(chǎn)生基因產(chǎn)物可能是有利的。遺傳改良種質(zhì)的商業(yè)化發(fā)展也已經(jīng)前進(jìn)到將多種性狀引入作物的階段，該方法常常被稱為基因堆積方法(genestackingapproach)。在該方法中，可以將賦予不同目的性狀的多種基因引入植物。當(dāng)將多種基因引入植物時(shí)，重要的是調(diào)整或控制每個(gè)基因以獲得最佳表達(dá)，并且《吏得調(diào)節(jié)元件多樣化，以降低基因沉默的可能性。根據(jù)這些和其它的考慮，在植物生物工程技術(shù)中基因表達(dá)的最佳控制和調(diào)節(jié)元件多樣化顯然是重要的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含以下元件的DNA植物表達(dá)構(gòu)建物擬南芥屬肌動(dòng)蛋白(Act)啟動(dòng)子序列Actla、Actlb和延伸因子let(EFloc)啟動(dòng)子序列、以及由有效連接于在作物細(xì)胞中起作用的異源結(jié)構(gòu)基因序列的這些啟動(dòng)子獲得的片段和順式元件。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供以有效連接包含下列元件的重組DNA構(gòu)建物在作物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括來自SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23的至少一種順式元件；對(duì)于所述啟動(dòng)子異源的結(jié)構(gòu)DNA序列；和在植物中起作用的3'非翻譯區(qū)，該3'非翻譯區(qū)引起在RNA序列的3'末端添加聚腺苷酸化核苷酸。例如，所述啟動(dòng)子可以主要包含來自下面任何一種的5，調(diào)節(jié)區(qū)SEQ'IDNO:12、SgQIDNO:22、SEQIDNO:23(包括或不包括它們中間的任何內(nèi)含子序列)。所述結(jié)構(gòu)基因可以包含任何異源核苷或產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的一方面是一種DNA構(gòu)建物，該DNA構(gòu)建物包含有效連接本發(fā)明啟動(dòng)子序列的結(jié)構(gòu)DNA序列，所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼賦予作物除草劑耐性的蛋白。該除草劑耐性蛋白包括但不限于草甘膦耐性蛋白基因如單獨(dú)的草甘膦抗性EPSP合酶基因，或者該基因與一種或多種草甘膦降解蛋白基因的組合。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供如上文所述的那些DNA構(gòu)建物，其中所述啟動(dòng)子是雜種或嵌合啟動(dòng)子，包含有效連接異源啟動(dòng)子序列的由選自以下的一種或多種序列獲得的至少一種順式元件SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26,所述異源啟動(dòng)子序列如花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子或玄參花葉病毒啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方案，提供串聯(lián)的例如如上文所述的DNA構(gòu)建物，其中所述啟動(dòng)子是雜種或嵌合啟動(dòng)子，包含有效連接在轉(zhuǎn)基因作物細(xì)胞中表達(dá)的異源基因序列的由選自以下的一種或多種序列獲得的至少一種順式元件SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26。所述嵌合啟動(dòng)子序列更具體地是包含在SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30中定義的序列。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方案，提供例如如上文所述的DNA構(gòu)建物，其中所述結(jié)構(gòu)DNA序列是草甘膦耐性基因，使得當(dāng)將所述DNA構(gòu)建物引入植物細(xì)胞時(shí)，它賦予所述植物細(xì)胞對(duì)于每升至少包括50克酸當(dāng)量(ga.eyi)草甘膦的草甘膦水溶液制劑的耐性。在其它相關(guān)實(shí)施方案中，所述DNA構(gòu)建物賦亍所述植物細(xì)胞對(duì)于草甘膦濃度更高(例如每升至少300克酸當(dāng)量草甘膦)的草甘膦制劑的耐性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建物賦予所述植物細(xì)胞對(duì)于以下除草劑施用的耐性例如以每4，000平方米453ml的比率施用RoundupUltra⑧至少一次，而在其它實(shí)施方案中，草甘膦耐性擴(kuò)展到例如以每4,000平方米453ml、每4,000平方米906ml或每4,000平方米1812ml施用一到二次或更多次。'根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供用上文所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物，其中包括單子葉才直物物種和雙子葉植物物種。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和擬南芥屬EFlot啟動(dòng)子在其它作物物種例如棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因(如aroA:CP4)表達(dá)時(shí)，所述啟動(dòng)子充分有活性，所述植物耐受草甘膦的商業(yè)化施用比率，展現(xiàn)良好的營養(yǎng)性耐性以及對(duì)繁殖組織的損傷低。也可以使用這樣的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)其它目的基因，所述目的基因包括但不限于賦予下列性狀的基因除草劑耐性、昆蟲防制、抗病性、穩(wěn)定性增加或保存期增加、產(chǎn)量提高、營養(yǎng)強(qiáng)化、表達(dá)藥用多肽產(chǎn)物或其它需要的多肽產(chǎn)物、或植物生理學(xué)或形態(tài)學(xué)的所需改變等等。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供用多種DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述DNA構(gòu)建物包含擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和擬南芥屬EFla啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子在其它作物物種例如棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因(如aroA:CP勺表達(dá)時(shí)充分有活性，所述植物耐受草甘膦的商業(yè)化施用比率，展現(xiàn)良好的營養(yǎng)性耐性以及對(duì)繁殖組織的損傷低。也可以使用這樣的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)其它目的基因，所述目的基因包括但不限于賦予下列性狀的基因除草劑耐性、昆蟲防制、抗病性、穩(wěn)定性增加或保存期增加、產(chǎn)量提高、營養(yǎng)強(qiáng)化、表達(dá)藥用多肽產(chǎn)物或其它需要的多肽產(chǎn)物、或植物生理學(xué)或形態(tài)學(xué)的所需改變等等。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方案，提供用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因作物，所述DNA構(gòu)建物包食擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和擬南芥屬EFloc啟動(dòng)子作為與花椰菜花葉病毒DNA分子融合的嵌合DNA分子，所述嵌合DNA分子在植物中具有啟動(dòng)子活性，在其它作物物種例如棉花、番茄和向日葵中充分有活性，例如當(dāng)用來控制草甘膦耐性基因(如aroA:CP4)表達(dá)時(shí)，所述植物耐受草甘膦的商業(yè)化施用比率，展現(xiàn)良好的營養(yǎng)體耐性以及對(duì)生殖組織的損傷低。也可以使用這樣的啟動(dòng)子在植物中表達(dá)其它目的基因，所述目的基因包括但不限于賦予下列性狀的基因除草劑耐性、昆蟲防制、抗病性、穩(wěn)定性增加或保存期增加、產(chǎn)量提高、營養(yǎng)強(qiáng)化、表達(dá)藥用多肽產(chǎn)物或其它需要的多肽產(chǎn)物、或植物生理學(xué)或形態(tài)學(xué)的所需改變等等。根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方案，提供在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)DNA序列的方法。這樣的方法包括提供如上文所述的DNA構(gòu)建物，將所述DNA構(gòu)建物引入植物細(xì)胞，然后再生所述植物細(xì)胞產(chǎn)生植抹，以便在所述植物中可表達(dá)所述結(jié)構(gòu)DNA。根據(jù)一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案，提供防除雜草的方法，其中所述DNA構(gòu)建物包含草甘膦耐性基因，對(duì)用所述DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的作物施用一次其用量足以防除雜草而不會(huì)顯著損害所述作物的草甘膦。附圖簡述圖1是pCGN8086的質(zhì)粒圖譜。圖2是pMON45325的質(zhì)粒圖i普。圖3是pMON45331的質(zhì)粒圖譜。圖4是pMON45332的質(zhì)粒圖i普。圖5是pCGN9190的質(zhì)粒圖i普。圖6是pCGN9153的質(zhì)粒圖譜。圖7是pCGN8099的質(zhì)粒圖語。圖8是pCGN8088的質(zhì)粒圖譜。圖9是pCGN8068的質(zhì)粒圖譜。圖10是pCGN8096的質(zhì)粒圖i普。圖11是pCGN9151的質(zhì)粒圖i普。圖12是pMON10156的質(zhì)粒圖谞。圖13是pMON52059的質(zhì)粒圖譜。圖14是pMON54952的質(zhì)粒圖譜。圖15是pMON54953的質(zhì)粒圖譜。圖16是pMON54954的質(zhì)粒圖鐠。圖17是pMON54955的質(zhì)粒圖譜。圖18是pMON54956的質(zhì)粒圖譜。序列表筒述SEQIDNO:l是用于分離Act2啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:2是用于分離Act2啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:3是用于分離Act8啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:4是用于分離Act8啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:5是用于分離Actll啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQ1DN0:6是用于分離Actll啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:7是用于分離EF1啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQEDNO:8是用于分離EF1啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:9是Act2啟動(dòng)子的序列，其中包括Act2基因的內(nèi)含子序列。堿基位置1-764代表啟動(dòng)子序列；堿基位置765-1215代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的5堿基5'非翻譯區(qū)(5，UTR);轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置597。SEQIDNO:10是Act8啟動(dòng)子的序列，其中包括Act8基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-797代表啟動(dòng)子序列；堿基位置798-1259代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的10堿基5，UTR;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置646。SEQIDNO:ll是Actll啟動(dòng)子的序列，其中包括Actll基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-1218代表啟動(dòng)子序列；石tt位置1219-1381代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的10堿基5，UTR;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置1062。SEQE)N0:12是EF1啟動(dòng)子的序列，其中包括EF1基因的笫一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-536代表啟動(dòng)子序列；堿基位置537-1137代表內(nèi)含子，其后是在ATG之前的22堿基5'UTR;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于堿基位置481。SEQIDNO:13是用于分離Actla啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:14是用于分離Actlb啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:15是用于分離Actla和Actlb啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:16是用于分離Act3啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:17是用于分離Act3啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:18是用于分離Act7啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:19是用于分離Act7啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:20是用于分離Actl2啟動(dòng)子的正向PCR引物。SEQIDNO:21是用于分離Actl2啟動(dòng)子的反向PCR引物。SEQIDNO:22是Actla啟動(dòng)子的序列，其中包括Actla基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-1033代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1034-1578代表內(nèi)含子和5'UTR。SEQIDNO:23是Actlb啟動(dòng)子的序列，其中包括Actlb基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-914代表啟動(dòng)子序列；堿基位置915-1468代表內(nèi)含子和5'UTR序列。SEQIDNO:24是Act3啟動(dòng)子的序列，其中包括Act3基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-1023代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1024-1642代表內(nèi)含子和5'UTR序列。SEQIDNO:25是Acf7啟動(dòng)子的序列，其中包括Act7基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-600代表啟動(dòng)子序列；堿基位置601-1241代表內(nèi)含子和5'UTR序列。SEQIDNO:26是Actl2啟動(dòng)子的序列，其中包括Actl2基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-1017代表啟動(dòng)子序列；堿基位置1018-1313代表內(nèi)含子和5'UTR序列。SEQIDNO:27是嵌合FMV-Actl1啟動(dòng)子的序列，其中包括Actl1基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-536代表FMV啟動(dòng)子序列；堿基位置553-1946代表擬南芥屬肌動(dòng)蛋白ll啟動(dòng)子、內(nèi)含子和5'UTR序列。SEQIDNO:2S是嵌合FMV-EFla啟動(dòng)子的序列，其中包括EFlcc基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置1-536代表FMV啟動(dòng)子序列；堿基位置553—1695代表EFla啟動(dòng)予、內(nèi)含子和5，UTR序列。SEQIDNO:29是CaMV-Act8啟動(dòng)子的序列，其中包括Act8基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置l-523代表CaMV啟動(dòng)子序列；堿基位置534-1800代表Act8啟動(dòng)子、內(nèi)含子和5'UTR序列。SEQIDNO:30是CaMV-Act2啟動(dòng)子的序列，其中包括Act2基因的第一個(gè)內(nèi)含子。堿基位置l-523代表CaMV啟動(dòng)子序列；堿基位置534-1742代表Act2啟動(dòng)子、內(nèi)含子和5'UTR序列。發(fā)明詳述本申請(qǐng)要求于99年12月16日申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)第60/171,173號(hào)的權(quán)益。提供下面的定義和方法以更好地定義本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域內(nèi)的一般技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除特別指出，應(yīng)當(dāng)按照相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員的常規(guī)使用來理解術(shù)語。使用在37CFR§1.822陳述的DNA堿基命名法。使用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸殘基單字母命名法和三字母命名法。"核酸(序列)"或"多核苷酸(序列)"指基因組來源或合成來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，即分別是從5，(上游)端讀到3，(下游)端的脫氧核糖核苷酸堿基或核糖核苦酸石A基的聚合物。核酸可以代表有義鏈或互補(bǔ)(反義)鏈。"天然的"指天然出現(xiàn)的("野生型")核酸序列。"異源的"序列指源自外來來源或物種的序列，或者當(dāng)來自同一來源時(shí)指由其原始形式受到修飾的序列。"分離的"核酸序列是與所述核酸天然出現(xiàn)的生物細(xì)胞中其通常結(jié)合的其它核酸序列(即其它染色體DNA或染色體外DNA)基本分離或純化出來的。該術(shù)語包括經(jīng)過生物化學(xué)純化以便基本去除污染的核酸和其它細(xì)胞成份的核酸。該術(shù)語還包括重組核酸和化學(xué)合成的核酸。本文所用術(shù)語"基本純化的"指與其天然狀態(tài)通常結(jié)合的其它分子分離開來的分子。更優(yōu)i^基本純化的分子是在制備物中主要存在的種類。基本純化的分子可以不含有天然混合物中存在的60%、優(yōu)選75%、更優(yōu)選90%其它分子(不包括溶劑)。術(shù)語"基本純化的"并不包括以天然狀態(tài)存在的分子。假如笫一種核酸序列在與參考核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最佳序列對(duì)比(在整個(gè)比較窗口上，適當(dāng)?shù)夭迦牖蛉笔У陀趨⒖夹蛄械?0%的核苷酸)時(shí)，在至少20個(gè)核苷酸位置、優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸位置、更優(yōu)選至少IOO個(gè)核苷酸位置、最優(yōu)選所述第一種核酸全長的比較窗口上，存在至少約75。/。核苷酸序列同一十生、優(yōu)選至少約80%同一性、更優(yōu)選至少約85%同一性、最優(yōu)選至少約90%同一性，那么該種核酸序列就與所迷參考序列顯示"基本同一性"。可以通過下面方法進(jìn)行比較窗口的最佳序列對(duì)比Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性序列對(duì)比算法；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988的相似性搜尋方法；優(yōu)選使用在WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI上這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)現(xiàn)形式(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。所述參考核酸可以是全長分子或較長分子的一部分。或者，假如一種核酸分子在嚴(yán)*件下與另一種核酸分子雜交，如下文所定義，那么這兩種核酸分子就具有基本同一性。假如兩種核酸序列的布置使得第一種核酸序列影響第二種核酸序列的功能，那么所述第一種核酸序列就與所述第二種核酸序列"有效連接"。優(yōu)選這兩種序列是單一連續(xù)核酸分子的組成部分，或者更優(yōu)選是臨近的。例如，假如一種啟動(dòng)子調(diào)節(jié)或介導(dǎo)一種基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，那么所迷啟動(dòng)子就與所述基因有效連接。"重組"核酸是通過人工組合兩種在其它情況下是分離的序列區(qū)段而獲得的，例如通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸區(qū)段。進(jìn)行核酸操作的技術(shù)是眾所周知的(參見例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,1989;Mailga等，MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborPress,1995;Birren等，GenomeAnalysis:第一巻，分析DNA,(1997),第二巻,檢測基因，(1"8)，第三巻，克隆系統(tǒng)，(19"),笫四巻，基因組作圖，(1999),ColdSpringHarbor,NewYork)?；瘜W(xué)合成核酸的方法在例如Beaucage和Carruthers,Tetra.Letts.22:1859-1862,1981和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103:3185，1981中討論?？梢岳缭谏虡I(yè)化的自動(dòng)寡核苷酸合成儀上進(jìn)行核酸的化學(xué)合成?？梢栽O(shè)計(jì)并化學(xué)合成"合成核酸序列"以增強(qiáng)在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)并用于克隆進(jìn)合適的構(gòu)建物。宿主細(xì)胞常常顯示優(yōu)選的密碼子選擇(Muxray等，1989)。因此設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)在特定宿主中表達(dá)的合成DNA應(yīng)當(dāng)反映在該宿主細(xì)胞中的密碼子選擇模式?？梢垣@得用于這些目的的計(jì)算才幾禾呈序，包括、但不限亍S叫uenceAnalysisSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,Inc.,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,Madison,WI53711的"BestFit"或"Gap"程序。核酸"擴(kuò)增"或"核酸復(fù)制"指產(chǎn)生額外的核酸序列拷貝，并使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行。多種擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的并且已經(jīng)得到描述，尤其是美國專利第4,683,195號(hào)和第4,683,202號(hào)以及PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等編輯，AcademicPress,SanDiego,1990。在PCR中，引物指退火到DNA模板以起始聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的確定序列的短寡核苷酸。"轉(zhuǎn)化的"、"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)基因"指已經(jīng)引入外源核酸(如重組構(gòu)建物)的細(xì)胞、組織、器官或生物。所引入的核酸最好整合入受體細(xì)胞、組織、器官或生物的基因組DNA，以便所引入的核酸通過隨后的后代遺傳。"轉(zhuǎn)基因"或"轉(zhuǎn)化的"細(xì)胞或生物還包括所述細(xì)胞或生物的后代，以及由使用所述"轉(zhuǎn)基因，，植物作為雜交親本的育種程序產(chǎn)生、并表現(xiàn)由于重組構(gòu)建物或構(gòu)建物的存在而引起的表型改變的后代。術(shù)語"基因"指染色體DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA、合成DNA或其它編碼肽、多肽、蛋白或RNA分子的DNA、以及在編碼序列兩側(cè)參與表達(dá)調(diào)節(jié)的區(qū)。一些基因可以轉(zhuǎn)錄成為mRNA并翻譯成為多肽(結(jié)構(gòu)基因)；而其它基因可以轉(zhuǎn)錄成為RNA(如rRNA、tRNA);其它類型基因作為表達(dá)調(diào)節(jié)物起作用(調(diào)節(jié)基因)?；?表達(dá)"指基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生對(duì)應(yīng)mRNA并且該mRNA翻譯產(chǎn)生對(duì)應(yīng)基因產(chǎn)物，即肽、多肽或蛋白。調(diào)節(jié)元件控制或調(diào)整基因表達(dá)，所述調(diào)節(jié)元件包括5'調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子。"遺傳成分"指可以構(gòu)成表達(dá)構(gòu)建物的成分或部分的任何核酸序列或遺傳元件。遺傳成分的例子包括但不限于啟動(dòng)子區(qū)、5'非翻譯前導(dǎo)區(qū)、內(nèi)含子、基因、3'非翻譯區(qū)和其它調(diào)節(jié)序列或影響一個(gè)或多個(gè)核酸序列轉(zhuǎn)錄或翻譯的序列。術(shù)語"重組DNA構(gòu)建物"、"重組構(gòu)建物，，、"表達(dá)構(gòu)建物"或"表達(dá)盒"指來自任何來源、能夠整合入基因組或自主復(fù)制的任何因子如質(zhì)粒、粘粒、病毒、BAC(細(xì)菌人工染色體)、自主復(fù)制型序列、其中一種或多種DNA序列使用眾所周知的重組DNA技術(shù)以功能性可操作方式連接的DNA分子。"互補(bǔ)"指核酸序列通過堿基配對(duì)(A-G-T與互補(bǔ)序列T-C-A配對(duì))的天然結(jié)合。假如兩個(gè)單鏈分子間只有部分核酸對(duì)是互補(bǔ)的，那么它們之間的互補(bǔ)性是部分的；假如所有堿基對(duì)都是互補(bǔ)的，那么它們的互補(bǔ)性就是完全的。互補(bǔ)性的程度影響雜交和擴(kuò)增反應(yīng)的效率和強(qiáng)度。"同源性"指核酸序列或氨基酸序列分別按照核苦酸或氨基酸位置同一性百分率而言的相似性水平(即序列相似性或同一性)。同源性也指在不同核酸或蛋白之間相似功能特性的概念。"啟動(dòng)子"指位于基因的可讀框(或蛋白編碼區(qū))翻譯起始密碼子5'或上游、涉及RNA聚合酶II和其它蛋白(反式作用轉(zhuǎn)錄因子)的識(shí)別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的核酸序列。"植物啟動(dòng)子"是在植物細(xì)胞中有功能的天然或非天然啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在植物的整個(gè)發(fā)育過程在大多數(shù)或所有植物組織中起作用。^L織特異性啟動(dòng)子、器官特異性啟動(dòng)中表達(dá)。啟動(dòng)子可能在植物的一個(gè)部分(如細(xì)胞類型、組織或器官)比在植物的其它部分呈現(xiàn)"增強(qiáng)的"表達(dá)(即更高的表達(dá)水平)，而不是在特定組織、器官或細(xì)胞類型中"特異性"表達(dá)。時(shí)序調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子僅在或主要在植物發(fā)育的某些時(shí)期或一天內(nèi)的某些時(shí)刻起作用，例如與晝夜節(jié)律有關(guān)的基因就是這種情況。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)答內(nèi)源刺激或外源刺激的存在，例如化合物(化學(xué)誘導(dǎo)物)，或應(yīng)答環(huán)境信號(hào)、激素信號(hào)、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)，選擇性表達(dá)有效連接的DNA序列。誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子包括例如由光、熱、脅迫、洪澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或化學(xué)藥品如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子?？梢杂萌魏沃参飭?dòng)子作為5，調(diào)節(jié)序列以調(diào)節(jié)特定一個(gè)基因或多個(gè)基因的表達(dá)。一種優(yōu)選的啟動(dòng)子是植物RNA聚合酶II啟動(dòng)子。植物RNA聚合酶n啟動(dòng)子象其它高等真核生物的RNA聚合酶n啟動(dòng)子一樣，有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)并由幾個(gè)獨(dú)立元件組成。一種這樣的元件是真核基因在體外正確表達(dá)和在體內(nèi)準(zhǔn)確有效地起始轉(zhuǎn)錄所必需的TATA框或Goldberg-Hogness框。TATA框通常位于約-25到-35,即在定義為位置+1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或加帽位點(diǎn)上游(5')25到35堿基對(duì)(bp)(Breathnach和Chambon,Ann.Rev.Biochem.50:349-383,1981;Messing等，GeneticsEngineeringofPlants,Kosuge等編輯，第211-227頁，1983)。另一個(gè)常見元件CCAAT框位于-70和-100bp之間。在植物中，CCAAT框可以具有與哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子的功能類似序列不同的共有序列(所述植物類似物已經(jīng)命名為"AGGA框"，以將其與動(dòng)物中的類似元件區(qū)分開來；Messing等，GeneticsEngineeringofPlants,Kosuge等編輯，第211-227頁，1983)。此外,事實(shí)上所有啟動(dòng)子都包括從約-100bp延伸到-l,OOObp或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)更上游的其它上游激活序列或增強(qiáng)子(Benoist和Chambon,Nature290:304-310,1981;Gruss等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA78:943-947,1981;和Khouiy和Gruss，Cell27:313-314，1983)。當(dāng)所述啟動(dòng)子與異源DNA序列融合時(shí)，所述啟動(dòng)子通常引起所轉(zhuǎn)錄?？梢约尤氚ㄕ{(diào)節(jié)序列的啟動(dòng)子片段(例如融合到具有其自身的部分或完全調(diào)節(jié)序列的活性啟動(dòng)子的5'端，或插入其中)(Fluhr等，Science232:1106-1112,1986;Ellis等，EMBOJ.6:11-16,1987;Stnttmatter和Chua,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:8986-8990,1987;Poulsen和Chua,Mol.Gen.Genet.214:16-23,1988;Comai等，PlantMol.Biol.15:3"-381,1991)?；蛘撸梢栽跓o活性的截短的啟動(dòng)子5，上游區(qū)加上異源調(diào)節(jié)序列，所述無活性的截短的啟動(dòng)子例如僅包括核心TATA、有時(shí)還包括CCAAT元件的啟動(dòng)子(Fluhr等，Science232:1106-1112,1986;Stnttmatter和Chua,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:8986-8990,1987;Aryan等，Mol.Gen.Genet.225:65-71,1991)。啟動(dòng)子通常包含多個(gè)獨(dú)立的"順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件"或簡稱"順式元件"，每個(gè)順式元件賦予對(duì)基因表達(dá)總體控制的不同方面(Strittmatter和Chua,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:8986-8990，19S7;EUis等，EMBOJ.6:11-16,1987;Benfey等，EMBOJ.9:1677-1684,1990)。1"順式元件"結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式作用蛋白因子。一些順式元件結(jié)合不止一種因子，而反式作用轉(zhuǎn)錄因子可以與不止一個(gè)順式元件以不同親和性相互作用(Johnson和McKnight,Ann.Rev.Biochem.58:799-839,1989)。已經(jīng)討論過植物轉(zhuǎn)錄因子、對(duì)應(yīng)的順式元件和它們相互作用的分析，例如參見Martin,Curr.OpinionsBiotech.7:130-138,1996;Murai,MethodsinPlantBiochemistryandMolecularBiology,Dashek編輯，CRCPress,1997,第397-422頁；和MethodsinPlantMolecularBiology,Maliga等編輯，ColdSpringHarborPress,1995,笫233-300頁。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可以包含賦予或調(diào)節(jié)基因表達(dá)的"順式元件"?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)鑒定順式元件，包括缺失分析，即從啟動(dòng)子的5'末端或內(nèi)部缺失一個(gè)或多個(gè)核苦酸;使用DNA酶I足跡法的DNA結(jié)合蛋白分析、曱基化干擾、電泳遷移率變動(dòng)分析、通過連接介導(dǎo)的PCR的體內(nèi)基因組足跡分析和其它常規(guī)分析；或通過常規(guī)序列比較方法分析與已知順式元件基序的序列相似性?？梢酝ㄟ^誘變(或取代)順式元件中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，或通過其它常規(guī)方法，進(jìn)一步研究所述元件的精細(xì)結(jié)構(gòu)(參見例如，MethodsinPlantBiochemistryandMolecularBiology,Dashek編輯，CRCPress，1997,第397-422頁，和MethodsinPlantMolecularBiology,Maliga等編輯，ColdSpringHarborPress，1995,第233-300頁)。順式元件。也可以合成順式元件，使其具有添加的包含有用限制酶位點(diǎn)的側(cè)翼序列，以利于亞序列操作。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子由多個(gè)獨(dú)立的"順式元件"組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用計(jì)算機(jī)程序鑒定包含以下核酸序列的"順式元件"的序列區(qū)SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQE)NO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQEDNO:25和SEQIDNO:26,其結(jié)構(gòu)域或基序的MEME或SIGNALSCAN。本發(fā)明包括SEQIDNO:9、SEQLDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQEDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的片段或順式元件，或者與本發(fā)明的核酸序列具有同源性的已知影響基因調(diào)節(jié)的順式元件的同源物。這樣的核酸片段可以包括已公開序列的任何區(qū)。如SEQE)NO:9、SEQE)NO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQ或部分啟動(dòng)子區(qū)可以包含至少一種調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件包括但不限于能夠例如在雄性生殖組織中調(diào)節(jié)有效連接的DNA的表達(dá)的"順式元件"或結(jié)構(gòu)域。植物啟動(dòng)子也可以包括通過操作已知啟動(dòng)子以獲得合成、嵌合或雜種啟動(dòng)子而產(chǎn)生的啟動(dòng)子。這才羊的啟動(dòng)子也可以結(jié)合來自一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的順式元件，例如通過在具有其自身部分或完全調(diào)節(jié)序列的活性啟動(dòng)子上添加異源調(diào)節(jié)序列(Ellis等，EMBOJ.6:11-16,1987;Stnttmatter和Chua,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:8986-8990,1987;Poulsen和Chua,Mol.Gen.Genet.214:16-23，1988;Comai等，Plant.Mol.Biol.15:373-381，1991)。也已經(jīng)通過在無活性的截短啟動(dòng)子的5'上游區(qū)添加異源調(diào)節(jié)序列，發(fā)展出嵌合啟動(dòng)子，所述無活性的截短啟動(dòng)子即僅包括核心TATA并任選包才舌CCAAT元件的啟動(dòng)子(Fluhr等，Science232:1106-1112,1986;Stnttmatter和Chua,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:8986-8990,1987;Aryan等，Mol.Gen.Genet.225:65-71,1991)。元件，如由各種環(huán)境因子如光、熱或脅迫調(diào)節(jié)的元件；由病原體或化學(xué)藥品等等調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)的元件。才艮據(jù)所述條件，這類元件可以或者正調(diào)節(jié)或者負(fù)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。順式元件的例子包括但不限于氧效應(yīng)元件(Cowen等，J.Biol.Chem.268(36):26904,1993)、光調(diào)節(jié)元件(參見例如，Bruce和Quail,PlantCell2:1081，1990和Bruce等，EMBOJ.10:3015,1991)、響應(yīng)茉莉酮酸曱酯處理的順式元件(Beaudoin和Rothstein,PlantMol.Biol.33:835,1997)、7Jc楊酸效應(yīng)元件(Strange等，PlantJ.11:1315,1997)、熱激反應(yīng)元件(Pelham等，TrendsGenet.1:31,1985)、響應(yīng)創(chuàng)傷和非生物性脅迫的元件(Loace等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:9230,1992;Mhin等，PlantMol.Biol.33:257,1997)、冷效應(yīng)元件(Baker等，PlantMol.Biol.24:701,1994;Jiang等,PlantMol.Biol.30:679,1996;Nordin等，PlantMol.Biol.21:641,1993;Zhou等，J.Biol.Chem.267:23515,1992)以及干旱效應(yīng)元件(Yamaguchi等，PlantCell6:251-264,1994;Wang等，PlantMol.Biol.28:605,1995;BrayE.A.TrendsinPlantScience2:48，1997)。在另一實(shí)施方案中，如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDN〇:26、SEQIDNO:27、SEQIDN〇:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的核芬酸序列包括任何長度能夠調(diào)節(jié)有效連接的DNA序列的所述核苷酸序歹'j。例如，如SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所公開的序列可以截短或缺失部分序列，但仍然能夠調(diào)節(jié)有效連接的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所公開序列的順式元件可以賦予特定的特異性，例如賦予有效連接的DNA序列在某些組織中的增強(qiáng)表達(dá)。因此，SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQE)NO:23、SEQEDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQEDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所公開序列的任何序列片段、部分或區(qū)可以用作調(diào)節(jié)序列，其中包括但不限于所公開序列的順式元件或基序。例如，可以從啟動(dòng)子序列的5，或3，末端缺失一個(gè)或多個(gè)磁Jjf寸，以產(chǎn)生"截短的"啟動(dòng)子。也可以在啟動(dòng)子序列內(nèi)部插入、缺失或置換一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)?？梢酝ㄟ^例如將啟動(dòng)子片^:置于最小啟動(dòng)子的上游而構(gòu)建啟動(dòng)子，以便所述啟動(dòng)子片段或元件有效連接。最小啟動(dòng)子或基礎(chǔ)啟動(dòng)子是能夠募集并結(jié)合基本轉(zhuǎn)錄機(jī)器的DNA片段。真核細(xì)胞中基本轉(zhuǎn)錄機(jī)器的一個(gè)例子是RNA聚合酶n復(fù)合物及其輔助蛋白。所述基本轉(zhuǎn)錄機(jī)器的酶促成份能夠利用最小或基礎(chǔ)啟動(dòng)子，起始和延伸特定基因的轉(zhuǎn)錄。也就是說，在啟動(dòng)子區(qū)沒有添加的能夠募集和結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(如增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄、阻抑轉(zhuǎn)錄、使轉(zhuǎn)錄成為激素依賴型等等)的轉(zhuǎn)錄因子的順式作用序列。可以結(jié)合取代、缺失、插入或它們的任何組合以產(chǎn)生最終構(gòu)建物?？梢孕揎棻景l(fā)明的啟動(dòng)子序列，例如以在其它物系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)。在另一方法中，可以通過多種方法設(shè)計(jì)或工程化新型雜種啟動(dòng)子。許多啟動(dòng)子包含激活、增強(qiáng)或確定所述啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或特異性的上游序列(Atchison,Ann.Rev.CellBiol.4:127,1988)。例如，T-DNA基因包舍確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的"TATA"框以及其它位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游調(diào)整轉(zhuǎn)錄水平的上游元件(Gelvin,TransgenicPlants,Kung,S.-D.和Us,R.編輯，SanDiego:AcademicPress,第49-87頁，1988)。另一種嵌合啟動(dòng)子將章魚氨酸合酶(oc力激活劑的三聚體結(jié)合到甘露氨酸合酶(mas)激活子加啟動(dòng)子上，據(jù)報(bào)道該啟動(dòng)子增加報(bào)道基因的表達(dá)(MinNi等，ThePlantJournal7:661,199S)。本發(fā)明的上游調(diào)節(jié)序列可以用于構(gòu)建這樣的嵌合或雜種啟動(dòng)子。構(gòu)建本發(fā)明變異型啟動(dòng)子的方法包括但不限于組合不同啟動(dòng)子的控制元件或重復(fù)啟動(dòng)子的部分或區(qū)(參見例如美國專利5,110,732和美國專利5,097,025)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟悉構(gòu)建、操作和分離大分子(如DNA分子、質(zhì)粒等等)、產(chǎn)生重組生物、篩選和分離基因的特定條件和程序(參見例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,1989;Mailga等，MethodsinPlantMolecularBiology，ColdSpringHarborPress,1995;Bixren等，GenomeAnalysis:第1巻，分析DNA,(1997),第2巻，檢測基因，(1998),第3巻，克隆系統(tǒng)，(1999),第4巻，基因組作圖，(1999),ColdSpringHarbor,NewYork)。本發(fā)明還包括設(shè)計(jì)、構(gòu)建和應(yīng)用包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQEDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26中一種或多種順式元件的嵌合或雜種啟動(dòng)子以調(diào)整或調(diào)節(jié)有效連接的核酸序列的表達(dá)。SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQE)NO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQE)NO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQEDNO:28、SEQE)NO:29和SEQIDNO:30的啟動(dòng)子序列、片段、區(qū)或其順式元件能夠在多種組織中轉(zhuǎn)錄有效連接的DNA序列，因此能夠在多種組織中選擇性調(diào)節(jié)基因表達(dá)。對(duì)于許多農(nóng)學(xué)性狀，需要在多種組織中轉(zhuǎn)錄一個(gè)或多個(gè)目的基因以賦予所需的特征。需要荻得調(diào)節(jié)有效連接的基因在選定靶組織中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子，因?yàn)榭赡懿幌Ｍ谒薪M織中表達(dá)基因，而是僅在某些組織中表達(dá)基因。例如，假如人們希望選擇性表達(dá)靶基因以表達(dá)除草劑耐性基因，人們可能希望在營養(yǎng)性組織和生殖組織中表達(dá)所述除草劑抗性基因。本發(fā)明的啟動(dòng)予序列可以用于在多種組織中調(diào)節(jié)基因表達(dá)，所述組織包括但不限于快速生長的分生組織、雄性生殖組織(雄蕊群)如花粉、花藥和花絲、雌性生殖組織(雌蕊群)如柱頭、花柱和子房、葉、萼片和花瓣。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于表達(dá)除草劑耐性基因，例如當(dāng)在植物發(fā)育的多種組織和階段需要耐性時(shí)表達(dá)。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于調(diào)節(jié)任何耙基因的轉(zhuǎn)錄，所述耙基因包括但不限于控制下列性狀的基因育性、產(chǎn)量、耐蟲性、真菌耐性、除草劑耐性或任何所需性狀。尤其優(yōu)選的基因包括除草劑耐性基因或耐蟲性基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)需要在多種組織中表達(dá)除草劑耐性基因時(shí)，本發(fā)明的啟動(dòng)子尤其可用于調(diào)節(jié)除草劑耐性基因的表達(dá)。例如，所述除草劑耐性基因可以賦予對(duì)除草劑草甘膦的耐性。合適的草甘膦耐性基因的例子包括但不限于草甘膦抗性EPSP合酶基因或降解草甘膦的基因產(chǎn)物如草甘膦氧化還原酶和膦酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。對(duì)于任何植物生物工程策略而言，獲得5'調(diào)節(jié)元件的廣泛選擇是重要的，以便獲得對(duì)于所需的表達(dá)分布型最為有效的合適調(diào)節(jié)元件。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于確定基因功能。許多基因的功能是未知的，而本發(fā)明的啟動(dòng)子可以用作構(gòu)建物中的遺傳元件，以允許對(duì)以有義或反義取向表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行表型評(píng)價(jià)。當(dāng)需要在組成組織和生殖組織進(jìn)行高水平基因表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以成為開發(fā)用于高通量測定的植物表達(dá)構(gòu)建物的成分?？梢赃x擇任何植物來鑒定基因和調(diào)節(jié)序列。用于分離基因和調(diào)節(jié)序列的合適植物靶的例子包括但不限于苜蓿、蘋果、杏、擬南芥屬、朝鮮薊、芝麻菜、石刁柏、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、越桔、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、巻心菜、canola、網(wǎng)紋甜瓜、胡蘿卜、木薯、篦麻籽、花椰菜、芹菜、櫻挑、菊苣、芫荽葉、柑桔、克里曼丁、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉花、酸果蔓、黃瓜、花旗松、茄子、苣荬菜、寬葉苦苣、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、獼猴桃、萵苣、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、油沖兆、堅(jiān)果、燕麥、油棕、油料種子油菜(oilseedrape)、秋葵、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、番木瓜、歐芽、歐洲防風(fēng)、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松、菠蘿、車前、李、石榴、楊、馬《令薯、南瓜、溫柏、radiatapine、radiscchio、蘿卜、油菜籽、樹莓、水稻、黑麥、高梁、南方松、大豆、菠茱、筍瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香、紅桔、茶樹、煙草、番茄、小黑麥、草皮、蕪菁、藤、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。對(duì)于鑒定調(diào)節(jié)序列尤其優(yōu)選的植物是擬南芥屬、玉米、小麥、大豆和棉花。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列分離自擬南芥04ra力/Apw'5"Aa/^"")植物DNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)建物包括有效連接可轉(zhuǎn)錄序列的本發(fā)明啟動(dòng)子序列，以及合適的終止子和調(diào)節(jié)元件?？梢詫⑦@樣的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的靶植物?？梢?吏用任何植物作為包含本發(fā)明啟動(dòng)子序列的核酸構(gòu)建物的合適宿主。合適靶植物的例子包括但不限于苜蓿、嫩莖花椰菜、巻心菜、canola、花椰菜、玉米、棉花、酸果蔓、黃瓜、苦苣、豌豆、楊、松、馬鈴薯、洋蔥、水稻、樹莓、大豆、甘蔗、甜菜、向日葵、番茄和小麥。啟動(dòng)子分離和修飾方法可以使用多種方法分離本文公開的啟動(dòng)子序列的片段。可以采用公眾可得到的序列信息，使用基亍PCR的方法從植物基因組文庫擴(kuò)增側(cè)翼區(qū)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知多種擴(kuò)增與已知序列核心區(qū)鄰近的未知DNA序列的方法。方法包括但不限于反向PCR(IPCR)、載體盒(vectorette)PCR、Y型(Y-shaped)PCR和基因組步查方法。對(duì)于本發(fā)明，通過可得的序列信息通過設(shè)計(jì)PCR引物從擬南齊屬分離所述核酸分子。也可以通過其它技術(shù)獲得核酸片段，例如通過化學(xué)方法直接合成片段，正如通常使用自動(dòng)寡核苷酸合成儀所進(jìn)行的實(shí)踐。也可以通過應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)獲得片段，例:^口使用分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組DNA技術(shù)的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)。對(duì)于使用特定擴(kuò)增引物對(duì)擴(kuò)增靶核酸序列(如通過PCR)，"嚴(yán)格PCR條件"指這樣的條件允許所述引物對(duì)僅與具有對(duì)應(yīng)野生型序列(或其互補(bǔ)物)的引物將會(huì)結(jié)合的靶核酸序列雜交，并且最好產(chǎn)生單一擴(kuò)增產(chǎn)物。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道制備植物基因組DNA的方法。在一種方法中，可以用限制酶部分消化，然后根據(jù)大小選擇處于特定大小范圍內(nèi)的DNA片段，可以從選定物種制備基因組DNA文庫。可以將所述基因組DNA克隆進(jìn)合適的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包括但不限于噬菌體，使用從許多銷售商(參見例如Stratagene,LaJollaCA或GibcoBRL,Gaithersburg,MD)獲得的合適克隆試劑盒用合適的構(gòu)建物如噬菌體制備。在另一實(shí)施方案中，可以修飾本文公開的啟動(dòng)子的核苷酸序列。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以創(chuàng)造在核苷酸序列上有改變的DNA分子?？梢孕揎椈蚋淖?nèi)鏢EQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQK)NO:28、SEQE)NO:29和SEQIDNO:30所示的本發(fā)明的核苷酸序列，以增強(qiáng)它們的控制特性。例如，可以通過在基于PCR的DNA修飾方法中插入、缺失或取代模板序列而修飾所述序列。"變異型，，DNA分子是包含如下改變的DNA分子其中天然序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸發(fā)生了缺失、添加和/或置換，但最好同時(shí)基本保留啟動(dòng)子功能。在啟動(dòng)子片段的情況下，"變異型"DNA可以包括影響其有效連接的最小啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的改變。例如通過標(biāo)準(zhǔn)DNA誘變技術(shù)或通過化學(xué)合成所述變異型DNA分子或其部分，可以產(chǎn)生變異型DNA分子。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列除可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)外，還可用作核酸雜交實(shí)驗(yàn)中的探針或引物。本發(fā)明的核酸探針和引物可以在嚴(yán)*件下與靶DNA序列雜交。術(shù)語"嚴(yán)格雜交條件"定義為在該條件下探針或引物特異性地與靶序列雜交，而不與非靶序列雜交，該條件可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。術(shù)語"嚴(yán)格條件"按照通過特定雜交程序(參見例如Sambrook等，1989,在9.52-9.55，Sambrook等，1989在9.47-9.52,9.56-9.58;Kanehisa,Nucl.AcidsRes.12:203-213,1984;和Wetmur和Davidson,J.MoLBiol.31:349-370,1968)使核酸探針與耙核酸的雜交(即與特定目的核酸序列的雜交)，在功能上加以定義。促進(jìn)DNA雜交的合適嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域內(nèi)4支術(shù)人員已知的，例如，在6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約WC,然后用2.0xSSC在50。C洗滌，或者所述條件可以在實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到，所述實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)包括但不限于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6。例如，可以在以下范圍內(nèi)選擇洗滌步^^中的鹽濃度從約2.0xSSC在50°C的低嚴(yán)格性到約0.2xSSC在50°C的高嚴(yán)格性。此外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫(約22。C)的低嚴(yán)格性條件增加到約65。C的高嚴(yán)格性。可以同時(shí)改變溫度和鹽，或者可以使溫度或鹽濃度保持恒定，而改變另一變量。對(duì)于高嚴(yán)格性，例如，使用DNA或RNA探針或引物的雜交可以在以下條件下進(jìn)行6xSSC,0.5%SDS，5xDenhardt，s,100嗎/mL非特異性DNA(如超聲處理過的鮭精DNA),65°C，用0.5xSSC,0.5%SDS在65。C下洗滌。假如一種核酸分子與另一種4亥酸分子顯示完全互補(bǔ)性，那么說前者是后者的"互補(bǔ)物"。如本文所用，當(dāng)其中一種分子的每一個(gè)核苷酸都與另一種分子的核苷酸互補(bǔ)，就說這兩種分子顯示"完全互補(bǔ)性"。假如兩種分子相互雜交，其穩(wěn)定性足以允許它們至少在常規(guī)的"低嚴(yán)格性"條件下保持相互退火，那么這兩種分子就是"最小互補(bǔ)的"。相似地，假如兩種分子相互雜交，其穩(wěn)定性足以允許它們?cè)诔Ｒ?guī)的"高嚴(yán)格性"條件下保持相互退火，那么這兩種分子就是"互補(bǔ)的"。人們考慮假如探針或引物與靶序列結(jié)合的特異性是保守的，那么就可以用低嚴(yán)格性條件如低雜交和/或洗滌溫度來鑒定具有較低程度序列相似性的相關(guān)序列。因此，由于本發(fā)明核苦酸序列與互補(bǔ)DNA片段序列段選擇性形成雙鏈體分子的能力，因此可以使用它們。通過雜交檢測DNA區(qū)段是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的，因此根據(jù)所設(shè)想的應(yīng)用，人們會(huì)希望使用不同的雜交條件以獲得探針對(duì)耙序列不同程度的選擇性，而選擇的方法將取決于所希望的結(jié)果。常規(guī)嚴(yán)格性條件描述于Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989和Haymes等，NucleicAcidHybridization,APracticalApproach,IRLPress,Washington,DC，1985。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在其它植物組織的雜交測定中使用核酸序列SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQBDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQDDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26、或這些序列的片段、區(qū)、順式元件或寡聚物，以鑒定密切相關(guān)或同源的基因和相關(guān)的調(diào)節(jié)序列。這些包括但不限于在任何基體上進(jìn)行的DNA印跡分析或RNA印跡分析，所述基體包括但不限于合適制備的植物組織、纖維素、尼龍或組合濾膜、芯片或載玻片。這樣的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，并且可以在由經(jīng)銷商提供的試劑盒或制劑中獲得。本文所用的核酸片段是并非全長的核酸的部分。例如，對(duì)于本發(fā)明，任何長度短于所公布的SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQEDNO:25和SEQEDNO:26的核苷酸序列的核普酸序列都被認(rèn)為是片段。片段也可以包i舌能夠在如上文所定義的嚴(yán)格雜交條件下與天然核酸特異性雜交的至少最小長度。這樣的最小片段的長度最好是天然核酸序列的至少8個(gè)核苷酸、更優(yōu)選15個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸。"探針"是分離的核酸，其上連接有常規(guī)的可檢測標(biāo)記或報(bào)道分子，例如放射性同位素、配體、4b學(xué)發(fā)光試劑或酶。"引物"是分離的核酸，其通過核酸雜交與互補(bǔ)革巴DNA鏈退火，形成引物和靶DNA鏈之間的雜交體，然后由聚合酶如DNA聚合酶沿著靶DNA鏈延伸。可以使用引物對(duì)擴(kuò)增核酸序列，如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它常規(guī)核酸擴(kuò)增方法。探針和引物的長度一般為11個(gè)核苷酸或更長，最好18個(gè)核苷酸或更長，更優(yōu)選25個(gè)核苷酸、最優(yōu)選30個(gè)核香酸或更長。所述探針和引物在高嚴(yán)格性雜交條件下與靶DNA或RNA序列特異性雜交在低嚴(yán)格性條件下與另一物種的靶天然序列特異性雜交。依照本發(fā)明的探針和引物最好與天然序列有完全序列相似性，雖然纟笨針與天然序列不同并且可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)保留與靶天然序列雜交的能力。制備和使用探針和引物的方法描逸于，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，第l隱3巻，Sambrook等編輯，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989(下文稱為"Sambrook等，1989");CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編輯，GreenPublishingandWiley-Interscience,NewYork,1992(定期更新)(下文稱為"Ausubel等，1992");和Innis等，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress:SanDiego,1990?？梢?人已知序列衍生出PCR引物對(duì)，例如通過使用為該目的的計(jì)算機(jī)程序如Primer(Version0.5,1991,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)?？梢允褂没诒疚墓_的天然啟動(dòng)子序列的引物和探針確認(rèn)所公開的序列，必要時(shí)^f吏用所述引物和探針通過常規(guī)方法如重克隆和重測序來修飾所公開的序列。構(gòu)建物和表達(dá)構(gòu)建物可以將依照本發(fā)明的天然或合成的核酸摻入能夠引入宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞中復(fù)制的重組核酸構(gòu)建物中，一般是DNA構(gòu)建物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將如SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO、SEQEDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQEDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的本發(fā)明的核苦酸序列或其片段、變異體或衍生物摻入表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括與遺傳元件例如可選擇、可篩選或可評(píng)價(jià)的標(biāo)記基因有效連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)。在另一實(shí)施方案中，如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的本發(fā)明所公開的核酸序列有效連接到遺傳元件，如賦予與下列性狀有關(guān)的所需特征的核酸植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營養(yǎng)強(qiáng)化、抗病性或有害生物耐性、或環(huán)境或化學(xué)藥品耐性。這些遺傳元件如標(biāo)記基因或生具有農(nóng)學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)物。在另一實(shí)施方案中，一種遺傳元件產(chǎn)生作為選擇裝置的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在可再生植物組織中起作用，產(chǎn)生賦予所述植物組織對(duì)在其它情況下有毒的化合物的抗性的化合物。用作可選擇、可篩選或可評(píng)價(jià)標(biāo)記的目的基因包括但不限于GUS((3-葡糖醛酸糖苷酶的編碼序列)、GFP(綠熒光蛋白的編碼序列)、LUX(螢光素酶的編碼基因)、抗生素抗性標(biāo)記基因或除草劑耐性基因。轉(zhuǎn)座子和相關(guān)抗生素抗性基因的例子包括轉(zhuǎn)座子Tns(bla)、Tn5(npt11)、Tn7(dhfr)、青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博來霉素)；氨曱蝶呤(和三曱氧千二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四環(huán)素。有用的特征(AdvisoryCommitteeonNovelFoodsandProcesses,1994年7月)。這些包括產(chǎn)生最小數(shù)目未轉(zhuǎn)化組織的嚴(yán)格選擇、不明顯干擾再生的大量獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件、應(yīng)用于大量物種、以及評(píng)《介組織中所述標(biāo)記存在的測定的可用性。許多選擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，幾種抗生素抗性標(biāo)記滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，包括卡那霉素抗性標(biāo)記(叩tll)、潮霉素B抗性標(biāo)記(aphIV)和慶大霉素抗性標(biāo)記(aac3和aacC4)。有用的顯性選擇標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因(如潮霉素抗性、卡那霉素抗性、博來霉素抗性、G418抗性、鏈霉素抗性或壯觀霉素抗性)；和除草劑抗性基因(如膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。選擇除草劑抗性轉(zhuǎn)化子的有用策略描述于，例如，Vasil，CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,第I-III巻，1984。尤其優(yōu)選用于本發(fā)明中的選擇標(biāo)記基因是賦予化合物抗性的基因，所述化合物如抗生素如卡那霉素，以及除草劑如草甘膦(Della-Cioppa等，Bio/Technology5(6),1987,美國專利5,463,175,美國專利5,633,435)。也可以實(shí)施其它選擇裝置，這些選擇裝置也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。為實(shí)施本發(fā)明，使用制備和應(yīng)用DNA構(gòu)建物和宿主細(xì)胞的常規(guī)組合物和方法，如特別是在Sambrook等，1989中討論的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。許多適于轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或適于建立轉(zhuǎn)基因植物的DNA構(gòu)建物已經(jīng)在如Pouwels等，CloningVectors:ALaboratoryManual,1985,增刊1987);Weissbach和Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989;Gelvin等，PlantMolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers,1990;和R.R.D.CroyPlantMolecularBiologyLabFax,BIOSScientificPublishers,1993中描述。植物表達(dá)構(gòu)建物可以包括，例如，處于5'和3'調(diào)節(jié)序列轉(zhuǎn)錄控制下的一個(gè)或多個(gè)克隆植物基因。它們也可以包括如所述選擇含有所述表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記。這樣的植物表達(dá)構(gòu)建物還包含一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(如控制誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)、環(huán)境調(diào)節(jié)或發(fā)育調(diào)節(jié)表達(dá)、細(xì)胞特異性或組織特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))、一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)RNA加工信號(hào)、一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)。也包括其它細(xì)菌起源的序列以允許所述構(gòu)建物在細(xì)菌宿主中克隆。所述構(gòu)建物一般還將包含廣宿主范圍的原核生物復(fù)制起點(diǎn)。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，所述植物表達(dá)構(gòu)建物包含一個(gè)如SEQEDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQE)NO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所公開的啟動(dòng)子區(qū)；一個(gè)有效連接的可轉(zhuǎn)錄序列；和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列。^沒想作子偶聯(lián)的非翻譯前導(dǎo)序列。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，所述植物表達(dá)構(gòu)建物包含一個(gè)如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所公開的啟動(dòng)子區(qū)；一個(gè)有效連接的可轉(zhuǎn)錄序列；和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列。植物表達(dá)構(gòu)建物也可以包含其它序列，其中包括但不限于包含可用于克隆目的的限制酶位點(diǎn)的多接頭序列。植物表達(dá)構(gòu)建物中的遺傳元件植物表達(dá)構(gòu)建物可以包含不止一個(gè)各自與不同啟動(dòng)子有效連接的可表達(dá)基因序列。許多啟動(dòng)子可用于任何目的基因的植物基因表達(dá)，所述目的基因包括但不限于選擇標(biāo)記、評(píng)價(jià)標(biāo)記、有害生物耐性基因、抗病性基因、營養(yǎng)強(qiáng)化基因和任何其它有農(nóng)學(xué)意義的基因。可用于植物基因表達(dá)的組成型啟動(dòng)子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)P-35S啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子賦予在大多數(shù)植物組織，包括單子葉植物(參見，例如，Dekeyser等，PlantCell2:591,1990;Terada和Shimamoto,Mol.Gen.Genet.220:389,1990)中的組成型、高水平表達(dá)(參見,例如，Odd等，Nature313:810,1985);CaMV35S啟動(dòng)子的串聯(lián)重復(fù)形式、增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子(P-e35S)、胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子(An等，PlantPhysiol.88:547，1988)、章魚氨酸合酶啟動(dòng)子(Fro匪等，PlantCell1:977,1989);如美國專利第5,378,619號(hào)所述的玄參花葉病毒(P-FMV)啟動(dòng)子和FMV啟動(dòng)子的增強(qiáng)形式(P-eFMV)(其中P-FMV的啟動(dòng)子序列串聯(lián)重復(fù))、花椰菜花葉病毒19S啟動(dòng)子、甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子、鴨跖草黃斑駁病毒啟動(dòng)子以及其它已頭口在植物細(xì)胞中表達(dá)的植物DNA病毒啟動(dòng)子。多種對(duì)環(huán)境信號(hào)、激素信號(hào)、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)應(yīng)答的植物基因啟動(dòng)子可用于在植物細(xì)胞中表達(dá)有效連接的基因，所述啟動(dòng)子包括由下列信號(hào)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(l)熱(Callis等，PlantPhysiol.88:965,1988),(2)光(如豌豆rbcS-3A啟動(dòng)子，KuhJemeier等，PlantCell1:471,1989;玉米rbcS啟動(dòng)子，Schaffiier和Sheen,PlantCell3:997，1991;或葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動(dòng)子，Simpson等，EMBOJ.4:2723,1985),(3)激素如脫落酸(Marcotte等，PlantCell1:969,1989),(4)創(chuàng)傷(如wunI,Siebertz等,PlantCell1:961,1989);或(5)化學(xué)藥品如茉莉酮酸曱酯、水楊酸或安全劑。使用(6)器官特異性啟動(dòng)子(如Roshal等，EMBOJ.6:1155,1987;Schemthaner等，EMBOJ.7:1249,1988;Bustos等，PlantCell1:839,1989)也是有利的。本發(fā)明的啟動(dòng)子是能夠在快速生長的分生組織和生殖組織中轉(zhuǎn)錄有效連接的DNA序列、并且可以在表達(dá)構(gòu)建物中有效連接任何目的基因的植物啟動(dòng)子。植物表達(dá)構(gòu)建物可以包括位于轉(zhuǎn)基因中多肽編碼序列上游或下游的RNA加工信號(hào)如內(nèi)含子。此外，所述表達(dá)構(gòu)建物可以包括來自植物基因3'非翻譯區(qū)的其它調(diào)節(jié)序歹'j(Thomburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:744(1987);An等，PlantCell1:115(1989)),例如包括3，終止子區(qū)以增加所述mRNA的mRNA穩(wěn)定性，例如馬鈴薯的PI-II終止子區(qū)或章魚氨酸或胭脂氨酸合酶3，終止子區(qū)。mRNA的5，非翻譯區(qū)在翻譯起始中起重要作用，也可以成為植物表達(dá)構(gòu)建物中的遺傳成分。例如，已經(jīng)證明來自熱激蛋白基因的非翻譯5'前導(dǎo)序列增強(qiáng)植物中的基因表達(dá)(參見，例如，美國專利5,362,865)。這些其它的上游和下游調(diào)節(jié)序列可以來自對(duì)于所述表達(dá)構(gòu)建物中存在的其它元件為天然或異源的來源。用本發(fā)明的啟動(dòng)子序列控制植物細(xì)胞中的基因表達(dá)。所公開的啟動(dòng)子序列是構(gòu)成用于植物轉(zhuǎn)化的構(gòu)建物的一部分的遺傳成分。本發(fā)明述質(zhì)?；驑?gòu)建物包含如所述的可選擇或可篩選標(biāo)記以及相關(guān)調(diào)節(jié)元件，以及一種或多種以足以賦予特定所需性狀的方式表達(dá)的核酸。本發(fā)明設(shè)想的有農(nóng)學(xué)意義的合適結(jié)構(gòu)基因的例子包括但不限于一種或多種耐蟲性基因如蘇云金芽孢桿菌C8a"7/w^wn"g&raz力(及r.)基因、有害生物耐性基因如防制真菌病的基因、除草劑耐性基因如賦予草甘膦耐性的基因、改善品質(zhì)的基因，所述品質(zhì)指例如產(chǎn)量、營養(yǎng)強(qiáng)化、環(huán)境或脅迫耐性、或任何在植物生理學(xué)、生長、發(fā)育、形態(tài)學(xué)或植物產(chǎn)品上的所需改變。例如，結(jié)構(gòu)基因?qū)ㄈ魏钨x予耐蟲性的基因，包括但不限于如下列文獻(xiàn)所述的芽孢桿菌屬昆蟲防制蛋白基因WO9931248,特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第5,689,052號(hào)，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利笫5,500,365號(hào)和第5,880275號(hào)，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中。在另一實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)基因可以賦予對(duì)除草劑草甘膦的耐性，賦予所述耐性的基因包括但不限于農(nóng)桿菌屬(jgra/acfen'wm)菌抹CP4草甘膦抗性EPSPS基因—ACP4)，如美國專利第5,633,435所述，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，或草甘膦氧化還原酶基因(GOX)，如美國專利第5,463,175所述，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中?；蛘?，所述DNA編碼序列可以通過編碼非翻譯RNA分子，例如制，從而影響這些表型(參見，例如，Bird等，Biotech.Gen.Engin.Rev.9:207,1991)。所述RNA也可以是工程化以切割所需內(nèi)源mRNA產(chǎn)物的催化性RNA分子(即核酶)(參見例如，Gibson和Shillitoe,Mol.Biotech.7:125,1997)。因此，產(chǎn)生表達(dá)目的表型改變或形態(tài)學(xué)改變的蛋白或mRNA的任何基因可用于實(shí)施本發(fā)明。序列影響基因表達(dá)。因此，本文所用術(shù)語調(diào)節(jié)序列指與細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成裝置聯(lián)合作用，控制、介導(dǎo)或影響基因產(chǎn)物表達(dá)的位于DNA序列上游、中間或下游的任何核苦酸序列。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道適亍植物轉(zhuǎn)化的構(gòu)建物。最好使用所述的可篩選或可評(píng)價(jià)標(biāo)記，將本發(fā)明的啟動(dòng)子序列摻入表達(dá)構(gòu)建物中，j試以在轉(zhuǎn)化植物中提供基因表達(dá)的指標(biāo)。在瞬觀^rj儀個(gè)八貝已知的。已經(jīng)報(bào)道了使用各種植物、組織和DNA傳遞系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記基因。例如，瞬植物物種，通過對(duì)組織的電穿孔或粒子轟擊直接傳遞基因。這樣的瞬時(shí)系統(tǒng)將包括但不限于來自小麥懸浮培養(yǎng)物的原生質(zhì)體(Zhou等,PlantCellReports12:612,1993)、小麥葉原生質(zhì)體的電穿孔(Sethi等，J.CropSci.52:152,1983);由玉米組織制備的原生質(zhì)體的電穿孔(Sheen,丄ThePlantCell3:225,1991)、或?qū)μ囟康慕M織的粒子轟擊。本發(fā)明包括應(yīng)用任何瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)來評(píng)價(jià)與選定報(bào)道基因、標(biāo)記基因或目的農(nóng)學(xué)基因有效連接的調(diào)節(jié)序列。設(shè)想在瞬時(shí)測定中通過合適傳遞系統(tǒng)測試的植物組織的例子將包括但不限于葉基組織、愈傷組織、子葉、根、胚乳、胚、花組織、花粉和表皮組織。在瞬時(shí)測定中可以使用任何可評(píng)價(jià)或可篩選標(biāo)記。對(duì)本發(fā)明啟動(dòng)子或5，調(diào)節(jié)序列進(jìn)行瞬時(shí)分析優(yōu)選的標(biāo)記基因包括P-葡糖搭酸糖普酶(GUS)基因或綠熒光蛋白(GFP)基因。將包含有效連接標(biāo)記基因的5'調(diào)節(jié)序列的表達(dá)構(gòu)建物傳遞到組織中，然后根據(jù)所述標(biāo)記，通過合適的機(jī)制分析所述組織。使用定量或定性分析作為工具，評(píng)價(jià)所述5'調(diào)節(jié)序列當(dāng)有效連接目的農(nóng)學(xué)基因時(shí)在穩(wěn)定植物中的可能表達(dá)分布型。最后，將本發(fā)明的5'調(diào)節(jié)序列直接摻入合適的植物轉(zhuǎn)化表達(dá)構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含有效連接可轉(zhuǎn)錄目的DNA序列的5'調(diào)節(jié)序列，將所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)植物，分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)4匕植;昧及其后代的所述5'調(diào)節(jié)序列賦予的所需表達(dá)分布。將外源DNA引入植物細(xì)胞的合適表達(dá)構(gòu)建物包括但不限于用于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的方法中的無毒性(disanned)Ti質(zhì)粒。這些構(gòu)建物可以包含一個(gè)抗性標(biāo)記、1J個(gè)T-DNA邊界、大腸桿菌(五.co/z)和農(nóng)桿菌屬的復(fù)制起點(diǎn)以及一個(gè)或多個(gè)目的基因和相關(guān)調(diào)節(jié)區(qū)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法中，可以利用許多菌抹和方法。這樣的菌林包括但不限于農(nóng)桿菌屬菌林C58、LBA4404、EHA101和EHA105。尤其優(yōu)選的菌才朱是才艮癌農(nóng)片干菌(4gro6(3cz^n'wwfwwe々cz'en力菌才朱?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方法引入的核酸的例子包括，例如，來自另一物種的DNA序列或基因，或甚至起源于同一物種或在同一物種中存在、但通過并非傳統(tǒng)繁殖或育種技術(shù)的遺傳工程方法摻入受體細(xì)胞的基因或序列。然而，術(shù)語"外源的"也用于指不在受轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中正常存在、或者可能僅僅不以所述轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段或基因中出現(xiàn)的形式、結(jié)構(gòu)存在的基因，或者指正常存在、扭人們希望以不同于天然表達(dá)模式的方式(如過量表達(dá))表達(dá)的基因。因此，術(shù)語"外源的"基因或DNA用于指任何引入受體細(xì)胞的基因或DNA區(qū)段，而不論所述細(xì)胞中是否已經(jīng)存在相似基因。外源DNA中包括的DNA類型包括已經(jīng)在所述植物細(xì)胞中存在的DNA、來自其它植物的DNA、來自不同生物的DNA、或外部產(chǎn)生的DNA如包含基因反義信息的DNA序列或編碼基因的合成或修飾形式的DNA序列?；瘶?gòu)建物引入植物?？梢岳脦追N方法將DNA序列引入植物細(xì)胞，這些方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。合適的方法包括但不限于細(xì)菌感染(如用上文所述的農(nóng)桿菌屬)、二元細(xì)菌人工染色體構(gòu)建物、直接傳遞DNA(如通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、干^/抑制介導(dǎo)的DNA攝入、電穿孔、與碳化硅纖維一起攪拌)以及加速DNA包被的粒子(在Potrykus,Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol"42:205,1991中綜述)。特異性轉(zhuǎn)化雙子葉植物的方法主要使用才艮癌農(nóng)桿菌。例如，已經(jīng)報(bào)道的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于棉花(美國專利第5,004,863號(hào)；美國專利第5,159,135號(hào)；美國專利第5，518，908號(hào)，WO97/43430)、大豆(美國專利第5,569,834號(hào)；美國專利第5,416,011號(hào)；McCabe等，Bio/Technology,6:923，1988;Christou等，PlantPhysiol.,87:671,1988);蕓苔屬(Brassica)(美國專利第5,463,174號(hào))以及花生(Cheng等，PlantCellRep.，15:653，1996)和苜蓿(Masoud，S.A.等，Transgen.Res.，5:313，1996)。已經(jīng)4艮道了轉(zhuǎn)化單子葉ii物的相似方法。已經(jīng)針對(duì)多種作物描述了使用這些方法的轉(zhuǎn)化和植物再生，所述作物包括但不限于石刁柏(^ara，""afo;Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:5345，1987);大麥(Z/on^w附vw/garae;Wan和Lemaux,PlantPhysiol"104:37，1994);玉米(Zeama";Rhodes,C.A.等，Science,240:204,1988;Gordon-Kamm等，PlantCell,2:603,1990;Fro腿等，Bio/Technology,8:833,1990;Koziel等，Bio/Technology,11:194,1993);燕麥(^vewas加Va;Somers等，Bio/Technology,10:1589，1992);雞腳草(1)^0;/&^0^^^;Horn等，PlantCellRep"7:469,1988);水稻(O7zfl^riw，包括indica變種和japonica變種，Toriyama等，Bio/Technology，6:10，1988;Zhang等，PlantCellRep.,7:379,1988;Luo和Wu,PlantMol.Biol.Rep.，6:165,1988;Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.,76:835,1988;Christou等,Bio/Technology,9:957,1991);高梁(&^g/mm^co/or;Casas，A.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:11212,1993);甘蔗(SaccAa畫卿.;Bower和Birch，PlantJ.,2:409,1992);蘋狀羊茅(尸eWwcaarMw&加cea;Wang，Z.Y.等，Bio/Technology，10:691，1992);草皮草(jgrasfe;^/w^l;Zhong等，PlantCellRep.,13:1，1993);禾口小麥(7h力.o/ma^yrivww;Vasil等，Bio/Technology，10:667，1992;WeeksT.等,PlantPhysiol"102:1077,1993;Becker等，Plant，J.5:299,1994)。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員明顯的是可以利用和改變多種轉(zhuǎn)化方法，從多種目的作物產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。才直物分一斤方法分析轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在以及本發(fā)明啟動(dòng)子序列賦予的表達(dá)水平和/或分布型。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道可用于分析轉(zhuǎn)化植物的多種方法。使用多種方法評(píng)價(jià)基因表達(dá)，并確定所引入的基因是否整合、是否正常起作用以及是否如所預(yù)期地遺傳。對(duì)于本發(fā)明，可以通過測定啟動(dòng)子有效連接的基因的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)所述啟動(dòng)子。使用報(bào)道基因，通過瞬時(shí)測定方法，可以確定對(duì)啟動(dòng)子功能的初步評(píng)價(jià)，但從對(duì)穩(wěn)定植物的分析可以獲得更確定性的啟動(dòng)子評(píng)^介。植物分析方法包括但不限于DNA印跡分析或RNA印跡分析、基于PCR的方法、生物化學(xué)分析、表型篩選方法、田間評(píng)價(jià)和免疫診斷學(xué)測定。本發(fā)明的方法包括但不限于PCR技術(shù)、分離基因組DNA、構(gòu)建3表達(dá)構(gòu)建物、瞬時(shí)測定和植物轉(zhuǎn)化方法，這些方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修改形式執(zhí)行。草甘膦噴灑試一險(xiǎn)在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行草甘膦耐性的溫室或田間評(píng)價(jià)。本文用術(shù)語"草甘膦"統(tǒng)稱母體除草劑N-膦酰曱基甘氨酸(也稱為草甘膦酸)、其鹽或酯、或在植物組織中轉(zhuǎn)化為N-膦酰曱基甘氨酸的化合物、或以其它方式提供離子形式N-膦酰甲基甘氨酸(也稱為草甘膦離子)的化合物。作為例證，F(xiàn)ranz的美國專利第3,799,758號(hào)和第4,405,531號(hào)公開了本文使用的水溶性草甘膦鹽，.所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中?？梢园凑毡景l(fā)明使用的草甘膦鹽包括但不限于堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽；銨鹽；Cw6烷基銨鹽，例如二曱基銨鹽和異丙基銨鹽；Cw6鏈烷醇銨鹽，例如單乙醇銨鹽；Cw6烷基锍鹽，例如三曱基锍鹽；它們的混合物等等。草甘膦酸分子有三個(gè)酸位點(diǎn)，這三個(gè)醆位點(diǎn)有不同的pKa值；因此可以1吏用一代鹽、二代鹽和三代鹽，或它們的混合物，或任何中間中和水平的鹽。草甘膦鹽有商業(yè)意義，部分因?yàn)樗鼈兪撬苄缘?。許多銨鹽、烷基銨鹽、鏈烷醇銨鹽、烷基锍鹽和堿金屬鹽是高度水溶性的，允許配制成高度濃縮的水溶液，在使用時(shí)用水稀釋。這樣的濃縮水溶液可以含有按酸當(dāng)量(ga.e71)表示的每升約50克到約500克草甘膦。優(yōu)選更高的草甘膦濃度，例如約300到約500ga.e./1?；蛘邔⒉莞熟Ⅺ}配制成水溶性組合物或水分散性組合物，例如采用粉劑、顆粒劑、丸狀或片劑的形式。所述組合物常常稱為干制劑，但詞語"干，，在這里不應(yīng)當(dāng)理解為意味著完全不含水。通常干制劑舍有少于約5%(重量)的水，^如約0.5%到約2%(重量)的水。這樣的制劑需要在使用時(shí)溶解或分散于水中。設(shè)想的干草甘膦制劑可以含有按酸當(dāng)量(％a.e.)表示的約5%到約80%(重量)的草甘膦。優(yōu)選在上逸范圍內(nèi)的較高草甘膦濃度，例如約50%到約80%a.e.。用于制造干制劑的尤其有用的草甘膦鹽是鈉鹽和銨jm_。本發(fā)明的植物處理組合物和液體以及干濃縮組合物可以任選地含有一種或多種所需的賦形劑成卩分。對(duì)于草甘膦組合物尤其有用的賦形劑成份是表面活性劑，表面活性劑協(xié)助水性噴灑溶液保留在相對(duì)疏水的植物葉表面，也幫助草甘膦穿透葉的蠟質(zhì)外層(角質(zhì)層)并因此接觸葉內(nèi)的活組織。表面活性劑也可以執(zhí)行其它有用功能。可以用于本發(fā)明草甘膦組合物中的表面活性劑在類型和化學(xué)種類上沒有限制。在特定情形下，非離子型、陰離子型、陽離子型和兩性型或者一種以上所述類型的組合都是有用的。然而，一般優(yōu)選至少一種存在的表面活性劑(如果有的話)應(yīng)當(dāng)是非陰離子型的，即至少一種所述表面活性劑應(yīng)當(dāng)是非離子型、陽離子型或兩性型的。在此有用的許多表面活性劑具有包含一個(gè)或多個(gè)部分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所述部分各由一個(gè)CV4烯化氧單位或C2_4烯化氧單位聚合鏈或共聚合鏈組成。所*面活性劑稱為聚氧化烯表面活性劑，包括非離子型、陰離子型、陽離子型和兩性型。在目前設(shè)想的組合物中有用的聚氧化蜂表面活性劑包含約2到約100個(gè)Cw烯化氧單位。在優(yōu)選的聚氧化烯表面活性劑中，烯化氧單位形成一條或多條環(huán)氧乙烷鏈或環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物鏈，蹄化氧單位的每條鏈具有一個(gè)氫(hydndo)端基或用C"烷基或Cw烷?；舛恕Ｔ诒景l(fā)明組合物中有用的表面活性劑的疏水部分可以是基本基于烴的，在這種情況下所述疏水部分一般是C8-24、優(yōu)選C12-18的烷基、鏈烯基、烷芳基、烷?；蜴溝；?。這些鏈可以是線性或分支的?；蛘?，所述疏水部分可以含有硅原子，例如采取硅氧烷基團(tuán)的形式如七曱基三硅氧烷基團(tuán)，或者所述疏水部分可以含有氟原子，例如作為部分氟化的烷基鏈或全氟烴基鏈。在非離子型表面活性劑中，尤其優(yōu)選的種類包括聚氧乙烯烷基、鏈烯基或烷芳基醚(例如乙氧基化伯醇或仲醇或烷基酚)、聚氧乙烯烷基或鏈烯基酯(例如乙氧基化脂肪酸)、聚氧乙烯脫氧山梨糖醇烷基酯、甘油基烷基酯、蔗糖酯、烷基多聚糖苷等等。所述非離子型表面活性劑的代表性具體例子包括聚氧乙烯(9)壬基酚、Shell的Neodol25-7(聚氧乙烯(7)C,w5線性伯醇)、UnionCarbide的Tergitol15-S-9(聚氧乙烯(9)dw5仲醇)、ICI的TweenTM20(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯)和Henkel的AgnmulPG-2069(C9-烷基多聚糖苷)。在陽離子型表面活性劑中，尤其優(yōu)選的種類包括聚氧乙烯叔烷基胺或鏈烯基胺(如乙氧基化脂肪胺)、季銨表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚胺等等。所述陽離子型表面活性劑有代表性的具體例子包括聚氧乙烯(5)椰油胺(cocoamine)、聚氧乙火希(15)牛油脂肪胺、氯化二^5更脂酰基二曱基銨、溴化十六烷基三曱基銨、氯化甲基雙(2-羥乙基)椰油銨、氯化N-十二烷基吡啶和聚氧丙烯(8)氯化乙氧基三曱基銨。尤其優(yōu)選的聚氧乙烯烷基醚胺是PCT公開說明書WO96/32839公開的那些化合物。且可以用于本文所設(shè)想的組合物中；所述叔銨表面活性劑具有式(NRaRbRcRd)mAn其中A是合適的陰離子如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根、硫酸根或磷酸根，m和n是整數(shù)，使得陽離子(NRaRbReRd)的正電荷與陰離子A的負(fù)電荷相平衡，Ra、Rb、Re和Rd的選擇包括但不限于(i)Ra是芐基或C8-24,優(yōu)選C12-18、烷基或鏈烯基，而Rb、Rc和Rd獨(dú)立地是Cw烷基，優(yōu)選曱基；(11)Ra和Rb獨(dú)立地是Cg-24、優(yōu)選Cms烷基或鏈烯基，而Rc和Rd獨(dú)立地是Cw烷基，優(yōu)選曱基；(in)Ra是C8—24、優(yōu)選C12—18烷基或鏈烯基，Rb是具有約2到約100個(gè)CM烯化氧單位(優(yōu)選環(huán)氧乙烷單位)的聚氧化烯鏈，而Re和Rd獨(dú)立地是C"烷基，優(yōu)選曱基；(IV)Ra是Cs-24、優(yōu)選dw8烷基或鏈烯基，Rb和Re是具有總共約2到約100個(gè)Cw烯化氧單位(優(yōu)選環(huán)氧乙烷單位)的聚氧化烯鏈，而Rd是Cw烷基，優(yōu)選曱基；(v)Ra是具有約2到約100個(gè)烯化氧單位的聚氧化烯鏈，其中主要是C34烯化氧單位(優(yōu)選環(huán)氧丙烷單位)，而Rb、Re和Rd獨(dú)立地是Cw烷基，優(yōu)選曱基或乙基。該類型中尤其優(yōu)選的季銨表面活性基是那些在Claude等的美國專利第5,464,807號(hào)中公開的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，與所述季銨表面活性基結(jié)合的所述陰離子A可以是草甘膦陰離子。在兩性型表面活性劑，包括本領(lǐng)域內(nèi)習(xí)慣更正確地描述為兩性離子型的表面活性劑中，尤其優(yōu)選的種類包括聚氧乙烯烷基氧化胺、烷基甜菜堿、烷基取代的氨基酸等等。所述兩性型表面活性劑有代表性的例子包括氧化十二烷基二甲基胺、聚氧乙烯(2)氧化椰油胺和硬脂?；趸鸩藟A。的合適表面活性劑，所述標(biāo)準(zhǔn)參考來源包括Gower出版的Fa"必ooto//"dw對(duì)ha/Sw;/acto"&,第二版(1997)、MCPublishingCompany出版的M:Cwfc/簡i5腦/i7力'e/^北美和國際版(1997)和Cosmetic,ToiletryandFragranceAssociation出版的/"femafz'o/ia/Co5wWc/"gre血"fDzWow",笫六版(1995)巻1和巻2。本發(fā)明組合物的其它可選成4分包括改變顏色、粘度、膠凝特性、冰點(diǎn)、吸濕性、結(jié)塊行為、溶解速率、分散性或其它配制特性的試劑。草甘膦商業(yè)制劑的例子包括1，旦不限于MonsantoCompany銷售的ROUNDUP、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS,SPARK和ACCORD除草劑，所有這些除草劑都含有異丙基銨鹽形式的草甘膦；MonsantoCompany銷售的ROUNDUPDRY和RIVAL⑧除草劑，所述除草劑含有銨鹽形式的草甘膦；MonsantoCompany銷售的ROUNDUPGEOFORCE除草劑，所述除草劑含有鈉鹽形式的草甘膦；ZenecaLimited銷售的TOUCHDOWN⑧除草劑，所述除草劑含有三曱基锍鹽。選擇有生物活性的草甘膦制劑的施用量在一般農(nóng)業(yè)技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員同樣會(huì)認(rèn)識(shí)到在實(shí)施本發(fā)明的過程中，單抹條件、天氣條件和生長條件影響所獲得的結(jié)果。二十多年的草甘膦應(yīng)用和關(guān)于所述應(yīng)用的已發(fā)表的研究已經(jīng)提供了豐富的信息，件下在特定生長階段有效除草的草甘膦施用量。本發(fā)明的一種方法適用于草甘膦作為除草劑或植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)其有生物活性的任何或所有植物物種。這包括世界范圍內(nèi)各種各樣的植物物種。同樣，本發(fā)明的組合物可應(yīng)用于草甘膦對(duì)其有生物活性的任何和所有植物物種。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用含草甘膦的除草劑于含本發(fā)明DNA構(gòu)建物的植抹，然后評(píng)價(jià)所述植林對(duì)所述草甘膦除草劑的耐性?？墒褂萌魏尾莞熟⒅苿y試含本發(fā)明DNA構(gòu)建物的植抹。例如，可以使用草甘膦組合物如RoundupUltraTM。評(píng)價(jià)植物草甘膦耐性的測試參數(shù)將隨多種因素而變。因素將包括但不限于草甘膦制劑的類型、所述制劑中使用的草甘膦的濃度和用量、植物類型、施用期間植物的發(fā)育階段、環(huán)境條件、施用方法以及特定制劑的施用次數(shù)。例如，可以在溫室環(huán)境中使用噴灑施用方法測試植物。使用RoundupUltraTM的測試范圍可以包括但不限于4,000平方米226.5ml到4,000平方米7248ml。根據(jù)具體作物和植物發(fā)育階段，RoundupUltraTM的優(yōu)選商業(yè)有效范圍可以從4,000平方米453ml到4,000平方米1812ml。一種作物可以至少噴灑施用一次草甘膦制劑,。為在棉花中測試，在3葉期以4，000平方米906ml施用一次，然后在后面的發(fā)育階段再施用。對(duì)于小麥，可以在3-5葉期以4,000平方米906ml施用RoundupUltraTM—次，然后根據(jù)所測試的小麥類型，在收獲前或收獲后施用一次。可以優(yōu)化每種作物的測試參數(shù)，以便找出賦予所需商業(yè)有效草甘膦耐性水平的包含本發(fā)明構(gòu)建物的特定植株。提供下面的實(shí)施例以示范本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在下面實(shí)施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實(shí)施中作用良好的技術(shù)。然而，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員根據(jù)本公開物應(yīng)當(dāng)理解在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對(duì)于所公開的具體實(shí)施方案可以作出許多改變而仍然獲得類似或相似的結(jié)果，因此在附圖中陳述或顯示的所有內(nèi)容應(yīng)當(dāng)被解釋為是說明性、而不是限制性的。實(shí)施例實(shí)施例1使用的質(zhì)粒構(gòu)建物是pUC克隆構(gòu)建物或雙邊界植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)如orf322、廣宿主范圍復(fù)制起點(diǎn)如on'V或oriRi、和選擇標(biāo)記的編碼區(qū)如編碼賦予壯觀霉素或鏈霉素抗性的Tn7氨基糖香腺苷轉(zhuǎn)移酶(aadA)的Spc/Str或慶大霉素(Gm,Gent)選擇標(biāo)記。為進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，所述宿主細(xì)菌菌林是根癌農(nóng)桿菌ABI或LBA4404。所述遺傳元件描述如下P-e35S是來自CaMV的35SRNA，包含重復(fù)的-90-300區(qū)，如美國專利第5,424,200號(hào)所述，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中；P-FMV是來自玄參花葉病毒的34S啟動(dòng)子，如美國專利第5,378,619號(hào)所述，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中；P-eFMV是所述FMV啟動(dòng)子的衍生物，包含重復(fù)的FMV;CTP2是擬南齊屬EPSP合酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)，如美國專利第5,633,435號(hào)所述；woACP4syn(aro4:CP4)是如美國專利第5,633,435號(hào)所述的CP4EPSP(合成序列)編碼區(qū)，爲(wèi)根據(jù)特定植物物種中的密碼子選擇而修飾以在植物中表達(dá)；E93'是豌豆RbcS基因分離物的作為聚腺苷酸化信號(hào)起作用的3'末端；mw是胭脂氨酸合酶基因的作為聚腺苷酸化信號(hào)起作用的3'末端；Hsp70是來自矮牽牛(/^wma/23/6〃血)的非翻譯前導(dǎo)序列，如美國專利笫5,362,865號(hào)所述，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中；GUS是大腸桿菌p-葡糖醛酸糖苷酶編碼序歹寸(Jefferson,R.A.Prac.A^/.爿o^.[U爿.，83:8447_8451，1987);右邊界(RB)和左邊界(LB)來自根癌農(nóng)桿菌章魚氨酸和胭脂氨酸菌抹的Ti質(zhì)粒。P-AtAct2是來自擬南芥肌動(dòng)蛋白2基因的啟動(dòng)子；AtAct2i是擬南芥肌動(dòng)蛋白2基因5'非翻譯區(qū)(UTR)中的內(nèi)含子；P-AtAct8是擬南芥肌動(dòng)蛋白8基因的啟動(dòng)子；AtAct2i是擬南芥肌動(dòng)蛋白8基因5'UTR中的內(nèi)含子；P-AtActll是擬南芥肌動(dòng)蛋白11基因的啟動(dòng)子；AtActlli是擬南芥肌動(dòng)蛋白11基因5'UTR中的內(nèi)含子；P-AtActla是擬南芥肌動(dòng)蛋白la基因的啟動(dòng)子，L-AtActla是所述肌動(dòng)蛋白la基因的非翻譯前導(dǎo)序列，I-AtActla是來自所述肌動(dòng)蛋白la基因的基因組DNA的內(nèi)含子；P-AtActlb是擬南芥肌動(dòng)蛋白lb基因的啟動(dòng)子，L-AtActlb是來自所述肌動(dòng)蛋白lb基因的非翻譯前導(dǎo)序列，I-AtActlb是來自肌動(dòng)蛋白lb基因的基因組DNA的內(nèi)含子；P-AtAct3是擬南芥肌動(dòng)蛋白3基因的啟動(dòng)子，L-AtAct3是來自所述肌動(dòng)蛋白3基因的非翻譯前導(dǎo)序列，I-AtAct3是來自所述肌動(dòng)蛋白3基因的基因組DNA的內(nèi)含子；P-AtAct7是擬南芥肌動(dòng)蛋白7基因的啟動(dòng)子，L-AtAcn是來自所述肌動(dòng)蛋白7基因的非翻譯前導(dǎo)序列，I-AtAct7是來自所述肌動(dòng)蛋白7基因的基因組DNA的內(nèi)含子；P-AtAct12是擬南芥肌動(dòng)蛋白12基因的啟動(dòng)子，L-AtAct12是來自所述肌動(dòng)蛋白12基因的非翻譯前導(dǎo)序列，I-AtAct12是來自所述肌動(dòng)蛋白12基因的基因組DNA的內(nèi)含子；P-AtEFla(P-AtEFl或EFla)是擬南芥延伸因子基因la的啟動(dòng)子，AtEFla-i(AtEFl-i)是擬南芥延伸因子基因la的5'UTR中的內(nèi)含子。圖1-18提供包含一到三個(gè)植物表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子。植物分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠不經(jīng)過分的試驗(yàn)，就可構(gòu)建包含本發(fā)明啟動(dòng)子和遺傳元件的植物表達(dá)盒的多種組合并在作物中測試。不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為在附圖中顯示的構(gòu)建物是能夠裝配的僅有的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物僅僅是作為例子提供給本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員。圖1(pCGN8086)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，該表達(dá)盒包含與目的基因(CTP2-aro4:CP4syn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子(P-AtAct8)。圖2(pMON45325)才是供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(CTP2-aro4:CP4syn)有效連接的至少一個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子(P-AtActll)。圖3(pMON45331)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)4匕構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(CTP2-aro4:CP4syn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子(P-AtEFl加內(nèi)舍子)。圖4(pMON45332)提供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(0^2-wo4:CP4syn)有效連接的至少一個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子(P-AtEFl加內(nèi)含子)。圖5(pMON9190)提供了包含三個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，在所述表達(dá)盒中，至少兩個(gè)本發(fā)明的啟動(dòng)子(P-AtEFl加內(nèi)含子，AtEFla-i;P-AtAct2力。內(nèi)含子，AtAct2i)與至少一個(gè)目的基因(CTP2-a廠o4:CP4syn)有效連接，而P-eFMV啟動(dòng)子與CTP2-ara4:CP4syn有效連接。圖6(pMON9153)植物表達(dá)盒與圖4(pMON45332)顯示的植物表達(dá)盒相同，顯示該質(zhì)粒圖i普的目的是鑒定在說明書中顯示的數(shù)據(jù)表中關(guān)于植物表型所示數(shù)據(jù)的表達(dá)盒。圖7(pCGN8099)提供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)目的基因(ara4:CP4syn)轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明雜種啟動(dòng)子P-FMV-AtEFloc和P-e35S-AtAct8。圖8(pCGN8088)提供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含本發(fā)明的一個(gè)啟動(dòng)子P-AtAct8加內(nèi)含子、AtAct8i和驅(qū)動(dòng)目的基因(。TO^4:CP4syn)表達(dá)的P-eFMV啟動(dòng)子。圖9(pCGN8068)提供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含本發(fā)明的一個(gè)啟動(dòng)子P-AtAct2加內(nèi)含子、AtAct2i和驅(qū)動(dòng)目的基因(aroACP4syn)表達(dá)的.P-eFMV啟動(dòng)子。圖10(pCGN8096)提供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)目的基因(aro乂:CP4syn)轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明雜種啟動(dòng)子P-FMVAAtActl1和P-e35S-AtAct2。圖11(pCGN9151)提供了包含兩個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)目的基因(a/^4:CP4syn)轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明雜種啟動(dòng)子P-FMV-AtEFlcc和P-e35S-AtAct2。圖12(pMON10156)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)目的基因ora4:CP4syn表達(dá)的P-eFMV啟動(dòng)子，該載體用于與本發(fā)明啟動(dòng)子序列進(jìn)行比較的目的。圖13(pMON52059)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含驅(qū)動(dòng)目的基因0^4:CP4syn)表達(dá)的雜種啟動(dòng)子(P-FMV-AtEFlcc)。圖14(pMON54952)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(CTP2-aroJ:CP4syn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子(P-AtActla加AtActla內(nèi)含子)。圖15(pMON54953)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(CTP2-aroACP"yn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子(P-AtActlb力口AtActlb內(nèi)含子)。圖16(pMON54954)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(012-wov4:CP4syn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子(P-AtAct3力口AtAct3內(nèi)含子)。圖17(pMON54955)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所迷表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(CTP2-aro4:CP4syn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子(P-AtAct7力。AtAct7內(nèi)含子)。圖18(pMON549S6)提供了包含一個(gè)表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物的例子，所述表達(dá)盒包含與至少一個(gè)目的基因(CTP2-wo4:CP4syn)有效連接的一個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子(P-AtActl2加AtActl2內(nèi)含子)。實(shí)施例2克隆構(gòu)建物和GUS構(gòu)建物列于表1。使用擬南芥LandsbergDNA作為模板(Rogers和Bepdicli，P/朋？Mo/.說o/.5:69，1998),用SEQIDNO:l(正向引物)和SEQIDNO:2(反向引物)在下面反應(yīng)中分離擬南芥屬肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子和內(nèi)含子(Genbank登記號(hào)U41998,如An等，/ta".10:107-121,1996所述)0.5嗎模板DNA、25pmole每種引物、taq聚合酶(BMB,Indianapolis,IN)，用蠟珠進(jìn)行"熱起始，，PCR。PCR熱循環(huán)儀條件如下94。Cl分鐘；30個(gè)循環(huán)的92°C40秒，55。Cl分鐘，72°C1分鐘30秒；5分鐘72。C延伸。所述PCR用GeneCleanII(BiolOlInc.,Vista,CA)纟屯化，用Hindin禾口NcoI消化，然后連接進(jìn)用HindIII和NcoI消化的構(gòu)建物pMON26149(表1)。證實(shí)啟動(dòng)子克隆的序列，并將得到的構(gòu)建物命名為pMON26170(表1)。f蛋白和EF1啟動(dòng)子序列的克隆構(gòu)建物和GUS構(gòu)建物構(gòu)建物描述pMON26149克隆構(gòu)建物pMON26170植物表達(dá)構(gòu)建物pMON26171植物表達(dá)構(gòu)建物pMON8677克隆構(gòu)建物pMON48407植物表達(dá)構(gòu)建物pMON26152克隆構(gòu)建物pMON26177植物表達(dá)構(gòu)建物pMON11750植物表達(dá)纟勾建物pMON15737植物表達(dá)構(gòu)建物啟動(dòng)子*/基因/3'Act2/GUS/nosAct8ZGUS/nosActll/GUSZnosEFl/GUS/nose35S/GUS/nosFMV/GUS/nos*所迷肌動(dòng)蛋白和延伸因子啟動(dòng)子序列也包含來自對(duì)應(yīng)基因的UTR的內(nèi)含子序列。實(shí)施例3使用擬南芥LandsbergDNA作為模板，應(yīng)用實(shí)施例2所述的PCR條件和純化方法，用引物SEQIDNO:3(正向引物)和SEQIDNO:4(反向引物)分離擬南芥屬肌動(dòng)蛋白8啟動(dòng)子和內(nèi)含子(Genbank登記號(hào)U42007，如An等，P/a"r10:107-121,1996所述)。如實(shí)施例2所述用限制酶克隆所述啟動(dòng)子，i正實(shí)所述啟動(dòng)子的序列，并將獲得的構(gòu)建物命名為pMON26171(表1)。實(shí)施例4使用擬南芥LandsbergDNA作為模板，應(yīng)用實(shí)施例2所述的PCR條件和純化方法，用引物SEQIDNO:5(正向引物)和SEQIDNO:6(反向引物)分離擬南芥屬肌動(dòng)蛋白11啟動(dòng)子和內(nèi)含子(Genbauk登記號(hào)U27981,如Huang等，P/aWMo/.嵐,33:125-139,1997所述)。用限制酶EcoRV和NcoI克隆所述啟動(dòng)子并將其連接進(jìn)pMON8677(表1),證實(shí)所述啟動(dòng)子的序列，并將獲得的構(gòu)建物命名為pMON48407(表l)。實(shí)施例5使用擬南齊LandsbergerectoDNA作為模板，應(yīng)用實(shí)施例2所述的PCR條件和純化方法，用引物SEQIDNO:7(正向引物)和SEQIDNO:8(反向引物)分離擬南芥屬延伸因子la(AtEFla)啟動(dòng)子和內(nèi)含子(Genbaiik登記號(hào)X16430,如Axelos氛M/.G饑G匿/.219:106-112，1989;Curie等，A^4i19:1305-1310;Curie等，尸/虛Mo/.說o/.18:1083-1089,1992;Curie等，艦G饑O威238:428-436,1993所述)。如實(shí)施例2所述用限制酶HindIII和NcoI克隆所述啟動(dòng)子并將其連接進(jìn)pMON26152(表l),證實(shí)所迷啟動(dòng)子的序列，并將獲得的構(gòu)建物命名為pMON26177(表1)。實(shí)施例6將所述植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物通過交配轉(zhuǎn)移進(jìn)農(nóng)桿菌屬。基本如WO/0036911所述進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中。如Ye等，尸/a"rJow"a/19:249-257,1999所述進(jìn)行擬南芥屬轉(zhuǎn)化。如美國專利第5,565,347號(hào)所述進(jìn)行番茄轉(zhuǎn)化，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中。實(shí)施例7通過合適的傳遞系統(tǒng)例如農(nóng)斥亍菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)靶作物(參見例如美國專利第5,569,834號(hào)，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第5,416,011號(hào)，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第5,631，152號(hào)，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第5,159，135號(hào)，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第5,004,863號(hào)，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，以及美國臨時(shí)申請(qǐng)?bào)?0/111795號(hào)，該文獻(xiàn)特此通過引用完整地結(jié)合到本文中)。或者，可以使用粒子轟擊方法(參見例如專利申請(qǐng)WO92/15675、WO97/48814和歐洲專利申請(qǐng)586,355和美國專利笫5，120，657號(hào)、美國專利第5，503，98號(hào)、美國專利第5，830，728號(hào)、美國專利笫5,015,580號(hào)，所有這些文獻(xiàn)都通過引用完整地結(jié)合到本文中)。可以利用大量轉(zhuǎn)化和再生系統(tǒng)，并且這些轉(zhuǎn)化和再生系統(tǒng)是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的。然后通過多種本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的分子、免疫診斷學(xué)、生物化學(xué)和/或田間評(píng)^r方法，分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植抹和后代中所述基因在目標(biāo)組織中的表達(dá)，所述評(píng)價(jià)方法包括但不限于在生長室或田間環(huán)境中以商業(yè)化有效的濃度使用草甘膦制劑進(jìn)行噴灑測試。實(shí)施例8通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行GUS測定(參見，例如，Jefferson等，5MS0/.6:3901,1987)。對(duì)于棉花，測試R0植抹。在發(fā)育不同階段根據(jù)大小選擇組織，取樣，匯集樣品以進(jìn)行分析。收獲棉花花序芽，取雄性生殖組織^^羊品(花藥和花絲)、雌性生殖組織樣品(整個(gè)柱頭、花柱和子房)和花冠(萼片和花瓣)。為進(jìn)行大小選擇，選擇每個(gè)階段的三個(gè)花序芽，所述花序芽包括小(短于0.5cm)、中(從0.5_0.7cm)和大(candlestage或開花)的幾種大小。將棉花植抹放置在溫室中約l-2周后收集葉樣品，并在約l-2月后收集其它樣品。不收集初花(頭五個(gè)結(jié)果位置保持完整)。對(duì)于擬南芥屬，分析V1植^^朱，并僅測試純合分離體和雜合分離體。每種構(gòu)建物分析八到十個(gè)事件(每事件5個(gè)植;昧)。擬南芥屬的GUS結(jié)果代表8-10個(gè)事件的匯集樣品。所公開的表(表2和表3)中的值代表對(duì)于所指定組織的平均GUS表達(dá)(pmol/MU/分鐘/mg)。實(shí)施例9分析植抹在葉組織和生殖組織中的GUS表達(dá)，所述生殖組織包括未成熟的花序芽和花。結(jié)果顯示于表2。測試的構(gòu)建物包括pMON48407(P-AtActn+內(nèi)含子ZGUS/nos)、pMON26170(P-AtAct2+內(nèi)含子/GUS/nos)、pMON26171(P-AtAct8+內(nèi)含子/GUS/nos)、pMON11750(e35S/GUS/nos)、pMON26177(P-EFla+內(nèi)含子/GUS/nos)和pMONl5737(P-FMV/GUS/nos)。所述肌動(dòng)蛋白和延伸因子啟動(dòng)子在多種組織包括生殖組織中賦予高水平GUS表達(dá)。表2.平均擬南界屬V1GUS表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實(shí)施例10測試R0棉花植株選定組織不同發(fā)育階段的GUS報(bào)道基因表達(dá)。根據(jù)大小對(duì)花序芽劃分階段(小、中和大；大-candle和開花)。雄蕊群代表雄性生殖組織。雌蕊群代表包括整個(gè)花托(柱頭、花柱和子房)的雌性生殖組織?；ü跇悠钒ㄝ嗥突ò?。如實(shí)施例8所述制備所述組織并進(jìn)行GUS測試。結(jié)果概述于表3。測試的構(gòu)建物包括pMON48407(P-EFlct+內(nèi)含子/gus/nos)、pMON26170(P-AtAct2+內(nèi)含子/gus/nos)和pMON48407(P-AtActl1+內(nèi)含子/gus/nos)。對(duì)于pMON26177測試六纟朱植株并獲得平均GUS值。對(duì)于pMON26170測試二十抹植抹并獲得平均GUS值。對(duì)于pMON48407測試/V4朱植株并獲得平均GUS值。結(jié)果證明所述肌動(dòng)蛋白和延伸因子啟動(dòng)子可用于尤其在生殖組織中有效表達(dá)有效連接的基因。表3.棉花植4朱的GUS測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>p即N26170Act2中雌蕊畫lpMON26170Act2中雄蕊7893pMON26170Act2大花冠289pMON26170Act2大雌蕊3218pMON26170Act242737pMON48407Act11葉28289pMON48407Act1110pMON48407Actll小雌蕊40755pMON48407Actl1小雄蕊47834pMON48407Actll中花冠742pMON48407Actl1中雌蕊52495pMON48407Actll中雄蕊35573pMON48407Actl1大花冠1072pMON48407Actll大雌,窓4869pMON48407Actll大力禽,窓42737實(shí)施例11在一個(gè)溫室噴灑測試中，使用RoundupUitraTM草甘膦制劑和TrackSprayer裝置(RoundupUltra是MonsantoCompany的注冊(cè)商才示),測i式轉(zhuǎn)化植抹。植林處于"二"真葉期或更晚的生長階段，在應(yīng)用Roundup噴灑前使葉干燥。使用的制劑是3磅Z力。侖a.e.(酸當(dāng)量)RoundupUltra制劑。使用如下的校準(zhǔn)對(duì)于20加侖/英畝噴灑體積噴嘴速度噴灑壓力噴灑高度軌道(Track)速度制劑9501恒流(evenflow)40,psi天棚頂和噴嘴尖之間18英寸1.1英尺/秒，對(duì)應(yīng)于1950-1.0伏的讀數(shù)RoundupUltraTM(3磅A.e./加侖)根據(jù)所需測試范圍，噴灑濃度將有所變化。例如，如所需噴灑率為8盎司/英畝，則使用3.1ml/L的工作溶液，如所需噴灑率為64盎司/英畝，則使用24.8ml/L的工作溶液。根據(jù)作物、植物發(fā)育階段和所需的耐性水平，評(píng)價(jià)周期將有所變化。實(shí)施例12用于番茄轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)構(gòu)建物列于表4。在使用草甘膦(RoundupUltraTM)制劑的溫室草甘膦噴灑試驗(yàn)中，篩選包含構(gòu)建物的番茄植株(TO)賦予轉(zhuǎn)基因番茄植林草甘膦耐性的效率，其中所述構(gòu)建物包含有效連接一個(gè)"r":CP4草甘膦耐性基因的至少一個(gè)肌動(dòng)蛋白或延伸因子啟動(dòng)子(包含內(nèi)含子)。4壬選地通過噴灑應(yīng)用草甘膦(RoundupUltra),篩選轉(zhuǎn)化進(jìn)番茄植林的有效連接一個(gè)aro4:CP4基因的至少一個(gè)肌動(dòng)蛋白或延伸因子啟動(dòng)子序列以及有效連接一個(gè)araACP4的一個(gè)eFMV花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子。以48盎司/英畝噴灑番茄植抹，然后在應(yīng)用后兩周進(jìn)行評(píng)價(jià)，分析營養(yǎng)性耐性，并在應(yīng)用后直到60天進(jìn)行評(píng)價(jià)，分析生殖性耐性。結(jié)杲顯示于表4,并根據(jù)選擇生殖耐受系的效率進(jìn)行分級(jí)。營養(yǎng)性耐性百分率是篩選出的顯示對(duì)草甘膦損害有足夠營養(yǎng)性耐性的系的百分率，考慮進(jìn)一步研究所述系的農(nóng)學(xué)性狀以制備商業(yè)化候選物。生殖性耐性百分率是也顯示有足夠繁殖耐性的營養(yǎng)耐受系的百分率，考慮對(duì)所逸系進(jìn)行進(jìn)一步的農(nóng)學(xué)評(píng)價(jià)。所有構(gòu)建物都證明能夠?yàn)檗D(zhuǎn)基因番茄植株有效提供營養(yǎng)性耐性和生殖性耐性。各種啟動(dòng)子組合能夠增加在本試驗(yàn)中通過篩選選擇營養(yǎng)性耐性系和生殖性耐性系的效率。包含擬南芥屬EFloc啟動(dòng)子的構(gòu)建物更加特異性地與營養(yǎng)性耐受系的高百分率相關(guān)。P-Act2啟動(dòng)子與P-eFMV和P-AffiFloc(pCGN9190)的組合提高了通過本方法篩選的繁殖性耐受系的百分率。表4.溫室軌道噴灑試驗(yàn)，其中噴灑率為48盎司/英畝*構(gòu)建物描述#測試的系營養(yǎng)耐性。/。1繁殖耐性％:pCGN9190eFMV/CP4+EFla/CP4+93083.252.4Act2/CP4,pCGN9153EFla/CP4+eFMV/CP439173.938.9pCG聽86Act8/CP42147.638.1pCGN8099FMV-EFlcc/CP4+Act8/CP471S4.536.6pCGN80S8eFMV/CP4+ActS/CP414479.934.7pMON45325eFMV/CP4+Actl1/CP4卯70—034.4pCGN8096FMV-Actll/CP4+Act2/CP420162.710.4pCGN8067Act2/CP420567.38.8*施用一次}從25次篩選匯集的結(jié)果。施用后14天計(jì)數(shù)2從25次篩選匯集的結(jié)果。施用后直到60天計(jì)數(shù)使用番茄種子產(chǎn)量作為本發(fā)明使用的賦予轉(zhuǎn)基因植物草甘膦耐性的各種啟動(dòng)子序列和表達(dá)盒組合的效率的衡量。在表5中，顯示了轉(zhuǎn)基因番茄植抹三個(gè)田間試驗(yàn)的結(jié)果，所述轉(zhuǎn)基因番茄植抹包含用本發(fā)明的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)草甘膦耐性的aroACP4編碼序列表達(dá)的構(gòu)建物。試驗(yàn)1是用從構(gòu)建物產(chǎn)生的植株的測試，所述構(gòu)建物包含天然形式的玄參花葉病毒啟動(dòng)子(P-FMV)或其重復(fù)形式(P-eFMV)以及也在用于測試本發(fā)明啟動(dòng)子序列的構(gòu)建物中出現(xiàn)的所述構(gòu)建物中的其它遺傳元件。也測試其它遺傳元件例如5，非翻譯序列和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的來源。構(gòu)建物pMON20"8包含連接矮牽牛Hsp705'UTR的P-eFMV、連接擬南芥屬EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP-2)的前導(dǎo)序列，并連接到E93'終止區(qū)。構(gòu)建物pMON20999與pMON20998的不同之處僅在于其啟動(dòng)子是P-FMV。構(gòu)建物pMON10156與pMON20998的不同之處僅在于其CTP來自矮牽牛EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP-4)。構(gòu)建物pMON45312與pMON20998的不同之處僅在于其前導(dǎo)序列是天然FMV前導(dǎo)序列。將番茄植抹移植到大田，排列成行。在田間用Roundup除草劑以48盎司/英畝的比率噴灑處理所逸植株。從果實(shí)收集番茄種子并稱重。一個(gè)未噴灑的番茄植林系作為對(duì)照以進(jìn)行比較，每種構(gòu)建物的效力以對(duì)照的百分率表示。試驗(yàn)1的結(jié)果(表5的欄l)是FMV啟動(dòng)子和P-eFMV僅提供未噴灑對(duì)照種子產(chǎn)量的5-11%。試驗(yàn)2和3在不同地點(diǎn)測試本發(fā)明的構(gòu)建物(表5的欄2和3)。試驗(yàn)2在試驗(yàn)1的同一地點(diǎn)進(jìn)行，構(gòu)建物pCGN8099(圖7)、pCGN9151(圖11)和pCGN9190(圖5)表現(xiàn)很好，提供了相對(duì)于未噴灑對(duì)照的25-46%種子。在一個(gè)生長季節(jié)較冷的不同地點(diǎn)，試驗(yàn)3證明pCGN8068(圖9)、pCGN8088(圖8)、pCGN8099、pCGN9151、pCGN9153(圖6)和pMON45325(圖2)能夠賦予番茄足夠的草甘膦耐性，產(chǎn)生相對(duì)于未噴灑對(duì)照約34-77%的正常種子。表5.番茄種子產(chǎn)量試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>實(shí)施例13SEQIDNO:l-8和SEQEDNO:13-21是由擬南齊Actl、Act2(Genbank#U41998)、Act3、Act7、Act8(Genbank#ATU42007)、Actll(Genbai]i:#ATU27981)、Actl2和Elfla(Genbaak存X16430)基因公共可得的信息設(shè)計(jì)的PCR引物。這些序列用于使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)延伸所述核酸序列(參見例如Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51:263,1986;Eriich等，歐洲專利申請(qǐng)50,424;歐洲專利申請(qǐng)84,796、歐洲專利申請(qǐng)258,017、歐洲專利申請(qǐng)237,362;Mullis,歐洲專利申請(qǐng)20U84;Mullis等，美國專利第4,683,202號(hào)；Erlich，美國專利4,582,788;和Saiki等，美國專利第4,683,194號(hào))。許多PCR擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的，并用于鑒定與已知序列鄰近的核酸序列。例如，已經(jīng)描述了反向PCR(IPCR)方法，該方法用于擴(kuò)增與已知序列核心區(qū)鄰近的未知DNA序列。也可以利用其它方法，例如捕獲PCR(LagerstromM.等，PCRMethodsApplic.1:111，1991)和步查PCR(Parker等，NucleicAcidsRes19:3055,1991)。許多生產(chǎn)商也已經(jīng)開發(fā)了基于這些方法的改進(jìn)形式的試劑盒以鑒定目的序列。技術(shù)進(jìn)步包括引物和連接物設(shè)計(jì)的改進(jìn)、聚合酶的改進(jìn)、以及熱循環(huán)儀的能力已經(jīng)促進(jìn)了更快的分離目的序列的有效方法。表5a.分離擬南芥屬肌動(dòng)蛋白和EF1a啟動(dòng)子序列的引物序列At.肌動(dòng)蛋白2正向At.肌動(dòng)蛋白2反向AtJ幾動(dòng)蛋白S正向At.肌動(dòng)蛋白S反向AtJ幾動(dòng)蛋白11正向At.肌動(dòng)蛋白11反向CCATCTGCCATGGTCTATATCCTGTCAt.EFla正向TTTTTTTTTAAGCTTGATATCGGAAGTTTCTCTCTTGAt.EFlcc反向CTTTTCCCATGGTAGATCTCTGGTCAACAAATCAt.肌動(dòng)蛋白la正向CCCAAGCTTAAATGACATCAGATACACGCAt.肌動(dòng)蛋白lb正向CATAAGCTTAGAGGTCCAAATTCAAt.肌動(dòng)蛋白I反向CCATCAGCCATGGTCTTCTACCTTTATGCAAAAt.肌動(dòng)蛋白3正向CCAAGCTTACCACACTCAGATGCATAAACAAACACAAt.肌動(dòng)蛋白3反向CATCAGCCATGGTC丁ACTCTCTGCA/VAAACAAt.肌動(dòng)蛋白7正向GCAAAGCTTACTAGTCAACAATTGGCCAt.肌動(dòng)蛋白7反向GATCGGCCATGGTTCACTAAAAAAAAAGAt.肌動(dòng)蛋白12正向GGAAGCTTGCGGCCGCTTTCTACTCTACATGTTTCT將擬南芥小植株的葉(lg)在9mlCTAB緩沖液(Saghai-Maroof等，1984,PNAS81:8014-8018)中勻漿。所述CTAB緩沖液含100mMTnsHa,pH7.8,700mMNaCl，50mMEDTA,1。/。CTAB(溴化烷基三曱基銨)和140mM2-巰基乙醇。在65。C溫育90分鐘后，加入4.5ml氯仿:異戊醇(24:1)，混合樣品10分鐘。通過在1500g離心10分鐘，分離水層，并用氯仿:異戊醇再萃取。第二次離心后，將水層轉(zhuǎn)移到含50ml10mg/mlRNA酶A(無DNA酶)的試管中，在室溫下溫育30分鐘以除去RNA。用6ml異丙醇沉淀DNA，并重懸浮于1ml10mMTnsHCl緩沖液pH8.5中。DNA;容液用等體積苯酚萃取一次，然后用等體積氯仿:異戊醇萃耳又一次。離心后，在水層加入1/10體積乙酸鈉(3M，pH5.2),然后加入2.S倍體積乙醇。鉤起DNA，在70%乙醇中洗，然后風(fēng)干并重懸浮于0.2ml10mMTrisHCl緩沖液。在50mlPCR反應(yīng)中使用擬南芥屬基因組DNA(100ng)。包含顯示于表5a的所述引物的反應(yīng)包含0.2mM反向和正向引物溶液、200nMdNTP和含鎂的PCR緩沖液、來自ExpandHighFidelityPCRSystem變性2分鐘后，反應(yīng)物以94。C0.5分鐘、55。C0.5分鐘和72。C1.5分鐘循環(huán)35次。在"/。瓊脂糖凝膠上通過電泳分析PCR產(chǎn)物。用T4DNA激酶將凝膠分離的代表肌動(dòng)蛋白la、肌動(dòng)蛋白lb、肌動(dòng)蛋白7和肌動(dòng)蛋白U序列的DNA片段磷酸化，連接進(jìn)去磷酸化并用Smal切割的pUC19克隆構(gòu)建物中。篩選白色菌落中合適插入片段的存在，用M13測序以確認(rèn)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的存在。選定的克隆命名為pMON54941(P-AtActla)、pMON54942(P-AtActlb)、pMON54943(P-AtAct7)和pMON54944(P-AtAct12)。隨后，用HindIII和NcoI消化包含所述插入片段序列的pUC19構(gòu)建物，幹放肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子DNA序列，凝膠分離所述DNA片段并連接進(jìn)用同樣限制酶消化的pMON26165。用HmdIII和NcoI消化肌動(dòng)蛋白3啟動(dòng)子(P-AtAct3)的PCR產(chǎn)物，然后直接克隆進(jìn)pMON26165,形成pMON54951。pMON26165包含GUS/nos終止子基因區(qū)段。與該啟動(dòng)子區(qū)段的連接使得能夠通過在植物細(xì)胞中P-葡糖醛酸糖香酶的表達(dá)測定每種啟動(dòng)子的功能活性。所述植物細(xì)胞可以是分離自例如煙草葉原生質(zhì)體，或者所述植物細(xì)胞可以包含在一種植物組織或器官中，如葉、根、子葉、下胚軸、胚、花或貯藏器官中。在大豆下胚軸中測定與P-e35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS相比，由這些啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)水平(表6)。將質(zhì)粒DNA/金粒子轟擊進(jìn)大豆下胚軸，48小時(shí)后用組織化學(xué)方法測定GUS活性。該測定中測試的所有肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子都在下胚軸組織中顯示功能活性，證明它們?cè)诋愒醋魑镂锓N中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的實(shí)用性。為了在作物中穩(wěn)定表達(dá)草甘膦抗性EPSPS，在農(nóng)桿菌雙元植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物中制備包含由本發(fā)明擬南芥屬肌動(dòng)蛋白la(pMON54952)、肌動(dòng)蛋白lb(pMON54953)、肌動(dòng)蛋白3(pMON54954)、肌動(dòng)蛋白7(pMON54955)和肌動(dòng)蛋白12(pMON54956)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的aro4:CP4EPSPS的構(gòu)建物。將這些構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)大豆和棉花細(xì)胞，在含草甘膦的組織培養(yǎng)培養(yǎng)基上選擇所述細(xì)胞并再生成植抹，然后分析"ro4:CPd蛋白的表達(dá)以及對(duì)施用草甘膦的耐性。進(jìn)一步通過常規(guī)育種方法將草甘膦耐性性狀轉(zhuǎn)移進(jìn)適于栽培的種質(zhì)中，產(chǎn)生顯示商業(yè)上可接受的草甘膦耐性的植^^朱。表6.在瞬時(shí)測定中，不同擬南茶屬肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子與P-e35S相比的<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實(shí)施例14棉花產(chǎn)量與結(jié)蕾頭4到5周內(nèi)所結(jié)棉蕾的數(shù)目相關(guān)。這些棉蕾保持到成熟的棉鈴以及它們對(duì)皮棉收成的貢獻(xiàn)是產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。當(dāng)測定轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物賦予棉花除草劑耐性的效力時(shí)，棉鈴保留的量是效力的量度，也是所需的性狀。在溫室條件下測定包含本發(fā)明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因棉花植抹(表7)的棉鈴保留。所述啟動(dòng)子指導(dǎo)賦予草甘膦耐性表型的ar":CP4編碼序列的表達(dá)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法或粒子槍方法轉(zhuǎn)化植物。所述粒子槍構(gòu)建物包含一個(gè)額外的含有GUS的表達(dá)盒，所迷表達(dá)盒可用于組織化學(xué)定位來自本發(fā)明啟動(dòng)子的P-葡糖醛酸糖苷酶活性。在含有草甘膦的培養(yǎng)基上再生轉(zhuǎn)基因植物，然后在生根培養(yǎng)基使植物生根。生根的小植株轉(zhuǎn)移到盒栽土壤，并轉(zhuǎn)移到生長室達(dá)到種子硬化(hardenmgoff)期。收集這些才直才朱系的種子并種植。來自每個(gè)系的十五個(gè)植抹在4葉期以48盎司Z英畝噴灑草甘膦。來自每個(gè)系的至少8個(gè)存活的植株在8葉期再次以48盎司/莢畝噴灑草甘膦。成熟時(shí)，計(jì)數(shù)產(chǎn)生頭五個(gè)棉鈴的最初位置上棉鈴的數(shù)目。噴灑草甘膦后保留的最初位置棉鈴數(shù)為3或更多的那些系(植抹圖>3)用于進(jìn)一步的研究。表7顯示了該研究獲得的數(shù)據(jù)。作圖系的數(shù)目指出第一次施用草甘膦噴灑后存活的系的數(shù)目。商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是系1445(pMON17136),該系含有驅(qū)動(dòng)CTP2-aray4:CP4基因/E93'表達(dá)的P-FMV啟動(dòng)子，該系在頭5個(gè)棉鈴中保留了不到1個(gè)棉鈴。構(gòu)建物pCGN8099、pCGN91S3、pCGN8088、pCGN8068在棉花中提供了足夠的生殖性草甘膦耐性，以至于來自所述構(gòu)建物14-35%檢測的系進(jìn)一步進(jìn)行后面的農(nóng)學(xué)試驗(yàn)。表7.溫室棉鈴保留研究<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實(shí)施例15棉花產(chǎn)量與結(jié)蕾頭4到5周內(nèi)所結(jié)棉蕾的數(shù)目相關(guān)。這些棉蕾保持到成熟的棉鈴以及它們對(duì)皮棉收成的貢獻(xiàn)是產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。當(dāng)測定轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物賦予棉花除草劑耐性的效力時(shí)，棉鈴保留的量是效力的量度，也是所需的性狀。在兩個(gè)地點(diǎn)，在田間條件下測定包含本發(fā)明啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因棉花植抹的棉鈴保留。將轉(zhuǎn)基因棉花系502-254-2(pCGN8068)、701-178-2(pCGN8068)、53-2(pCGN8088)、178-1(pCGN9153)和60-1(pCGN9153)與1445(草甘膦耐受系)和包含構(gòu)建物pMON17136(P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93，)相比較，另外還包括一個(gè)野生型非轉(zhuǎn)基因系Cokerl30。田間設(shè)計(jì)是包括2行x20-30英尺x3個(gè)重復(fù)的隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)。在棉花4直抹發(fā)育的8葉期以1.12磅ai/A=48盎司產(chǎn)物和1.5磅ai/A=64盎司產(chǎn)物的比率施用作為RoundupUltra制劑的草甘膦。積極管理所有棉:^小區(qū)的雜草防除和害蟲防制以及其它農(nóng)學(xué)因素，例如種植時(shí)間、施肥、灌溉、PGR應(yīng)用和脫葉。棉鈴保留百分率如下確定隨機(jī)選4奪每個(gè)小區(qū)中間兩行中間的十個(gè)植才朱(每4亍五林)進(jìn)行作圖，繪制每個(gè)保留的棉鈴的位置。應(yīng)該在第一次開花后4周進(jìn)行第一次作圖(生長中期圖)，收獲時(shí)進(jìn)行第二次作圖。收集的數(shù)據(jù)包括底部五個(gè)花節(jié)最初位置棉鈴的數(shù)目，該數(shù)目指示轉(zhuǎn)基因棉花系對(duì)草甘膦的生殖性耐性。表8說明了本發(fā)明啟動(dòng)子的好處它們使得轉(zhuǎn)基因棉花植抹能夠保留棉鈴。該增強(qiáng)的生殖性耐性導(dǎo)致皮棉產(chǎn)量增力口(表9)和種子產(chǎn)量增加(表10)。表8.底部5個(gè)最初位置棉鈴在生長中期植株作圖時(shí)的棉鈴保留位置1位置2未處理48oz/A64oz/A未處理48oz/A64oz/A(17136)1445686753816362(8068)502-254-2877264778069(8068)701-178-285776084S676(簡8)53-289Sl80797673(9153)178-1778373857179(9153)60-180898177S287PM121SBR925663表9.皮棉產(chǎn)量(磅復(fù)畝)和產(chǎn)量百分率〔位置1)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實(shí)施例16在轉(zhuǎn)基因擬南芥中比較驅(qū)動(dòng)CTP2-aroA'CP4編碼序列表達(dá)的雜種啟動(dòng)子P-FMV-AtEFla(圖13,pMON52059)和P-FMV/CTP2-am4:CP4/E93'(pMON15737)的效力。通過真空滲入產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(Bechtold等，CRAcadPansLifeSci316:1194-1199)，種子盆栽在土壤中，置于調(diào)整到24。C、16小時(shí)光(120^En^s力周期的生長室內(nèi)以允許植株的正常生長和發(fā)育。通過以24盎司/英畝的比率噴灑施用草甘膦除草劑，選擇pMON52Q59VI事件草甘膦耐性轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植抹，將存活的植抹移植到單個(gè)的盆中。在約16天后，對(duì)應(yīng)于抽莒的觀察時(shí)，以24盎司/英畝的比率笫二次噴灑8個(gè)pMON52059VI植抹和8個(gè)pMON15737純合植林。所述第二次噴灑將確定所述兩種構(gòu)建物賦予生殖性耐性的效力。觀察植抹對(duì)施用草甘膦的營養(yǎng)性效應(yīng)。所有植抹都有完全的營養(yǎng)性耐性，沒有見察到不正常的花。然而，出現(xiàn)長角果敗育指示在敗育的長角果中沒有結(jié)種子。計(jì)數(shù)每個(gè)植抹產(chǎn)生的長角果總數(shù)以及包含種子的長角果(能育長角果)的總數(shù)，并制成表格。結(jié)果顯示于表9，該結(jié)果表明雜種啟動(dòng)子構(gòu)建物pMON52059獲得的能育長角果有89%,比pMON15737的8%改善IO倍以上。能育結(jié)果結(jié)構(gòu)的數(shù)目與能夠產(chǎn)生的種子數(shù)量相關(guān)，這對(duì)于產(chǎn)量與種子數(shù)量相關(guān)的作物尤其重要。對(duì)于如棉花、大豆、canola、小麥和玉米等作物，對(duì)草甘膦的生殖性耐性對(duì)于好的產(chǎn)量是絕對(duì)必要的。11.比較雜種啟動(dòng)子P-FMV-EFla(pMON52059)和P-FMV,芥屬植抹7于草甘膦的生殖性耐性植抹pMON52059匕B性<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>實(shí)施例17向日葵(/^/w"r/zw丄.)是用于油和食物的重要農(nóng)業(yè)作物。將本發(fā)明構(gòu)建物pMON45325(圖2)、pMON45332(圖4)和pMON45331(圖3)轉(zhuǎn)化進(jìn)向日葵。已經(jīng)報(bào)道了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的向日葵轉(zhuǎn)化(Schrammeijer等，尸/"WCe//鄉(xiāng)orte,9:55-60,1990;EP0486234)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的用轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物的方法包括下胚軸、頂端分生組織、原生質(zhì)和其它向日葵組織。轉(zhuǎn)基因向日葵系SFB250-27包含pMON20999(P-FMV/CTP2-aro4:CP4/E93，)表達(dá)盒；SFB288-01、SFB295-09包含pMON45325(P-FMV-aroA:CP4/E93，::P-AtActll+內(nèi)含子/CTP2-aroA:CP4/E93');SFB289-01包含pMON45332(P-AtEFloc+內(nèi)含子/CTP2-aroA:CP4/E93，::P-eFMV/CTP2隱aroA:CP4/E93，)；SFB303-08、SFB303-09、SFB303-11和HA300B包含pMON45331(P-AtEFla+內(nèi)含子/CTP2-aroA:CP4/E9)。測試這些系的草甘膦耐性，結(jié)果顯示于表12。常頭狀花序大小百分率和花粉產(chǎn)生的函數(shù)來測量。在V-4葉期和V-8葉期，以0盎司/英畝、32盎司/英畝或64盎司/英畝的比率用草甘膦噴灑這些植抹。評(píng)價(jià)所述向日葵植才朱對(duì)草甘膦的營養(yǎng)性耐性。在植抹發(fā)育的V4期和V8期、在32盎司/英畝和64盎司/英畝的草甘膦噴灑水平達(dá)到了營養(yǎng)性耐性。評(píng)價(jià)草甘膦營養(yǎng)性耐性轉(zhuǎn)基因向日葵系的頭狀花序數(shù)目、正常頭狀花序百分率、正常頭狀花序大小百分率和正常脫落花粉百分率。在一個(gè)地點(diǎn)的一個(gè)田間試驗(yàn)中評(píng)價(jià)這些性狀。頭狀花序計(jì)數(shù)和花粉產(chǎn)生的制表顯示于表12。從本發(fā)明構(gòu)建物選出的系顯示更高的正常頭狀花序百分率、一般更高的正常頭狀^^序大小百分率和更好的花粉脫落。表12.向日葵草甘膦抗性評(píng)價(jià)系編號(hào)頭狀花序數(shù)%正常頭狀花序%正常頭狀花%脫落的花粉序大小SFB250-2728297536SFB288-0111367373SFB295-0928576468SFB289-0113389238SFB303-0825689264SFB303-094381S888SFB305-1145'7184100HA300:B301009797非轉(zhuǎn)基因分離子0000實(shí)施例18元件。在一種方法中，進(jìn)行缺失分析以去除所述啟動(dòng)子的多個(gè)區(qū)，然后分析獲得的啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)子活性。假如截短的啟動(dòng)子的活性與原始啟動(dòng)子片段相比發(fā)生改變，就認(rèn)為該DNA片段對(duì)于啟動(dòng)子調(diào)節(jié)是必需的。通過這種缺失分析，可以鑒定對(duì)于轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)必需的小DNA區(qū)。也可以鑒定啟動(dòng)子序列基序，工程化新型啟動(dòng)子使其包含這些順式元件，以調(diào)節(jié)有效連l妾的可轉(zhuǎn)錄序列的表達(dá)。見例如美國專利第5,223,419號(hào)，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第4,990,607號(hào)，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中，美國專利第5,097,025號(hào)，特此通過引用完整地結(jié)合到本文中。另一種可采用的方法是尋找啟動(dòng)子間具有相似表達(dá)分布型的相似序列D具有重疊活性模式的啟動(dòng)子可能具有共同的調(diào)節(jié)機(jī)制?？梢岳脦追N計(jì)算機(jī)程序鑒定啟動(dòng)子間保守的序列基序，所述計(jì)算機(jī)程序包括但不限于MEME、SIGNALSCAN或GENESCAN。這些基序可能代表調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。一旦鑒定了所述序列基序，就可以測定它們的功能。例如，可以從啟動(dòng)子中缺失所述基序序列以確定所述基序?qū)τ谡?dòng)子功能是否是必需的?；蛘撸梢詫⑺龌蛱砑拥阶钚?dòng)子上，以測試它是否足以激活轉(zhuǎn)錄?？梢匀缦聹y試懷疑的負(fù)調(diào)節(jié)元件的充分性將其添加到活性啟動(dòng)子中，檢測啟動(dòng)子活性的降低。一些順式作用調(diào)節(jié)元件可能需要其它元件以發(fā)揮功能。因此，可以通過本領(lǐng)域內(nèi)4支術(shù)人員已知的任何方法，以不同組合測試多種元件。一旦已經(jīng)鑒定了有功能的啟動(dòng)子元件，就可以在核苷酸水平上修飾啟動(dòng)子元件以影響蛋白結(jié)合。所述修飾可能導(dǎo)致更高或更低的親和性結(jié)合，這將影響從該啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄水平。啟動(dòng)子元件可以加性作用或協(xié)同作用影響啟動(dòng)子活性。在這點(diǎn)上，可以串聯(lián)排列來自不同5'調(diào)節(jié)區(qū)的啟動(dòng)子元件，獲得具有不同活性范圍或不同表達(dá)分布型的啟動(dòng)子。因此，來自異源來源的啟動(dòng)子元件組合或者相似元件或相同元件的重復(fù)可能賦予有效連接的可轉(zhuǎn)錄序列的更高水平表達(dá)。例如，可以形成一種啟動(dòng)子元件的多聚體，以增加由該啟動(dòng)子元件所實(shí)現(xiàn)模式的^f寺異性表達(dá)的水平。構(gòu)建包含新型工程化5，調(diào)節(jié)元件的表達(dá)構(gòu)建物所需的技術(shù)方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的。在表達(dá)構(gòu)建物中測試所述工程化啟動(dòng)子，并通過有效連接所述新型啟動(dòng)子到合適的報(bào)道基因如GUS然后在瞬時(shí)植物測定中測試，瞬時(shí)測試所述啟動(dòng)子。將所述新型啟動(dòng)子有效連接到一個(gè)或多個(gè)目的基因，并與一個(gè)或多個(gè)其它調(diào)節(jié)元件摻入植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建物，然后通過合適的DNA傳遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)化進(jìn)目標(biāo)植物。通過適于評(píng)價(jià)所需特征的多種分子方法、免疫診斷學(xué)方法、生物化學(xué)方法、表型方法或田間方法，評(píng)價(jià)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株及其后代。在舉例說明并描述本發(fā)明的原理后，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚可以在安排和細(xì)節(jié)上改變本發(fā)明而不偏離這些原則。我們要求保護(hù)在所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的改變。結(jié)合到本文中，其程度等同于具體并分別指出各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用結(jié)合到本文中。CPGH0863380D序歹lj表<110>Fincher,KarenLFlasinski,StanislawWilkinson,JackQ.<120>新型植物表達(dá)構(gòu)建物<130〉11898.0018.OOPCOOM0BS018<140>US60/171,173<141>1999-12-16<160>30<170>Patentlnversion3.0<210〉1<211>39<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>合成寡核苷酸<400>1t.t.tt,ttttgatat.caagcttcaactatt.tttatgtatgc39〈210〉2<211〉47<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>合成寡核苷酸<400〉2gcct,cagccatggtga.g"tctgctgcaaacacacaaaaagagttcaat47<210>3<211>42<212>隨<213>人工序列<220〉<223>合成寡核苷酸<400〉3ttttttttgatatcaagcttccatttttcttttgcataattc42<210〉4<211>47<212>DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉合成寡核苷酸<400〉4gcatcggccatggtgagtcttctgcaatcaaaaacataaagatctga47<210〉5<211>40<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉合成寡核苷酸<400〉5tttt,ttttta.agcttgatatcacaacca,aatgtcaaa.tgg40<210〉6<211〉26<212〉廳<213〉人工序列<220〉<223〉合成寡核苷酸<400〉6ccatctgccatggtctatatcctgtc26<210>7<211>37<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉合成寡核苷酸<400〉7tttttttttaagcttgatalcggaagtttctctcttg37<210〉8<211>33<212>醒<213〉人工序列<220〉<223>合成寡核苷酸<400〉8ct,tttcccatggtagatctctggtcaacaaatc33〈210>9<211〉1219<212>腿<213〉A(chǔ)rabidopsisThaliana<400〉9caactatttttatgt,atgcaagagtcagcatatgtataa,ttgattcagaatcgttttgac60gagttcggatgtagtagtagccattatttaatgtacatactaatcgtgaatagtgatatg120at.gaaaca.ttgtatcttattgtataaata.tccataaa.cacatcatgaa鄰acact,ttctt180tcacggtctgaattaa.ttatgata,caattctaat,agaaaacgaattaaattacgttgaat240tgtatgaaatctaat,tgaacaagccaaccacgacgacgact,aacgttgcctggattgact300cggtttaagttaaccactaaaaaaacggagctgtcatgtaacacgcggatcgagcaggtc360acagtcatgaagccatcaaagcaaaagaactaatccaagggctgagatgattaattagtt420taaaaattagttaacacgagggaaaaggctgtctgacagccaggtcacgttatctttacc480tgtggtcgaaatgat,tcgtgtctgtcgattttaattattttt,ttgaaaggccgaaaataa540agttgtaagagataaacccgcctatataaattcatat.attttcctctccgctttgaattg600tctcgttgtcctcctcactttcatcagccgttttgaatctccggcgacttgacagagaag660aacaaggaagaagactaagagagaaagtaagagataatccaggagattcattctccgttt720tgaatcttcctcaatctcatcttcttccgctctttctttccaaggtaataggaactttct780ggatctactttatttgctggatctcgatcttgttttctcaatttccttgagatctggaat840tcgtttaatttggatctgtgaacctccactaaatcttttggttttactagaatcgatcta900agttgaccgatcagttagctcgattatagctaccagaatttggcttgaccttgatggaga960gatccatgtt,catgttacctgggaaatgat,ttgtatatgtgaattgaaatctgaactgtt1020ga.agtt.agattgaatctgaacactgtcaatgttagattgaatctgaacactgttta,agtt1080agatgaagtttgtgta.tagattcttcgaaactttaggatttgtagtgtcgtacgttgaac1140agaaagcta,t,ttctgattcaatcagggtttatttgactgtattgaactctttttgtgtgt1200tt,gca.gcagactcaccatg1219<210>10〈211〉1271〈212〉DNA〈213>ArabidopsisThaliana<220><221〉niisc_feature<222〉(535)..(536)<223〉y=c或t/u<220><221〉misc—feature〈222〉(561),.(561)〈223>y=c或t,/u<400>10ccatttttcttttgcataattgtcttctgaaaataatcat肌ataactgtacccttttcaataaacaatccaaaacacgacttgaaaattagaagaaaaagctgtcatatatgtcgaccctcatgtttatttttttatttttttcatcttgcataa.tt,ca60tgggtctactacattct.cctgacattacgtttt,atgtgtt120caaaatatttcaggacttgtttacgttt,tcaggagaaaaa180atatagaaataacatttgtagaaatcgtggattttcctta240ccaccgttgtctcctcgactcggtaacacccgatcgccga300tgaaaagaataataaaaaaaaaaaaggaatgatgattgaa360tatcacagt,caatccaatagcctatattcgccaactgata420tatccaacggctcacaaattttcacaaacttttcaa.aaaagtataataaaagaggctgtc480tgacagccatgtcacgttatactttttccgtatgatcgaaatgattcgtctttgyygaat540ttaattatttccaaaattgaygactctaaagaaaaaeiaaatagtttttcagataaacccg600cctatataaatagttcaacactcggtttatttcttctcccctcaaagaattgcctcgtcg660tcttcagcttcatcggccgttgcatttcccggcgataagagagagaaagaggagaaagag720tgagccagtt,cttcatcgtcgtggttcttgtttcttcctcgatctctcgatcttctgctt780t,tgcttt,tccgattaaggtaattaaaacctccgatctacttgttcttgtgttggatctcg840attacgatttctaag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tttgtgtatagattcttcgaaactttaggaatttctgattcaatcagggttta.tttgactcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgc420cccacccacgaggagcatcgtggaaaaaga480ggattgatgtgatatcaagcttcaactatt540attga/ttcagaatcgttttgacgagttcgg600actaatcgtgaatagtgatatgatgaaaca660acatcatgaaagacactttctttcacggtc720aacgaatt,aaattacgttgaattgtatgaa780actaacgttgcctggattgactcggtttaa840taacacgcggatcgagcaggtcacagtcat900gggctgagatgattaattagtttaaaaatt960gccaggtcacgttatctttacctgtggtcg1020ttttttgaaa,ggccgaaaataaagttgtaa1080ttttcctctccgct,ttgaatt,gtctcgttg1140ctccggcgacttgacagagaagaacaagga1200ccaggagattcattctccgttttgaatctt1260tccaaggtaataggaactttctggatctac1320caatttccttgagatctggaattcgtttaa1380tggtt,ttactagaatcgatctaagttgacc1440tttggcttgaccttgatggagaga.tccatg1500gtgaattgaaatctgaactgttgaagttag1560gaatctgaacactgtttaagttaga/tgaag1620tttgtagtgtcgtacgttgaacagaaagct1680gtatt,gaactctttttgtgtgtttgcagca1740174權(quán)利要求1.一種DNA構(gòu)建物，其包含Act7、Act3、Act12、Act1a、Act1b、EF1α、Act2、Act8或Act11啟動(dòng)子的至少一個(gè)順式元件。2.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中所述Act7、Act3、Actl2、Actla、Actlb、EFla、Act2、Act8或Actll啟動(dòng)子的至少一個(gè)順式元件包含增強(qiáng)子。3.權(quán)利要求1或2的DNA構(gòu)建物，其包含SEQIDNO:25、24、26、22、23、12、9、10或11。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物，其進(jìn)一步包含結(jié)構(gòu)DNA序列，其中所述結(jié)構(gòu)DNA序列有效連接順式元件和3，未翻譯區(qū)。5.權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建物，其中結(jié)構(gòu)DNA序列編碼除草劑耐性蛋白。6.權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建物，其中結(jié)構(gòu)DNA序列編碼草甘膦耐性蛋白。7.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中所述草甘膦耐性蛋白是草甘膦氧化還原酶(GOX)蛋白或5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白。8.權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建物，其中所述草甘膦耐性蛋白是am4:CP4EPSPS。9.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中編碼草甘膦耐性蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列進(jìn)一步有效連接編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)的結(jié)構(gòu)DNA序列。10.權(quán)利要求9的DNA構(gòu)建物，其中葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽是擬南芥的CTP2。11.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中編碼草甘膦耐性蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列進(jìn)一步有效連接轉(zhuǎn)錄終止序列。12.權(quán)利要求11的DNA構(gòu)建物，其中轉(zhuǎn)錄終止序列是E9。13.權(quán)利要求4的DNA構(gòu)建物，其中結(jié)構(gòu)DNA序列是蘇云金芽孢桿菌昆蟲防制基因。14.轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求l-13任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物。15.多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求l-13任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物。16.—種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括由權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或權(quán)利要求15的多個(gè)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述DNA構(gòu)建物。17.權(quán)利要求16的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物還具有營養(yǎng)性和生殖性草甘膦耐性。18.權(quán)利要求17的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物能夠耐受暴露于高達(dá)每4000平方米7248克的草甘膦。19.權(quán)利要求17的方法，其中轉(zhuǎn)基因植物能夠耐受暴露于每4000平方米453-1812克的草甘膦。20.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是單子葉作物。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述單子葉作物是大麥、玉米、水稻、黑麥、高梁或小麥。22.權(quán)利要求16-19任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉作物。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述雙子葉作物是苜蓿、番茄、大豆、棉花、canola或向日葵。24.—種在植物中表達(dá)結(jié)構(gòu)DNA序列的方法，該方法包括(1)提供權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物；(2)將所述DNA構(gòu)建物引入才直物細(xì)胞；和(3)使所述植物細(xì)胞再生而產(chǎn)生植林，使得所述結(jié)構(gòu)DNA序列在所述植抹中可表達(dá)。25.—種防除雜草的方法，該方法包括(1)提供用權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的作物；和(2)對(duì)所述作物施用足量草甘膦以防除雜草而不損害所述作物。26.—種農(nóng)學(xué)上有用的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品是從包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因才直物加工得到的，其中所述產(chǎn)品包含所述DNA構(gòu)建物。27.權(quán)利要求26的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是食品。28.權(quán)利要求26的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是玉米或大豆粗粉。29.權(quán)利要求26的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是皮棉。30.權(quán)利要求26的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是營養(yǎng)物。31.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物中的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述DNA構(gòu)建物。32.—種制備轉(zhuǎn)基因草甘膦耐性植物的方法，其包括(a)使轉(zhuǎn)基因植物與另一植物雜交，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物；(b)獲得來源于步驟(l)的雜交的至少一個(gè)子代植物；(c)選擇草甘膦耐性子代，其中所述子代包含所述DNA構(gòu)建物，并且是轉(zhuǎn)基因草甘膦耐性植物。33.權(quán)利要求32的方法，其中步驟(c)包括用草甘膦噴灑子代。34.權(quán)利要求32的方法，其中步驟(c)包括用雜交或擴(kuò)增方法檢測所述DNA構(gòu)建物。35.—種生長轉(zhuǎn)基因草甘膦耐性植物的方法，其包括(1)種植至少一種種子，其中所述種子包含權(quán)利要求l-12任一項(xiàng)的DNA構(gòu)建物；并(2)使所述種子長成植物，由此生長轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述DNA構(gòu)建物，并且是草甘膦耐性植物。全文摘要本發(fā)明涉及新型植物表達(dá)構(gòu)建物。更具體地說，本發(fā)明提供了包含5’調(diào)節(jié)序列以調(diào)節(jié)有效連接的基因在植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建物。文檔編號(hào)A01H5/00GK101353669SQ200810212530公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2000年12月12日優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日發(fā)明者J·Q·威爾金森,K·L·芬徹,S·輔拉辛斯基申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司