專利名稱：：一種用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法，該方法可用于對發(fā)光光狀桿菌進(jìn)行基因修飾。
背景技術(shù)：
：光狀桿菌屬;/^w/za6c^與異小桿屬/^e/wtoAto線蟲共生，共生菌寄生于線蟲腸道內(nèi)，線蟲攜帶共生菌進(jìn)入寄主昆蟲體內(nèi)，并將共生菌釋放到昆蟲血腔中，共生菌在昆蟲血腔中繁殖，產(chǎn)生殺蟲毒素，在48h內(nèi)將寄主昆蟲殺死，并能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，抑制其他雜菌的污染。共生菌抑菌譜廣，已報道共生菌對多種細(xì)菌、真菌、酵母菌等(包括植物病原菌、人的病原菌)起抑制作用。發(fā)光光狀桿菌屬p/wto^w6c/^已成為當(dāng)前研究熱點，有關(guān)發(fā)光光狀桿菌的基因改良及修飾使其具有更好殺蟲效果的研究成為科學(xué)家們主攻方向。一種基于Wl筮菌體red/ET重組酶的重組方法已應(yīng)用于大腸桿菌基因工程研究，但從未應(yīng)用于發(fā)光光狀桿菌中。Red重組系統(tǒng)由三種蛋白組成Exo蛋白是一種核酸外切酶，結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從5'端向3'端降解DNA，產(chǎn)生3'突出端；Beta蛋白結(jié)合在單鏈DNA上，介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火；Gam蛋白可與RecBCD酶結(jié)合，抑制其降解外源DNA的活性。因此本發(fā)明旨在發(fā)明一種用于發(fā)光光狀桿菌p^/o^a6dfw/1/m/"e"em的Red/ET重組方法，便于科學(xué)家們對發(fā)光光狀桿菌基因的改良及修飾進(jìn)行研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法，該方法具有同源序列短(40-60bp)、重組效率高和操作簡單的特點。這種技術(shù)可在DNA靶標(biāo)分子的任意位點進(jìn)行基因敲除、敲入、點突變等操作，無需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法如下所需材料為菌種和載體/7/wfw^aM附/wm'"^ce"sDSM15138:購自德國生物材料資源中'LV(艮卩theGermanResourceCentreforBiologicalMaterial,DSMZwww.dsmz.de)?！?co//YZ2005、pSC101-705-flp-cmr，pSC101-BAD-a卩yA購自德國genebrigdes公司(www.genebi.igdes.com)。pASK-IBA購自IBAGmbH(http:〃www.iba-go.de)。￡co//YZ2005，pSC101-BAD-apyA和Red/ET試劑盒購自德國genebrigdes公司(www.genebrigdes.com)，pASK-IBA購自IBAGmbH。pASK陽a卩丫A由本發(fā)明獲得，其特性見表2，用于發(fā)光光狀桿菌red/ET重組。工具酶RNaseA、ProteinaseK、限制性內(nèi)切酶購自NewEnglandBiolabs公司。Taqpolymerase購自Eppendorf公司。試劑盒PCR純化試劑盒購自Inviteck公司，小量、中量及大量提取質(zhì)粒試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。用于質(zhì)粒構(gòu)建的Red/ET試劑盒由德國genebrigdes公司(www.genebrigdes.com)提供.抗體抗Red0的polyclonal抗體和Antirabbitantibody-HRP為QIAGEN公司所提供。其它試劑Na0H,NaCl，HC1，酒精，甘氨酸SDS，硼酸，HEPES，考馬斯亮藍(lán)G250，EDTA，甘油，30%丙烯酰胺/亞甲雙丙烯酰胺溶液為MERCK試劑；二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DSM0)，Trisbase,抗生素，DTT，TEMED，溴酚藍(lán)，二甲苯青，牛白蛋白，(L+)阿拉伯糖(99%)，酚氯仿為Sigma試劑；瓊脂粉，酵母提取物，蛋白胨，異丙醇，甲醇，Tween20為VWRProlabo試劑；硝酸纖維素膜購于Schleicher&Schue11。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購于NewEnglandBiolabs公司。dNTPMix購于Promega公司；過硫酸銨為Bio-rad試劑；瓊脂糖為Invitrogen試劑。1)用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組質(zhì)粒pASK-a^A構(gòu)建過程如下A、帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物a計A的獲得以pSC101-BAD-a卩yA質(zhì)粒DNA為模板，以pl(5，GATAGAGAAAAGTGAAATGAATAGTTCGACAAAAATCTAGCAGGAGGAATTCACCATGGATATTAATACTGAAACTGAG'3(帶下劃線的堿基為同源臂))禾QP2(AATGTGCGCCATTTTTCACTTCACAGGTCAAGCTTCTCGAGATCCTAGCTTAAAAATCTTCGTTAGTTTCTGC(帶下劃線的堿基為同源臂))為引物，按50[xl反應(yīng)體系(38|alddH20;2.0^5mMdNTP;5.0nllOxTaqbuffer;1.5lil50pmo1/1引物上游；1.5pl50pmo1/1引物下游；1.0^lOOng/pl模板；1.0WlU/|alTaqpolymarase)及反應(yīng)程序(95'C預(yù)變性3min;32個循環(huán)95°C變性45sec，52'C退火55sec，72。C延伸3min;最后72。C延伸10min)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物apYA;B、重組質(zhì)粒pASK-al^A的構(gòu)建將30nl過夜菌￡.co/iYZ2005接種于1.4mlLB，37°C振搖2h;采用電轉(zhuǎn)的方法(1200V/cm)將帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物apYA和被NcoI酶切的pASK-IBA共轉(zhuǎn)化入￡co//YZ2005中；37'C恢復(fù)培養(yǎng)lh;將其鋪在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37。C過夜培養(yǎng)；從過夜培養(yǎng)的含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板挑單克隆，；將克隆接種于1.8ml含有100pg/ml氨芐青霉素的LB中，振搖過夜；制備質(zhì)粒DNAl-10pg，溶于2(HilddH20，取4pl質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切鑒定；挑出正確克隆制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，結(jié)果表明所得重組質(zhì)粒pASK-ap丫A正確無誤。2)利用red/ET重組方法在p/wtoAa6^^/wm/"e;yce,wDSM15138中將cmr基因替換染色體DNA上的cipB基因方法如下A、帶cipB同源臂cmr基因(40—60bp)的引物的合成P3:5，TATTCTACAGAATATTTTTTCAAACACTCATTTAGAAATTTAACAAATAATTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC3，(帶下劃線的堿基為同源臂)；p4:5，AAGTTATTTATCAATTGGTTAGATTAAAATTTGGAGTTTATGTTGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC3,(帶下戈'J線的堿基為同源臂)。B、帶cipB同源臂cn^基因PCR產(chǎn)物的獲得以質(zhì)粒pSC101-705-flp-cmfDNA為模板，以p3和p4為引物，按50pl反應(yīng)體系(38nlddH20;2.0pl5mMdNTP;5.0nl10xTaqbuffer;1.5^150pmol/1引物上游；1.5nl50pmol/1引物下游；1.0^lOOng/pl模板；1.0^lU/plTaqpolymarase)及反應(yīng)程序(95。C預(yù)變性3min;32個循環(huán)95。C變性45sec，52。C退火45sec，72。C延伸1min20sec;最后72。C延伸10min)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶cipB同源臂的cmr基因。C、將red/ET重組質(zhì)粒pASK-apyA導(dǎo)入//wtoWa6fi^/w卵'"e;yceraDSM15138中1)將30^1新鮮過夜培養(yǎng)p/Wwtok/z^/w脂'weyce"sDSM15138接種于1.4mlLB中，30°C，1050rpm下振搖培養(yǎng)3h;2)感受態(tài)細(xì)胞的制備將1.4ml菌液冰浴5min;4'C，ll，OOOrpm下離心0.5min，棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10%甘油+2mMHEPES重懸菌體；4°C，11,400rpm下離心0.5min，棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10%甘油+2mMHEPES重懸菌體；4°C，12,000rpm下離心0.5min，棄上清，留約50pl于Ep管中；加入1pl質(zhì)粒DNA(pASK-c^A)，混勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；3)采用電轉(zhuǎn)的方法(1100V/cm)將pASK.-apYA轉(zhuǎn)化入//^wtoMw,y/膽,:wescDSM15138中；4)3(TC恢復(fù)培養(yǎng)1h;5)將其鋪在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板上，30。C培養(yǎng)過夜；6)限制性酶切和Westernblotting對克隆子進(jìn)行鑒定(結(jié)果見圖3)。D、將40pl過夜菌含有pASK-a卩yA的；/w,07^a6fl^/w脂'we:ycemDSM15138接種于1.4ml含有100pg/ml氨芐青霉素的LB中，30'C振搖培養(yǎng)2h。E、力[J2pl2mg/mlAHT，30。C誘導(dǎo)60min。F、采用電轉(zhuǎn)的方法(1100V/cm)將帶cipB同源臂的cmfPCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入含有pASK-aP丫A的//20tor/^Mtw/wm/wescms'DSM15138中。G、，3(TC恢復(fù)培養(yǎng)lh。H、將其鋪在含有15ng/ml氯霉素的LB平板上，3(TC過夜培養(yǎng)(Red/ET重組效率見表l)。I、42'C下熱激去除質(zhì)粒pASK-a卩yA1)將40^1過夜菌含有pASK-ap丫A的//wtor^Mz^/w脂7je;ce"sDSM15138接種于1.0ml含有15pg/ml氯霉素的LB平板上，42'C下振搖培養(yǎng)過夜。2)30'C下恢復(fù)培養(yǎng)lh。3)將其鋪在含有15嗎/ml氯霉素的LB平板上，30。C下培養(yǎng)過夜。4)從含有15pg/ml氯霉素的LB平板上挑單克隆分別在含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板及含有15pg/ml氯霉素的LB平板上進(jìn)行雙劃線。5)將在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板不長，但能在含有15|ag/ml氯霉素的LB平板上生長的菌落接種于l.Oml含有15ng/ml氯霉素的LB中，3(TC下振搖培養(yǎng)過夜。6)用EcoRI進(jìn)行限制性酶切，結(jié)果表明質(zhì)粒pASK-aPyA己去除。J、對敲除cipB基因的突變型；/zotor/wMw;y/w脂力eycera進(jìn)行鑒定1)克隆PCR對突變株的鑒定以5'TCAAACTAAATCAGGTTATTCTACAG3，和5'TACAATTTCATATAGGCAAGATGAATGG3'為引物，反應(yīng)程序為預(yù)變性，95'C下3min;32個循環(huán)(95。C下變性45sec，52。C下退火45sec，72。C下延伸1min10sec);最后72'C下延伸10min。按附錄五操作步驟進(jìn)行克隆PCR，獲得PCR產(chǎn)物，取5plPCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4A。2)SDS-PAGE電泳鑒定移取過夜培養(yǎng)菌于新的1.5ml管中，最高速離心lmin收集細(xì)胞；加50^1去離子水重懸細(xì)胞；加50|al2xSDSLoadingbuffer;取5pl樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4B。本發(fā)明建立的red/ET重組方法，雖然重組效率較在大腸桿菌中的Red/ET重組低，但這大大拓寬了Red重組技術(shù)的應(yīng)用范圍，使之成為基因敲除和插入的有力工具，與現(xiàn)有其它重組方法相比具備以下特點1、Red同源重組技術(shù)與其它基因操作方法相比具有同源序列短(40-60bp)、重組效率高和快捷方便的特點。2、這種技術(shù)可在DNA靶標(biāo)分子的任意位點進(jìn)行基因敲除、敲入、點突變等操作，無需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。3、這種新型重組技術(shù)可直接將目的基因克隆于載體上，目的基因既可來源于細(xì)菌人工染色體也可是基因組DNA。圖l為pASK-aPyA質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。圖2為采用本發(fā)明所創(chuàng)造的red/ET重組方法在；/wtoWzaW^/w脂'weyceraDSM15138中將cmr基因替換了染色體DNA上的cipB基因流程圖。圖3為含有質(zhì)粒pASK-a卩yA的/^otoA"^^/wm/"^ceraDSM15138酶切鑒定圖(a)及Westernblotting對退火蛋白re鄰鑒定圖(b);其中(a)M:lkbladderDNAmarker;泳道1:陽性對照(質(zhì)粒pASK-a^ADNA);泳道2-6:5個含有質(zhì)粒pASK國a卩yA的^//oto^w6^s/"柳7MceraDSM15138克隆質(zhì)粒DNA;(b)M:蛋白質(zhì)marker;泳道1，2，3，4，5:未經(jīng)誘導(dǎo)的克隆l，2，3,4，5;泳道ll,21，31，41，51:經(jīng)誘導(dǎo)的克隆12345。圖4為野生型和敲除了cipB基因的突變型/^oto^aWws/wmz'"^cmyDSM15138克隆PCR產(chǎn)物鑒定圖(a)、SDS—PAGE鑒定圖(b)和Red/ET重組示意圖(c);注(a)M:lkbladderDNAmarker,泳道l:未敲除cipB基因的野生型j^o/w/^M^/ww/"McemDSM15138克隆PCR產(chǎn)物，泳道2-7:敲除cipB基因的突變型i5/wm'"Mcem克隆PCR產(chǎn)物；(b)l:cipB基因；2:帶cipB同源臂cmr基因；ha:同源臂；(c)M:蛋白Marker;泳道1,2:野生型;/otor/w6t/船/w脂'"escemDSM15138;泳道3-12:突變型;/zWw/z淑z^/謹(jǐn).臘c謹(jǐn)。具體實施例方式一種用于發(fā)光光狀桿菌中的red/ET重組方法具體實施方式如下1材料1.1菌種和載體p/wtoAaZ^M/w,w77^cmsDSM15138:購自德國生物材料資源中心(艮卩theGermanResourceCentreforBiologicalMaterial,DSMZwww.dsmz.de)。YZ2005、pSC101-705-flp-cmr，pSC101-BAD-a卩yA購自德國genebrigdes公司(www.genebrigdes.com)。pASK-IBA購自IBAGmbH(http:〃www.iba-go.de)?！?co"YZ2005,pSC101-BAD-a卩丫A和Red/ET試劑盒購自德國genebrigdes公司(www.genebrigdes.com)，pASK-IBA購自IBAGmbH。pASK-apyA由本發(fā)明獲得，其特性見表2，用于發(fā)光光狀桿菌red/ET重組。1.2工具酶RNaseA、ProteinaseK、限制性內(nèi)切酶購自NewEnglandBiolabs公司。Taqpolymerase購自Eppendorf公司。1.3試劑盒PCR純化試劑盒購自Inviteck公司，小量、中量及大量提取質(zhì)粒試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。用于質(zhì)粒構(gòu)建的Red/ET試劑盒由德國genebrigdes公司(www.genebrigdes.com展供。1.4抗體抗Re鄰的polyclonal抗體和Antirabbitantibody-HRP為QIAGEN公司所提供。1.5其它試劑NaOH，NaCl，HC1，酒精，甘氨酸SDS，硼酸，HEPES，考馬斯亮藍(lán)G250，EDTA，甘油，30%丙烯酰胺/亞甲雙丙烯酰胺溶液為MERCK試劑；二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DSMO)，Trisbase,抗生素，DTT，TEMED，溴酚藍(lán)，二甲苯青，牛白蛋白，(L+)阿拉伯糖(99%)，酚氯仿為Sigma試劑；瓊脂粉，酵母提取物，蛋白胨，異丙醇，甲醇，Tween20為VWRProlabo試劑；硝酸纖維素膜購于Schleicher&Schue11。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購于NewEnglandBiolabs公司。dNTPMix購于Promega公司；過硫酸銨為Bio-md試劑；瓊脂糖為Invitrogen試劑。2方法2.1根據(jù)圖1操作流程所示用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組質(zhì)粒pASK-a^A構(gòu)建具體實施方法如下A、帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物apYA的獲得以pSC101-BAD-a(^A質(zhì)粒DNA為模板，以帶ASK同源臂引物pi(5，GATAGAGAAAAGTGAAATGAATAGTTCGACAAAAATCTAGCAGGAGGAATTCACCATGGATATTAATACTGAAACTGAG'3(帶下劃線的堿基為同源臂))和P2(AATGTGCGCCA丁TTTTCACTTCACAGGTCAAGCTTCTCGAGATCCTAGCTTAAAAATCTTCGTTAGTTTCTGC(帶下劃線的堿基為同源臂))為引物，按50nl反應(yīng)體系(38HlddH20;2.0nl5mMdNTP;5.0|al10xTaqbuffer;1.5pi50pmol/1引物上游；1.5pi50pmol/1引物下游；1.0^100ng/pl模板；1.0^lU/plTaqpolymarase)及反應(yīng)程序(95。C預(yù)變性3min;32個循環(huán)95。C變性45sec,52'C退火55sec，72'C延伸3min;最后72。C延伸10min)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物apYA。B、重組質(zhì)粒pASK-aPYA的構(gòu)建將30pl過夜菌五.co//YZ2005接種于1.4mlLB，37。C振搖2h;采用電轉(zhuǎn)的方法(1200V/cm)將帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物a|^A和被NcoI酶切的pASK-IBA共轉(zhuǎn)化入￡.co/fYZ2005中；37'C恢復(fù)培養(yǎng)lh;將其鋪在含有100^ig/ml氨芐青霉素的LB平板上，37'C過夜培養(yǎng)；從過夜培養(yǎng)的含有100ng/ml氨芐青霉素的LB平板挑單克隆,；將這些重組克隆接種于1.8ml含有100jig/ml氨芐青霉素的LB中，振搖過夜；少量制備質(zhì)粒DNA,溶于2(^lddH20，取4nl質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切鑒定；挑出正確克隆制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序，結(jié)果表明所得重組質(zhì)粒pASK-apYA正確無誤。2.2用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法如下A、合成帶需修飾基因同源臂(40-60bp)的引物；B、PCR擴(kuò)增獲得帶需修飾基因同源臂打靶基因；C、將red/ET重組質(zhì)粒pASK-a^A導(dǎo)入；/otor/^6c/M/w/w'"eycera中(具體操作如下將30|xl新鮮過夜培養(yǎng)//2^w/w6^w/ww!'"escera接種于1.4mlLB中，30°C，1050rpm下振搖培養(yǎng)3h。2)感受態(tài)細(xì)胞的制備將1.4ml菌液冰浴5min;4°C，11,000rpm下離心0.5min,棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10%甘油+2mMHEPES重懸菌體；4°C，11,400rpm下離心0.5min，棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10%甘油+2mMHEPES重懸菌體；4°C，12,000rpm下離心0.5min，棄上清，留約50pi于Ep管中；加入1pi質(zhì)粒DNA(pASK-a(3YA)，混勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中。3)采用電轉(zhuǎn)的方法(1100V/cm)將pASK隱a卩yA轉(zhuǎn)化入/7/20to^flk^y/w^"^cem中。4)30。C恢復(fù)培養(yǎng)lh。5)將其鋪在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板上，30°C培養(yǎng)過夜)；D、將40^1過夜菌含有pASK-a卩yA的/7/zotor/w6fl^/w/m'"wcera接種于1.4ml含有l(wèi)OOpg/ml氨芐青霉素的LB中，3(TC下振搖培養(yǎng)2h;E、力口2ial2mg/mlAHT(anhydrotetracycline，脫水四環(huán)素)，30。C下誘導(dǎo)60min;F、采用電轉(zhuǎn)的方法(1100V/cm)將帶需修飾基因同源臂的打靶基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入含有pASK-a卩yA的p/zoto/^a6Aw/w脂'"escera中；G、3(TC下恢復(fù)培養(yǎng)lh;H、將其鋪在選擇性LB平板上，3(TC下過夜培養(yǎng)；I、42'C熱激去除質(zhì)粒pASK-a卩YA;J、對所得克隆進(jìn)行鑒定。根據(jù)以上方法按圖2所示操作流程應(yīng)用red/ET重組方法在/"附Z"Mce"sDSM15138中將cmf基因替換染色體DNA上的cipB基因的具體實施方法如下A、合成帶cipB同源臂cmr基因的引物p3(5TATTCTACAGAATATTTTTTCAAACACTCATTTAGAAATTTAACAAATAATTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC3'(帶下戈機(jī)的堿基為同源臂))和p4(5，AAGTTATTTATCAATTGGTTAGATTAAAATTTGGAGTTTATGTTGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC3'(帶下劃線的堿基為同源臂))。B、帶cipB同源臂cmr基因PCR產(chǎn)物的獲得以質(zhì)粒pSC101-705-flp-cmfDNA為模板，以為pl，p2引物，按50pl反應(yīng)體系(38ddH20;2.0pl5mMdNTP;5.0pl10xTaqbuffer;1.5pl50pmol/1引物上游；1.5W50pmo1/1引物下游；1.0^1100ng4U模板；l.O^illU/plTaqpoly靈ase)及反應(yīng)程序(95'C預(yù)變性3min;32個循環(huán):95"C變性45sec，52。C退火45sec，72。C延伸1min20sec;最后72。C延伸10min)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶cipB同源臂的cmr基因。C、將red/ET重組質(zhì)粒pASK陽apyA導(dǎo)入;/zoto^za6^s/ww/"^ce/wDSM15138中1)將30!丄1新鮮過夜培養(yǎng)p/wtor/^6cky/w脂'"^cemDSM15138接種于1.4mlLB中，30°C，1050rpm下振搖培養(yǎng)3h;2)感受態(tài)細(xì)胞的制備將1.4ml菌液冰浴5min;4°C，11,000rpm下離心0.5min，棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10%甘油+2mMHEPES重懸菌體；4°C，11，400rpm下離心0.5min,棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10%甘油+2mMHEPES重懸菌體；4°C，12,000rpm下離心0.5min,棄上清，留約50pl于Ep管中；加入lpl質(zhì)粒DNA(pASK-api'A)，混勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；3)采用電轉(zhuǎn)的方法(1100V/cm)將pASK-a卩丫A轉(zhuǎn)化入i/zotor/wk^f/w/m'we"eraDSM15138中；4)3(TC恢復(fù)培養(yǎng)1h;5)將其鋪在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板上，3(TC培養(yǎng)過夜；6)酶切鑒定和Westernblotting對克隆子進(jìn)行鑒定(結(jié)果見圖3)。D、將40pl含有pASK-apyA的/j/zotoM"6^s/ww/"e,yceraDSM15138過夜菌接種于1.4ml含有100ng/ml氨芐青霉素的LB中，3(TC振搖培養(yǎng)2h。E、力Q2(il2mg/mlAHT，3(TC誘導(dǎo)60min。F、采用電轉(zhuǎn)的方法Ul00V/cm)將帶cipB同源臂的cmrPCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入含有pASK-aP丫A的j9/wton^6t/附/,/"e"em、DSM15138中。G、30'C恢復(fù)培養(yǎng)lh。H、將其鋪在含有15pg/ml氯霉素的LB平板上，30'C過夜培養(yǎng)(Red/ET重組效率見表l)。I、42。C下熱激去除質(zhì)粒pASK-o^A1)將40^1過夜菌含有pASK隱apyA的；/w/wto6fi附/wm'"e化eraDSM15138接種于1.0ml含有15pg/ml氯霉素的LB平板上，42'C下振搖培養(yǎng)過夜。2)30。C下恢復(fù)培養(yǎng)lh。3)將其鋪在含有15(xg/ml氯霉素的LB平板上，3(TC下培養(yǎng)過夜。4)從含有15pg/ml氯霉素的LB平板上挑單克隆分別在含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板及含有15pg/ml氯霉素的LB平板上進(jìn)行雙劃線。5)將在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB平板不長，但能在含有15^ig/ml氯霉素的LB平板上生長的菌落接種于1.0ml含有15pg/ml氯霉素的LB中，3(TC下振搖培養(yǎng)過夜。6)用EcoRI進(jìn)行限制性酶切，結(jié)果表明質(zhì)粒pASK-a^A已去除。J、對敲除cipB基因的突變型；/wtor;w6^s/ww/""cera進(jìn)行鑒定1)克隆PCR對突變株的鑒定以5'TCAAACTAAATCAGGTTATTCTACAG3，和5'TACAATTTCATATAGGCAAGATGAATGG3'為引物，反應(yīng)程序為預(yù)變性，95'C下3min;32個循環(huán)(95。C下變性45sec，52"C下退火45sec，72。C下延伸1min10sec);最后72"C下延伸10min。按附錄五操作步驟進(jìn)行克隆PCR，獲得PCR產(chǎn)物，取5filPCR產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4A。2)SDS-PAGE電泳鑒定移取100pl過夜培養(yǎng)菌于新的1.5ml管中，最高速離心lmin收集細(xì)胞；加50|iil去離子水重懸細(xì)胞；加50(il2xSDSLoadingbuffer;取5pl樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4B。表l;/zWw/w6iiky/wwmesrewDSM15138red/ET重組效率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組質(zhì)粒pASK-a^A構(gòu)成元件及其作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>Reda此基因編碼的蛋白是一種核酸外切酶，單亞基的分子量為24kD，這種蛋白的活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子，中間有一中空的通道,通道的一端可容納雙鏈DNA分子，另一端只可容納單鏈DNA,結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從5'端向3'端降解DNA，產(chǎn)生3突出端。Re鄰此基因編碼的蛋白是一種退火酶，單亞基的分子量為25.8kD在溶液中，Beta蛋白自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),緊緊地結(jié)合在單鏈DNA3'突出端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，同時介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火，雙鏈DNA退火完成后，Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來。Beta蛋白在Red同源重組過程中起著決定性的作用。RedY此基因編碼的蛋白為16kD的多肽分子，可與RecBCD酶結(jié)合，抑制其降解外源DNA的活性。RecA此基因編碼的蛋白分子量約42kD,可促使單鏈DNA侵入雙鏈DNA中。Apr氨芐青霉素抗性基因，一種篩選標(biāo)記。ori原核復(fù)制起始子。權(quán)利要求1、一種用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法，它包括下列步驟A、用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組質(zhì)粒pASK-αβγA構(gòu)建a、帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物αβγA的獲得，以pSC101-BAD-αβγA質(zhì)粒DNA為模板，以p1、p2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物αβγA；p15’GAIAGAGAAAAGTGAAATGAAIAGTTCGACAAAAATCTAGCAGGAGGAATTCACCATGGATATTAATACTGAAACTGAG’3；P2AATGTGCGCCATTTTTCACTTCACAGGTCAAGCTTCTCGAGATCCTAGCTTAAAAATCTTCGTTAGTTTCTGC；b、重組質(zhì)粒pASK-αβγA的構(gòu)建，將30μl過夜菌E.coliYZ2005接種于1.4mlLB，振搖2h，采用電轉(zhuǎn)的方法將帶ASK同源臂的PCR產(chǎn)物αβγA和被NcoI酶切pASK-IBA共轉(zhuǎn)化入E.coliYZ2005中，恢復(fù)培養(yǎng)1h；將其鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，從過夜培養(yǎng)的含有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板挑單克隆，將重組克隆接種于1.8ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中，振搖過夜，制備質(zhì)粒DNA，溶于20μlddH2O，取4μl質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切鑒定；挑出克隆制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序；B、利用red/ET重組方法在photorhabdusluminescensDSM15138中將cmr基因替換染色體DNA上的cipB基因a、帶cipB同源臂cmr基因的引物的合成P35’TATTCTACAGAATATTTTTTCAAACACTCATTTAGAAATTTAACAAATAATTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC3’；p45’AAGTTATTTATCAATTGGTTAGATTAAAATTTGGAGTTTATGTTGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC3’；b、帶cipB同源臂cmr基因PCR產(chǎn)物的獲得，以質(zhì)粒pSC101-705-flp-cmrDNA為模板，以p3和p4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得帶cipB同源臂的cmr基因；c、將red/ET重組質(zhì)粒pASK-αβγA導(dǎo)入photorhabdusluminescensDSM15138中，首先將30μl新鮮過夜培養(yǎng)photorhabdusluminescensDSM15138接種于1.4mlLB中，30℃，1050rpm下振搖培養(yǎng)3h；第二是感受態(tài)細(xì)胞的制備將1.4ml菌液冰浴5min；4℃，11,000rpm下離心0.5min，棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10％甘油+2mMHEPES重懸菌體；4℃，11,400rpm下離心0.5min，棄上清；加入0.9ml預(yù)冷的10％甘油+2mMHEPES重懸菌體；4℃，12,000rpm下離心0.5min，棄上清，留50μl于Ep管中；加入1μl質(zhì)粒pASK-αβγA，混勻，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；第三是采用電轉(zhuǎn)的方法將pASK-αβγA轉(zhuǎn)化入photorhabdusluminescensDSM15138中，30℃恢復(fù)培養(yǎng)1h；第四是將其鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，30℃培養(yǎng)過夜；第五是限制性酶切和Westernblotting對克隆子進(jìn)行鑒定；d、將40μl過夜菌含有pASK-αβγA的photorhabdusluminescensDSM15138接種于1.4ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中，30℃振搖培養(yǎng)2h，加2μl2mg/mlAHT(anhydrotetracycline脫水四環(huán)素)，30℃誘導(dǎo)60min；e、采用電轉(zhuǎn)的方法將帶cipB同源臂的cmrPCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入含有pASK-αβγA的photorhabdusluminescensDSM15138中，30℃恢復(fù)培養(yǎng)1h，將其鋪在含有15μg/ml氯霉素的LB平板上，30℃過夜培養(yǎng)；f、42℃下熱激去除質(zhì)粒pASK-αβγA，對所得克隆進(jìn)行鑒定。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于發(fā)光光狀桿菌的red/ET重組方法，該重組質(zhì)粒pASK-αβγA構(gòu)建如下以含αβγA基因的質(zhì)粒為模板，以帶ASK同源臂為引物，通過PCR擴(kuò)增獲得帶同源臂的PCR產(chǎn)物αβγA，以pASK-IBA為載體，采用Red/ET重組構(gòu)建質(zhì)粒pASK-αβγA，對質(zhì)粒鑒定。該red/ET重組如下首先合成帶需修飾基因同源臂的引物；其次PCR擴(kuò)增獲得帶需修飾基因同源臂打靶基因；第三將red/ET重組質(zhì)粒pASK-αβγA導(dǎo)入photorhabdusluminescens中；第四將含有pASK-αβγA的photorhabdusluminescens過夜菌接種于LB中，培養(yǎng)；第五加脫水四環(huán)素誘導(dǎo)；第六將帶需修飾基因同源臂的打靶基因PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入pASK-αβγA中；最后是將其鋪在選擇性LB平板上，培養(yǎng)，去除質(zhì)粒pASK-αβγA。該方法同源序列短，重組效率高，快捷方便。文檔編號C12N15/09GK101173269SQ20071005358公開日2008年5月7日申請日期2007年10月18日優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日發(fā)明者印遇龍,唐志如,張友明,黃瑞林申請人:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所