一種地中海貧血基因的條碼化磁珠液相芯片檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種地中海貧血基 因的條碼化磁珠液相芯片檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 地中海貧血又稱海洋性貧血，簡稱地貧，是世界上最常見的人類單基因遺傳性血 液病，是一組由于珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變，使血紅蛋白中珠蛋白肽鏈合成減少或不能合 成所致的遺傳性溶血性貧血。我國長江以南各省發(fā)病率較高，其中以廣東、廣西、四川、云 南、海南、香港、臺(tái)灣較為多見，在北方則少見。
[0003] 地中海貧血病由于珠蛋白缺失的多樣性所致（缺乏的珠蛋白鏈的類型、數(shù)量不 一），臨床表現(xiàn)呈多樣性，癥狀的輕重程度也不同。有的胎兒及嬰幼兒即因患極重的溶血性 貧血致死，有的患者需要進(jìn)行反復(fù)輸血治療，也有的患者雖血紅蛋白異常而一生無任何臨 床癥狀的。如夫妻為同型地中海貧血攜帶者，則其子女有1/4機(jī)會(huì)患重型地中海貧血。世 界上約有4. 83%的人口攜帶珠蛋白變異基因，我國發(fā)病率較高的廣西人群中地中海貧血基 因攜帶率為12. 22%~23. 02%。由于地中海貧血的患者缺少正常的血紅蛋白，紅血球攜氧 能力差，體內(nèi)主要造血器官骨髓與次要造血器官肝臟、脾臟均會(huì)進(jìn)行旺盛的造血作用，但造 出的紅血球也多半品質(zhì)不佳，容易被破壞，成為惡性循環(huán)。骨髓增生會(huì)侵犯周圍的皮質(zhì)骨， 使骨骼變的脆弱。旺盛的造血作用會(huì)消耗極多的養(yǎng)分與能量，使身體其他部位的養(yǎng)分供需 失調(diào)。目前尚無針對地中海貧血的有效的治療方法，不斷的輸血雖然可以改善貧血的癥狀， 也可避免過度的造血作用，但血紅蛋白中的鐵質(zhì)會(huì)過度累積在身體中，并堆積至各重要器 官造成器官病變，而且輸血治療費(fèi)用昂貴，給患者及家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神痛苦。 因此遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷以及在我國南方開展大范圍人群的分子篩查作為防治該疾病的首 要途徑，對控制重型地貧患兒的出生，提高出生人口素質(zhì)具有重要意義。
[0004] 人體血漿中正常的血紅蛋白由兩對不同的珠蛋白肽鏈（a鏈和非a鏈）組成，非 a鏈有0、Y、S、U結(jié)構(gòu)與a鏈相似）及e 5種。珠蛋白的這幾種肽鏈分別由其相應(yīng) 的基因編碼，這些基因的缺失或點(diǎn)突變可造成各種肽鏈的合成障礙，致使血紅蛋白的組分 改變。根據(jù)本病缺乏的珠蛋白鏈的種類及缺乏程度，通常將地中海貧血分為a、0、S和 S等4種類型，其中以0和a地中海貧血最多見，也最嚴(yán)重。
[0005] 現(xiàn)在對地中海貧血的基因檢測手段有Southern blotting印跡雜交、PCR限制性 片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP)連鎖分析技術(shù)、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測（PCR-SSCP)、等位基 因特異性寡核苷酸（AS0)技術(shù)、反向點(diǎn)雜交法（RDB)、突變寡核苷酸延伸擴(kuò)增（M0EA)、多重 等位基因特異性PCR法（MAS-PCR)、跨越斷裂點(diǎn)PCR法（Gap-PCR)、熒光PCR、基因芯片等。 目前臨床使用的方法主要為反向點(diǎn)雜交法（RDB)結(jié)合跨越斷裂點(diǎn)PCR(Gap-PCR)電泳法，但 其存在通量低、操作繁瑣、耗時(shí)長和需人工判讀等弊端?；贚uminex液相芯片建立的檢測 方法能極大改善此局面，可是該系統(tǒng)的微球是由熒光染料混合而成，通過熒光對微球進(jìn)行 區(qū)分，由于微球?qū)饷舾?，易發(fā)生光漂白，而且基于Luminex液相芯片建立的檢測方法還存 在微球的熒光染料與藻紅蛋白熒光信號(hào)互相干擾的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種地中海貧血基因的條 碼化磁珠液相芯片檢測試劑盒。本發(fā)明使用條碼化磁珠（BMB)的Intelliplex?技術(shù)在可 見光下識(shí)別磁珠上微蝕刻的條碼，對磁珠進(jìn)行解碼分類，由于條碼化磁珠本身不含有熒光 物質(zhì)，從而有效地解決了 Luminex平臺(tái)存在的問題。
[0007] -種地中海貧血基因的條碼化磁珠液相芯片檢測試劑盒，包括擴(kuò)增地中海貧血基 因的PCR試劑和檢測地中海貧血基因的雜交試劑，其中，所述雜交試劑包括液相芯片；所述 液相芯片由偶聯(lián)有特異性雜交探針的條碼化磁珠、空白條碼化磁珠、游離的雜交陽性反序 探針和雜交緩沖液組成。
[0008] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述特異性雜交探針包含：
[0009] 檢測-32C>A位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:19的MN探針和序列為SEQ ID N0:20 的 0 1M 探針；
[0010] 檢測-30T>C位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:21的0 2N探針和序列為SEQ ID N0:22 的 0 2M 探針；
[0011] 檢測_29A>G位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:23的0 3N探針和序列為SEQ ID N0:24 的 0 3M 探針；
[0012] 檢測_28A>G位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:25的0 4N探針和序列為SEQ ID N0:26 的 0 4M 探針；
[0013] 檢測CAP+40-+43(-AAAC)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:27的05N探針 和序列為SEQ ID N0:28的0 5M探針；
[0014] 檢測起始密碼子ATG>AGG位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:29的0 6N探針 和序列為SEQ ID N0:30的0 6M探針；
[0015] 檢測⑶14-15 (+G)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:31的0 7N探針和序列 為 SEQ ID N0:32 的 0 7M 探針；
[0016] 檢測CD17A>T位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQIDNO:33的^3 8N探針和序列為SEQ ID N0:34 的 0 8M 探針；
[0017] 檢測⑶26G>A位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQIDN0:35的^3 9N探針和序列為SEQ ID N0:36 的 0 9M 探針；
[0018] 檢測CD27-28(+C)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:37的0 10N探針和序列 為 SEQ ID N0:38 的 0 10M 探針；
[0019] 檢測IVS-1-1GXT位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:39的M1N探針和序列 為 SEQ ID N0:40 的 0 11M 探針；
[0020] 檢測IVS-1-5G>C位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:41的M2N探針和序列 為 SEQ ID N0:42 的 0 12M 探針；
[0021] 檢測CD31(-C)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:43的13N探針和序列為 SEQ ID N0:44 的 0 13M 探針；
[0022] 檢測CD41-42(-TCTT)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:45的M4N探針和 序列為SEQ ID N0:46的0 14M探針；
[0023] 檢測CD43G>T位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:47的M5N探針和序列為 SEQ ID N0:48 的 0 15M 探針；
[0024] 檢測CD71/72+A位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:49的0 16N探針和序列為 SEQ ID N0:50 的 0 16M 探針；
[0025] 檢測IVS2-654C->T位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:51的M7N探針和序 列為SEQ ID N0:52的0 17M探針；
[0026] 檢測Westmead(WS)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:53的a 1N探針和序列 為 SEQ ID N0:54 的 a 1M 探針；
[0027] 檢測Quong Sze(QS)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:55的a 2N探針和序 列為SEQ ID NO: 56的a 2M探針；
[0028] 檢測Constant Spring(CS)位點(diǎn)的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID N0:57的a 3N探 針和序列為SEQ ID NO: 58的a 3M探針；
[0029] 檢測a 2的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID NO:62的a 2探針；
[0030] 檢測3. 7缺失片段的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID NO:59的3. 7探針；
[0031] 檢測4. 2缺失片段的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID NO:60的4. 2探針；
[0032] 檢測SEA缺失片段的探針，優(yōu)選為序列為SEQ ID NO:61的SEA探針；
[0033] 監(jiān)控雜交體系是否正常工作的雜交陽性探針，優(yōu)選地，所述雜交陽性探針的序列 為 SEQ ID N0:63。
[0034] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR試劑包括擴(kuò)增非缺失型a珠蛋白基因 和/或0珠蛋白基因的正義引物及反義引物的PCR mix A、對應(yīng)所述PCR mix A的陽性對 照品A、擴(kuò)增缺失型a珠蛋白基因的正義引物及反義引物的PCR mix B、對應(yīng)所述PCR mix B的陽性對照品B ;所述PCR mix A和PCR mix B中的正義引物或反義引物的5'端以及所 述雜交陽性反序探針的5'端帶有生物素標(biāo)記；其中，
[0035] 所述陽性對照品 A 由包含-32C>A、CAP+40-+43(-AAAC)、CD14-15(+G)、 CD26G>A、IVS-1-1G>T、CD31(-C)、CD41-42(-TCTT)、CD71/72+A、IVS2-654C->T、Constant Spring(CS)、Westmead(WS)雜合突變位點(diǎn)的質(zhì)粒組成；所述陽性對照品B由包含a 2擴(kuò)增 目的片段的質(zhì)粒和3. 7缺失后擴(kuò)增目的片段的質(zhì)粒組成。
[0036] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR mix A由序列為SEQ ID NO: 1的 0 1-引物F、序列為SEQ ID N0:2的0 1-引物R、序列為SEQ ID N0:3的0 2-引物F、序列 為SEQ ID N0:4的0 2-引物R、序列為SEQ ID N0:5的0 3-引物F、序列為SEQ ID N0:6 的0 3-引物R、序列為SEQ ID N0:7的0 4-引物F、序列為SEQ ID N0:8的0 4-引物R、序 列為SEQ ID N0:9的a-引物F、序