專利名稱：肝癌早期診斷的標(biāo)志物基因ctcfl及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種人類肝癌相關(guān)基因CTCFL(CCCTC-BINDING FACTOR-LIKE)作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的用途。
背景技術(shù)：
目前我國(guó)有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死于肝病約30萬，其中50％為原發(fā)性肝癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％左右。絕大多數(shù)與HBV、HCV感染有關(guān)。肝癌發(fā)病率在我國(guó)居2-3位，主要在青壯年男性發(fā)病，在華東地區(qū)的發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，近年來，有持續(xù)上升趨勢(shì)。在上海，肝癌的發(fā)病率居第三位，僅次于肺癌和胃癌。最新資料顯示這個(gè)比例還有繼續(xù)上升的趨勢(shì)。現(xiàn)在，肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國(guó)人民生命安全。因此，非常有必要對(duì)肝癌發(fā)生的分子機(jī)制作深入的研究。
隨著人類基因組測(cè)序的完成，基因組學(xué)的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到以解析基因功能為主的功能基因組學(xué)研究。功能基因組學(xué)的重點(diǎn)是以疾病為中心，全力解決人類疾病相關(guān)基因研究中的重大科學(xué)問題。肝癌在我國(guó)素有“國(guó)病”之稱，它愈后效果之差使得對(duì)于肝癌的早期診斷的研究變得尤為重要。
CTCFL基因定位于人類染色體20q13.31上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供CTCFL基因作為肝癌早期診斷標(biāo)志物的作用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種蛋白多肽作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用，所述蛋白多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸序列作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用，所述的多核苷酸是具有SEQ ID NO1所示的編碼序列，或者至少與SEQ ID NO1中的83-2074位核苷酸至少有70％同源性的序列，或者在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示序列雜交的序列。
本發(fā)明還提供了一種用于診斷和檢測(cè)早期肝癌的試劑盒，所述試劑盒含有下列(I)-(V)的序列或者它們的連續(xù)片斷，(I)SEQ ID NO1所示的編碼序列；(II)與SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示序列雜交的序列；(IV)具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
本發(fā)明還提供了一種用于診斷和檢測(cè)早期肝癌的生物芯片，所述生物芯片的載體上含有下列(I)-(V)的序列或者它們的連續(xù)片斷，(I)SEQ ID NO1所示的編碼序列；(II)與SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示序列雜交的序列；(IV)具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
本發(fā)明由于公開了人類基因CTCFL及其編碼蛋白，使得對(duì)其進(jìn)行深入地研究有可能使它作為早期肝癌的診斷標(biāo)志物定量檢測(cè)指標(biāo)，為進(jìn)一步的臨床推廣做貢獻(xiàn)。


圖1為通過RT-PCR驗(yàn)證CTCFL基因在肝癌/癌旁組織中的表達(dá)譜，N為癌旁組織，C為癌組織，β-actin作為內(nèi)對(duì)照；圖2為通過RT-PCR驗(yàn)證CTCFL基因在正常肝和胎肝中的表達(dá)譜，以在睪丸組織中的表達(dá)作為對(duì)照；具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所屬的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1組織分離(Tissue isolation)組織來源于HBV陽(yáng)性并表達(dá)甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人(RT-PCR證實(shí)AFP在肝癌均為陽(yáng)性而癌旁為陰性)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。
實(shí)施例2抽提組織RNA抽提RNA試劑采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法產(chǎn)生的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進(jìn)行無RNA酶處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無RNA酶的環(huán)境。
將碾杵和勻漿器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4℃離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4℃離心沉淀RNA；用75％乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提得RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計(jì)測(cè)定260/280比值(比值均在1.7~2.0)；并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
超低溫保存。
實(shí)施例3cDNA的合成取總RNA2μg，OligodT16 1μ，70℃保溫3min，立即冰上變性5min。加入5×buffer，DTT和50mg/L的dNTP各2μL及1μL的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42℃2h。模板使用終濃度通常為1μg/100μL。
實(shí)施例4RT-PCR擴(kuò)增以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin正向引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’β-actin反向引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’CTCFL正向引物5’-CTGCAAGCAGGAACGTCATA-3’CTCFL反向引物5’-TCCCCTGATCCACACTTCTC-3’以及10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLoDNA模板，最后補(bǔ)充ddH2O使反應(yīng)體系為10μL。PCR地反應(yīng)條件是94℃變性5min；然后每個(gè)循環(huán)94℃30s、53℃ 30s、72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。
實(shí)施例4RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CTCFL基因在肝癌及其癌旁組織中的表達(dá)利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CTCFL基因在32對(duì)肝癌/癌旁組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)HBV陽(yáng)性的原發(fā)性肝癌手術(shù)病人體內(nèi)肝癌組織和癌旁組織中約有75％表達(dá)了CTCFL基因。結(jié)果見圖1。
實(shí)施例5RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CTCFL基因在正常肝、胎肝和睪丸中的表達(dá)圖2顯示利用β-actin作為對(duì)照時(shí)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CTCFL基因在正常肝(normal liver)、胎肝(fetal liver)和睪丸中的表達(dá)。結(jié)果提示在正常肝和胎肝中，CTCFL基因通常是不表達(dá)的。結(jié)合實(shí)施例4中在HBV陽(yáng)性的原發(fā)性肝癌手術(shù)病人中約有75％的病人在肝中異常表達(dá)了CTCFL基因，有理由相信，CTCFL基因可以作為診斷早期肝癌的標(biāo)志物。
實(shí)施例6CTCFL基因用于制備生物芯片用獲取的CTCFL基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出全長(zhǎng)的CTCFL基因或該基因的部分片斷，用作生物芯片點(diǎn)樣的樣品。
用英國(guó)的BioRobotics自動(dòng)點(diǎn)膜儀將樣品點(diǎn)在8×12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點(diǎn)4個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)的DNA量約為10ng。陽(yáng)性對(duì)照是重復(fù)4次點(diǎn)樣的人β-actin基因，陰性對(duì)照是重復(fù)4次點(diǎn)樣的λ噬菌體DNA。
含有CTCFL基因的芯片可作為肝癌的早期診斷標(biāo)志物。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>肝癌早期診斷的標(biāo)志物基因CTCFL及其應(yīng)用<130>NP-10010<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3493<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(83)..(2074)<400>11 ACGCGGTGCA CGAGGCAGAG CCCACAAGCC AAAGACGGAG TGGGCCGAGC ATTCCGGCCA61 CGCCTTCCGC GGCCAAGTCA TTATGGCAGC CACTGAGATC TCTGTCCTTT CTGAGCAATT121 CACCAAGATC AAAGAACTCG AGTTGATGCC GGAAAAAGGC CTGAAGGAGG AGGAAAAAGA181 CGGAGTGTGC AGAGAGAAAG ACCATCGGAG CCCTAGTGAG TTGGAGGCCG AGCGTACCTC241 TGGGGCCTTC CAGGACAGCG TCCTGGAGGA AGAAGTGGAG CTGGTGCTGG CCCCCTCGGA301 GGAGAGCGAG AAGTACATCC TGACCCTGCA GACGGTGCAC TTCACTTCTG AAGCTGTGGA361 GTTGCAGGAT ATGAGCTTGC TGAGCATACA GCAGCAAGAA GGGGTGCAGG TGGTGGTGCA
421ACAGCCTGGC CCTGGGTTGC TGTGGCTTGA GGAAGGGCCC CGGCAGAGCC TGCAGCAGTG481TGTGGCCATT AGTATCCAGC AAGAGCTGTA CTCCCCGCAA GAGATGGAGG TGTTGCAGTT541CCACGCTCTA GAGGAGAATG TGATGGTGGC CAGTGAAGAC AGTAAGTTAG CGGTGAGCCT601GGCTGAAACT ACTGGACTGA TCAAGCTCGA GGAAGAGCAG GAGAAGAACC AGTTATTGGC661TGAAAGAACA AAGGAGCAGC TCTTTTTTGT GGAAACAATG TCAGGAGATG AAAGAAGTGA721CGAAATTGTT CTCACAGTTT CAAATTCAAA TGTGGAAGAA CAAGAGGATC AACCTACAGC781TGGTCAAGCA GATGCTGAAA AGGCCAAATC TACAAAAAAT CAAAGAAAGA CAAAGGGAGC841AAAAGGAACC TTCCACTGTG ATGTCTGCAT GTTCACCTCT TCTAGAATGT CAAGTTTTAA901TCGTCATATG AAAACTCACA CCAGTGAGAA GCCTCACCTG TGTCACCTCT GCCTGAAAAC961CTTCCGTACG GTCACTCTGC TGCGGAACCA TGTTAACACC CACACAGGAA CCAGGCCCTA1021 CAAGTGTAAC GACTGCAACA TGGCATTTGT CACCAGTGGA GAACTCGTCC GACACAGGCG1081 CTATAAACAT ACTCATGAGA AACCCTTTAA ATGTTCCATG TGCAAGTATG CCAGTGTGGA1141 GGCAAGTAAA TTGAAGCGCC ATGTCCGATC CCACACTGGG GAGCGCCCCT TTCAGTGTTG1201 CCAGTGCAGC TATGCCAGCA GAGATACCTA CAAGCTGAAA CGCCACATGA GAACGCACTC1261 AGGTGAGAAG CCTTACGAAT GCCACATCTG CCACACCCGC TTCACCCAGA GCGGGACCAT1321 GAAAATACAT ATTCTGCAGA AACACGGCGA AAATGTCCCC AAATACCAGT GTCCCCATTG1381 TGCCACCATC ATTGCACGGA AAAGCGACCT ACGTGTGCAT ATGCGCAACT TGCATGCTTA1441 CAGCGCTGCA GAGCTGAAAT GCCGCTACTG TTCTGCTGTC TTCCATGAAC GCTATGCCCT1501 CATTCAGCAC CAGAAAACTC ATAAGAATGA GAAGAGGTTC AAGTGCAAAC ACTGCAGTTA1561 TGCCTGCAAG CAGGAACGTC ATATGACCGC TCACATTCGT ACCCACACTG GAGAGAAACC1621 ATTCACCTGC CTTTCTTGCA ATAAATGTTT CCGACAGAAG CAACTTCTAA ACGCTCACTT1681 CAGGAAATAC CACGATGCAA ATTTCATCCC GACTGTTTAC AAATGCTCCA AGTGTGGCAA
1741 AGGCTTTTCC CGCTGGATTA ACCTGCACAG ACATTCGGAG AAGTGTGGAT CAGGGGAAGC1801 AAAGTCGGCT GCTTCAGGAA AGGGAAGAAG AACAAGAAAG AGGAAGCAGA CCATCCTGAA1861 GGAAGCCACA AAGGGTCAGA AGGAAGCTGC GAAGGGATGG AAGGAAGCCG CGAACGGAGA1921 CGAAGCTGCT GCTGAGGAGG CTTCCACCAC GAAGGGAGAA CAGTTCCCAG GAGAGATGTT1981 TCCTGTCGCC TGCAGAGAAA CCACAGCCAG AGTCAAAGAG GAAGTGGATG AAGGCGTGAC2041 CTGTGAAATG CTCCTCAACA CGATGGATAA GTGAGAGGGA TTCGGGTTGC GTGTTCACTG2101 CCCCCAATTC CTAAAGCAAG TTAGAAGTTT TTAGCATTTA AGGTGTGAAA TGCTCCTCAA2161 CACGATGGAT AAGTGAGAGA GAGTCAGGTT GCATGTTCAC TGCCCCTAAT TCCTAAAGCA2221 AGTTAGAAAT TTTTAGCATT TTCTTTGAAA CAATTAAGTT CATGACAATG GATGACACAA2281 GTTTGAGGTA GTGTCTAGAA TTGTTCTCCT GTTTGTAGCT GGATATTTCA AAGAAACATT2341 GCAGGTATTT TATAAAAGTT TTAAACCTTG AATGAGAGGG TAACACCTCA AACCTATGGA2401 TTCATTCACT TGATATTGGC AAGGTGGCCC ACAATGAGTG AGTAGTGATT TTTGGATATT2461 TCAAAATAGT CTAGACCAGC TAGTGCTTCC ACAGTCAAAG CTGGACATTT TTATGTTGCA2521 TTATATACAC CCATGATATT TCTAATAATA TATGGTTTTA AACATTAAAG ACAAATGTTT2581 TTATACAAAT GAATTTTCTA CAAAATTTAA AGCTACCATA ATGCTTTTAA TTAGTTCTAA2641 ATTCAACCAA AAAATGTTTT ACTCTTATAA AAAGGAAAAC TGAGTAGGAA ATGAAATACT2701 AGATTAGACT AGAAAATAAG GAATAAATCG ATTTTACTTT GGTATAGGAG CAAGGTTCAC2761 CTTTAGATTT TTGTATTCTC TTTTAATTAT GCTCCTTGGC AGGTATGAAA TTGCCCTGGT2821 TACATTCCAT TATTGCTTAT TAGTATTTCA CTCCATAACC CTTTTTTCTG CTAAAACTAC2881 TCTTTTTATA TTTGTAAAAT AATTGGCAGA GTGAGAAGAA ACATAAAATC AGATAAGGCA2941 AATGTGTACC TGTAAGGAAT TTGTACTTTT TCATAATGCC CAGTGATTAG TGAGTATTTC3001 CCTTTTGCCA GTTGACAAGA TTTTTCCACC CTCGAGCAGC GTGAGAGATG CCTCTTTAAC
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421 HGENVPKYQC PHCATIIARK SDLRVHMRNL HAYSAAELKC RYCSAVFHER YALIQHQKTH481 KNEKRFKCKH CSYACKQERH MTAHIRTHTG EKPFTCLSCN KCFRQKQLLN AHFRKYHDAN541 FIPTVYKCSK CGKGFSRWIN LHRHSEKCGS GEAKSAASGK GRRTRKRKQT ILKEATKGQK601 EAAKGWKEAA NGDEAAAEEA STTKGEQFPG EMFPVACRET TARVKEEVDE GVTCEMLLNT661 MDK
權(quán)利要求
1.一種蛋白多肽作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白多肽具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蛋白多肽作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的蛋白多肽是含有SEQ ID NO2序列的多肽。
3.一種多核苷酸序列作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的多核苷酸是具有SEQ ID NO1所示的編碼序列，或者至少與SEQ ID NO1中的83-2074位核苷酸至少有70％同源性的序列，或者在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO1所示序列雜交的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的一種多核苷酸序列作為早期肝癌診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.一種用于診斷和檢測(cè)早期肝癌的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有下列(I)-(V)的序列或者它們的連續(xù)片斷，(I)SEQ ID NO1所示的編碼序列；(II)與SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示序列雜交的序列；(IV)具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
6.一種用于診斷和檢測(cè)早期肝癌的生物芯片，其特征在于所述生物芯片的載體上含有下列(I)-(V)的序列或者它們的連續(xù)片斷，(I)SEQ ID NO1所示的編碼序列；(II)與SEQ ID NO1中位核苷酸序列具有至少有70％同源性的序列；(III)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1所示序列雜交的序列；(IV)具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO2序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了人類基因CTCFL(CCCTC－BINDING FACTOR－LIKE)基因作為肝癌早期診斷的標(biāo)志物方面的用途。人類CTCFL基因定位于人類染色體20ql3.31上，該基因由3493個(gè)核苷酸組成，編碼664個(gè)氨基酸。CTCFL基因原本是一種僅在睪丸組織中表達(dá)的人類基因，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在肝癌患者的肝組織及癌旁組織中約有75％的個(gè)體發(fā)生了明顯的表達(dá)差異，提示我們CTCFL(CCCTC－BINDING FACTOR－LIKE)基因作為肝癌早期診斷的標(biāo)志物方面的用途，對(duì)其進(jìn)行深入地研究有可能定量化診斷指標(biāo)并進(jìn)行臨床推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1951963SQ20051003068
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者黃健, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心