專利名稱：檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法，尤其涉及一種檢測(cè)四種/四種以上侵襲 性念珠菌的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法。屬于真菌核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，適 用于臨床及科研中對(duì)白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌及其他侵襲性念 珠菌的快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著器官移植、骨髓移植的廣泛開展，艾滋病和腫瘤患者的增多以及皮質(zhì)類 固醇激素、廣譜抗生素、免疫抑制劑的大量應(yīng)用，侵襲性念珠菌感染的發(fā)病率明顯增高。 美國(guó)的一項(xiàng)前瞻性研究顯示，真菌感染占醫(yī)院血行感染的9.5%。念珠菌感染對(duì)免疫抑制和 免疫缺陷病人的危害性大，死亡率高達(dá)45%,已成為威脅患者生命最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。研 究表明，盡管白色念珠菌仍是侵襲性念珠菌感染最主要的病原菌，但其在臨床分離菌中所 占的比例逐年下降，而熱帶念珠菌等非白色念珠菌(non-albicans Candida, NAC)感染比例 呈上升趨勢(shì)，且克柔念珠菌對(duì)氟康唑天然耐藥，光滑念珠菌對(duì)此藥不敏感，給臨床的治療 帶來(lái)一定的困難。既往研究發(fā)現(xiàn)，早期有效的抗念珠萬(wàn)治療可以顯著改善預(yù)后。因此，早 期確診侵襲性感染念珠菌菌種，對(duì)其實(shí)施針對(duì)性治療，及時(shí)救治生命具有重要意義。
然而，侵襲性念珠菌感染的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，不同病原菌之間在毒力、感染部位、 藥物敏感性以及臨床預(yù)后等方面均有差異，對(duì)其做出診斷常需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果。目前 侵襲性念珠菌的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括真菌'培養(yǎng)和表型檢測(cè)法、血清學(xué)檢測(cè)法、組織病理切 片鑒定法與分子生物學(xué)鑒定技術(shù)等。真菌培養(yǎng)受取材時(shí)間、取材部位、樣本因素、培養(yǎng)條 件等因素的影響，陽(yáng)性率一直很低，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，常規(guī)培養(yǎng)需要3天，不能發(fā)揮指導(dǎo)臨床 早期針對(duì)性治療的作用。血清學(xué)方法雖然因操作過(guò)程簡(jiǎn)便而廣受實(shí)驗(yàn)室歡迎，但該方法應(yīng) 用范圍窄，又存在交叉抗原，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，且無(wú)法鑒定到種，無(wú)法滿足診斷需 要。組織病理鑒定法是臨床侵襲性念珠菌病的確診方法，但因該法是有創(chuàng)性檢查，患者較 難接受，且重癥侵襲性真菌感染患者，常常伴有血小板減少，凝血功能差， 一般不宜采用 組織活檢方法。該方法陽(yáng)性率低。因此，前述的實(shí)驗(yàn)室'診斷方法限制了其在臨床診斷中的 運(yùn)用。
由于分子生物學(xué)方法特異性和敏感性高，并且可快速診斷，是目前真菌感染診斷研究 中最活躍的一種方法；熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR)技術(shù)具有自 動(dòng)化程度高、操作過(guò)程全封閉、無(wú)污染、實(shí)時(shí)性、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于病 毒、細(xì)菌等病原體的檢測(cè)；因此，本發(fā)明基于分子生物學(xué)方法，研究一種檢測(cè)侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的，是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測(cè)四種/四種以上侵 襲性念珠菌的快速診斷試劑盒。
本發(fā)明的第二個(gè)目的，是為了提供檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌快速診斷試劑盒的 應(yīng)用方法。
本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到-
檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特征是
1) 在所述試劑盒內(nèi)設(shè)有熒光定量PCR反應(yīng)液、至少四種念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì) 控品；
2) 所述熒光定量PCR反應(yīng)液含有特異性引物和四種念珠菌相對(duì)應(yīng)的熒光探針，所述特 異性引物序列如序列表SEQ IDNe: l所示；
3) 所述侵襲性念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱 帶念珠菌或由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌加上若干種其他侵襲性 念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)"煮沸法"獲得的Dk樣品；所述陰性質(zhì)控品為滅菌三蒸水。
本發(fā)明的第一個(gè)目的還以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到
本發(fā)明的一種實(shí)施方式是所述侵襲性念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品是由白色念珠菌、克柔念 珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)"煮沸法"獲得的DNA樣品；與白色念珠菌、 克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌相對(duì)應(yīng)的熒光探針序列如序列表SEQ IDNS: 2所示。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式是所述其他侵襲性念珠菌,可以是近平滑念珠菌、季也蒙念珠
菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念珠菌中的一種或二種以上組合。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式是所述熒光定量PCR反應(yīng)液包括25Ul反應(yīng)體系包括
Brilliant QPCR Master mixl112. 5ul，通用引物(0.1,1/1)各O. 5ul，四條探針
(0. lmmol/1)各0. 25 u 1， DNA模板1 1，補(bǔ)DEPC (力'et/ jp;^rocar力o朋te，焦碳酸二乙 酯)水至25u 1。
本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過(guò)采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下 步驟
1)用"煮沸法"從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA;2) 分別取第l)步中待測(cè)標(biāo)本的DNA和與所述DNA同樣量的陽(yáng)性質(zhì)控品，加入到含有 熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中；
3) 用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果的Ct值，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。
4) 所述結(jié)果判斷方法是檢測(cè)樣品Ct值《35.0者，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線判為陽(yáng)性； 無(wú)Ct值，且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線者判為陰性；若Ct值〉35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣 本，按前述步驟重做。重做結(jié)果出現(xiàn)Ct值和典型的擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。
本發(fā)明的第二個(gè)目的還可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到
所述熒光定量PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)條件是95。C變娃l(Mn, 95。C30s， 59。Clmin， 59°C lmin，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。
所述Ct值指熒光信號(hào)在每次循環(huán)的延伸階段收集，熒光信號(hào)閾值以剛好超過(guò)正常陰性 對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所需的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。
本發(fā)明的作用原理利用Taq酶的5' —3'外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同 熒光(例如F屈、HEX、 CY5、 ROX)標(biāo)記的四條探針，分別和四種念珠菌的保守基因序列相 對(duì)應(yīng)，四條探針的5'端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM(或HEX、 CY5、 ROX)，靠近3，端標(biāo)以熒光 淬滅基團(tuán)BHQ1 (或BHQ3)。反應(yīng)體系中的每種探針可以與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生 特異性雜交，每種探針對(duì)應(yīng)每種堿基序列。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的 熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，檢測(cè)波長(zhǎng)處光密度增加 而被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生i雜交，延伸期T叫酶隨引物延伸沿 著DNA模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針結(jié)合處切斷探針，淬滅作用被解除，熒光信號(hào)釋放出來(lái)。 模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放，結(jié)果中被檢測(cè)到的熒 光信號(hào)所標(biāo)記的探針，對(duì)應(yīng)于檢測(cè)區(qū)域的基因類型。
本發(fā)明具有的有益效果如下
1、 本發(fā)明結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，采用通用引物和白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念 珠菌、熱帶念珠菌的種特異探針，開發(fā)研制出用于檢測(cè)四種對(duì)氟康唑等臨床一線抗真菌藥 敏感性不同的侵襲性念珠菌的試劑盒，可同步對(duì)四種侵襲性念珠菌進(jìn)行檢測(cè)，能夠?yàn)榕R床 侵襲性念珠菌病的早期病原體診斷提供依據(jù)，以便早期及時(shí)制定治療方案，'減少死亡率和 后遺癥。
2、 本發(fā)明的試劑盒的特異性好，通過(guò)引物高特異擴(kuò)增和熒光探針的高特異雜交雙重控 制，具有很高的準(zhǔn)確性，假陽(yáng)性低；能簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏地同時(shí)檢測(cè)四種對(duì)氟康唑 等臨床一線抗真菌藥敏感性不同的侵襲性念珠菌，為臨床侵襲性念珠菌病的早期病原體診 斷提供依據(jù)。3、本發(fā)明試劑盒具有靈敏度高，反應(yīng)過(guò)程由熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控，熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì) 熒光信號(hào)具有很高的檢測(cè)靈敏度；檢測(cè)速度快，僅2.5小時(shí)，加上樣品DNA的提取制備， 共需3小時(shí)；步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；所有試劑均是一次性擴(kuò)增，沒(méi)有后處理，毋需開蓋， 不產(chǎn)生污染。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用試劑Brilliant QPCR Master mixII ，購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司;PCR通 用引物和熒光探針，購(gòu)自上海超世生物技術(shù)有限公司。
具體實(shí)施例1
本實(shí)施例1構(gòu)成檢測(cè)四種侵襲性念珠菌的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法。 包括盒體和設(shè)置在盒體內(nèi)的熒光定量PCR反應(yīng)液、四種念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品； 所述熒光定量PCR反應(yīng)液含有特異性引物和四種念珠菌相對(duì)應(yīng)的熒光探針；所述侵襲性念
珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)"煮
沸法"獲得的DNA樣品，所述陰性質(zhì)控品為滅菌三蒸水。
所述三種物質(zhì)的制備方法如下
1)熒光定量PCR反應(yīng)液的配制Brilliant QPCR Master mixl112. 5nl，通用引物
(0. l咖o1/1)各O. 5ul， 4條探針(0. lmmol/1)各0.25ul, DNA模板lpl，補(bǔ)DEPC水至25 1。
其中通用引物包括正向引物、反向引物兩種，分別是 正向引物(P1): 5'~ GGC ATGCCTGTTTGAGCGT ~ 3'; 反向引物(P2) : 5' ~ TCCTCCGCTTATTGATATGC — 3'; 所述4條探針如表1所述
表1種特異性熒光定量PCR探針序列及熒光標(biāo)記
白色念珠菌FAM-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGATCCCG-B叫1
克柔念珠菌腿-TCGGAGCTGCGACTCGCCTGA-B即
光滑念珠菌CY5-TTAATCTGCTGCTCGTTTGCGCGA-BHQ3
熱帶念珠菌ROX-.CGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACA-BHQ1
2)白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌陽(yáng)性質(zhì)控品四種念珠菌經(jīng)"煮沸法"獲得的DNA樣品，一2(TC保存。 3)陰性質(zhì)控品滅菌三蒸水。
本發(fā)明特異檢測(cè)四種念珠菌的快速診斷試劑盒的使用方法如下
1) 模板DNA的制備
取含菌懸液]ml， 13，000rpm離心10min。棄上清，沉淀中加入lmL滅菌生理鹽水，振蕩懸
浮，13， 000rpm離心lOmin。棄上清，向沉淀加入滅菌三蒸水100 n 1，再放入100'C水浴18min， 13， OOOrptn離心10min,取上清，置-20。C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 2) 熒光定量PCR反應(yīng) ，
取熒光定量PCR反應(yīng)液M.5u 1，加入第一步所取得的DNA模板In 1，補(bǔ)DEPC水至25n 1。 循環(huán)條件為95'C變性10min， 95'C30s， 59'Clmin， 59。Clmin，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)在每 次循環(huán)的延伸階段收集。
3) 結(jié)果判斷
循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件分析檢測(cè)結(jié)果。循環(huán)域值(Ct值)設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲
情況調(diào)整，以Ct值剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)；陰性結(jié)果判定無(wú)Ct值，且 無(wú)典型的擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性結(jié)果判定Ct值《35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；實(shí)驗(yàn)灰區(qū)Ct值〉 35.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣本建議重做。重做結(jié)果出現(xiàn)Ct值和典型的擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，
否則為陰性。
本實(shí)施例提供檢測(cè)四種侵襲性念珠菌的多重?zé)晒舛╥ PCR試劑盒，主要針對(duì)四種念珠 菌檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片斷進(jìn)行反應(yīng)體系，如引物和探針濃度、退火溫度等的優(yōu) 化，建立了多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)四種侵襲性念珠菌的方法，是一種特異檢測(cè)四種侵襲性 念珠菌的熒光定量PCR快速診斷試劑盒。，
具體實(shí)施例2
本實(shí)施例2構(gòu)成檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其 應(yīng)用方法。
本具體實(shí)施例2的特點(diǎn)是所述侵襲性念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品由白色念珠菌、克柔念珠 菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌加上若干種其他侵襲性念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)"煮沸法"獲得 的DNA樣品，所述侵襲性念珠菌的陰性質(zhì)控品為滅菌三蒸水。所述其他侵襲性念珠菌可以 是近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念珠菌中的一種或二種以上組合。 其余與具體實(shí)施例l相同。
結(jié)合表2、表3所示，用本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增13種94株臨床上常見的致病性真菌、5種細(xì)菌和人全血細(xì)胞DNA，白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌的Ct值均《35.0，鑒 定結(jié)果為陽(yáng)性，而其它念珠菌、細(xì)菌、曲霉菌、新生隱球菌、人類基因組DNA等Ct值無(wú)讀數(shù)， 呈陰性結(jié)果。
由表2、表3數(shù)據(jù)結(jié)果充分證明本發(fā)明試劑盒具有很好的特異性。 具體實(shí)施例3
將白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌懸液按IO倍倍比稀釋為5X108、 5 X107、 5Xl(f、 5X105、 5X101、 5X10'、 5X102、 5X 10'CFU/ml。按上述方法提取腿后進(jìn)行熒 光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果在5X 10'CFU/ml均仍能觀察到"S"型曲線，表明熒光定量PCR法最低可 檢出5X10'CFU/ml的上述四種念珠菌，苯發(fā)明的試劑盒具有很強(qiáng)的靈敏性。
具體實(shí)施例4
隨機(jī)抽取的10份樣品，經(jīng)多重?zé)晒舛縋CR法進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均與常規(guī)真菌培養(yǎng) 結(jié)果相符，證明本發(fā)明試劑盒具有很好的重復(fù)性。
表2多重?zé)晒舛縋CR法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)菌株編號(hào)白色念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌熱帶念珠菌
白色念珠菌ATCC64548+一—一
白色念珠菌ATCC90028+—一—
克柔念珠菌ATCC5258，一+一—
克柔念珠菌ATCC6258一+一一
光滑念珠菌ATCC2001一—+—
熱帶念珠菌ATCC750——一+
乳酒念珠菌ATCC10022———一
近平滑念珠菌ATCC22019一t—一
季也蒙念珠菌ATCC6260一——一
葡萄牙念珠菌ATCC38533一—一—
黑曲霉菌ATCC16404一—一
煙曲霉菌ATCC10894—一一一
土曲霉菌ATCC10020一一一一標(biāo)準(zhǔn)菌株 編號(hào)
白色念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌熱帶念珠菌
黃曲霉菌 ATCC 16870
大腸埃希菌 ATCC 35218 肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 陰溝腸桿菌 ATCC 700323 流感嗜血桿菌 ATCC 49247 銅綠假單胞桿f ATCC 27853
表3多重?zé)晒舛縋CR法檢測(cè)fe床分離菌株結(jié)果
菌株種類 多重?zé)晒舛縋CR法結(jié)果
白色念珠菌(n=18)白色念珠菌18/18
克柔念珠菌(n=10)10/10
光滑念珠菌(n=16)光滑念珠菌16/16
熱帶念珠菌(n=16)熱帶念珠菌16/16
乳酒念珠菌(n=2)陰性2/2
季也蒙念珠菌(n=2)陰性 t2/2
近平滑念珠菌(n=8)陰性8/8
葡萄牙念珠菌(n=6)陰性6/6
新生隱球菌(n=2) ,陰性2/2
通過(guò)上述具體實(shí)施例可知，念珠菌核糖體RNA基因(rDNA)為串連重復(fù)序列，由編碼 18S rRNA、 5. 8S rRNA、 28SrRNA的基因和相互之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internally transcribed spacers ，ITS)構(gòu)成。編碼rRNA的基因在生物進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守， 一定程度上反映了各 物種間的進(jìn)化關(guān)系和種間差異，可作為研究生物系統(tǒng)進(jìn)化和分類的可靠參照物，設(shè)計(jì)通用 引物。ITS區(qū)進(jìn)化速率較快，具有一定的種間變異性和種內(nèi)保守性，可用于區(qū)分同屬不同種 乃至種內(nèi)水平的變異。其中，ITSII區(qū)有較高的種間變異性和種內(nèi)特異性，可用來(lái)設(shè)計(jì)種特 異核酸探針。根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物和針對(duì)可變區(qū)'設(shè)計(jì)的種特異核酸探針，不僅可以 把真菌跟其他病原菌區(qū)分開來(lái)，而且可將其鑒定到種。序列表
<110>廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、廣州呼吸疾病研究所、呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
<120>檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法
<160〉 2
<210〉1
<211〉
〈212〉DNA ,
<213>人工序列
<220〉
<223>為了用于病毒、細(xì)菌等病原體的檢測(cè)而設(shè)計(jì)的引物，用作熒光定量PCR擴(kuò)增 <400〉1
正向引物(P1): ggcatgcctg tttgagcgt 19 反向引物(P2): tcctccgctt attgatatgc 20
<210>2
<211〉
<212>DNA
<213>人工序列
<220〉
〈223〉為了用于病毒、細(xì)菌等病原體的檢測(cè)而設(shè)計(jì)的四種特異性熒光定量PCR探針序列及 熒光標(biāo)記序列，用作熒光定量PCR擴(kuò)增 ' <400>2
白色念珠菌 FAM_ cctaagccattgtcaaagcgatcccg-BHQ1 克柔念珠菌 HEX- tcggagctgcgactcgcctga-BHQ1 光滑念珠菌 CY5- ttaatctgctgctcgtttgcgcga-BHQ3 熱帶念珠菌麗-cgcttattttgc"gtggccaccaca-BHQ權(quán)利要求
1、檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，包括盒體，其特征是1)在所述試劑盒內(nèi)設(shè)有熒光定量PCR反應(yīng)液、至少四種念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品；2)所述熒光定量PCR反應(yīng)液含有特異性引物和至少四種念珠菌相對(duì)應(yīng)的熒光探針，所述特異性引物序列如序列表SEQ ID №1所示；3)所述侵襲性念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌或由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌加上若干種其他侵襲性念珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)“煮沸法”獲得的DNA樣品，所述陰性質(zhì)控品為滅菌三蒸水。
2、 如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，其特征 是所述侵襲性念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品是由白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念 珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)"煮沸法"獲得的DNA,樣品；與白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、 熱帶念珠菌相對(duì)應(yīng)的熒光探針序列如序列表SEQ IDNs: 2所示。
3、 如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒，其特征 是所述其他侵襲性念珠菌可以是近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌和乳酒念 珠菌中的一種或任意二種以上組合。
4、 檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟1) 用"煮沸法"從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA;2) 分別取第l)步中待測(cè)標(biāo)本的DNA和與所述DNA同樣量的陽(yáng)性質(zhì)控品，加入到含有 熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中；3) 用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，'根據(jù)反應(yīng)結(jié)果的Ct值，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。4) 所述結(jié)果判斷方法是檢測(cè)樣品Ct值《35.0者，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線判為陽(yáng)性； 無(wú)Ct值，且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線者判為陰性；若Ct值〉35.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣 本，按前述步驟重做。重做結(jié)果出現(xiàn)Ct值和典型的擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。
5、 如權(quán)利要求4所述檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法， 其特征在于熒光定量PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)條件是95。C變性10rain， 95。C30s， 59。Clmin， 59'Clmin，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。
6、 如權(quán)利要求4所述檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法， 其特征在于所述Ct值指熒光信號(hào)在每次循環(huán)的延伸階段收集，熒光信號(hào)閾值以剛好超過(guò) 正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所需的擴(kuò)增循環(huán)次 數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)四種/四種以上侵襲性念珠菌的快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法，其特征是在試劑盒內(nèi)設(shè)有含有特異性引物和至少四種念珠菌相對(duì)應(yīng)的熒光探針的熒光定量PCR反應(yīng)液、至少四種念珠菌的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)儀檢測(cè)的Ct值進(jìn)行判斷。本發(fā)明試劑盒具有特異性好，靈敏度高的特點(diǎn)；通過(guò)引物高特異擴(kuò)增和熒光探針的高特異雜交雙重控制，假陽(yáng)性低；能簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏地同時(shí)檢測(cè)四種對(duì)氟康唑等臨床一線抗真菌藥敏感性不同的侵襲性念珠菌。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101509037SQ20091003818
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者何為群, 劉曉青, 張彥峰, 淳 楊, 靈 楊, 袁錦屏, 邱桂霞, 黃紅川, 黎毅敏 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;廣州呼吸疾病研究所;呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室