專利名稱：：Cyp2c19、abcb1基因snp檢測液相芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：波立維(Plavix，又稱氯吡格雷，Cl叩idogrel)是新一代血小板凝聚抑制劑，于1998年3月獲FDA正式批準(zhǔn)上市。它與阿司匹林的聯(lián)合治療在急性冠脈綜合癥和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)患者中得到廣泛應(yīng)用，可以有效預(yù)防心肌梗死，中風(fēng)和血管性死亡。目前，全球有數(shù)以萬計的患者在植入冠脈支架后長期服用波立維以預(yù)防血栓形成。波立維是一種前體藥物，需經(jīng)過P450酶系代謝形成活性代謝產(chǎn)物?？茖W(xué)研究證明波立維的療效存在顯著的個體差異，主要是受患者特定的吸收和代謝酶基因多態(tài)性(單核苷酸多態(tài)性，SNP)的影響。對波立維藥效反應(yīng)較低的患者，服用該藥預(yù)防心血管事件的作用將顯著減弱。最近的臨床研究進(jìn)一步證實，波立維的療效與患者體內(nèi)兩個基因的SNP關(guān)系密切，即CYP2C19和ABCB1。攜有兩個CYP2C19功能減弱等位基因位點的患者，以及攜有一個或一個以上ABCB1基因變異位點(C3435T)的患者，他們與正?；蛐突颊呦啾龋诮邮芟嗤委煼桨傅那闆r下發(fā)生心血管事件(包括血管性死亡、急性心肌梗塞和中風(fēng))的概率增加近50%。因此，檢測患者這兩個基因的多態(tài)性情況能科學(xué)指導(dǎo)波立維的臨床使用。CYP2C19是波立維的主要代謝酶，能活化波立維使其產(chǎn)生藥效。在中國人群中，CYP2C19常見的兩種功能減弱等位基因型為CYP2C19"和CYP2C19"，它們的分布頻率分別是29.7%和3.5%。而ABCB1主要影響波立維在腸道的吸收，ABCB1基因C3435T突變型(分布頻率約為39.7%)會顯著削弱波立維的吸收能力。目前國內(nèi)外尚未有同時檢測波立維兩個療效相關(guān)基因——CYP2C19和ABCB1基因多態(tài)性的產(chǎn)品上市。目前國內(nèi)外能檢測CYP2C19基因SNPs的產(chǎn)品，如AmershamBioscience(GEhealthcare)的CodeLinkP450,Roche的A即liChipP450等，主要建立在傳統(tǒng)固相芯片的基礎(chǔ)上，價格昂貴，而且敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。而其它以PCR為基礎(chǔ)的檢測SNPs的技術(shù)，如直接測序法，半定量PCR技術(shù)，PCR—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測，這些技術(shù)存在靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高的缺點，普通PCR方法和熒光定量PCR由于檢測通量的局限性不能滿足臨床的需要。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長度多態(tài)(PCR—RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進(jìn)行一種突變的檢測，耗時費力?；谛酒脑恚绹鳯uminex公司開發(fā)出了以微球為載體的懸浮液相芯片技術(shù)。該項技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至lOO種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強度，再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測的要求，同時具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點。我們采用xTAG液相芯片技術(shù)可以同時檢測多種SNPs，實現(xiàn)高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測CYP2C19基因的正常基因型以及兩種常見等位基因型CYP2C19W和CYP2C19+3，以及ABCB1基因的正常基因型和C3435T等位基因的變異。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種CYP2C19和ABCB1基因SNP檢測液相芯片，包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的6種微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.7SEQIDNO.12中的序列；(2).針對每種型別的SNP位點分別設(shè)計的3對ASPE引物，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因SNP位點的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述針對目的基因SNP位點的特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、和SEQIDNO.5及SEQIDNO.6;(3).擴增出分別具有CYP2C19和ABCB1基因SNP位點的目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為，針對CYP2C19Exon5的SEQIDNO,13及SEQIDNO.14;針對CYP2C19Exon4的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16;針對ABCB1Exon26的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18。優(yōu)選地所述3對由tag序列和特界性序列組成的特異ASPE引物為由SEQIDNO.19和SEQIDNO.1組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.20和SEQIDNO.2組成的ASPE引物;由SEQIDNO.21和SEQIDNO.3組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.22和SEQIDNO.4組成的ASPE引物;由SEQIDNO.23和SEQIDNO.5組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.24和SEQIDNO.6組成的ASPE引物。本發(fā)明的另一目的是提供一種ABCBi基因SNP檢測液相芯片。一種ABCB1基因SNP檢測液相芯片，主要包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的2種微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.11SEQIDNO.12中的序列；(2).針對SNP位點設(shè)計的ASPE引物，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因SNP位點的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述針對目的基因SNP位點的特異性序列為SEQIDNO.5及SEQIDNO.6;(3).擴增出具有ABCBl基因SNP位點的目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為SEQIDNO.17及SEQIDNO.18。本發(fā)明的另一目的是提供一種CYP2C19基因SNP檢測液相芯片。一種CYP2C19基因SNP檢測液相芯片，主要包括有(1).分別包被有特異的anti-t叫序列的4種微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.7SEQIDNO.IO中的序列；(2).針對每種型別的SNP位點分別設(shè)計的2對ASPE引物，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因SNP位點的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述針對目的基因SNP位點的特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、和SEQIDNO.3及SEQIDNO.4;(3).擴增出具有CYP2C19基因SNP位點的目標(biāo)序列的引物。本發(fā)明的另一目的是提供使用上述液相芯片對CYP2C19、ABCB1基因SNP進(jìn)行檢測的方法。一種使用上述液相芯片對CYP2C19和ABCB1基因SNP檢測的方法，主要包括以下步驟(1)PCR擴增待測樣品DNA;(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-TT試劑盒進(jìn)行酶切處理；(3)用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記；(4)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(5)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(6)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達(dá)100X。所制備的CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并fi所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。2.本發(fā)明設(shè)計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型。3.本發(fā)明的檢測方法歩驟簡單，三種SNPs檢測可通過一步多重PCR即可完成三個具有SNP位點的目標(biāo)序列的擴增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨床需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。具體實施例方式所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環(huán)境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n>3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)千擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5—30個T。實施例lCYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE引物針對CYP2C19的兩種常見SNP位點和ABCB1基因C3435TSNP位點分別設(shè)計特異性的引物序列。ASPE引物由"Tag+特異性引物序列"組成。ASPE引物序列如下表所示表lASPE引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>每條ASPE引物包括兩個部分，5'端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性tag序列(如表2所示)，3'端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表l所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。表2ASPE特異性引物右端的Tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>二、anti-tag序列包被的微球根據(jù)所設(shè)計的ASPE特異性引物片段，選擇tag序列，最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結(jié)構(gòu)，選擇的六種tag序列及其微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表3所示表3微球上的anti-tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>選擇的六種微球(FlexMAP微球)購自美國Li」minex公司，也可自己合成anti-tag序列，購買Luminex公司的羧基化微球進(jìn)行包被。包被的過程如下:根據(jù)所選擇的tag序列合成對應(yīng)于每種微球的anti-tag序列，每個anti-tag序列前加上一段5—10個T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工牛物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的anti-tag序列用ddH20配成100咖ol/ml的貯存液。微球包被的過程如下分別取5X106個上述編號的羧基化的微球(購自L函inex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopr叩yl)-N-ethylcarbodi丄m:ide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02^的Tween-20洗滌一次，再用O.1X的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于100u]的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，1腸1/LEDTA中，2-8'C避光保存。三、擴增出具有SNP位點的目標(biāo)序列的引物CYP2C19基因的兩種常見的SNP位點為CYP2C19W和CYP2C1W3，ABCB1基因與波立維藥物吸收相關(guān)的多態(tài)性位點變異為C3435T。它們的多態(tài)性位點在不同的外顯子上。CYP2C1W2為G681A突變，發(fā)生在外顯子5;CYP2C19沐3為G636A突變，發(fā)生在外顯子4;而ABCB1基因C3435T突變發(fā)生在外顯子26。利用Primer5.0設(shè)計三對引物(見表4)，分別擴增出三條具有SNP位點的目標(biāo)序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2運用CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250;ia):<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2XTm雜交緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>過濾后貯存于4'C。ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。生物素標(biāo)記的dCTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。一、樣本的DNA提取參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，詳細(xì)步驟如下1.取患者抗凝靜脈血300pl加到-個1.5ml干凈無茼的離心管中；2.向離心管中加入500ji1AP1緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；3.加入100nlAP2緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；4.室溫下12，OOOrpm離心lO分鐘；5.小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPr印中，蓋上蓋子，以6，OOOrpm離心l分鐘；6.倒掉廢液收集管中的廢液，用800)al緩沖液Wl洗滌l次，以6，OOOrpm離心l分鐘；7.倒掉廢液收集管中的廢液，加入800pl緩沖液W2，以12，OOOrpm離心l分鐘；倒掉廢液收集管中的廢液，加入50(V1緩沖液W2，以12，OOOrpm離心l分鐘，棄掉廢液；8.將吸附柱AxyPr印放回空收集管中，12，OOOrpm離心l分鐘；9.將吸附柱AxyPr印置于一干凈無菌的1.5ml離心管中，加入40|_11TE緩沖液，室溫下放置l分鐘，12，OOOrpm離心l分鐘洗脫DNA，電泳檢測，-20。C保存。二、待測樣品的PCR擴增利用Primw5.O設(shè)計三對引物，多重PCR—步擴增出CYP2C19的外顯子5和外顯子4，以及ABCB1的外顯子26共三條具有突變位點的目標(biāo)序列，產(chǎn)物大小分別為308bp、261bp、268bp。引物序列(SEQNO.13-18)見上述表4所示。首先配制多重PCR引物工作液分別各取SEQNO.13-18的引物貯存液100ul于1.5ml微量離15心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應(yīng)體系如下IOX緩沖液(含Mf)5uldNTP(各2.5咖ol/L)4ulT叫酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL)6ul模板DNA(10ng/ul)1ulddH"33.5ul共50ulPCR擴增程序為:95°C3min;94°C20s，56。C30s，72°C30s,30個循環(huán);72°ClOmin;4'C保存?zhèn)溆谩Ｈ?、PCR產(chǎn)物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細(xì)步驟如下1.取7.5ulPCR反應(yīng)后的產(chǎn)物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37。C聘育15min。80。C孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。四、位點特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE)利用上述設(shè)計的位點特異性弓I物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記。首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取G681Ai、G681A-m、G636Ai、G636A-m、C3435T-w、C3435T-m相應(yīng)的ASPE引物貯存液l(M于l,5ml微量離心管中，加入10畫1/LTrisBuffer補至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下IOX緩沖液2ulMgCl2(50誦ol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100咖ol/L)1ulTsp酶(5U/ul)0.25ul混合的ASPE引物丁作液(各500nmol/L)1ul酶切處理的PCR擴增產(chǎn)物5ulddH2010.ul共20ulPCR程序為:96°C2min;94°C30s'58°Clmin，72°C2min，30個循環(huán);4。C保存?zhèn)溆?。五、雜交反應(yīng)1.根據(jù)設(shè)計的ASPE引物，選擇相應(yīng)的最優(yōu)的六種FlexMAP微球(微球濃度均為2.5X105個/ml)。每種微球分別帶有不同顏色編碼，同吋每種微球表面分別連接有一段24bp的特異性的寡核苷酸序列(anti-tag)，這些anti-tag序列能分別與對應(yīng)的ASPE引物3'端的tag序列特異結(jié)合；本實施例每組樣品檢測中都分別選擇LUA42，LUA24，LM27，LUA1，LUA46，LUA74共六種微球；2.分別取lul每種編號的微球于l.5m]的微量離心管中；3.微球于^10000g離心1-2min;174.棄去上清，微球重懸于100ul的2XTm雜交緩沖液中，渦旋混勻；5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中，對照孔加25ul的ddH20;6.取5-25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中，用ddH20補足至50ul;7.用錫箔紙包住96孔板以避光，95'C60s，37°C15min孵育雜交；8.雜交后的微球于》3000g離心2—5min;9.去上清，將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中；10.微球于》3000g離心2—5tnin;11將微球重懸于75ul的lXTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ugZml的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE);12.37。C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結(jié)果如表5和表6所示。對熒光值(MFI)和數(shù)據(jù)處理有以下要求1.每個位點需至少有一個等位基因MFI大于300而且大于10XPCR陰性對照MFI;2.NETMFI二樣品MFI—PCR陰性對照MFI(NETMFI小于0的以0表示)；3.滿足以上兩個條件的數(shù)據(jù)，按下列公式計算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據(jù)經(jīng)驗對每個檢測位點的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測20份樣本的CYP2C19和ABCB1基因多態(tài)性，實驗數(shù)據(jù)符合上述要求，因此可計算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設(shè)置如下突變比值范圍在0%_20%視為野生型純合子；30%-70%視為雜合子；80%-100%視為變異型純合子。以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照，計算本發(fā)明所提供的分型方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測20份樣本的CYP2C19和ABCB1基因型檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達(dá)到100%?？梢姳景l(fā)明所提供的CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片能夠準(zhǔn)確地檢測出CYP2C19、ABCB1基因的SNP類型，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。表5樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>94852970514171310'101236836184573051158328400215933711242842644922294531318516575315166143313408062759038815399463332054520164331367316524383173541950320961411844324623201405019333579165583322059419530091922表6樣本CYP2C19和ABCB1突變類型分析結(jié)果樣本號突變比值(％)液相芯片檢測結(jié)果測序檢測結(jié)果G681AG636AC3435TCYP2C19ABCB1CYP2C19ABCB110%1%46%681位等位基因型GG，636位等位基因型GG3435位等位基因型CT681位等位基因型GG,636位等位基因型GG3435位等位基因型CT251%0%1%681位等位基因型GA，636位等位基因型GG3435位等位基因型cc681位等位基因型GA，636位等位基因型GG3435位等位基因型CC32%52%3%681位等位基因型GG,636位等位基因型GA3435位等位基因型CC681位等位基因型GG，636位等位基因型GA3435位等位基因型CC2041%3%2%681位等位基因型GG636位等位基肉型GG3435位等位基閃型CC681位等位基因型GG,636位等位基因型GG3435位等位基因型CC51%0%60%681位等位基因型GG636位等位基因型GG3435位等位基因型CT681位等位基閃型GG，636位等位基因型GG3435位等位基因型CT6100%1%40。/。681位等位基因型AA,636位等位基因型GG3435位等位基肉型CT681位等位基因型AA，636位等位基因型GG3435位等位基因型CT72%0%43%681位等位基因型GG636位等位基因型GG3435位等位基問型CT681位等位基因型GG,636位等位基因型GG3435位等位基因型CT80%1%0%681位等位基因型GG636位等位基因型GG3435位等位基隨CC681位等位基因型GG，636位等位基因型GG3435位等位基因型CC93%0%0%681位等位基因型GG636位等位基因型GG3435位等位基閑型CC681位等位基因型GG,636位等位基閃型GG3435位等位基因型CC10100%0%39%681位等位基因型AA，636位等位基因型GG3435位等位基閑型CT681位等位基因型AA，636位等位基因型GG3435位等位基因型CT112%0%380/o681位等位基因3435位等位基681位等位基因3435位等位基21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>序歹l]表〈110〉廣州益善生物技術(shù)有限公司<120〉CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片及其檢測方法〈160〉24<170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉22〈212〉■〈213〉人工序列〈400〉1aagtaatttgttatgggttccc22〈210〉2〈211〉22〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉2aagtaatttgttatgggttcct2224〈211〉19〈212〉讓〈213〉人工序列<400〉3gattgtaagcaccccctgg19〈210〉4〈211〉19<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉4gattgtaagcaccccctga19〈210〉5〈211〉19〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5ggtgtcacaggaagagatc19<210〉6〈211〉19〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉6ggtgtcacaggaagagatt19〈210>7<211〉24〈212〉脆〈213〉人工序列〈■〉7gtttatagtgaaatatgaagatag24〈210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>8gtattgtattgaaaaggtaattga24〈210〉9〈211〉24〈212〉腿26〈213>人工序列<400〉9aaagttgagtattgatttgaaemg24〈210〉10〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>10gatttgtattgattgagattaaag24〈210〉11<211〉24<212>DNA〈213>人工序列〈400〉11tgtattgaatgaattgttgatgta24〈210〉12〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉12tgaaattagtttgtaagatgtgta24〈210〉13〈211〉21<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉13aaattacaaccagagcttggc21<210>14〈211〉21<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉14atcacaaatacgcaagcagtc21〈210〉15〈211〉21〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉15tccaatcatttagcttcaccc21〈210〉16〈211〉21<212>DNA〈213〉人工序列<400〉16ttcagggcttggtcaatatag21〈210〉17〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉17tgctacattcaaagtgtgctg21〈210〉18〈211〉21〈212〉纖〈213〉人工序列〈400〉18acttacattaggcagtgactc21〈210〉19〈211〉24〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉19ctatcttcatatttcactataaac24〈210〉20〈211>24〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>20tcaattaccttttcaatacaatac24〈210>21<211>24〈212〉腿〈213〉人工序列<400>21cttttcaaatcaatactcaacttt24<210〉22〈211〉24〈212>DNA〈213>人工序列30〈400〉22ctttaatctcaatcaatacaaatc〈210〉23〈211〉24〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉23tacatcaacaattcattcaataca〈210〉24〈211〉24〈212〉薩〈213〉人工序列〈400〉24tacacatcttacaaactaat.ttca24242權(quán)利要求1.一種CYP2C19和ABCB1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).分別包被有特異的antitag序列的6種微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.7～SEQIDNO.12中的序列；(2).針對每種型別的SNP位點分別設(shè)計的3對ASPE引物，每種ASPE引物由3’端的針對目的基因SNP位點的特異性序列和5’端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述針對目的基因SNP位點的特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、和SEQIDNO.5及SEQIDNO.6；(3).擴增出分別具有CYP2C19和ABCB1基因SNP位點的目標(biāo)序列的引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C19和ABCB1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對CYP2C19Exon5的SE(〕IDNO.13及SEQIDNO.14;針對CYP2C19Exon4的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16;針對ABCB1Exon26的SEQIDNO.17及SEQIDNO.18。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的CYP2C19和ABCB1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述3對由tag序列和特異性序列組成的特異ASPE引物為由SEQIDNO.19和SEQIDNO.1組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.20和SliQIDNO.2組成的ASPE引物;由SEQIDNO,21和SEQIDNO.3組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.22和SEQIDNO.4組成的ASPE引物；由SEQIDNO.23和SEQIDNO.5組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.2柳SEQIDNO.6組成的ASPE引物。4.一種ABCB1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).分別包被有特異的anti-tag序列的2種微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.11SEQIDNO.12中的序列；(2).針對SNP位點設(shè)計的1對ASPE引物每利'ASPE引物由3'端的針對目的基因SNP位點的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(l)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述針對目的基因SNP位點的特異性序列為SEQIDNO.5及SEQIDNO.6;(3).擴增出具有ABCB1基因SNP位點的目標(biāo)序列的引物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ABCB1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為SEQIDNO.17及SEQIDNO.18。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的ABCB1基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述特異ASPE引物為由SEQIDN0.23和SEQIDNO.5組成的ASPE引物，及由SEQIDNO,24和SEQIDNO.6組成的ASPE引物。7.—種CYP2C19基因SNP檢測液相芯片，其特征是，主要包括有-(1).分別包被有特異的anti-tag序列的4種微球，每種微球具有不同顏色編碼，anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQIDNO.7SEQIDNO.IO中的序列；(2).針對每種型別的SNP位點分別設(shè)計的2對ASPE引物，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因SNP位點的特異性序列和5'端的tag序列組成，所述tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選的微球上anti-tag序列互補配對；所述針對目的基因SNP位點的特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、和SEQIDNO.3及SEQIDNO.4;(3).擴增出具有CYP2C19基因SNP位點的目標(biāo)序列的引物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的CYP2C19基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為針對CYP2C19Exon5的SEQIDNO.13及SEQIDNO.14;針對CYP2C19Exon4的SEQIDNO.15及SEQIDNO.16。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的CYP2C19基因SNP檢測液相芯片，其特征是，所述2對由tag序列和特異性序列組成的特異ASPE引物為由SGQIDNO.19和SEQIDNO.1組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.20和SEQIDNO.2組成的ASPE引物;由SEQIDNO.21和SEQIDNO.3組成的ASPE引物，及由SEQIDNO.22和SEQIDNO.4組成的ASPE引物。10.—種CYP2C19和ABCB1基因SKP檢測的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1所述的CYP2C19和ABCB1基因SNP檢測液相芯片，主要包括以下歩驟(1)PCR擴增待測樣品DNA;(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-TT試劑盒進(jìn)行酶切處理；(3)用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記；(4)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(5)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(6)通過熒光檢測儀檢測。全文摘要本發(fā)明公開了CYP2C19、ABCB1基因SNP檢測液相芯片及其檢測方法，該液相芯片包括有分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.7～SEQIDNO.12中的序列；針對目的基因SNP位點的特異性序列和5’端的tag序列組成的3對ASPE引物，特異性序列分別為SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、和SEQIDNO.5及SEQIDNO.6；擴增引物。所述液相芯片檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。文檔編號G01N21/64GK101565749SQ200910038648公開日2009年10月28日申請日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者任立芬,何嘉英,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司