缺血性腦卒中的分子診斷標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了缺血性腦卒中的分子診斷標(biāo)志物，具體地該診斷標(biāo)志物為PPIE，PPIE在缺血性腦卒中患者中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)檢測(cè)PPIE在受試者體內(nèi)的表達(dá)水平，可以判斷受試者是否患有缺血性腦卒中或者患缺血性腦卒中的概率。本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，使用該產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷，從而降低因診斷不及時(shí)而導(dǎo)致的高死亡率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
缺血性腦卒中的分子診斷標(biāo)志物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及缺血性腦卒中的分子診斷標(biāo)志物，具體地該標(biāo)志 物為PPIE。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦血管病與屯、血管病及腫瘤一起是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的=大疾病之一，其具有高 發(fā)病率、高致殘率與高死亡率的特點(diǎn)，同時(shí)也與屯、血管病及腫瘤一起是人類(lèi)=大死亡原因 之一。腦血管病主要是由于腦組織血液循環(huán)障礙而導(dǎo)致局部神經(jīng)功能缺失的神經(jīng)系統(tǒng)疾 病，可分為急性腦血管病及慢性腦血管病。急性腦血管疾病又常被稱(chēng)為腦卒中，在美國(guó)，每 年約80萬(wàn)人患有腦卒中類(lèi)疾病，且發(fā)病率隨著年齡的增加而增加，運(yùn)給其不斷老年化的社 會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的問(wèn)題。在中國(guó)，腦血管病發(fā)病率逐年上升，已占據(jù)人口致死和致殘?jiān)虻牡谝?位。近幾年流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)每年新發(fā)腦卒中病例約有200萬(wàn)。而隨著經(jīng)濟(jì)水平 的快速發(fā)展，我國(guó)人口老齡化問(wèn)題的不斷加重，W及不健康的生活方式等眾多因素，使得缺 血性腦血管病發(fā)病率逐年增長(zhǎng)。
[0003] 腦卒中又可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中占全部腦卒中發(fā)病 率的80%左右，并且其發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而增高。缺血性腦卒中的發(fā)生主要是由于腦栓 塞及局部血栓的形成，運(yùn)可能是由動(dòng)脈粥樣硬化引起的血管狹窄、血栓栓塞，或者是來(lái)源于 屯、臟的栓子隨血流至腦部引起腦栓塞；而各種原因造成的血管損傷、血管炎癥也是重要原 因之一。諸多原因引起腦部血液供應(yīng)障礙，而造成受損腦組織的不可逆性損害，使得腦組織 缺血、缺氧導(dǎo)致最終壞死，給患者造成一系列的神經(jīng)功能缺損和障礙。目前按照國(guó)際上公認(rèn) 的最常用分型標(biāo)準(zhǔn)的分類(lèi)方法，缺血性腦卒中疾病TOAST分型系統(tǒng)，可將缺血性腦卒中分為 5個(gè)亞型:大動(dòng)脈粥樣硬化型、屯、源性栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型及不明原因型。
[0004] 缺血性腦卒中是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜性疾病，隨著人類(lèi)基因組計(jì) 劃的完成和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，基因的研究受到廣泛重視，尋找疾病的基因標(biāo)記物成為當(dāng) 前研究的熱點(diǎn)。今年來(lái)，越來(lái)越多研究認(rèn)為，基因在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重 要的調(diào)控作用，因此基因與缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系也備受關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種缺血性腦卒中的診斷標(biāo) 志物；
[0006] 本發(fā)明的目的之二，提供一種診斷產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[000引本發(fā)明提供了檢測(cè)PPIE基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，所述PPIE基因在缺血性腦卒中患者中表達(dá)下調(diào)。
[0010] 進(jìn)一步，所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 、原位雜交或微陣列忍片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。
[0011] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增PPIE基因 的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增PPIE基因的 引物;所述用免疫檢測(cè)診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與PPIE蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述 用原位雜交診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與PPIE基因的核酸序列雜交的探針;所述用微 陣列忍片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與PPIE 蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因忍片包括與PPIE基因的核酸序列雜交的探針。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述用實(shí)時(shí)定量PCR特異擴(kuò)增PPIE基因的引物 序列如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0013] 進(jìn)一步，所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括忍片和/或試劑盒;其中所述忍片包括 基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒。
[0014] 本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)PPIE基因 的表達(dá)水平來(lái)診斷缺血性腦卒中。
[0015] 進(jìn)一步，上面所述的產(chǎn)品包括忍片、或試劑盒。其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白 質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定在固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧 酸探針包括用于檢測(cè)PPIE基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)PPIE基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片 包括固相載體W及固定在固相載體上的PPIE蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因檢測(cè) 試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)PPIE基因轉(zhuǎn)錄水平的試 劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括PPIE蛋白的特異性抗體。其中，所述基因忍片可用于檢測(cè) 包括PPIE基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與缺血性腦卒中相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述 蛋白質(zhì)忍片可用于檢測(cè)包括PPIE蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與缺血性腦卒中相關(guān)的多個(gè) 蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與缺血性腦卒中的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高缺血性腦 卒中診斷的準(zhǔn)確率。
[0016] 進(jìn)一步，所述基因檢測(cè)試劑盒用于特異性擴(kuò)增PPIE基因引物對(duì)。
[0017] 進(jìn)一步，所述用于擴(kuò)增PPIE基因的引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所 /J、- O
[0018] 在本發(fā)明中，"抗體"覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性 抗體）、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。"單克隆抗體"指 從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除 了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類(lèi)變體一般W極小量存在。此類(lèi)單 克隆抗體典型的包括包含結(jié)合祀物的多膚序列的抗體，其中祀物結(jié)合多膚序列是通過(guò)包括 從眾多多膚序列中選擇單一祀物結(jié)合多膚序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。
[0019] 單克隆抗體還包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種 或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另 一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，W及此類(lèi)抗體的片 段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性即可。
[0020] "抗體或抗體片段"指無(wú)論自天然生成抗體的任何物種衍生，還是通過(guò)重組DNA技 術(shù)創(chuàng)建;無(wú)論自血清、B細(xì)胞、雜交瘤、轉(zhuǎn)染瘤、酵母或細(xì)菌分離的抗體(例如IgG、IgM、IgA、 1神或1旨6)或片段(諸如化13少(曰13'）2少￥、二硫化物連接的。￥、3。。￥、閉合構(gòu)象多特異性抗 體、二硫化物連接的scFv、雙抗體）。
[0021] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的 分子。除非另有指出，術(shù)語(yǔ)"探針"通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核巧酸(往往稱(chēng)為 "祀多核巧酸"）結(jié)合的多核巧酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全 序列互補(bǔ)性的祀多核巧酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式， 包括，但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。
[0022] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質(zhì)上，所述雜交陣列原 件諸如聚核巧酸探針(例如寡核巧酸)或結(jié)合劑(例如抗體）。所述基質(zhì)可W是固體基質(zhì)，例 如，玻璃或二氧化娃玻片、珠、纖維光學(xué)粘結(jié)劑或半固態(tài)基質(zhì)，例如硝酸纖維素膜。核巧酸序 列可W是DNA、RNA或其中的任何排列。
[0023] 各種探針陣列已經(jīng)描述在文獻(xiàn)中并且可W用于本發(fā)明上下文中檢測(cè)可能與本文 所述表型相關(guān)的標(biāo)志物。例如，DNA探針陣列忍片或較大的DNA探針陣列晶片（否則，可W通 過(guò)打斷晶片而獲得各個(gè)體忍片）用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。DNA探針陣列晶片一般包含玻 璃晶片，其上放置了高密度DNA探針(短DNA片段)陣列。運(yùn)些晶片各自可W保持例如約6000 萬(wàn)個(gè)用于識(shí)別較長(zhǎng)樣品DNA序列（例如，來(lái)自個(gè)體或群體，例如，包含所關(guān)注的標(biāo)志物）的DNA 探針。用玻璃晶片上的DNA探針組識(shí)別樣品DNA通過(guò)DNA雜交進(jìn)行。當(dāng)DNA樣品與DNA探針陣列 雜交時(shí)，樣品結(jié)合于樣品DNA序列互補(bǔ)的那些探針。通過(guò)評(píng)價(jià)個(gè)體樣品DNA與那些探針更穩(wěn) 固地雜交，有可能確定已知的核酸序列是否存在于樣品中，由此確定核酸中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物 是否存在。還可W使用運(yùn)一手段通過(guò)控制雜交條件W允許區(qū)別單一核巧酸，例如，用于SNP 鑒定和一種或多種SNP的樣品基因分型來(lái)進(jìn)行ASH。陣列提供了一種同時(shí)(或串連)檢測(cè)多個(gè) 多態(tài)性標(biāo)志物的便利性實(shí)施方案。
[0024] 上述探針具有與祀點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。運(yùn)里，所謂"互補(bǔ)"， 只要是雜交即可，可W不是完全互補(bǔ)。運(yùn)些多核巧酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有 80 % W上、優(yōu)選90 % W上、更優(yōu)選95 % W上、特別優(yōu)選100 %的同源性。運(yùn)些探針可W是DNA， 也可W是RNA，另外，可W為在其一部分或全部中核巧酸通過(guò)?魁、1魁、6魁、6魁^魁等人工 核酸置換得到的多核巧酸。
[0025] 在本發(fā)明的上下文中，"PPIE基因"包括人PPIE基因W及人PPIE基因的任何功能等 同物的多核巧酸。PPffi基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中PPIE基因（NC_ 000001.11)DNA序列具有70% W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；在本發(fā)明的 具體實(shí)施方案中，所述PPIE基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
[00%]本發(fā)明的PPIE基因可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達(dá)PPIE的DNA 片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0027]病毒載體可W是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、瘤疹病毒(例如單純瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。 真核表達(dá)載體可W是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、PCDNA3.0表 達(dá)載體、PCDNA3.1表達(dá)載體、祀GFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、pTRE表達(dá)載 體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如地in438、pCAMBIA1301等。
[00%]在本發(fā)明的上下文中，PPffi基因表達(dá)產(chǎn)物包括人PPIE蛋白W及人PPIE蛋白的部分 膚。所述PPIE蛋白的部分膚含有與缺血性腦卒中相關(guān)的功能域。
[0029]叩Pffi蛋白"包括PPIE蛋白W及PPIE蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 PPIE蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人PPIE的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明 的【具體實(shí)施方式】中，所述PPIE蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)。
[0030] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0031] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷缺血性腦卒中"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有缺血 性腦卒中、也包括判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0033] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 PPIE基因表達(dá)與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，對(duì)于掲示缺血 性腦卒中的發(fā)病機(jī)理具有重要的意義
[0034] 本發(fā)明提供了診斷產(chǎn)品，通過(guò)檢測(cè)血液中PPIE的表達(dá)水平，從而判斷受試者是否 患有缺血性腦卒中、或者判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早治 療，降低缺血性腦卒中的致殘率或死亡率。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1顯示利用QPCR檢測(cè)PPIE基因在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)情況.
[0036] 具體的實(shí)施方式
[0037] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。W下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0038] 實(shí)施例1篩選與缺血性腦卒中相關(guān)的基因標(biāo)志物
[0039] 1、樣品收集
[0040] 各收集10例正常人血液和缺血性腦卒中患者血液樣本，上述所有標(biāo)本的取得均通 過(guò)倫理委員會(huì)的同意。
[0041] 2、RNA樣品的制備及質(zhì)量分析
[0042] 2.1 RNA樣品的制備
[0043] 使用Promega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。具體步驟如下：
[0044] 1)取Iml收集在肝素或邸TA處理過(guò)的試管中的全血，放進(jìn)無(wú)菌離屯、管中；
[0045] 2)收集血細(xì)胞:300化pm(400g)離屯、5min，小屯、地從樣品頂部吸走上清；
[0046] 3)加Iml血細(xì)胞裂解液，小屯、吸放4-5次，重懸沉淀物；
[0047] 4)3000巧 m 離屯、5min;
[0048] 5)重復(fù)步驟3)和4)兩次(共=次）；
[0049] 6)避開(kāi)細(xì)胞沉淀物，小屯、吸走幾乎所有上清，只保留10化1上清液;確認(rèn)一下BME已 經(jīng)加到RNA裂解液中，然后加17化1 RNA裂解液到細(xì)胞中，吸放重懸并裂解細(xì)胞；
[(K)加]7)加35化1 RNA稀釋液，顛倒混合3-4次；
[0化1] 8)置于70。(：水浴中3111111;
[0化2] 9)室溫下 13000g 離屯、IOmin;
[0053] 10)將清亮裂解物轉(zhuǎn)移到一支無(wú)菌離屯、管中；
[0054] 11)向澄清裂解液中加入20化1 95 %乙醇，用移液槍吸放3-4次W混合;將此混合 物轉(zhuǎn)移到離屯、柱裝配體中，13000g離屯、Imin;
[0055] 12)從離屯、柱裝配體上拿下離屯、柱，棄去收集管中的液體，將離屯、柱裝回到收集管 上，確認(rèn)一下RNA Wash Solution已用乙醇稀釋?zhuān)?00]il RNA洗涂液于離屯、柱裝配體， 13000g 離屯、Imin;
[0056] 13)棄去收集管中的液體，將離屯、柱裝回到收集管上，將50iil新鮮制備的D化Se解 育混合物直接加到離屯、柱內(nèi)的膜上；
[0化7] 14)室溫下解育15min，向離屯、柱中加入20化1 DNA酶終止緩沖液（確認(rèn)已加入乙 醇），13000g離屯、Imin;
[0化引 15)加入60化1 RNA洗涂液（已加入乙醇），13000g，離屯、Imin;
[0化9] 16)清空收集管，向離屯、柱內(nèi)加入25化1 RNA洗涂液(已加入乙醇），高速離屯、2min;
[0060] 17)將離屯、柱從收集管上轉(zhuǎn)移到洗脫管上，向膜上加10化1無(wú)核酸酶水，將離屯、柱 裝配體放進(jìn)離屯、機(jī)并使洗脫管的蓋子朝外，13000g離屯、Imin，丟棄離屯、柱，蓋好盛有RNA的 洗脫管，存于-70°C。
[0061 ] 2.2 RNA樣品的質(zhì)量分析(Nano化OP1000分光光度計(jì)）
[0062] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品，RNA-seq測(cè)序的樣品要求:0D260/0D280為 1?8-2?2d
[0063] 2.3 RNA樣品的質(zhì)量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0064] 將上述提取的R N A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，A g i I e n t T e C h n O I O g i e S 2100Bioanalyzer檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無(wú)降解、RNA完整 性指數(shù)合格、濃度達(dá)到要求的符合RNA-seq測(cè)序CDNA文庫(kù)構(gòu)建的要求，可W用于文庫(kù)構(gòu)建及 測(cè)序。
[0(?日]3、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0066] 3.1 RNA-seq 讀段定位
[0067] 首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用Top化t Vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組化gl9)進(jìn)行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預(yù)先構(gòu)建的索引 從Top化t主頁(yè)下載，并作為參考基因組，利用Top化t與基因組匹配時(shí)，允許每個(gè)讀段(默認(rèn) 到20)有多個(gè)匹配位點(diǎn)，最多2次錯(cuò)配。Top化t根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號(hào)建立可能的 剪切位點(diǎn)庫(kù)，根據(jù)運(yùn)些剪切位點(diǎn)庫(kù)將沒(méi)有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 Top化t方法的系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。
[006引3.2轉(zhuǎn)錄豐度評(píng)估
[0069]匹配上的讀段文件通過(guò)Cufflinks vl.0.3處理，Qifflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度。FPKM值指的是每一百萬(wàn)測(cè)序片段中匹配到特定 基因化b長(zhǎng)的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過(guò)貝葉斯推理方法計(jì)算FPKM估計(jì)值的置信區(qū)間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)下載（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0070] 3.3差異表達(dá)基因的檢測(cè)
[0071 ] 將下載的Ensembl GTF文件和通過(guò)TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度，檢測(cè)差異表 達(dá)。在化ffi壯巧俞出中只有q值<0.01，測(cè)試顯示成功的比較才被認(rèn)為是差異表達(dá)。
[007^ 4、結(jié)果
[0073] RNA-seq結(jié)果顯示，PPIE基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達(dá)量顯著低于正常 人的表達(dá)量。
[0074] 實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證PPIE基因的差異表達(dá)
[0075] 1、根據(jù)高通量測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果選擇PPIE基因進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1 中的樣本收集方式選擇缺血性腦卒中患者血液和正常人血液各80例。
[0076] 2、1?^4提取步驟同實(shí)施例1。
[0077] 3、逆轉(zhuǎn)錄:使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。具體步驟如下：
[0078] (1)取總RNA 2iig進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入Oligo(dT)，充分混勻；70°C水浴;5min后立 即冰浴2-3min;
[0079] (2)構(gòu)建反應(yīng)體系，其中包括5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液扣l，dNTP(2.5mM)扣l，RNasin 40UAU ,M-MLV 200UAU，補(bǔ)無(wú)核酶水至;
[0080] (3) 42 °C 水浴 60min 后，95 °C 水浴 5min W 滅活 M-MLV;
[0081 ] (4)-20°C 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0082] 4、QPCR 擴(kuò)增
[0083] (1)引物設(shè)計(jì)
[0084] 根據(jù)Genebank中PPIE基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[00化]PPIE基因：
[0086] 正向引物為5'-TCACAGATATTCAGATTC-3'（沈Q ID N0.3);
[0087] 反向引物為5'-CCTTCCTTAATTCTCATT-3'（沈Q ID N0.4)。
[0088] GAPDH 基因：
[0089] 正向引物為5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.5);
[0090] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0091] (2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0092] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0093] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0094]
[0095]
[0096] (3)PCR反應(yīng)條件:95°C IOmin，（95°C 15s，60°C60s) X 45個(gè)循環(huán)。WSY服 Green作為 巧光標(biāo)記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，A A CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0097] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0098] 實(shí)驗(yàn)采用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，使用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0099] 6、結(jié)果
[0100] 結(jié)果如圖1所示，與正常人血液相比，PPIE基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達(dá) 下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)，同RNA-S巧結(jié)果一致。
[0101] 上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)PPIE基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PPIE基因在缺血性腦卒中患者中表達(dá) 下調(diào)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:通過(guò) RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或微陣列芯片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷缺血性腦卒中的 產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增PPIE基因的引物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述特異擴(kuò)增PPIE基因的引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括芯片 和/或試劑盒，其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒 和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒。7. -種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，其特征在于，所述的產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)PPIE基因來(lái) 診斷缺血性腦卒中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述基因檢測(cè)試劑盒用于特異性擴(kuò)增PPIE 基因引物對(duì)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述用于擴(kuò)增PPIE基因的引物對(duì)的序列 如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105925713SQ201610509640
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年7月1日
【發(fā)明人】楊承剛, 邊洋, 宋宏濤
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司