用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物、引物以及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非小細胞肺癌檢測領域，特別涉及用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物、引物以及檢測方法。用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物，包括miR6801、miR22、miR19b中的任一種或多種。本發(fā)明從大量miRNA中進行篩選，得到的這三種標記物在人血清中穩(wěn)定存在，可作為非小細胞肺癌的腫瘤標記物，用于非小細胞肺癌的輔助診斷指標。本發(fā)明還提供了用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA熒光定量PCR引物，得到的引物對非小細胞肺癌的檢測具有很好的敏感性和特異性，能很好的輔助非小細胞肺癌的檢測。并提供了用于輔助檢測非小細胞肺癌的試劑盒以及檢測方法，以便于輔助檢測非小細胞肺癌的檢測。
【專利說明】
用于輔助檢測非小細胞肺癌的標巧物、引物從及檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及非小細胞肺癌檢測領域，具體而言，設及用于輔助檢測非小細胞肺癌 的標記物、引物W及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 微小RNA(miRNA，miR)是一類內(nèi)源性高度保守的長度為18-25個核巧酸的非編碼單 鏈RNA分子，人類miRNA可作為診斷非小細胞肺癌的新的血清標志物指標。目前miR-205、 miR-125b、miR-25、miR-155等已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可用于非小細胞肺癌診斷的標志物指標。
[0003] 迄今為止，21.0版本的miRNA權威數(shù)據(jù)庫已經(jīng)顯示人類目前存在的miRNA種類有 2581種，其中可作為非小細胞肺癌診斷標志物的miRNA需要進一步被發(fā)現(xiàn)。
[0004] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物，所述的標記物 經(jīng)大量篩選得到，得到的運巧巾血清miRNA分子穩(wěn)定存在，可作為非小細胞肺癌的腫瘤標記 物，可用于非小細胞肺癌的輔助診斷指標。
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA巧光定量PCR引 物，得到的引物對非小細胞肺癌的檢測具有很好的敏感性和特異性，能很好的輔助非小細 胞肺癌的檢測。
[0007] 本發(fā)明的第S目的在于提供用于輔助檢測非小細胞肺癌的試劑盒，W便于輔助檢 測非小細胞肺癌的檢測。
[000引本發(fā)明的第四目的在于提供輔助檢測非小細胞肺癌的方法，該方法簡單易行，穩(wěn) 定可靠，為非小細胞肺癌的診斷提供輔助技術支持。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術方案：
[0010] 用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物，包括11111?6801、1]111?22、1]111?1%中的任一種或 多種。
[0011] 現(xiàn)有的miRNA種類有2581種，但可作為非小細胞肺癌診斷標志物的miRNA需要進一 步被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人從 miR27d、miR12 加、miR197、miR27b、miR15b、miR16、miR25、miR155、 miR205等中進行篩選，得到用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物，為miR6801、miR22、 miR19b中的任一種或多種。運=種標記物在人血清中穩(wěn)定存在，可作為非小細胞肺癌的腫 瘤標記物，用于非小細胞肺癌的輔助診斷指標。
[0012] 本發(fā)明提供的用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物可W為=個標記物中的任一 種，如可W為miR6801或miR22或miR19b;也可W為S個標記物中的任意兩種，如可W為 miR6801 和 miR22 ;miR6801 和 miR19b ;miR22 和 miR19b;也可 W 為S個標記物中的 S種。
[OOU]本發(fā)明還提供了用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA巧光定量PCR引物，包括內(nèi)參 引物和檢測引物，所述檢測引物選自第一引物對、第二引物對、第S引物對中的任一種或多 種；
[0014] 所述第一引物對的上游引物的堿基序列如SEQ ID No. I所示；
[001引所述第二引物對的上游引物的堿基序列如沈Q ID No.2所示；
[0016] 所述第=引物對的上游引物的堿基序列如SEQ ID No.3所示；
[0017] 所述內(nèi)參引物的上游引物的堿基序列如沈Q ID No.4所不；
[0018]所述第一引物對、所述第二引物對、所述第S引物對和所述內(nèi)參引物的下游引物 均相同，所述下游引物的堿基序列如SEQ ID No.5所示。
[0019]本發(fā)明提供的用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA巧光定量PCR引物，對非小細胞 肺癌的檢測具有很好的敏感性和特異性，能很好的輔助非小細胞肺癌的檢測。
[0020] 其中，第一引物對對應于miR6801而設計;第二引物對對應于miR22而設計;第=引 物對對應于miR19b而設計。
[0021] 本發(fā)明提供的用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA巧光定量PCR引物，每次檢測均 需要內(nèi)參引物的存在，W便于檢測各引物對的變化情況。
[0022] 本發(fā)明還提供了含有上述miRNA巧光定量PCR引物的試劑盒，W便于檢測使用。
[0023] 本發(fā)明還提供了檢測非小細胞肺癌標記物的方法，提取待測血清樣本中的miRNA, 得到提取物；
[0024] 對所述提取物加 POly(A)尾己，然后逆轉錄得到CDNA產(chǎn)物；
[0025] W所述CDNA產(chǎn)物為模板，W上述的miRNA巧光定量PCR引物進行實時巧光定量PCR。
[0026] 本發(fā)明提供的檢測非小細胞肺癌標記物的方法，簡單易行，檢測結果穩(wěn)定可靠，可 結合非小細胞肺癌的癥狀等進行確診，為非小細胞肺癌的診斷提供輔助技術支持。
[0027] 其中，提取待測血清樣本中的miRNA采用常規(guī)的方法進行即可，若采用試劑盒進行 提取，則參照試劑盒的步驟進行，提取得到的提取物為小片段RNA的混合物。
[00%]優(yōu)選地，WmiRNA逆轉錄通用引物作為引物對所述提取物逆轉錄得到CDNA產(chǎn)物；
[0029] 所述通用引物為：如SEQ ID No.6所示的引物序列、如SEQ ID No.7所示的引物序 列和如SEQ ID No.8所示的引物序列的混合物。
[0030] 采用上述通用引物進行逆轉錄，得到的CDNA產(chǎn)物再進行實時巧光定量PCR，引物特 異性強，結果穩(wěn)定可靠。
[0031] 更優(yōu)選地，所述混合物中，=個引物序列W等重量混合。
[0032] 經(jīng)試驗驗證，通用引物的工作濃度為0.4-0.化g/化逆轉錄得到的CDNA非特異性擴 增少，為下一步的實施巧光定量PC財是供良好的模板。優(yōu)選地，所述通用引物的工作濃度為 0.4-0.6蛇/化。
[0033] 實時巧光定量PCR的反應體系的體積可W根據(jù)需求進行選擇，為了便于操作且節(jié) 約成本，進一步地，所述實時巧光定量PCR的反應體系的體積為15-3化L。如實時巧光定量 PCR的反應體系的體積為15化、2化L、25化、3化L等等。
[0034] 綜合考慮，更優(yōu)選地，所述實時巧光定量PCR的反應體系的體積為20iiL。
[0035] 經(jīng)驗證，采用W下的實時巧光定量PCR反應程序進行反應，引物特異性強。優(yōu)選地， 實時巧光定量PCR的反應程序為：
[0036] 94-95°C 保持 2-5min;
[0037] 94-95°C 保持 15-20s，60°C 保持 34-35S，循環(huán)40-45次。
[003引如實時巧光定量PCR的反應程序可W為：
[0039] 95°C 保持 2min;
[0040] 95 °C 保持 15s，60 °C 保持 34s，循環(huán)45 次。
[0041 ] 也可W為：
[0042] 94°C 保持 5min;
[0043] 94°C 保持 20s，60°C 保持 35s，循環(huán) 40 次。
[0044] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0045] (1)本發(fā)明首次得到miR6801、miR22、miR19b中的任一種或多種可作為輔助檢測非 小細胞肺癌的標記物，為非小細胞肺癌的診斷提供技術支持。
[0046] (2)本發(fā)明還提供了用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA巧光定量PCR引物，得到 的引物對非小細胞肺癌的檢測具有很好的敏感性和特異性，能很好的輔助非小細胞肺癌的 檢測。
[0047] (3)本發(fā)明還提供了用于輔助檢測非小細胞肺癌的試劑盒，W便于輔助檢測非小 細胞肺癌的檢測。
[0048] (4)本發(fā)明還提供了檢測非小細胞肺癌標記物的方法，簡單易行，檢測結果穩(wěn)定可 靠，為非小細胞肺癌的診斷提供輔助技術支持。
【附圖說明】
[0049] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，W下將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0050] 圖1為本發(fā)明實施例中病例組和對照組中的不同miRNA的表達水平柱形圖。
【具體實施方式】
[0051] 下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可W通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0化2]實施例1
[0化3] -、選擇病例組和對照組
[0054] 病例組:2012年8月至2013年10月某醫(yī)院收治的初治NSCLC患者120例，其中男性65 例、女性55例，年齡41-73歲(平均50.1歲），其中肺腺癌69例、肺鱗癌51例。所有NS化C患者全 部經(jīng)細胞學或組織學確診，W往未進行放療或化療，無急性感染、無屯、臟病史、無中樞神經(jīng) 系統(tǒng)轉移和營養(yǎng)不良。NSCLC患者經(jīng)體格檢查、胸片、腹部彩超、頭腦CT、骨掃描等確定臨床 分期，肺癌分期參照2002年美國癌癥聯(lián)合協(xié)會(AJCC)標準。NSCLC患者有雙徑可測量病灶， 活動狀態(tài)(PS)評分0-2(美國東部腫瘤協(xié)作組ECOG標準），預計生存時間>3個月；血常規(guī)檢 查正常，中性粒細胞絕對值> 2.0 X 109/L，血紅蛋白> 90g/L，血小板> 100 X 109/1;肝、腎 功能正常，轉氨酶《正常值高限的2倍，總膽紅素《正常值高限，肌酢《正常值高限。
[0055] 健康對照組：某醫(yī)院體檢健康職工45名，其中男性22名、女性23名，年齡25-55歲 (平均39.4歲），無高血壓、高血脂、糖尿病等基礎性疾病。
[0056] 二、標本采集
[0057] 用帶血清分離膠的真空采血管收集NS化C患者和健康人空腹外周靜脈血4mL。所有 標本經(jīng)4000轉/分離屯、后分離出血清，將每個血清樣本(最少50化L轉移至1.5mL eppendorf 管中，注意避免移液槍頭不要觸碰到采血管底端的血凝塊。所有血清標本于采血后4小時內(nèi) 處理完畢，收集后的血清樣本放至-80°C超低溫冰箱中冷凍，集中進行microRNA的提取。
[0化引 S、血清標本microRNA提取
[0059] 參考北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的miRNA提取分離試劑盒(批號:DP501)的操 作程序提取所有血清標本中的miRNA(所設及耗材均為無RNA酶），具體流程如下：
[0060] 1.取血清樣本20化L，加入等體積裂解液緩沖液，旋滿振蕩30秒后室溫靜置10分 鐘。
[0061 ] 2.于室溫12，000轉/分離屯、10分鐘，取上清，轉入一無RNA酶離屯、管中。
[0062 ] 3.加入20化L氯仿劇烈振蕩15秒，室溫放置5分鐘。
[0063] 4.于室溫12,000轉/分離屯、15分鐘，將無色水相(約30化L)轉移到新管中。
[0064] 5.緩慢加入轉移液體積1/3體積的無水乙醇，混勻，將體系全部轉入吸附柱miR spin,室溫放置2分鐘，室溫12,000轉/分離屯、30秒，離屯、后棄掉吸附柱miR spin,保留流出 液。
[00例 6.緩慢加入流出液體積(約300化)2/3的無水乙醇（約300化），混勻，將得到的溶液 和沉淀一起轉入吸附柱miR elute，室溫放置2分鐘，室溫12，000轉/分離屯、30秒，離屯、后棄 掉流出液，保留吸附柱miR elute。
[0066] 7.向吸附柱miR elute中加入5(K)化去蛋白液MRD(已加入乙醇），室溫靜置2分鐘， 室溫12，000轉/分離屯、30秒，棄去廢液。
[0067] 8.向吸附柱miR elute中加入60化L漂洗液RW(已加入乙醇），室溫靜置2分鐘，室溫 12,000轉/分離屯、30秒，棄去廢液。
[0068] 9.重復操作步驟8-次。
[0069] 10.將吸附柱miR elute放入2血收集管中，室溫12,000轉/分離屯、1分鐘，去除殘余 液體。
[0070] 11.將吸附柱miRelute轉入一個新的無RNA酶的1.5mL離屯、管中，加入20化無RNA酶 的雙蒸水，室溫放置2分鐘，室溫12，000轉/分離屯、2分鐘，提取的microRNA檢測濃度后-80°C 保存或直接進行逆轉錄。
[0071] 12.MicroRNA濃度檢測：取microRNA樣品化L，使用Quawell Q3000微量核酸檢測儀 在RNA模式中進行初步檢測。檢測結果顯示，該方法提取的小RNA產(chǎn)物中包含長度在20- 200nt 的mi croRNA、S iRNA、snRNA等小片段 RNA。
[0072] 四、血清microRNA的檢測
[0073] 1 .MicroRNA 分子 3'端poly (A)化及逆轉錄
[0074] 1.1 miRNA 3'端poly(A)化處理流程參考北京天根生化科技公司生產(chǎn)的miRcute miRNA First-Strand cDNA合成試劑盒(批號:KR201)，提取的miRNA標本于冰上解凍后在無 核酸酶的離屯、管中加入的組分如表1所示。
[0075] 表1力化Oly(A)尾己反應體系的組成成分 「T / I
[0078]將離屯、管在37°C保持60分鐘，得到的poly(A)反應產(chǎn)物于-80°C超低溫冰箱保存。 [00巧]1.2 POly(A)已修飾的microRNA逆轉錄流程參考北京天根生化科技公司生產(chǎn)的 miRcute miRNA First-Strand cDNA合成試劑盒（批號：KR201)，在無核酸酶的離屯、管中加 入如表2所示的組分。
[0080]表2逆轉錄反應體系的組成成分
LUUOZ」 共T，microKiNA化年專求旭化I引'物/于yu ;/、」：巧j/yr不的二巧引物刀、別銜?用牛々義丄.OJig/ JiL 母液，再各自等體積混合，制成0.化g AiL的工作液。
[0083] 表3 microRNA逆轉錄通用引物序列
[0084]
[0086]將逆轉錄反應的離屯、管放置在37°C保持60分鐘，得到的CDNA產(chǎn)物直接用于定量分 析或在-20°C低溫冰箱保存。
[0087] 2.實時巧光定量PCR
[008引 2.1室溫融化2XmiRcutemiRNA premix(含SYBR)和逆轉錄引物（IOyM)，使用時將 2 XmiR州temiRNA premix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經(jīng)輕微離屯、后使用。將試劑 置于冰上，反應體系如表4所示。
[0089] 表4實時巧光定量PCR反應體系 「mon1
[0091] 實時巧光定量PCR反應程序為：
[0092] 94°C2分鐘；（預變性）
[0093] 94 °C 20 秒，60 °C 34 秒，45 個循環(huán)。
[0094] 表4中所用的不同的引物對序列如表5所示，其中，化s-miR-103qPCRprimer為內(nèi)參 引物，每次進行實時巧光定量PCR時均W該引物作為內(nèi)參。
[0095] 表5引物序列
[0096]
[0097] 下游引物均為通用引物:5'-TCAA CGAT ACGC TACG TAACG AAAAAAAAAA-3'。
[0098] 2.2將不同引物配置的反應液放置于Roche light巧Cler 480II實時巧光定量 PCR擴增儀進行讀數(shù)。在每個qRT-PCR反應中都設置空白對照，即只加入去除核酸酶水，該反 應體系中未檢測到PCR的擴增信號。
[0099] 2.3配制濃度為3%的瓊脂糖凝膠，選取miRNA樣本PCR擴增產(chǎn)物，加入適量上樣緩 沖液，按照樣孔順序加入膠孔，電泳60分鐘后，置于凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照分析。
[0100] 2.4巧光定量擴增已逆轉錄為CDNA的microRNA，通過烙解曲線、擴增曲線W及凝 膠電泳綜合考察qRT-PCR反應體系擴增特異性。
[0101] 2.5 qRT-PCR實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過Ii曲tcycler 480II軟件進行分析，軟件自動設置PCR 反應的基線值及界值，每個CDNA樣本的表達量檢測均重復3次。
[0102] 2.6所有miRNA的相對表達量用表示，各樣本的ACt值=(目的基因Ct值-內(nèi) 參基因Ct值），Ct值是熱循環(huán)儀檢測到反應體系中巧光信號的強度值。Ct值反應檢測的靈敏 性，同一份標本在不同條件下檢測，若其值越低表明靈敏性越高。
[0103] 五、統(tǒng)計學分析
[0104] 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，正態(tài)分布計量 資料W均數(shù)±標準差表示，偏態(tài)分布計量資料W中位數(shù)（四分位間距）表示。多組間血清 miRNA相對表達量比較采用Kruskal Wallis H檢驗或t檢驗，兩組之間比較采用Mann- Whitney U檢驗或t檢驗。所有統(tǒng)計學檢驗均為雙側概率檢驗，P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意 義。
[01化]病例組(NSCLC)和對照組中的不同mi RNA的表達情況如圖1所示。從圖1可W看出， NSCLC患者血清中miR-22的表達水平顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Z = 2.129，P <0.05) ;NS化C患者血清中miR-19b的表達水平顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(Z = 2.590，P<0.05);NS化C患者血清中miR-6801的表達水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng) 計學意義(Z = 2.238，P<0.05)。
[0106] 計算不同病例組(NSCLC)和對照組中的不同miRNA的敏感性和特異性，結果如表6 所示。
[0107] 表6血清miRNA對NS化C檢測的敏感性、特異性（％ )
[010 引
L0109」如表6所不，血渭miR-22對NS化C檢測的敏感性為19%、特弁性為86.7% ;血渭miR- 19b對NS化C檢測的敏感性為16.5 %、特異性為82.2 % ;血清miR-6801對NS化C檢測的敏感性 為34.7%、特異性為95.6% ; S項聯(lián)合(miR-22+miR-19b+miR-6801)對NS化C檢測的敏感性 為58.7%、特異性為86.7%。
[0110] 另外，還對miR27d、miR12化、miR197、miR27b、miR15b、miR16、miR25、miR155、 miR205等miRNA設計引物，進行實時巧光定量PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)運些miRNA在患者與健康者 之間的表達水平差別不顯著。
[0111] W上研究首次發(fā)現(xiàn)，應用實時巧光定量PCR法檢測人血清miR-6801、miR-22和miR- 19b中的任一種或多種可用于輔助非小細胞肺癌診斷。
[0112] 此外，還進行W下實驗：
[0113] 通用引物的工作濃度為0.4或0.化g/iiL，結果與上述效果一致。
[0114] 改變實時巧光定量PCR的反應體系的體積為15化、2化U30化，結果與上述效果一 致。
[0115] 改變實時巧光定量PCR的反應程序為：
[0116] 95°C 保持 2min;
[0117] 95 °C 保持 15s，60 °C 保持 34s，循環(huán)45 次。
[011引或者
[0119] 94°C 保持 5min;
[0120] 94°C 保持 20s，60°C 保持 35s，循環(huán) 40 次。
[0121 ]得到的結果與上述結果一致。
[0122]綜上，本發(fā)明所提供的非小細胞肺癌標記物包括在人血清中穩(wěn)定存在且可檢測的 miRNA分子包括:miR-6801、miR-22和miR-19b。該巧巾血清miRNA分子標志物及其引物可用于 制備診斷試劑盒，用于早期肺癌的輔助診斷。
[0123]盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的 精神和范圍的情況下可W作出許多其它的更改和修改。因此，運意味著在所附權利要求中 包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有運些變化和修改。
【主權項】
1. 用于輔助檢測非小細胞肺癌的標記物，其特征在于，包括miR6801、miR22、miR19b中 的任一種或多種。2. 用于輔助檢測非小細胞肺癌的miRNA熒光定量PCR引物，其特征在于，包括內(nèi)參引物 和檢測引物，所述檢測引物選自第一引物對、第二引物對、第三引物對中的任一種或多種； 所述第一引物對的上游引物的堿基序列如SEQ ID No.1所示； 所述第二引物對的上游引物的堿基序列如SEQ ID No.2所示； 所述第三引物對的上游引物的堿基序列如SEQ ID No.3所示； 所述內(nèi)參引物的上游引物的堿基序列如SEQ ID No.4所示； 所述第一引物對、所述第二引物對、所述第三引物對和所述內(nèi)參引物的下游引物均相 同，所述下游引物的堿基序列如SEQ ID No.5所示。3. 含有權利要求2所述的miRNA熒光定量PCR引物的試劑盒。4. 用于檢測權利要求1所述的標記物的方法，其特征在于，包括以下步驟： 提取待測血清樣本中的miRNA，得到提取物； 對所述提取物加 Poly(A)尾巴，然后逆轉錄得到cDNA產(chǎn)物； 以所述cDNA產(chǎn)物為模板，以權利要求2所述的miRNA熒光定量PCR引物進行實時熒光定 量 PCR 〇5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，以miRNA逆轉錄通用引物作為引物對所述 提取物逆轉錄得到cDNA產(chǎn)物； 所述通用引物為：如SEQ ID No.6所示的引物序列、如SEQ ID No.7所示的引物序列和 如SEQ ID No.8所示的引物序列的混合物。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合物中，三個引物序列以等重量混 合。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述通用引物的工作濃度為0.4-0.6ygAx L08. 根據(jù)權利要求4所述的輔助檢測非小細胞肺癌的方法，其特征在于，所述實時熒光定 量PCR的反應體系的體積為15-30yL。9. 根據(jù)權利要求8所述的輔助檢測非小細胞肺癌的方法，其特征在于，所述實時熒光定 量PCR的反應體系的體積為20yL。10. 根據(jù)權利要求4-9任一項所述的輔助檢測非小細胞肺癌的方法，其特征在于，所述 實時熒光定量PCR的反應程序為： 94-95 °C 保持 2-5min; 94-95°C 保持 15-20s，60°C 保持34-35s，循環(huán)40-45次。
【文檔編號】C12N15/11GK105925686SQ201610318306
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】時廣利, 許紹發(fā)
【申請人】首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院