作為診斷標(biāo)志物的新miRNA的制作方法
【專利說明】作為診斷標(biāo)志物的新miRNA
[0001] 本發(fā)明涉及新的miRNA標(biāo)志物及其用途。具體地，本發(fā)明涉及可用于疾病（特別 是神經(jīng)元病癥，如阿爾茨海默氏病（AD))的診斷或治療的新的miRNA標(biāo)志物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 最近，分子診斷學(xué)的重要性已經(jīng)日趨增加。已發(fā)現(xiàn)步入疾病的臨床診斷中（尤其 是，傳染性病原體的檢測、基因組的突變的檢測、患病細(xì)胞的檢測和疾病的誘因的風(fēng)險(xiǎn)因子 的鑒定）。
[0004]尤其是，通過確定組織中的基因表達(dá)，核酸分析在疾病的研宄和診斷中打開非常 有希望的新的可能性。
[0005] 待檢測的感興趣核酸包括基因組DNA、表達(dá)的mRNA和其他RNA諸如微小 RNA(簡稱miRNA)。miRNA是具有多種生物功能的新一類小RNA(A.Keller等人，Nat Methods. 20118(10) :841-3)。它們是見于真核細(xì)胞中的短的（平均具有20-24個(gè)核苷酸） 核糖核酸（RNA)分子。已在哺乳動物中鑒定了幾百個(gè)不同種類的微小RNA(S卩，幾百個(gè)不同 的序列）。它們對于轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是重要的，并與靶信使RNA轉(zhuǎn)錄物（mRNA)上的互補(bǔ)序 列相結(jié)合，這可導(dǎo)致翻譯阻抑或靶物降解和基因沉默。因此，它們還可用作研宄、診斷和治 療目的的生物標(biāo)志物。
[0006] 定義
[0007] 除非另外定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理 解的含義相同。
[0008] 術(shù)語"核酸分子"是指具有確定的序列的多核苷酸分子。它包含DNA分子、RNA分 子、核苷酸類似物分子以及它們的組合，如摻入了核苷酸類似物的DNA分子或RNA分子。
[0009] 術(shù)語"標(biāo)志物"或"生物標(biāo)志物"指可檢測其存在或濃度并與已知狀況（比如疾病 狀態(tài)）或與臨床結(jié)果（比如對治療的應(yīng)答）相關(guān)聯(lián)的生物分子，例如，核酸、肽、蛋白、激素 等。
[0010] 術(shù)語"評估生理和/或病理狀況"包括分類患有或有風(fēng)險(xiǎn)形成病理狀況的患者的 樣品，篩選病理狀況的存在或形成病理狀況的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)測形成病理狀況的風(fēng)險(xiǎn)，或預(yù)測患有 或有風(fēng)險(xiǎn)形成病理狀況的患者中的病理狀況結(jié)果。
[0011] 如本文所用，術(shù)語"預(yù)測病理狀況或疾病的結(jié)果"意指包括經(jīng)歷給定治療的患者的 結(jié)果預(yù)測和未經(jīng)治療的患者的預(yù)后兩者。
[0012] 本發(fā)明的含義中的"結(jié)果"是在疾病的進(jìn)程中獲得的限定狀況。此疾病結(jié)果可以 例如是臨床狀況諸如"疾病的復(fù)發(fā)"、"疾病的消退"、"對治療的應(yīng)答"，疾病階段或等級或類 似狀況。
[0013] "風(fēng)險(xiǎn)"被理解為受試者或患者發(fā)生或達(dá)到某種疾病結(jié)果的可能性。在本發(fā)明的上 下文中，術(shù)語"風(fēng)險(xiǎn)"并不意在指就患者的健康而言攜帶任何積極含義或消極含義，而僅指 發(fā)生或形成既定事件或狀況的或然性或可能性。
[0014] 術(shù)語"臨床數(shù)據(jù)"指與患者的健康狀況相關(guān)的可用數(shù)據(jù)和信息的總體，包括但不限 于年齡、性別、重量、絕經(jīng)期/激素狀況、疾病發(fā)生學(xué)數(shù)據(jù)、既往病例（anamnesis)數(shù)據(jù)、通過 體外診斷方法諸如血檢或尿檢獲得的數(shù)據(jù)、通過成像方法獲得的數(shù)據(jù)，比如X-射線、計(jì)算 機(jī)斷層攝影術(shù)、1則、？￡!\鄧6(^、超聲、電生理學(xué)數(shù)據(jù)、遺傳分析、基因表達(dá)分析、活組織檢查 評估、手術(shù)內(nèi)發(fā)現(xiàn)。
[0015]如本文所用的，術(shù)語患者的"樣品的分類"指所述樣品與至少兩類的至少一種的關(guān) 聯(lián)。這些種類可以是例如"高風(fēng)險(xiǎn)"和"低風(fēng)險(xiǎn)"，高、中等和低風(fēng)險(xiǎn)；其中風(fēng)險(xiǎn)是在某個(gè)時(shí) 期中發(fā)生某個(gè)事件的似然性，例如，疾病的發(fā)生、疾病的進(jìn)程等。它可進(jìn)一步意為疾病的有 利的或不利的臨床結(jié)果、對給定治療的反應(yīng)性或非反應(yīng)性等的種類。分類可通過利用算法 (尤其是判別函數(shù)）來進(jìn)行。算法的簡單例子是根據(jù)第一定量參數(shù)的分類，例如，高于或低 于某個(gè)閾值的感興趣核酸的表達(dá)水平?；颊邩悠返姆诸惪捎糜陬A(yù)測疾病的結(jié)果或發(fā)生疾病 的風(fēng)險(xiǎn)。代替利用感興趣的單一核酸的表達(dá)水平，可使用感興趣的若干核酸的組合評分。此 外，可將另外的數(shù)據(jù)與第一定量參數(shù)組合使用。所述另外的數(shù)據(jù)可以是來自患者的臨床數(shù) 據(jù)，比如性別、年齡、患者的重量、疾病分級等。
[0016]"判別函數(shù)"是用于分類對象或事件的一組變數(shù)的函數(shù)。因此，判別函數(shù)允許根據(jù) 可從患者、樣品或事件可獲得的數(shù)據(jù)或參數(shù)將所述患者、樣品或事件分類為一個(gè)種類或多 個(gè)種類。該分類是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)手段。例如，根據(jù)從所述患者、 樣品或事件中獲得的數(shù)據(jù)可將患者分類為"高風(fēng)險(xiǎn)"或"低風(fēng)險(xiǎn)"、"需要治療"或"不需要治 療"或其它種類。分類不限于"高對低"，而是可以實(shí)施分類成多個(gè)種類、分級等。允許分類 的判別函數(shù)的例子包括但不限于由支持向量機(jī)（supportvectormachine,SVM)、k-最近鄰 (k-nearest-neighbor，kNN)、（樸素（naive))貝葉斯模型定義的判別函數(shù)，或分段定義的 函數(shù)，諸如例如在子集發(fā)現(xiàn)、決策樹、數(shù)據(jù)的邏輯分析（LAD)等中的。
[0017]術(shù)語"表達(dá)水平"指例如感興趣核酸的確定的水平表達(dá)。術(shù)語"表達(dá)水平的模式 (pattern)"指與來自參照核酸（例如來自對照）相比較，或與計(jì)算的平均表達(dá)值（例如在 DNA芯片分析中）相比較的確定的表達(dá)水平。模式不限于兩種基因的比較，而且還涉及基因 與參照基因或樣品的多重比較。某個(gè)"表達(dá)水平的模式"也可作為結(jié)果并通過下文公開的 感興趣的若干核酸的比較和測量來確定，并展示出這些轉(zhuǎn)錄物彼此的相對豐度。表達(dá)水平 還可相對于不同組織，患者對健康對照等中的表達(dá)來評價(jià)。
[0018] 本發(fā)明的含義中的"表達(dá)水平的參照模式"應(yīng)理解為可用于與另一表達(dá)水平模式 相比較的任何表達(dá)水平模式。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)水平的參照模式是 例如在充當(dāng)參照組的一組健康或患病個(gè)體中觀察到的平均表達(dá)水平模式。
[0019] 在本發(fā)明的上下文中，"樣品"或"生物樣品"是源自生物學(xué)生物體或已同生物學(xué)生 物體相接觸的樣品。生物樣品的例子是：細(xì)胞、組織、體液、活組織檢查樣本、血液、尿液、唾 液、痰液、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液，和其他。
[0020] "探針"是能夠與特定生物分子特異性結(jié)合或相互作用的分子或物質(zhì)。術(shù)語"引 物"、"引物對"或"探針"應(yīng)具有分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這些術(shù)語的常規(guī)含義。在 本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，"引物"、"引物對"和"探針"指具有下述序列的寡核苷酸或多 核苷酸分子，所述序列與待檢測或定量的靶分子或靶序列的區(qū)域相同、互補(bǔ)、作為該區(qū)域的 同源物、或同源，從而引物、引物對或探針可特異性地與靶分子結(jié)合，所述靶分子例如，待檢 測或待定量的靶核酸、RNA、DNA、CDNA、基因、轉(zhuǎn)錄物、肽、多肽或蛋白。如本文所理解的，弓丨 物可自身發(fā)揮探針功能。如本文所理解的，"探針"還可包含例如引物對和內(nèi)部標(biāo)記探針的 組合，其是許多商品化qPCR方法中所常見的。
[0021]"miRNA"是短的、天然存在的RNA分子，并應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的一般含 義。"源自miRNA的分子"是以化學(xué)方法或酶促方法獲自miRNA模板的分子，比如cDNA。
[0022] 術(shù)語"陣列"指裝置（例如，芯片裝置）上可尋址的位置的排列。位置的數(shù)目可從 幾個(gè)變化到至少幾百或幾千個(gè)。每個(gè)位置代表獨(dú)立的反應(yīng)位點(diǎn)。陣列包括但不限于核酸陣 列、蛋白陣列和抗體陣列。"核酸陣列"指含有核酸探針（比如寡核苷酸、多核苷酸或基因的 較大部分）的陣列。陣列上的核酸優(yōu)選為單鏈的。"微陣列"指生物芯片或生物學(xué)芯片，即 具有至少約100/cm2密度的含固定探針的離散區(qū)域的區(qū)域陣列。
[0023] "基于PCR的方法"指包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的方法。這是通過利用一種、兩種 或更多種引物在體外酶促復(fù)制指數(shù)擴(kuò)增核酸（例如DNA或RNA)的方法。對于RNA擴(kuò)增，可 使用逆轉(zhuǎn)錄作為第一步?；赑CR的方法包含動力學(xué)或定量PCR(qPCR)，其特別適宜于分 析表達(dá)水平）。當(dāng)其實(shí)現(xiàn)表達(dá)水平的確定時(shí)，可例如使用基于PCR的方法以檢測給定mRNA 的存在，其通過（1)在逆轉(zhuǎn)錄酶的協(xié)助下將完整的mRNA庫（所謂的轉(zhuǎn)錄物組）逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并（2)在相應(yīng)的引物的協(xié)助下檢測給定cDNA的存在進(jìn)行。該方法通常稱作逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR(rtPCR)。術(shù)語"基于PCR的方法"包含端點(diǎn)PCR應(yīng)用及應(yīng)用特別的熒光團(tuán)或嵌入染料 的動力學(xué)/實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，所述熒光團(tuán)或嵌入染料發(fā)射熒光信號作為擴(kuò)增的靶標(biāo)的函數(shù)，并 允許進(jìn)行靶標(biāo)的監(jiān)測和定量。定量方法可以根據(jù)外部標(biāo)準(zhǔn)曲線是絕對的或相對于比較性內(nèi) 部標(biāo)準(zhǔn)品。
[0024] 術(shù)語"下一代測序"或"高通量測序"指使測序方法平行化，一次產(chǎn)生幾千個(gè)或 幾百萬個(gè)序列的高通量測序技術(shù)。例子包括大規(guī)模平行標(biāo)簽測序（MassivelyParallel SignatureSequencing,MPSS)、Polony測序、454 焦磷酸測序、Illumina(Solexa)測 序、SOLiD測序、離子半導(dǎo)體測序、DNA納米球測序、Helioscope(TM)單分子測序、單分子 SMRT(TM)測序、單分子實(shí)時(shí)（RNAP)測序、納米孔DNA測序。<