一種以非編碼RNA Tmevpg1為檢測(cè)或診斷篩查標(biāo)志物的重癥肌無力檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及以非編碼RNA Tmevpgl為檢測(cè)或診斷篩查標(biāo) 志物的重癥肌無力檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 重癥肌無力（myasthenia gravis, MG)是一種由B細(xì)胞介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補(bǔ)體參 與的累及神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)為神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscular junction, NMJ)傳遞障礙導(dǎo)致的骨骼肌無力，易疲勞。研究表明抗NMJ處的乙酰膽堿受 體（acetylcholine receptor, AchR)抗體是主要的抗體，另外anti-AchR陰性的全身型 MG 患者約 40% 可 anti-MuSK (muscle-specific tyrosine kinase,)抗體陽性，anti-AchR 及 anti-MuSK 抗體均陰性的全身型 MG 患者約 20 % 可 anti_LRP4 (Lipoprotein-Related Protein 4)抗體陽性。MG的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，環(huán)境、遺傳、激素水平等因素均可參與其發(fā) 病。CD4+T細(xì)胞在MG的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，一定的誘因下使機(jī)體內(nèi)環(huán)境中促炎因子占優(yōu)勢(shì)， 自身免疫系統(tǒng)紊亂，免疫耐受被打破，⑶4+T細(xì)胞被激活，Thl，Th2，Thl7、Treg亞群比例失 衡，輔助B細(xì)胞增殖分化，產(chǎn)生自身抗體，從而破壞神經(jīng)肌肉接頭處的AchR結(jié)構(gòu)或影響其大 量聚集，使神經(jīng)興奮性遞質(zhì)無法有效傳遞，從而產(chǎn)生重癥肌無力的臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可累及 呼吸肌危及生命。MG發(fā)病率較高，目前仍呈上升趨勢(shì)，顯著影響了患者的生活及生存質(zhì)量 給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，早期預(yù)防和篩查重癥肌無力疾病顯得十分重 要，而目前針對(duì)該種疾病的早期預(yù)防篩查還沒有明顯的措施。
[0003] LncRNAs (long noncoding RNAs)是長度大于200bp的長鏈非編碼RNA。全基因 組水平非編碼DNA序列的研究發(fā)現(xiàn)，在人類基因組中大約有10, 000?200, 000種不同類 型IncRNAs被轉(zhuǎn)錄。近年來的研究表明，IncRNAs具有廣泛的生物學(xué)功能，可通過以下機(jī)制 1.募集染色體重塑復(fù)合體到特定的基因位點(diǎn)來標(biāo)記基因沉默區(qū)域；2募集轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn) 或抑制基因表達(dá).；3.轉(zhuǎn)錄基因的反義鏈IncRNA可調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因相應(yīng)mRNAs的剪接或引導(dǎo) 其降解，來參與細(xì)胞凋亡、分化、發(fā)育等多種重要的調(diào)控過程。LncRNAs在免疫系統(tǒng)中也有著 不可忽視的作用，它參與了 CD8+T細(xì)胞的激活與分化，并且隨著T細(xì)胞的分化而呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài) 的變化，對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育凋亡起關(guān)鍵作用。研究表明，IncRNAs與人淋巴細(xì)胞白血病、癌癥 的發(fā)生有關(guān)，可作為淋巴細(xì)胞型白血病易感性的標(biāo)記物之一。而在重癥肌無力中還沒有報(bào) 道IncRNA作為其發(fā)生、預(yù)后判斷的標(biāo)志物以及靶點(diǎn)治療的位點(diǎn)。因此，項(xiàng)目給予前期非編 碼RNATmevpgl在重癥肌無力中的表達(dá)水平，開發(fā)一種以IncRNA為基礎(chǔ)的判斷重癥肌無力 發(fā)生、以及預(yù)后標(biāo)志物的試劑盒。
[0004] Tmevpgl是在免疫系統(tǒng)中第一個(gè)被證實(shí)的IncRNA，又名IFNG-ASl，研究發(fā)現(xiàn) Tmevpgl位于染色體上編碼細(xì)胞因子的基因叢中，如INF-γ，IL-22, IL-26,并且包含了整 個(gè)IFNG基因的反義鏈，可以調(diào)控INF-γ的基因表達(dá)。人Tmevpgl在NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞 中均有表達(dá)。研究表明，人Tmevpgl的基因表達(dá)是Thl細(xì)胞選擇性的，尤其是效應(yīng)性Thl細(xì) 胞，即受Thl細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Stat4和τ-bet的調(diào)控。因此，Tmevpgl在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮 重要的功能，其異常表達(dá)可能參與了免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展。然而Tmevpgl在重癥肌無 力疾病中目前還沒有研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以非編碼RNATmevpgl為檢測(cè)或診斷 篩查標(biāo)志物的重癥肌無力檢測(cè)試劑盒。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0007] 所述以Tmevpgl為檢測(cè)或診斷篩查標(biāo)志物的重癥肌無力檢測(cè)試劑盒包括如下引 物：
[0008] Tmevpgl的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引物為：
[0009] 正向引物為：5' -CATGGTACATGTGGGTCCAA-3'（SEQ ID NO. 1);
[0010] 反向引物為：5' -TTAGCAGTTGGTGGGCTTCT-3'（SEQ ID NO. 2);
[0011] GAPDH的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引物為：
[0012] 正向引物為 5' -CTCATGACCACAGTCCATGC-3'（SEQ ID NO. 3);
[0013] 反向引物為 5' -TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0014] 上述試劑盒中試劑盒包括本領(lǐng)域提取RNA的常規(guī)試劑，如下：淋巴細(xì)胞分離液； RNAiso Plus;無水乙醇；三氯甲燒；異丙醇。DEPC水或無酶水。TaKaRa的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)。突光定量 PCR 突光染料 SYBR 及緩沖液，雙蒸水。
[0015] 上述Tmevpgl的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引物和GAPDH的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引 物用于制備重癥肌無力檢測(cè)試劑。
[0016] 上述長鏈非編碼RNA Tmevpgl用于制備重癥肌無力檢測(cè)或診斷篩查標(biāo)志物。
[0017] 發(fā)明人已檢測(cè)了 Tmevpgl在25例重癥肌無力及10例健康對(duì)照組中的表達(dá)。結(jié) 果顯示，Tmevpgl在重癥肌無力中低表達(dá)，與對(duì)照相比，p〈0. 05,具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1)，圖1顯示Tmevpgl在重癥肌無力患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，這些結(jié)果提示 Tmevpgl是重癥肌無力診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的重要標(biāo)志物之一，S卩，Tmevpgl作為其發(fā) 生的標(biāo)志物以及靶點(diǎn)治療的位點(diǎn)。因此，本發(fā)明開發(fā)的以Tmevpgl為基礎(chǔ)的判斷重癥肌無 力發(fā)生、以及預(yù)后標(biāo)志物的試劑盒具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。本發(fā)明試劑盒通過相對(duì) 定量的檢測(cè)重癥肌無力患者外周血標(biāo)本中Tmevpgl的表達(dá)水平，用于重癥肌無力篩查和診 斷。
【附圖說明】
[0018] 圖1是非編碼RNATmevpgl在重癥肌無力患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】 [0019] 實(shí)施例中所用常規(guī)試劑均為市售
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 一、RNA提取方法：
[0022] (1)用EDTA抗凝采血管采取外周肘靜脈血樣標(biāo)本5ml。
[0023] (2) 3000rpm室溫離心IOmin,小心吸出上層血清。
[0024] (3)向剩余的血液樣本中加入等體積PBS (I X)液，充分吹打混勻稀釋血樣；
[0025] (4)將上述稀釋后的血樣靠壁緩慢地加入到另一已加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液 的離心管中，并使上述混合液處于淋巴細(xì)胞分離液液面之上（即兩種液體不要混合，保留 清晰的界面），2400rpm室溫離心20min ;
[0026] (5)用移液槍小心吸取離心后標(biāo)本中第二層白細(xì)胞膜層，裝入一新的無酶離心管 中，3000rpm，4°C離心 IOmin,棄上清；
[0027] (6)加入Iml PBS(IX)液洗滌白細(xì)胞，4°C離心lOmin，棄上清；
[0028] (7)重復(fù)步驟6
[0029] (8)加入ImlRNAiso plus，吹打溶解細(xì)胞至白色絮狀物完全消失，室溫（15-30°C ) 靜置5分鐘使核蛋白體完全分解（注意：若不繼續(xù)做完整個(gè)提取，震蕩后可直接放入-80°C 凍存）
[0030] (9)每ImlRNAiso plus加入200ul氯仿；若為凍存標(biāo)本，需從-80°C冰箱中取出后 在冰上溶解，劇烈震蕩15s (使充分變性），室溫靜置5分鐘后12000rpm，4°C離心15min，吸 取上清轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中；
[0031] (10)加入200ul氯仿，重復(fù)步驟9
[0032] (11)加入與上清液等體積的異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫放置30min。
[0033] (12) 12000rpm，4°C離心 lOmin，小心吸棄上清；
[0034] (13)加入Iml的75%乙醇（DEPC水配制），上下顛倒混勻后；7500rpm，4°C離心 5min〇
[0035] (14)棄上清，室溫干燥5-10min，待殘余的乙醇揮發(fā)完全后，加入適量的DEPC水溶 解RNA沉淀，存于-70°C。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。
[0036] 二、RNA提出質(zhì)量檢測(cè)：
[0037] (I) NanoDrop? ND-IOOO 測(cè)定 RNA 濃度和純度，
[0038] 測(cè)量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零，滴加 I. 5ul洗滌測(cè)量基座的三次，用擦鏡 紙擦拭，加 I. 5ul樣本測(cè)定RNA的濃度。RNA的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一，260nm/280nm的比值在 1. 7-2. 0之間為合格樣本，樣本除了 260nm的峰外無明顯的雜峰。
[0039] (2)瓊脂糖凝膠檢測(cè)RAN的質(zhì)量
[0040] 用無酶水配置TAE電泳buffer，配置2%的瓊脂糖凝膠，100V的電壓電泳，15min， 拍照檢測(cè)28S、18S和5S的亮度，如果條帶出現(xiàn)彌散則為不合格RNA。
[0041] 三、RNA逆轉(zhuǎn)錄方法：
[0042] (1)融解IncRNA反轉(zhuǎn)錄所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待 用
[0043] (2)去除基因組DNA反應(yīng)
[0044] 按表1所示成分于冰上配制反應(yīng)混合液至總體積IOul
[0045] 表 1
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以非編碼RNA Tmevpgl為檢測(cè)或診斷篩查標(biāo)志物的重癥肌無力檢測(cè)試劑盒，其 特 征在于，所述試劑盒包括如下引物： Tmevpgl的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引物為： 正向引物為：5' -CATGGTACATGTGGGTCCAA-3' ； 反向引物為：5' -TTAGCAGTTGGTGGGCTTCT-3' ； GAPDH的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引物為： 正向引物為 5' -CTCATGACCACAGTCCATGC-3' ； 反向引物為 5' -TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的Tmevpgl的實(shí)時(shí)定量的特異性PCR引物和GAPDH的實(shí)時(shí)定量的 特異性PCR引物在制備重癥肌無力檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的Tmevpgl在制備重癥肌無力檢測(cè)或診斷篩查標(biāo)志物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以非編碼RNA？Tmevpg1為檢測(cè)或診斷篩查標(biāo)志物的重癥肌無力檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。該試劑盒通過相對(duì)定量的檢測(cè)重癥肌無力患者外周血標(biāo)本中Tmevpg1的表達(dá)水平，用于重癥肌無力篩查和診斷。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104561257
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410384004
【發(fā)明人】羅朝輝, 劉曉芳, 羅夢(mèng)川, 楊歡, 肖波, 徐立群, 李秋香
【申請(qǐng)人】中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年8月6日