專利名稱：一種用于測定嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)基因的基因檢測芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因分析檢測產(chǎn)品，更具體地，本發(fā)明涉及適用于測定與嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)病相關(guān)的基因(RET、SDHB、SDHD及VHL)基因型的基因檢測芯片，本發(fā)明還涉及測定所述基因(RET、SDHB、SDHD及VHL)基因型的方法。
背景技術(shù)：
嗜鉻細(xì)胞瘤是是腎上腺髓質(zhì)和腎上腺外嗜鉻組織的腫瘤，起源于胚胎神經(jīng)嵴，為自主神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。該病多為散發(fā)，也可表現(xiàn)為家族性，后者與遺傳有關(guān)，存在相應(yīng)的胚系易感基因突變，除單純的家族性嗜鉻細(xì)胞瘤外，還包括由RET(Rearranged during Transfection)突變導(dǎo)致的多內(nèi)分泌腺瘤病2型(multipleendocrine neoplasia type 2，MEN-2)、VHL基因突變導(dǎo)致的von Hippel-Lindau(VHL)病、I型神經(jīng)纖維瘤(NF1)、副節(jié)細(xì)胞瘤和SDH(線粒體復(fù)合酶II，又名琥珀酸脫氫酶，)基因相關(guān)的腫瘤[Koch CA，Vortmeyer AO，Huang SC，等，Genetic aspects of pheochromocytoma.Endocr Regul.2001；35(1)43-52.Review.Opocher G，Schiavi F，Conton P，等，Clinical and genetic aspects ofphaeochromocytoma.Horm Res.2003；59 Suppl 156-61.]。與散發(fā)型相比，遺傳型患者的發(fā)病年齡早，預(yù)后差，早期診斷和防治對于提高生存率有至關(guān)重要的作用。
1、RETMEN-2是一種常染色體顯性遺傳的單基因病。根據(jù)其臨床表現(xiàn)可分為3種亞型MEN-2A，MEN-2B和家族性甲狀腺髓樣癌(Familial medullary thyroidcarcinoma，F(xiàn)MTC)。MEN-2A型(Sipple綜合征)最為常見，臨床表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌(近100％)、嗜鉻細(xì)胞瘤(50％)，以及甲狀旁腺腺瘤或增生(20％)；MEN-2B型占MEN-2的5％，表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤，以及一些特殊體征；FMTC患者僅有甲狀腺髓樣癌[Takami H.Medullary thyroid carcinoma andmultiple endocrine neoplasia type 2.Endocr Pathol.2003；14(2)123-31；Yip L，CoteGJ，Shapiro SE，等.Multiple endocrine neoplasia type 2evaluation of thegenotype-phenotype relationship.Arch Surg.2003；138(4)409-16.]。
MEN-2病人的早期臨床表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌。資料表明，C細(xì)胞增生可見于20月齡的嬰兒，微小甲狀腺髓樣癌的病理改變可見于3歲兒童，病變轉(zhuǎn)移可在6歲兒童發(fā)生，90％以上患者在25歲前有甲狀腺髓樣癌的臨床表現(xiàn)。此病的早期診斷和防治是提高生存率的關(guān)鍵。
遺傳學(xué)研究表明，RET基因突變是MEN-2的病理基礎(chǔ)。此基因位于10q 11.2，全長約55kb，含有21個外顯子，蛋白表達(dá)物有3種亞型，為酪氨酸激酶受體(RTK)超家族成員，在腎臟和外周神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育中起重要作用[Kurokawa K，Kawai K，Hashimoto M等，Cell signaling and gene expressionmediatedby RET tyrosine kinase.J Intern Med.2003；253(6)627-33.]。迄今已發(fā)現(xiàn)RET基因的突變類型有169種(幾乎每個外顯子均存在突變)，這些突變與多種疾病有關(guān)，包括MEN-2、Hirschsprung病、全結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏癥、散發(fā)性甲狀腺髓樣癌、先天性中樞性換氣不足綜合癥(Congenital central hypoventilationsyndrome，CCHS)和嗜鉻細(xì)胞瘤等。不同的RET相關(guān)疾病中的突變位點不同，其中MEN-2A(25種)，MEN-2B(5種)、Hirschsprung病(101種)、全結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏癥(7種)、甲狀腺髓樣癌(31種)。國外MEN-2家系已報道有500多例，國內(nèi)患者目前僅發(fā)現(xiàn)10余例，在散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤病例中有4.8-7.8％的突變率[Januszewicz A，Neumann HP，Lon I，等，Incidence and clinical relevance of RETproto-oncogene germline mutations in pheochromocytoma patients.J Hypertens.2000；18(8)1019-23.Neumann HP，Bausch B，McWhinney SR，等，Germ-linemutations in nonsyndromic pheochromocytoma.N Engl J Med.2002；346(19)1459-66.]。
MEN-2A 85％的突變發(fā)生在第10和第11號外顯子編碼的半胱氨酸富含區(qū)，即第609、611、61 8、620、630和634位密碼子由高度保守的半胱氨酸突變?yōu)槠渌被?。此外，在?3和第14號外顯子也存在與MEN-2A相關(guān)的突變位點。
韓國的Kim等研制了一種可以檢測RET基因9個位點，57種點突變方式的芯片[Kim IJ，Kang HC，Park JH等，RET oligonucleotide microarray for thedetection of RET mutations in multiple endocrine neoplasia type 2 syndromes.ClinCancer Res.2002；8(2)457-63.]，但其信息容量有限，而且不同人種的基因突變與疾病相關(guān)性規(guī)律有所不同。
94％的MEN-2B的特異種系突變發(fā)生在第16號外顯子編碼的酪氨酸激酶區(qū)，即第918位密碼子由蛋氨酸突變?yōu)樘K氨酸(M918T)。也有突變發(fā)生于第922位密碼子的絲氨酸突變?yōu)槔野彼醄Kalinin VN，Amosenko FA，Shabanov MA等，Three novel mutations in the RET proto-oncogene.J Mol Med.2001；79(10)609-12.]。
約20％的散發(fā)型嗜鉻細(xì)胞瘤存在RET基因半胱氨酸富含區(qū)或酪氨酸激酶區(qū)的突變，且半胱氨酸富含區(qū)可有非半胱氨酸殘基的突變及10號外顯子的缺失[Beldjord C等，J Clin EndocrinolMetab，1995，80206322068.]。
2、SDHSDH是三羧酸循環(huán)和有氧電子傳遞呼吸鏈中的關(guān)鍵酶之一，包含A、B、C、D4個亞單位。亞單位A(SDHA，黃素蛋白)和B(SDHB，鐵硫蛋白)形成酶接觸中心，而亞單位C(SDHC)和D(SDHD)組成線粒體膜內(nèi)復(fù)合酶II錨定區(qū)，4個亞單位分別由4個基因編碼。
SDHB基因定位于1p36.1-p35，基因組DNA包含近40kb，8個外顯子，編碼鐵硫蛋白亞單位，有252個氨基酸。
SDHC基因定位于1q21，基因組DNA包含近50kb，6個外顯子，編碼琥珀酸。輔酶Q氧化還原酶中細(xì)胞色素b大亞單位(cybL)，有140個氨基酸。
SDHD基因定位于11q23，基因組DNA包含19kb，4個外顯子和3個內(nèi)含子，4個外顯子堿基對分別為52b、117b、145b、163b，編碼琥珀酸。輔酶Q氧化還原酶中細(xì)胞色素b小亞單位(cybS)，有103個氨基酸。
許多研究已發(fā)現(xiàn)SDHD、SDHC、SDHB基因突變與家族性副神經(jīng)節(jié)瘤(hereditary paraganglioma，PGL)和嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生有關(guān)，線粒體功能異常而引發(fā)致癌作用是其可能的機(jī)制。這些基因突變導(dǎo)致的PGL多為神經(jīng)嵴衍生的良性、生長緩慢的神經(jīng)外胚層腫瘤，高度血管化是其主要特點，可能由于SDH基因突變使線粒體氧傳感通路異常，造成組織缺氧，通過增加活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生進(jìn)而在低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的作用下，激活促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)等基因的轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤血管形成，在嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制中可能起一定作用[Favier J，Briere JJ，Strompf L，等，Hereditary paraganglioma/pheochromocytoma and inherited succinatedehydrogenase deficiency.Horm Res.2005；63(4)171-9.Review.Pawlu C，BauschB.Neumann HP.Mutations of the SDHB and SDHD genes.Fam Cancer.2005；4(1)49-54.Review.Bertherat J，Gimenez-Roqueplo AP.New insights in thegenetics of adrenocortical tumors，pheochromocytomas and paragangliomas.HormMetab Res.2005；37(6)384-90.Review.]。
目前已發(fā)現(xiàn)的SDHB基因突變有30種，至少20種與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)；SDHD基因突變有37種，至少10種與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)。[Gimenez-Roqueplo AP，F(xiàn)avier J，Rustin P，等，Mutations in the SDHB gene are associated with extra-adrenaland/or malignant phaeochromocytomas.Cancer Res.2003；63(17)5615-21；Astuti D，Latif F，Dallol A，等，Gene mutations in the succinate dehydrogenase subunitSDHB cause susceptibility to familial pheochromocytoma and to familialparaganglioma.Am J Hum Genet.2001；69(1)49-54；Astuti D，Douglas F，LennardTW，等，Germline SDHD mutation in familial phaeochromocytoma.Lancet.2001；357(9263)1181-2.Astuti D，Douglas F，Lennard TW，等]3、VHLVHL基因突變導(dǎo)致的VHL病是一種常染色體顯性遺傳性腫瘤綜合征，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)雙側(cè)多中心血管母細(xì)胞瘤(hemangioblastoma)、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎癌和腎、胰腺及附睪囊腫等。根據(jù)是否合并嗜鉻細(xì)胞瘤又分為1型(不合并嗜鉻細(xì)胞瘤)和2型(合并嗜鉻細(xì)胞瘤)，發(fā)病率為新生兒的1/36,000，18％有嗜鉻細(xì)胞瘤，常為雙側(cè)性。VHL基因?qū)儆谝职┗颍ㄎ挥?p25-26，有3個外顯子，編碼2種蛋白(pVHL)pVHL19和pVHL30分別含有160和213個氨基酸。pVHL與轉(zhuǎn)錄延長因子B，C及CUL2(VHL相關(guān)基因)一起形成復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)RNA聚合酶II的延伸過程，與mRNA穩(wěn)定性有關(guān)；此外，pVHL基因的失活導(dǎo)致泛醌化過程喪失，同時上調(diào)缺氧誘導(dǎo)的基因(如VEGF)表達(dá)，促進(jìn)血管生成，VHL失活引起HIF功能失調(diào)，可能是導(dǎo)致嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生的機(jī)制之一[Kim WY，Kaelin WG.Role of VHL gene mutation in human cancer.J Clin Oncol.2004；22(24)4991-5004.Review.Gimm O.Pheochromocytoma-associatedsyndromesgenes，proteins and functions of RET，VHL and SDHx.Fam Cancer.2005；4(1)17-23.Review.]。
目前已發(fā)現(xiàn)超過300種的VHL基因突變，散布于整個基因中，與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的突變超過30個，歐美的研究認(rèn)為遺傳性嗜鉻細(xì)胞瘤中，VHL基因突變最為多見[Neumann HP，Cybulla M，Shibata H，New genetic causes ofpheochromocytomacurrent concepts and the clinical relevance.Keio J Med.2005；54(1)15-21.Review.]。
目前的科研單位科研采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單股鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)、手工或自動測序、異源雙鏈分析等方法，所有這些都需經(jīng)過電泳環(huán)節(jié)，不僅操作繁瑣，檢測周期長，而且影響檢測經(jīng)過的因素多，不易控制，難以滿足臨床檢驗的要求，使臨床至今還無法開展有關(guān)嗜鉻細(xì)胞瘤易感檢驗的檢測。
基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進(jìn)展之一，提供了一種同時、快速檢測一種或幾種相關(guān)的單基因病所有致病基因、所有突變位點的方法，尤其適用于突變位點多，且散在分布或可能由不同的致病基因引起的基因病。它是將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產(chǎn)物等)，有序固定在固相載體(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團(tuán)修飾的載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜)上形成陣列，通過與實際樣本(或擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)行雜交反應(yīng)，只需一次實驗，就可高通量獲得所有待檢基因的信息。這種平行檢測、高信息通量的特點使其在基因表達(dá)、基因多態(tài)性檢測等方面的應(yīng)用受到廣泛重視。
嗜鉻細(xì)胞瘤是引起內(nèi)分泌性高血壓的重要原因，可以單獨(dú)發(fā)生，也可為其他疾病(如MEN-2、VHL病)的一種表型。其臨床表現(xiàn)錯綜復(fù)雜，常規(guī)的抗高血壓治療效果欠佳，并可引起嚴(yán)重的心、腦血管并發(fā)癥。但是，如果早期明確診斷是可治愈的。
根據(jù)我國成年人群高血壓患病率和嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)病率(1％左右)來估算[史軼蘩主編.協(xié)和內(nèi)分泌和代謝學(xué).科學(xué)出版社1999第一版]，我國大約有160萬嗜鉻細(xì)胞瘤患者，以RET為例，約有7.7-12.5萬患者可能攜帶RET突變基因。這意味著部分臨床診斷為散發(fā)性嗜鉻細(xì)胞瘤的患者可能將RET突變基因傳遞給子代，有90％的攜帶者將發(fā)展為甲狀腺髓樣癌。對于攜帶者及其親屬都需要進(jìn)行基因突變的檢測，以確定突變基因的傳遞情況，及早防治。然而長期以來，由于缺乏方便快捷的早期診斷手段和有效的鑒別診斷方法，患者常錯過最佳治療時機(jī)和正確的治療措施，其家族中攜帶致病基因的人群得不到正確的防治。
目前，對于大樣本，多基因、多突變位點的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)基因檢測，直接采用測序法檢測突變時間長、成本大、效率低，顯然已不能勝任。因此，現(xiàn)有技術(shù)中迫切需要一種可快速、方便、高通量進(jìn)行嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)基因突變檢測的方法和工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可快速、方便、高通量進(jìn)行嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)基因突變檢測的方法和工具。具體地，本發(fā)明提供了快速測定與嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)的RET、SDHB、SDHD及VHL基因型的基因檢測芯片。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于測定嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的基因芯片，它包括固相載體和有序固定于所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括(a)特異性地針對RET基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針；(b)特異性地針對SDHB基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針；(c)特異性地針對SDHD基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針；和(d)特異性地針對VHL基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的RET基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→AGC；
RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子11中第632位氨基酸密碼子GAG→AAG；RET基因外顯子11中第633位氨基酸附近密碼子ACGAGCTGTGCCGCACGGTGAT→ACGAGggCTGTGCCGCACGGTGAT；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子11中第640位氨基酸密碼子GCC→GGC；RET基因外顯子11中第641位氨基酸密碼子GCT→TCT；RET基因外顯子11中第648位氨基酸密碼子GTC→ATC；RET基因外顯子13中第768位氨基酸密碼子GAG→GAT；RET基因外顯子13中第768位氨基酸密碼子GAG→GAC；RET基因外顯子13中第790位氨基酸密碼子TTG→TTT；RET基因外顯子13中第791位氨基酸密碼子TAT→TTT；RET基因外顯子14中第804位氨基酸密碼子GTG→TTG；RET基因外顯子14中第804位氨基酸密碼子GTG→ATG；RET基因外顯子15中第904位氨基酸密碼子TCC→TGC；RET基因外顯子16中第918位氨基酸密碼子ATG→ACG；RET基因外顯子16中第922位氨基酸密碼子TCC→TAC；
所述的SDHB基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自SDHB基因外顯子2中第43位氨基酸密碼子GCC→CCC；SDHB基因外顯子2中第46位氨基酸密碼子CGA→GGA；SDHB基因外顯子2中第46位氨基酸密碼子CGA→TGA；SDHB基因外顯子2中第46位氨基酸密碼子CGA→CAA；SDHB基因外顯子3中第90位氨基酸密碼子CGA→TGA；SDHB基因外顯子6中第198位氨基酸的密碼子第591位缺失堿基C；SDHB基因外顯子6中第207位氨基酸的密碼子第620和621位缺失堿基TG；SDHB基因外顯子7中第230位氨基酸的密碼子CGC→TGC；SDHB基因外顯子7中第230位氨基酸的密碼子CGC→CAC；SDHB基因外顯子7中第238-240位氨基酸的密碼子第713-716位缺失堿基TCTC；所述的SDHD基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自SDHD基因外顯子2中第22位氨基酸的密碼子第64位C→T；SDHD基因外顯子2中第32位氨基酸的密碼子第94位TCA缺失TC；SDHD基因外顯子2中第38位氨基酸密碼子CGA→TGA；SDHD基因外顯子2中第50位氨基酸的密碼子第148-149位之間插入A；SDHD基因外顯子3中第68位氨基酸的密碼子第202-203位之間插入A；SDHD基因外顯子3中第92位氨基酸密碼子GAC→TAC；SDHD基因外顯子4中第112位氨基酸的密碼子第334-337位之間缺失ACTG；SDHD基因外顯子4中第121位氨基酸密碼子CAG→TAG；所述的VHL基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自VHL基因外顯子1中第93位氨基酸密碼子GGC→TGC；VHL基因外顯子1中第93位氨基酸密碼子GGC→GAC；VHL基因外顯子1中第98位氨基酸密碼子TAC→CAC；VHL基因外顯子1中第98位氨基酸密碼子TAC→TGC；VHL基因外顯子1中第112位氨基酸密碼子TAC→CAC；VHL基因外顯子3中第156位氨基酸密碼子TAT→TGT；
VHL基因外顯子3中第161位氨基酸密碼子CGA→CAA；VHL基因外顯子3中第167位氨基酸密碼子CGG→TGG；VHL基因外顯子3中第167位氨基酸密碼子CGG→CAG；VHL基因外顯子3中第178位氨基酸密碼子CTG→CCG；VHL基因外顯子3中第184位氨基酸密碼子CTC→CAC；VHL基因外顯子3中第188位氨基酸密碼子CTG→GTG。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸探針的種類為20-250種，并且每個寡核苷酸探針含有10-30個連續(xù)核苷酸。更特別的，每個寡核苷酸探針含有18-28個連續(xù)核苷酸。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，每個寡核苷酸探針的5′端還包含一段氨基修飾的4-25聚的聚脫氧胸苷酸(dT)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述致病相關(guān)突變位點位于突變位點所在寡核苷酸探針的中部。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列為(a)特異性地針對RET基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO55-129；(a)特異性地針對SDHB基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO1-17；(a)特異性地針對SDHD基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO18-33；和(a)特異性地針對VHL基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO34-54。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種同時確定樣品中RET、SDHB、SDHD及VHL基因型的方法，包括以下步驟(1)從樣品中抽提獲得DNA；(2)以步驟(1)中獲得的DNA為模板，擴(kuò)增獲得包含RET、VHL、SDHB、SDHD基因中突變位點的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)標(biāo)記步驟(2)中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物；
(4)將步驟(3)中所得經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交；(5)檢測基因芯片的雜交信號，從而確定樣品中RET、SDHB、SDHD及VHL基因型。
作為本發(fā)明的一個優(yōu)選例，上述步驟(2)中，分別在RET、VHL、SDHB、SDHD基因各自獨(dú)立的擴(kuò)增體系中擴(kuò)增包含突變位點基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
更佳地，在步驟(3)中，標(biāo)記所采用的標(biāo)記物選自地高辛，生物素，熒光素，Cy3，Cy5，堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，或它們的衍生物分子。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(5)中，檢測雜交信號的方法選自堿性磷酸酶催化的四氮唑藍(lán)(NBT)顯色反應(yīng)，辣根過氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)顯色反應(yīng)，辣根過氧化物酶催化的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的顯色反應(yīng)，或熒光檢測。
更佳地，所述的樣品是血液、毛發(fā)、口腔粘膜脫落物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于測定RET、SDHB、SDHD及VHL基因型的試劑盒，該試劑盒包含所述的基因芯片。
更佳地，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。
在本發(fā)明的第四方面，提供了所述的用于測定嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的基因芯片的用途，用于制備檢測嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的試劑盒。


圖1用本發(fā)明基因芯片檢測RET 804密碼子G/T基因型所得結(jié)果的照片。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛和深入的研究，從嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)基因中選出特別相關(guān)的RET、SDHB、SDHD或VHL基因，深入研究和分析了所述基因中各位點的突變對于疾病的影響情況。本發(fā)明人針對致病最為相關(guān)的突變位點，設(shè)計了相應(yīng)的基因探針，制備了檢測嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的檢測基因芯片。該基因芯片可以快速、有效地檢測測試對象患嗜鉻細(xì)胞瘤的易感性，從而可從人群檢測出嗜鉻細(xì)胞瘤有遺傳性突變的高危對象，為嗜鉻細(xì)胞瘤的早期診斷和輔助診斷提供有用的參考數(shù)據(jù)。
本發(fā)明所述的基因芯片，包括固相載體和有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針由10-30個(更特別的為18-28個)連續(xù)核苷酸組成。在一個優(yōu)選例中，采用的探針序列見表3，用于擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的序列見表2，突變位點信息見表1。
為了增強(qiáng)檢測信號的強(qiáng)度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率，上述探針最好位于所在探針的中部。所述探針還可以在其5′端包含一段氨基修飾的0-25聚的聚脫氧胸苷酸(聚dT)。
所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)(如醛基、氨基、異硫晴酸基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。
本發(fā)明的基因芯片制備可采用生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5′端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后后點樣儀將其點在修飾玻片或硅片，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其制備方法也可參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring themetabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000，1-130。
本發(fā)明所述的測定RET、VHL、SDHB、SDHD基因型的方法，可包括以下步驟(1)制備染色體DNA；(2)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增RET、VHL、SDHB、SDHD基因中包含表1中突變位點的基因片段；(3)標(biāo)記以上所得擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)將所得標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交；(5)檢測基因芯片的雜交信號，識讀結(jié)果。
制備用于PCR擴(kuò)增的染色體DNA的方法很多，可以從全血中制備、也可以從發(fā)根中制備，還可以從口腔粘膜的脫落物中制備。具體方法可參閱文獻(xiàn)(丁振諾，蘇明權(quán)主編.《臨床PCR基因診斷技術(shù)》，世界圖書出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法擴(kuò)增染色體基因特定片段的方法已經(jīng)是本領(lǐng)域公知技術(shù)。其中的關(guān)鍵在于引物設(shè)計，有關(guān)引物設(shè)計的方法、軟件均可以從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明涉及的RET、VHL、SDHB、SDHD基因突變位點的擴(kuò)增引物和體系可根據(jù)上述各種方法及有關(guān)文獻(xiàn)(KB穆里斯，F(xiàn)·費(fèi)里，R·吉布斯等主編《PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)》)記載的方法由使用者獨(dú)立完成。
對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記可以通過采用5′端帶標(biāo)記基團(tuán)的引物進(jìn)行擴(kuò)增的方法，也可通過在擴(kuò)增過程中摻入帶標(biāo)記基團(tuán)的單核苷酸的方法加以實現(xiàn)，所述標(biāo)記基團(tuán)包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)，也可以參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》；J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾主編，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2002年；馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000，1-130。
帶標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交前，先將擴(kuò)增產(chǎn)物變性。此時，可采用常規(guī)變性方法變性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。此類方法例如將擴(kuò)增產(chǎn)物加熱至94～98℃，并保溫2～10min，然后迅速置冰上。或者，也可采用堿變性然后中和的方法。如果突變位點分多管進(jìn)行擴(kuò)增，可將這些管的擴(kuò)增產(chǎn)物先混和，然后在一起變性，也可以先一起變性，再混和。
將上述擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交時，可以先將基因芯片與預(yù)雜交緩沖液進(jìn)行預(yù)雜交。
本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片之間的固相雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進(jìn)行，本領(lǐng)域一般人員依據(jù)經(jīng)驗容易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣本濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。或者也可以參照J(rèn).薩姆布魯克，D.W.拉塞爾主編，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2002年。
然后根據(jù)標(biāo)記信號在基因芯片上的位置、強(qiáng)度等信息獲取待測信息。本發(fā)明所述檢測基因芯片雜交信號的方法是基于與抗生物素抗體或親合素或鏈親合素或抗地高辛抗體或抗熒光素抗體復(fù)合在一起的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶催化的四氮唑藍(lán)(NBT)合5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的顯色反應(yīng)。具體方法可參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》。若擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光基團(tuán)標(biāo)記，也可直接用熒光檢測設(shè)備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray3000等)獲取待測信息。
本發(fā)明還提供一種用于測定與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的RET、VHL、SDHB、SDHD基因型的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明所說的基因芯片；更特別的，還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。所述的芯片圖像分析軟件比如BaiO公司的BaiO ArrayDoctor 2.0，Media Cybernetics公司的Arraypro 4.0。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(a)本發(fā)明提供基因芯片及其試劑盒，可用于檢測嗜鉻細(xì)胞瘤患者及易感人群的RET、VHL、SDHB、SDHD基因型進(jìn)行篩查監(jiān)測，這為臨床從嗜鉻細(xì)胞瘤患者中篩出高危人群，預(yù)測遺傳性疾病發(fā)生的危險并提供有針對性的治療提供了一種簡便易行的解決方案。
(b)本發(fā)明的基因芯片能夠便捷、高通量地分析單基因突變位點信息，在基因診斷方面具有無與倫比的優(yōu)勢。在嗜鉻細(xì)胞瘤的診治中，基因突變的檢測不僅可預(yù)測發(fā)病，進(jìn)行早期診斷，而且還可對家族其他成員進(jìn)行篩查監(jiān)測。
(c)本發(fā)明的基因芯片具有檢測操作簡單。
(d)本發(fā)明的基因芯片的覆蓋面廣，全面地反映國人嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)基因突變位點。
(e)本發(fā)明的基因芯片的寡核苷酸探針之間的相互干擾小，結(jié)果準(zhǔn)確。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1探針的設(shè)計
1.突變位點信息本實施例針對與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)基因(RET、VHL、SDHD和SDHB)的58個位點86種突變類型(詳情見表1)，這些位點包含國內(nèi)外已報道過的基因型及本發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)的突變類型。
本實施例涉及RET、VHL、SDHB、SDHD的致病相關(guān)突變位點如表1所示。
表1突變位點




注核苷酸中，有野生型前的數(shù)字代表從起始密碼ATG開始的核苷酸個數(shù)；fs代表發(fā)生了移位突變；X代表翻譯終止；del代表堿基缺失，ins代表堿基插入。
2.探針的設(shè)計根據(jù)以上的致病相關(guān)突變位點，本實施例采用Primer Priemer5.0軟件(加拿大Primer公司開發(fā))設(shè)計探針，具體的探針序列表2所示。
表2探針序列





注編號中有W者為野生型。
實施例2基因芯片的制備1.基因探針的合成設(shè)備ABI3300 DNA合成儀純化方法HPLC方法委托單位上海生工生物工程服務(wù)有限公司基因探針的序列如表2所示。
質(zhì)檢方法檢測探針的雜交靈敏度。具體地說就是將合成的探針用水溶解并稀釋至10pmol/ul，加入點樣緩沖液配成點樣液，然后點樣在基片上并固定，用標(biāo)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(帶生物素標(biāo)記)與之雜交，檢測后其信號值不得低于50。
2.基因芯片的點樣設(shè)備GMS417基因芯片點樣儀，美國，Affymetrix公司。
試劑BaiO點樣緩沖液上海百傲科技有限公司方法根據(jù)GMS417基因芯片點樣儀使用說明書記載的方法按以下步驟點樣1)根據(jù)芯片設(shè)計原則，編制如表3所示點樣模式的點樣程序2)表3芯片點樣陣列圖


3)將合成好的檢測合格的探針用純水溶解并稀釋至10pmol/ul；4)將稀釋好的探針溶液與BaiO點樣緩沖液以1∶1比例混合，然后按照點樣程序加入到384孔板的指定位置；5)將醛基修飾的基片依次放置在點樣儀的點樣平臺上；6)將上述點樣板置于點樣儀中，啟動點樣儀的點樣程序，自動完成點樣過程。
7)點樣效果的質(zhì)檢將點樣后的基片依次置于體視顯微鏡下觀察點樣效果，重點是有無漏點，各點之間是否均勻、整齊。
3.探針在芯片上的固定設(shè)備BaiO基因芯片固定器，上海百傲科技有限公司試劑BaiO基因芯片活化液上海百傲科技有限公司方法基因芯片活化液可使醛基修飾載玻片上醛基的活性增強(qiáng)，提高氨基修飾基因探針的固定效率。使用時，將BaiO基因芯片活化液(瓶底有沉淀為正?，F(xiàn)象)倒入敞口容器(如小飯盒)中，與點樣完畢的芯片一同放入BaiO基因芯片固定器內(nèi)，25-30℃靜置過夜既可。
實施例3血樣的處理與PCR擴(kuò)增1.對血樣的要求靜脈全血，EDTA抗凝，不少于500ul。
2.血樣的采集、儲存方法(1)采集采集被檢者靜脈血500ul，用一次性無菌注射針頭抽取，收集于含50ul的2％EDTA溶液的無菌1.5ml離心管中，將管蓋蓋上，上下顛倒數(shù)次，使混勻。
(2)存放待測全血在2-4℃保存，保存期3個月；在-20℃保存期半年，-80℃可長期保存。冷凍保存的操作步驟與細(xì)胞株的凍存方法一樣。
(3)運(yùn)輸采用冰壺加冰或泡沫箱加干冰密封運(yùn)輸。
3.血樣DNA模板的制備方法設(shè)備TGL-16B臺式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠HH·S11·2恒溫水浴，上海醫(yī)療器械五廠Eppendorf微量移液器，10ul，20ul，100ul，1000ul試劑抽提掖1，抽提掖2上海百傲科技有限公司(1)取無菌的1.5ml離心管(自備)，向其中加入混勻的待檢全血100ul和抽提掖1溶液300ul，充分混勻，室溫靜置8分鐘；將離心管置離心機(jī)中，6000g離心1分鐘；(2)取出離心管，傾去上清液，離心管底部可見少量白色沉淀；(3)向離心管中加入抽提掖2溶液60ul，充分振蕩使沉淀溶解；沸水浴中15分鐘；(4)取出離心管，置離心機(jī)中，12,000g離心15分鐘。離心后上清液可直接用于PCR擴(kuò)增。
實施例4用PCR方法分別擴(kuò)增并標(biāo)記基因引物的設(shè)計采用Primer Priemer 5.0軟件，具體的引物序列見表4。
表4引物序列


注FP為上游引物，RP為下游引物。1-FP/1-RP，2-FP/2RP，3FP/3RP及4FP/RP分別擴(kuò)增SDHB的第2，3，6，7號外顯子；5-FP/5-RP，6-FP/6-RP，7FP/7-RP分別擴(kuò)增SDHB的第2，3，4號外顯子；8-FP/8-RP和9FP/RP分別擴(kuò)增VHL的第1和第3號外顯子；10-FP/10-RP，11-FP/11-RP，13-FP/13-RP及16-FP/16-RP分別擴(kuò)增RET的第10，11，13-16號外顯子。
委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物(序列見表4)，然后用水稀釋至10pmol/ul。將購置的Taq酶(產(chǎn)品編號Lot，CE1101-1，TaKaRa)、10×緩沖液(產(chǎn)品編號Lot，A2402-2，TaKaRa)、dNTP(產(chǎn)品編號D0056，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、純水及實施例2獲得的PCR擴(kuò)增模板按以下配方的擴(kuò)增體系

注隨機(jī)挑選的16個DNA模板用以調(diào)整反應(yīng)參數(shù)，也可根據(jù)具體情況調(diào)整模板和純水的體積。
用PCR擴(kuò)增儀(MJ Research，PTC 100)按照以下程序擴(kuò)增94℃，5min；然后按94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，30sec做40個循環(huán)，最后72℃，5min。
實施例5標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與基因芯片的雜交采用上海百傲科技有限公司的芯片雜交試劑盒與顯色試劑盒進(jìn)行此雜交試驗。所述芯片雜交試劑盒(產(chǎn)品編號BST05010，上海百傲科技有限公司)包含預(yù)雜交液，雜交緩沖液，洗液1，反應(yīng)艙。所述芯片顯色試劑盒(產(chǎn)品編號BST06010，上海百傲科技有限公司)包含抗體液，洗液2，洗液3，顯色液。
(1)將實施例3中PCR擴(kuò)增液和陰性陽性擴(kuò)增液(共計100ul)加入到同一個0.2ml的薄壁管中，98℃熱變性5分鐘，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置5分鐘；(2)取出將實施例1中的基因芯片，做好樣品編號，在雜交艙中加入預(yù)雜交液溶液200μl，于43℃靜置5分鐘，吸除該緩沖液；(3)取無菌的1.5ml離心管(白備)，從雜交緩沖液瓶中吸出120μl雜交緩沖液，加入已變性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合物，混勻，將液體全部加入到雜交艙中(加液時應(yīng)注意無氣泡產(chǎn)生)；(4)將基因芯片迅速放入43℃恒溫箱中，保溫30分鐘。同時取1.5ml離心管，從洗液1瓶中吸出700μl洗液1，于43℃恒溫箱中預(yù)熱；(5)從恒溫箱中取出基因芯片，吸除雜交艙中溶液；(6)在雜交艙中加入200μl已預(yù)熱的洗液1，43℃保溫5分鐘，然后吸除。再重復(fù)此步驟兩次；(7)在雜交艙中加入洗液2溶液200μl，室溫放置2分鐘；(8)吸除雜交艙中溶液，向雜交艙中加入抗體液溶液200μl，室溫放置20分鐘；(9)吸除雜交艙中溶液，向雜交艙中加入洗液2溶液200μl，室溫靜置5分鐘。再重復(fù)此步驟一次；(10)吸除雜交艙中溶液，向雜交艙中加入洗液3溶液200μl，室溫放置2分鐘；(11)吸除雜交艙中溶液，向雜交艙中加入顯色液溶液200μl，43℃避光放置40分鐘；(12)吸除雜交艙中溶液，小心揭除雜交艙，將顯色載玻片顯色區(qū)小心用蒸餾水沖洗一下，置43℃烘干。
實施例6基因芯片雜交信號的檢測將顯色載玻片面朝下扣在BaiO生物芯片識讀儀的片槽上檢測，具體操作見儀器使用說明。檢測圖像經(jīng)Array Doctor軟件分析可自動輸出檢測結(jié)果。所述基因芯片檢測所得結(jié)果的照片見圖1。
結(jié)果表明，受檢者在RET804密碼子野生型和突變型均有信號(A野生型，B突變型)，軟件判別結(jié)果為G/T雜合基因型，屬于嗜鉻細(xì)胞瘤的高危人群，經(jīng)測序結(jié)果驗證完全符合。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于測定嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的基因芯片，其特征在于，它包括固相載體和有序固定于所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括(a)特異性地針對RET基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針；(b)特異性地針對SDHB基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針；(c)特異性地針對SDHD基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針；和(d)特異性地針對VHL基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針。
2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的RET基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第609位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第611位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第618位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子10中第620位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子11中第630位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子11中第632位氨基酸密碼子GAG→AAG；RET基因外顯子11中第633位氨基酸附近密碼子ACGAGCTGTGCCGCACGGTGAT→ACGAGggCTGTGCCGCAC GGTGAT；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→CGC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→GGC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TTC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→AGC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TGG；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TAC；RET基因外顯子11中第634位氨基酸密碼子TGC→TCC；RET基因外顯子11中第640位氨基酸密碼子GCC→GGC；RET基因外顯子11中第641位氨基酸密碼子GCT→TCT；RET基因外顯子11中第648位氨基酸密碼子GTC→ATC；RET基因外顯子13中第768位氨基酸密碼子GAG→GAT；RET基因外顯子13中第768位氨基酸密碼子GAG→GAC；RET基因外顯子13中第790位氨基酸密碼子TTG→TTT；RET基因外顯子13中第791位氨基酸密碼子TAT→TTT；RET基因外顯子14中第804位氨基酸密碼子GTG→TTG；RET基因外顯子14中第804位氨基酸密碼子GTG→ATG；RET基因外顯子15中第904位氨基酸密碼子TCC→TGC；RET基因外顯子16中第918位氨基酸密碼子ATG→ACG；RET基因外顯子16中第922位氨基酸密碼子TCC→TAC；所述的SDHB基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自SDHB基因外顯子2中第43位氨基酸密碼子GCC→CCC；SDHB基因外顯子2中第46位氨基酸密碼子CGA→GGA；SDHB基因外顯子2中第46位氨基酸密碼子CGA→TGA；SDHB基因外顯子2中第46位氨基酸密碼子CGA→CAA；SDHB基因外顯子3中第90位氨基酸密碼子CGA→TGA；SDHB基因外顯子6中第198位氨基酸的密碼子第591位缺失堿基C；SDHB基因外顯子6中第207位氨基酸的密碼子第620和621位缺失堿基TG；SDHB基因外顯子7中第230位氨基酸的密碼子CGC→TGC；SDHB基因外顯子7中第230位氨基酸的密碼子CGC→CAC；SDHB基因外顯子7中第23 8-240位氨基酸的密碼子第713-716位缺失堿基TCTC；所述的SDHD基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自SDHD基因外顯子2中第22位氨基酸的密碼子第64位C→T；SDHD基因外顯子2中第32位氨基酸的密碼子第94位TCA缺失TC；SDHD基因外顯子2中第38位氨基酸密碼子CGA→TGA；SDHD基因外顯子2中第50位氨基酸的密碼子第148-149位之間插入A；SDHD基因外顯子3中第68位氨基酸的密碼子第202-203位之間插入A；SDHD基因外顯子3中第92位氨基酸密碼子GAC→TAC；SDHD基因外顯子4中第112位氨基酸的密碼子第334-337位之間缺失ACTG；SDHD基因外顯子4中第121位氨基酸密碼子CAG→TAG；所述的VHL基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點選自VHL基因外顯子1中第93位氨基酸密碼子GGC→TGC；VHL基因外顯子1中第93位氨基酸密碼子GGC→GAC；VHL基因外顯子1中第98位氨基酸密碼子TAC→CAC；VHL基因外顯子1中第98位氨基酸密碼子TAC→TGC；VHL基因外顯子1中第112位氨基酸密碼子TAC→CAC；VHL基因外顯子3中第156位氨基酸密碼子TAT→TGT；VHL基因外顯子3中第161位氨基酸密碼子CGA→CAA；VHL基因外顯子3中第167位氨基酸密碼子CGG→TGG；VHL基因外顯子3中第167位氨基酸密碼子CGG→CAG；VHL基因外顯子3中第178位氨基酸密碼子CTG→CCG；VHL基因外顯子3中第184位氨基酸密碼子CTC→CAC；VHL基因外顯子3中第188位氨基酸密碼子CTG→GTG。
3.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針的種類為20-250種，并且每個寡核苷酸探針含有10-30個連續(xù)核苷酸。
4.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，每個寡核苷酸探針的5′端還包含一段氨基修飾的4-25聚的聚脫氧胸苷酸。
5.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述致病相關(guān)突變位點位于突變位點所在寡核苷酸探針的中部。
6.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，(a)特異性地針對RET基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO55-129；(a)特異性地針對SDHB基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO1-17；(a)特異性地針對SDHD基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO18-33；和(a)特異性地針對VHL基因的嗜鉻細(xì)胞瘤致病相關(guān)突變位點的寡核苷酸探針的序列選自SEQ ID NO34-54。
7.一種同時確定樣品中RET、SDHB、SDHD及VHL基因型的方法，包括以下步驟(1)從樣品中抽提獲得DNA；(2)以步驟(1)中獲得的DNA為模板，擴(kuò)增獲得包含RET、VHL、SDHB、SDHD基因中突變位點的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)標(biāo)記步驟(2)中所得的擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)將步驟(3)中所得經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交；(5)檢測基因芯片的雜交信號，從而確定樣品中RET、SDHB、SDHD及VHL基因型。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，分別在RET、VHL、SDHB、SDHD基因各自獨(dú)立的擴(kuò)增體系中擴(kuò)增包含突變位點基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
9.一種用于測定RET、SDHB、SDHD及VHL基因型的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的基因芯片。
10.一種權(quán)利要求1所述的用于測定嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的基因芯片的用途，其特征在于，用于制備檢測嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于測定嗜鉻細(xì)胞瘤易感性的基因芯片，包含該基因芯片的試劑盒和使用該芯片或試劑盒測定四個基因不同基因型的方法及芯片圖像分析軟件。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法可用于檢測與嗜鉻細(xì)胞瘤相關(guān)的基因突變，為嗜鉻細(xì)胞瘤的治療和預(yù)后提供必要信息。
文檔編號C12Q1/68GK1952171SQ20051003066
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者朱鼎良, 高平進(jìn), 周曉鷗 申請人:上海市高血壓研究所