豬圓環(huán)病毒2型探針?lè)謪^(qū)；5-豬繁殖與呼吸綜合征病毒探針?lè)謪^(qū)；6-豬瘟病毒探針?lè)?區(qū)；7-豬傳染性胃腸炎病毒探針?lè)謪^(qū)； 雜交說(shuō)明：P1 :探針固定陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控芯片點(diǎn)樣過(guò)程，芯片雜交前后都應(yīng)陽(yáng)性； P2 :雜交陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控芯片雜交過(guò)程，檢測(cè)任何樣品都應(yīng)陽(yáng)性； N:雜交陰性對(duì)照，檢測(cè)任何樣品都應(yīng)陰性； 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)?要求外，1號(hào)探針亮； 副豬嗜血桿菌基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)弦笸猓?號(hào)探 針殼； 豬肺炎支原體基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)弦笸猓?號(hào)探 針殼； 豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)弦笸猓?號(hào) 探針殼。
[0013] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)弦?外，5號(hào)探針殼。
[0014] 豬瘟病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)弦笸猓?號(hào)探針亮。
[0015] 豬傳染性胃腸炎病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針?lè)弦笸猓?7號(hào)探針殼。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于 實(shí)施例。
[0017] 實(shí)施例1，本發(fā)明是分別對(duì)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、gl撥嗜血桿菌和豬肺炎支 原體進(jìn)行培養(yǎng)，提取病原體基因組DNA;對(duì)豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟 病毒和豬傳染性胃腸炎病毒細(xì)胞增殖，提取病毒基因組。對(duì)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副 豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳 染性胃腸炎病毒的特異保守序列進(jìn)行克隆、測(cè)序分析，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了 7條寡核苷酸 探針，可與相應(yīng)病原體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性結(jié)合，PCR進(jìn)行基因組擴(kuò)增時(shí)，上游通用引物 5'端利用Cy3熒光色素進(jìn)行標(biāo)記，探針可與此產(chǎn)物在42°C下進(jìn)行雜交。根據(jù)熒光信號(hào)位 置、強(qiáng)度判斷雜交結(jié)果，以此來(lái)鑒定豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支 原體、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒。根據(jù) Genbank網(wǎng)站上公布的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán) 病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的全基因序列利用 PrimerPremier5.0 生物軟件設(shè)計(jì)PCR引物SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11、SEQIDNO. 12、SEQIDNO. 13、SEQIDNO. 14、SEQIDNO. 15、SEQIDN01.6、SEQIDNO. 17、SEQIDNO. 18、 SEQIDNO. 19、SEQIDNO. 20、SEQIDNO. 21、SEQIDNO. 22、SEQIDNO. 23、SEQIDNO. 24 和SEQIDNO. 25。同時(shí)，克隆基因序列，并進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)分析，利用fastPCR生物軟件設(shè)計(jì) 所述7條特異性寡核苷酸探針，SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQ IDNO. 5、SEQIDNO. 6和SEQIDNO. 7。通過(guò)這16條PCR引物和7條特異性的探針，可以 特異的、敏感的快速鑒定區(qū)別7種病原體。根據(jù)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局文件（2009. 178 號(hào)）《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)進(jìn)出境豬甲型H1N1流感檢驗(yàn)檢疫工作的通知一一A型流感分型基因 芯片檢測(cè)方法》提供的質(zhì)控序列合成本發(fā)明用質(zhì)控序列SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9。
[0018] 每條探針的5'端均通過(guò)15個(gè)胸腺嘧啶核苷酸連接有一個(gè)氨基，具體核苷酸序列 如下： SEQIDNO. 1 為： 5' -NH2-T15-GTTCATCGCCTAAACCAAATTCGGAATCTACGCC; SEQIDNO. 2 為： 5' -NH2-T15-GAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG; SEQIDNO. 3 為： 5' -nh2-t15-AAACTTTTATCAAAGACGGCGATCAAAATATGAC； SEQIDNO. 4 為： 5' -NH2-T15-GGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAG; SEQIDNO. 5 為： 5' -nh2-t15-GCTGTAGATGGGAGCTGCTGTCGTTGCTGGCGTTG； SEQIDNO. 6 為： 5' -NH2-T15-ACTACTGGCTTCTGCTTCACCCACTTATACATCACCT; SEQIDNO. 7 為： 5' -nh2-t15-GCACCATCCTTGGCAACCCAGACAACTCCATCTAATT； SEQIDNO. 8 為： 5, -nh2-t15-gctgcctcggcaaggagt-tamra; SEQIDNO. 9 為： 5' -NH2-T15-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTo
[0019] 實(shí)施例2,參見(jiàn)圖1，用于七種重要豬病病原檢測(cè)的基因芯片，采用基因芯片微量 點(diǎn)樣技術(shù)，將待測(cè)樣品探針與各種質(zhì)控探針固定在經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的基片上，形成8行X7列 的微陣列。微陣列上探針?lè)植紡纳系较乱来螢椋狐c(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)P1 :1行X8點(diǎn)，雜交陽(yáng) 性質(zhì)控分區(qū)P2 :1行X4點(diǎn)，雜交陰性質(zhì)控分區(qū)N:1行X4點(diǎn)，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌 檢測(cè)探針?lè)謪^(qū)1 :1行X4點(diǎn)，副豬嗜血桿菌檢測(cè)探針?lè)謪^(qū)2 :1行X4點(diǎn)，豬肺炎支原體檢測(cè) 探針?lè)謪^(qū)3 :1行X4點(diǎn)，豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)探針區(qū)分4 :1行X4點(diǎn)，豬繁殖與呼吸綜合 征病毒檢測(cè)探針?lè)謪^(qū)5 :1行X4點(diǎn)，豬瘟病毒檢測(cè)探針?lè)謪^(qū)6 :1行X4點(diǎn)，豬傳染性胃腸 炎病毒探針?lè)謪^(qū)7 :1行X4點(diǎn)，雜交陰性質(zhì)控分區(qū)N:1行X4點(diǎn)，點(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)P1 :1 行X8點(diǎn)。每張芯片上有至少一個(gè)上述微陣列，每個(gè)微陣列可以檢測(cè)一份樣品。
[0020] 雜交陰性質(zhì)控分區(qū)N，包含點(diǎn)樣緩沖液，點(diǎn)樣緩沖液為市售產(chǎn)品，例如博奧生有限 公司生產(chǎn)的。其余各分區(qū)包括對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針和質(zhì)控探針。
[0021] 圖2~9為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的檢測(cè)結(jié)果圖，分別為豬傳染性胸膜肺炎放線 桿菌基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果；副豬嗜血桿菌基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的 雜交結(jié)果；豬肺炎支原體基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果；豬圓環(huán)病毒2型基因組 DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果；豬繁殖與呼吸綜合征病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié) 果；豬瘟病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果；豬傳染性胃腸炎病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的雜交結(jié)果；七種病原核酸經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果。
[0022] 實(shí)施例3、試劑準(zhǔn)備 1)芯片洗液 根據(jù)需要及實(shí)際情況，按如下比例配制洗滌液I和洗滌液II。
[0023] 洗液I:SSC終濃度為2X，SDS終濃度為0. 2 %。如600mL洗液I=528mL蒸餾 水+60mL20XSSC+12mL10%SDS，或根據(jù)需要按比例配制。
[0024]洗液II:SSC終濃度為 0? 2X。如 600mL洗液II=594mL蒸餾水+6mL20XSSC， 或根據(jù)需要按比例配制。
[0025] 若10%SDS產(chǎn)生白色絮狀沉淀，請(qǐng)置于42°C水浴中溶解混勻后配制洗液。
[0026] 2)無(wú)水乙醇。
[0027] 3)冰水混合物。
[0028] 實(shí)施例4、病原體基因組的提取 按照相應(yīng)商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取患病動(dòng)物的組織或細(xì)菌培養(yǎng)液 或病毒的細(xì)胞增殖液的全基因組，制備樣品。
[0029] 實(shí)施例5、PCR擴(kuò)增病毒基因組DNA/cDNA 1、PCR反應(yīng)體系：在PCR配液區(qū)內(nèi)，在冰上融化PCRMix及基因組DNA，按如下體系配制 反應(yīng)液。25yLPCR反應(yīng)液包含：rTaq酶12. 5yL、引物Mix: 3.lyL、待測(cè)樣品DNA5 yL、無(wú)核酸酶滅菌水4. 4yL; 其中，所述引物Mix含有： 序列為SEQIDN0. 10的10ymol/L豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 11的10ymol/L豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 12的10ymol/L副豬嗜血桿菌上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 13的10ymol/L副豬嗜血桿菌下游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 14的10ymol/L豬肺炎支原體上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 15的10ym〇l/L豬肺炎支原體下游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 16的10ymol/L豬圓環(huán)病毒2型上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 17的10ymol/L豬圓環(huán)病毒2型下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 18的10ymol/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 19的10ymol/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒下游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 20的10ymol/L豬瘟病毒上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 21的10ymol/L豬瘟病毒下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 22的10ym〇l/L豬傳染性胃腸炎病毒上游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 23的10ym〇l/L豬傳染性胃腸炎病毒下游引物0.lyL 序列為SEQIDNO. 24的20ymol/L通用引物上游引物1yL， 序列為SEQIDNO. 25的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌上游引物SEQIDNO. 10 : 5' -AGGTGACACTATAGAATATAGTGCTTACCGCATGTAGTGG-3r ； 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌下游引物SEQIDNO. 11 : 5' -GTACGACTCACTATAGGGATGGCTGCTCCGCTTTTGG-3r ； 副豬嗜血桿菌上游引物IDNO. 12: 5' -AGG