一種檢測海洋環(huán)境中β?變形菌群落的基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測海洋環(huán)境γ?變形菌群落的基因芯片，包括有芯片載體，以及固定在芯片載體上的，用于檢測海水中的Alcaligenaceae菌、Burkholderiaceae菌、Comamonadaceae菌、Hydrogenophilaceae菌、Methylophilaceae菌、Neisseriaceae菌、Nitrosomonadaceae菌、Oxalobacteraceae菌、Rhodocyclaceae菌的探針。本發(fā)明芯片所使用的探針可以快速、高通量地對海水中的β?變形菌群落進(jìn)行檢測，最大可以檢測9個(gè)科的β?變形菌信息，從而為海洋環(huán)境細(xì)菌群落的監(jiān)測提供了有力的技術(shù)支持，為建立、健全近岸海域海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評價(jià)體系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【專利說明】
-種檢測海洋環(huán)境中e-變形菌群落的基因巧片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測海洋環(huán)境中丫 -變形菌群落的 基因忍片。
【背景技術(shù)】
[0002] 0-變形菌與a、丫、S、e-變形菌亞綱同屬于變形菌口。其中a-變形菌、丫-變形菌在 海洋環(huán)境中最為常見，e-變形菌報(bào)道相對較少，但其功能不容小勵(lì)。Lee等人在利用Fish/ MR技術(shù)研究聚憐微生物時(shí)，確定聚憐菌主要隸屬于(6-變形菌綱;Kong等人的研究認(rèn)為(6-變 形菌亞綱類微生物直接與憐的去除效率有關(guān);還有研究表明e-變形菌亞綱的微生物多具備 降解能力，常見于受污染水體中。例如，其中的化odocyclaceae科微生物較多包含的為好氧 反硝化桿菌類，居于水環(huán)境中，具備較強(qiáng)的代謝多樣性，在水體生物修復(fù)中起到關(guān)鍵的作 用。而M化osomonadaceae則為典型的硝化菌科。因此，0-變形菌在環(huán)境中占有非常重要的 地位，增強(qiáng)對其檢測研究意義重大。
[0003] 目前，海洋環(huán)境生物監(jiān)測W浮游生物、底棲生物、潮間帶生物、游泳動(dòng)物、大腸桿菌 等生物種類組成和數(shù)量監(jiān)測為主要項(xiàng)目，缺乏對海洋細(xì)菌群落多樣性的監(jiān)測。細(xì)菌復(fù)雜的 群落結(jié)構(gòu)、功能、相互作用和動(dòng)態(tài)變化對海洋生態(tài)功能的維持有著重要意義。微生物群落對 環(huán)境變化響應(yīng)快速，對污染具有指示作用。因此，增加對海洋環(huán)境各個(gè)細(xì)菌種類組成和數(shù)量 分布的監(jiān)測，對建立、健全近岸海域海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評價(jià)體系十分必要。e-變形菌作為一 類代謝多樣性復(fù)雜，對水體污染具有較強(qiáng)修復(fù)作用的微生物，納入海洋環(huán)境生物監(jiān)測具有 十分迫切的必要性。
[0004] 目前傳統(tǒng)的微生物監(jiān)測主要是利用分離培養(yǎng)方法。運(yùn)種監(jiān)測方法繁瑣、耗時(shí)，不適 合對多種細(xì)菌進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測。亟需發(fā)展高通量、高效、便捷、低成本的海洋細(xì)菌群落監(jiān)測技 術(shù)?；蛉唐夹g(shù)是采用原位合成或顯微點(diǎn)樣技術(shù)將大量DNA探針有序地固化于支持物上， 然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號(hào)的檢測分析，獲得樣品的基因序列、基因表達(dá)信息 等遺傳信息。具有高通量、并行性;采用巧光標(biāo)記，檢測的準(zhǔn)確性高、檢測時(shí)間短，可完全實(shí) 現(xiàn)自動(dòng)化及快速檢測。在忍片制備和結(jié)果檢測W及信號(hào)分析、處理過程中采用計(jì)算機(jī)控制， 分析、檢測結(jié)果更為客觀、準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測海洋環(huán)境丫 -變形菌群落的基因忍 片，即可平行、快速、高通量的檢測海洋環(huán)境丫-變形菌群落，使基因忍片技術(shù)更好的應(yīng)用于 海洋環(huán)境監(jiān)測，W彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明的基因忍片，包括有忍片載體，W及固定在忍片載體上的，用于檢測海水中 的 Alcaligenaceae 菌、Burkholder iaceae 菌、Comamonadaceae 菌、Hydrogenophilaceae 菌、 Methylophilaceae^>Neisseriaceae^>Nitrosomonadaceae^>Oxalobacteraceae^> Rhodocyclaceae 菌的探針 D
[0007] 其中用于檢測41。日11邑611日。6日6菌的核酸探針，其核巧酸序列為569 10^:1-3中 的任一種或幾種；
[000引其中用于檢測Alcanivoracaceae菌的核酸探針，其核巧酸序列為沈Q ID N0:4-6 中的任一種或幾種；
[0009] 其中用于檢測(：〇111日111〇11日(1日。6日6菌的核酸探針，其核巧酸序列為569 10^:7-9中 的任一種或幾種；
[0010] 其中用于檢測Hy化ogenopMlaceae菌的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 10-12中的任一種或幾種；
[0011] 其中用于檢測MethylopMlaceae菌的核酸探針，其核巧酸序列為沈Q ID N0:13- 15中的任一種或幾種；
[0012] 其中用于檢測化1336'1曰。6曰6菌的核酸探針，其核巧酸序列為569 10^:16-18中 的任一種或幾種；
[0013] 其中用于檢測Ni化osomonadaceae菌的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NOiig- Sl 中的任一種或幾種；
[0014] 其中用于檢測Oxalobacteraceae菌的核酸探針，其核巧酸序列為沈Q ID NOiSS- SS 中的任一種或幾種；
[0015] 其中用于檢測化odocyclaceae菌的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID N0:24-26 中的任一種或幾種；
[0016] 在本發(fā)明的基因忍片上還固定有雜交陽性對照質(zhì)控探針、雜交陰性對照質(zhì)控探 針、表面化學(xué)質(zhì)控探針中的任一種或幾種，
[0017] 其中雜交陽性對照質(zhì)控探針(PC)的核巧酸序列為沈Q ID NO:27;
[001引雜交陰性對照質(zhì)控探針(NC)的核巧酸序列為SEQ ID NO:28;
[0019] 表面化學(xué)質(zhì)控探針(CK)的核巧酸序列為SEQ ID N0:29,是一條用皿X染料標(biāo)記的 40個(gè)T的寡核巧酸序列。運(yùn)些巧光探針點(diǎn)的位置可作為忍片上DNA微陣列坐標(biāo)，在忍片檢測 過程中起到定位探針位置的作用。
[0020] 本發(fā)明忍片所使用的探針可W快速、高通量地對海水中的0-變形菌群落進(jìn)行檢 巧。，最大可W檢測9個(gè)科的0-變形菌信息，從而為海洋環(huán)境細(xì)菌群落的監(jiān)測提供了有力的技 術(shù)支持，為建立、健全近岸海域海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評價(jià)體系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0021] 圖1:本發(fā)明e-變形菌口群落基因忍片布局圖。
[0022] 圖2:本發(fā)明0-變形菌口群落基因忍片的特異性檢測（Comamonadaceae)科檢測結(jié) 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0024] 實(shí)施例1 :護(hù)變形菌群落檢測基因忍片的探針設(shè)計(jì)
[0025] 采用高通量測序技術(shù)和克隆文庫技術(shù)獲得東海海水中(6-變形菌群落信息。根據(jù)(6- 變形菌群落1 6 S rRNA基因序列信息，對東海海水中3 1個(gè)主要的0-變形菌科 (A1caligenaceae、Burkholderiaceae、Comamonadaceae、Hydrogenophilaceae、 Methylophilaceae、Neisseriaceae、Nitrosomonadaceae、Oxalobacteraceae、 化odocyclaceae)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，并在BLAST中進(jìn)行驗(yàn)證，獲得用來制備基因忍片的探針序 列。
[0026]
【申請人】從檢測特異性的角度出發(fā)，對上述可能作為探針的序列進(jìn)行篩選，最終確 定了如下的探針序列：
[0027] 其中用于檢測Alcaligenaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID N0:1- 3中的任一種或幾種；
[0028] 其中用于檢測Burkholderiaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 4-6中的任一種或幾種；
[00巧]其中用于檢測Comamonadaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID N0:7- 9中的任一種或幾種；
[0030] 其中用于檢測HydrogenopMlaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 10-12中的任一種或幾種；
[0031] 其中用于檢測Met的lophiIaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 13-15中的任一種或幾種；
[0032] 其中用于檢測化isseriaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID N0:16- 18中的任一種或幾種；
[0033] 其中用于檢測Nitrosomonadaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 19-21中的任一種或幾種；
[0034] 其中用于檢測化alobacteraceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 22-23中的任一種或幾種；
[00巧]其中用于檢測Rhodocyclaceae微生物的核酸探針，其核巧酸序列為SEQ ID NO: 24-26中的任一種或幾種；
[0036] 還有點(diǎn)制在忍片上的：
[0037] 雜交陽性對照質(zhì)控探針(PC)，采用的是細(xì)菌16S rRNA基因的保守性片段。其主要 功能是與PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增出來的基于16S rRNA基因的標(biāo)記物雜交，從而對擴(kuò)增、標(biāo)記和 雜交等檢測過程的正確性進(jìn)行有效控制，其核巧酸序列為SEQ ID NO:27;
[0038] 雜交陰性對照質(zhì)控探針(NC)，采用的是一段40個(gè)T的寡核巧酸序列。該探針不會(huì)與 任何的擴(kuò)增和標(biāo)記產(chǎn)物結(jié)合，因此該探針可從反面監(jiān)控雜交過程的可靠性，其核巧酸序列 為沈Q ID NO:28;
[0039] 表面化學(xué)質(zhì)控探針(CK)是一條用肥X染料標(biāo)記的40個(gè)T的寡核巧酸序列，可監(jiān)測點(diǎn) 樣過程的可靠性，另外巧光探針點(diǎn)的位置可作為忍片上DNA微陣列坐標(biāo)，在忍片檢測過程中 起到定位探針位置的作用，其核巧酸序列為SEQ ID NO:29(圖1)。
[0040] 實(shí)施例2:本發(fā)明的0-變形菌群落檢測基因忍片的特異性檢測
[0041 ] 選擇0-變形菌中的海水優(yōu)勢科Comamonadaceae的代表性克隆Uncultured Comamonadaceae bacteri皿clone 2-8對0-變形菌群落檢測基因忍片的特異性進(jìn)行檢測。
[0042] ① DM的提取:用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DM。
[0043] ②16S rRNA基因的擴(kuò)增：利用克隆載體pEASY-Tl通用引物M13F(GTA AAA CGA CGG CCA GT)和M13R(GTC CTT TGT CGA TAC TG)對16S rRNA基因進(jìn)行線性擴(kuò)增。擴(kuò)增程序 為 94°C5min，25 個(gè)循環(huán)（94°C30s，55°C30s，72°Clmin30s)，72°C10min。
[0044] ③巧光標(biāo)記：利用巧光標(biāo)記的隨機(jī)引物（Cy3-順N N順順N)和Klenow酶對16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。37 °C 1.化，70 °C 1 Omin。
[0045] ④雜交:將15化巧光標(biāo)記產(chǎn)物和化L雜交液混合與a變形菌群落基因忍片50°C雜 交12h。忍片清洗，干燥后用掃描儀檢測結(jié)果。
[0046] 結(jié)果顯示（圖2)，克隆Uncultured Comamonadaceae bacterium clone 2-8與本發(fā) 明的基因忍片上對應(yīng)的Comamonadaceae科的探針具有明顯的雜交信號(hào)，而與其它科的探針 無雜交信號(hào)，說明本發(fā)明的海洋e-變形菌群落檢測基因忍片具有高的特異性。
[0047] 實(shí)施例3:利用忍片檢測海水樣品中的0-變形菌種類
[004引將海水樣品22A與本發(fā)明的海洋0-變形菌群落檢測基因忍片進(jìn)行雜交，具體方法 如實(shí)施例2。并與高通量測序的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果如表1所示。
[0049] 表1海水樣品22A中0-變形菌種類檢測結(jié)果
[(K)加 ]
[0051] 基因忍片檢測結(jié)果表明海水樣品2 2 A中含有的0 -變形菌亞綱包含 Burkholderiaceae、Comamonadaceae、Methylophilaceae、Nitrosomonadaceae、 Oxalobacteraceae;高通量測序結(jié)果表明海水樣品22A中含有0 -變形菌亞綱包含 Comamonadaceae、Me thylophilaceae、Neisseriaceae、Nitrosomonadaceae、 化odocyclaceae。本發(fā)明的基因忍片的檢測結(jié)果與高通量測序結(jié)果大體一致，說明該基因 忍片可W較準(zhǔn)確地鑒定出海洋環(huán)境e-變形菌的種類。
[0052] 實(shí)施例4:利用忍片檢測海水樣品中的0-變形菌群落結(jié)構(gòu)
[0化3] 將海水樣品224、1514、￥謹(jǐn)8601、￥1?404、？6104、冊?1104、203、602與本發(fā)明的海洋 e-變形菌群落檢測基因忍片進(jìn)行雜交，具體方法如實(shí)施例2。其中，22A與151A來自2013年東 海海水樣；203與602來自2012郵塘水樣;Y1MB601和Y1P404來自2014年夏季大塘郵腸道； PE104和HSPI104為2013秋季大塘樣品。將忍片檢測出的各個(gè)0-變形菌的種類和豐度進(jìn)行 PCoA分析，并與高通量測序結(jié)果的PCoA分析進(jìn)行比較。忍片檢測結(jié)果表明海水樣品22A與 151A的0-變形菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，聚在一起;203、602與Y1MB601、Y1P404均來自郵相關(guān) 樣品，其中的e-變形菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高，聚在一起;PE104、HSP104的0-變形菌群落結(jié)構(gòu) 相似性較高，聚在一起。高通量測序結(jié)果同樣表明海水樣品22A與151A聚在一起，203、602、 Y1MB60UY1P404聚在一起，其余兩個(gè)環(huán)境樣品聚在一起。運(yùn)說明本發(fā)明的基因忍片可W準(zhǔn) 確、快速的對海水e-變形菌群落進(jìn)行鑒定，且大大縮短了檢測時(shí)間。因此，為海洋環(huán)境細(xì)菌 群落的監(jiān)測提供了有力的技術(shù)支持，為建立、健全近岸海域海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評價(jià)體系奠 定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片包含有芯片載體，以及固定在芯片載體 上的，用于檢測海水中的A1 caligenaceae菌、Burkholderiaceae菌、Comamonadaceae菌、 Hydrogenophilaceae菌、MethylophilaceaeT^NeisseriaceaeT^Nitrosomonadaceaelif、 Oxalobacteraceae 菌、Rhodocyclaceae 菌中的任一種的探針， 其中用于檢測Alcaligenaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:l-3中的任 一種或幾種； 用于檢測Alcanivoracaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID N0:4_6中的任一 種或幾種； 用于檢測Comamonadaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID N0:7_9中的任一種 或幾種； 用于檢測Hydrogenophilaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:10-12中的任 一種或幾種； 用于檢測Methylophilaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQIDN0:13-15中的任一 種或幾種； 用于檢測Neisseriaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 16-18中的任一種 或幾種； 用于檢測Nitrosomonadaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ IDN0:19-21中的任 一種或幾種； 用于檢測Oxalobacteraceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ IDN0:22-23中的任一 種或幾種； 用于檢測Rhodocyclaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID N0:24_26中的任一 種或幾種。2. 如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的芯片載體還固定有雜交陽性對照 質(zhì)控探針、雜交陰性對照質(zhì)控探針、表面化學(xué)質(zhì)控探針中的任一種或幾種。3. 如權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述的雜交陽性對照質(zhì)控探針的核苷酸 序列為SEQ ID NO:27。4. 如權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述的雜交陰性對照質(zhì)控探針的核苷酸 序列為SEQ ID NO:28。5. 如權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述的表面化學(xué)質(zhì)控探針的核苷酸序列 為SEQ ID N0:29。6. 如權(quán)利要求5所述的基因芯片，其特征在于，表面化學(xué)質(zhì)控探針用HEX染料進(jìn)行標(biāo)記。7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基因芯片在檢測海洋環(huán)境γ-變形菌群落中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK106048077SQ201610708997
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月23日
【發(fā)明人】趙維, 王敬敬, 黃志勇
【申請人】中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所