專利名稱：檢測用微型反應器、基因檢測裝置和基因檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微型反應器，尤其是一種可適于基因檢測的含有生物反應器的基因檢測裝置。
背景技術：
近年來，通過利用微型機技術和超微細加工技術，開發(fā)了通過將用于進行以往的試樣制備、化學分析、化學合成等的裝置、方法(例如，泵、閥、流路、傳感器等)微細化將其集中在一塊芯片上的系統(tǒng)。
它們也被稱為μ-TAS(Micro total Analysis System)、生物反應器、Lab-on-chips、生物芯片，有望應用于醫(yī)療檢查、診斷領域、環(huán)境測定領域、農(nóng)業(yè)制造領域。尤其是如在基因檢測中所見到的那樣，在需要復雜的過程、熟練的操作技術、機器類的操作時，可以說自動化、高速化以及簡便化的微型化分析系統(tǒng)由于可以不必選擇成本、必要試樣量、所需時間以及時間和場所，因此好處很多。
例如，家畜中發(fā)現(xiàn)的新型傳染病的突發(fā)性流行中，作為病因的病毒、細菌的鑒定成為爭奪緊急預防對策中的第一層障礙。相對于菌類的培養(yǎng)容易限制速度的以往的檢測方法，不挑場合可迅速獲得結果的基因檢查技術滿足這種迫切需要。進而在通過基因的疾病診斷、生活習慣病等的發(fā)病風險預測、基因治療中也有很高需求。
臨床檢查中，注重這些分析用芯片中的分析的定量、分析的精度、經(jīng)濟性等。因此，建立結構簡單、且高可信度的送液系統(tǒng)成為需要解決的問題。因此需要精度高、可信度優(yōu)異的微液體控制元件。本發(fā)明人現(xiàn)已提出了適用于此的微型泵系統(tǒng)(專利文獻1和2)。
此外，對于以大量的臨床試樣為對象的芯片，理想的是可任意使用的，進而需要克服多用途適應性、制造成本等問題。
在以高密度固定多個DNA片段的DNA芯片中存在著搭載信息的內(nèi)容、龐大的制作成本、以及檢測精度、再現(xiàn)性等仍然不充分的問題。不過，根據(jù)基因檢查的目的和種類，可以提供通過使用可以適當變更的探針實時追蹤DNA擴增反應的效率方面比在芯片基板上網(wǎng)絡地配置多個DNA探針的方式更簡便且迅速的檢查方法。
專利文獻1特開2001-322099號公報專利文獻2特開2004-108285號公報非專利文獻1“DNA芯片技術及其應用”，《蛋白質(zhì) 核酸 酶》第43卷，第13期(1998年)君塚房夫，加藤郁之進，共立出版(株)發(fā)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可以任意使用的類型的、低成本且具有簡單結構和高精度的送液系統(tǒng)，使精度高的檢測成為可能的微型反應器，尤其是基因檢測用的微型反應器。目的在于通過合并提供具有難以產(chǎn)生諸如交叉感染，轉移(carry-over)感染這樣的問題的結構的生物微型反應器。
本發(fā)明的基因檢測裝置鑒于上述狀況形成的，其特征在于為了確保多用途性，高敏感度，適當改變所使用的引物和生物探針的方式進行DNA擴增。
上述目的可以通過以下結構實現(xiàn)。
試樣檢測用微型反應器具有(1)板狀的芯片，(2)具有用于分別儲存多種試劑的儲存室的多個試劑儲存部，(3)混合從前述多個試劑儲存部的出口送出的多種試劑從而生成混合試劑的試劑混合部，(4)具有用于從外部注入試樣的注入口的試樣接收部，和(5)使從前述試劑混合部送出的混合試劑和由試樣接收部送出的試樣混合反應的反應部，
前述多個試劑儲存部、試劑混合部、試樣接收部和反應部組裝在前述芯片內(nèi)，并通過流路連通；前述試劑混合部有防止初期混合試劑送出到反應部的送出防止結構。
在上述微型反應器中，前述試劑混合部形成混合流路，向反應部送出混合試劑的送出流路在混合流路的中間部分分叉，初期混合試劑通過儲存于該混合流路的中間部與下游末端之間可以防止從輸送流路送出到反應部。
此外，在上述微型反應器中，前述試劑混合部在前述混合流路與前述送出流路的連接部具有在前述混合流路內(nèi)的壓力達到規(guī)定壓力以上時向前述送出流路送出混合試劑的送液控制部。
試樣檢測用微型反應器具有(1)板狀的芯片，(2)具有用于分別儲存多種試劑的儲存室的多個試劑儲存部，(3)混合從前述多個試劑儲存部的出口送出的多種試劑從而生成混合試劑的試劑混合部，(4)具有用于從外部注入試樣的注入口的試樣接收部，和(5)使從前述試劑混合部送出的混合試劑和由試樣接收部送出的試樣混合反應的反應部，前述多個試劑儲存部、試劑混合部、試樣接收部和反應部組裝在前述芯片內(nèi)，并通過流路連通；前述各試劑儲存部有用于在儲存室注入驅動液的注入口和用于通過注入的試劑從儲存室推出試劑的出口，前述注入口和可以與外部泵連接的泵連接部連接，驅動液通過外部泵從注入口注入到儲存室，前述注入口與前述泵連接部的連接部中設置有末端開放的空氣排出流路。


本發(fā)明的一個實施方式中的基因檢測用微型反應器的概況圖。
圖1的微型反應器與裝置主體構成的基因檢測裝置的概況圖。
表示密封劑填充于試劑儲存部和與之連通的流路之間的狀態(tài)的圖。
表示壓電泵，(a)表示該泵的一個實例的截面圖，(b)是其上面圖。(c)是表示壓電泵的其它實例的截面圖。
表示外加給泵的壓電元件的驅動電壓波形與液體的位置變位之間的關系的圖。
(a)是表示輸送驅動液的泵部的結構的圖，(b)是表示輸送試劑的泵部的結構的圖。
表示用于排出空氣的流路的圖。
(a)，(b)表示通過由Y字的分支流路的上游輸送試劑和試樣，在流路中混合試劑和試樣的樣子的圖，(c)是表示送液泵的驅動的樣子。
(a)，(b)是沿送液控制部的流路軸方向的截面圖。
(a)，(b)表示設置于流路中的止逆閥的一個例子。
表示設置于流路中的活動閥的一個例子的截面圖，(a)表示開閥狀態(tài)，(b)表示關閥狀態(tài)。
是表示試劑定量部的結構的圖。
表示通過切去其前端部分，混合比率穩(wěn)定后向下一步驟輸送混合液的流路的結構的圖。
表示本發(fā)明的一個實施方式中的微型反應器的試劑混合部的結構的圖。
是表示由圖14的流路連通的、進行試樣與試劑的擴增反應和檢測的部分的結構的圖。
是表示由圖14的流路連通的、進行陽性對照與試劑的擴增反應和檢測的部分的結構的圖。
是表示由圖14的流路連通的、進行陰性對照與試劑的擴增反應和檢測的部分的結構的圖。
表示設置于流路中的活動閥的一個例子的截面圖，(a)表示開閥狀態(tài)，(b)表示關閥狀態(tài)。
表示設置于流路中的活動閥的一個例子的截面圖，(a)表示開閥狀態(tài)，(b)表示關閥狀態(tài)。
具體實施例方式
首先，對可以實現(xiàn)上述目的的本發(fā)明的優(yōu)選結構進行說明。
本發(fā)明的基因檢測用微型反應器的特征在于，按如下方式構成在一個芯片內(nèi)設置有注入試樣或從試樣提取的DNA的試樣儲存部、和儲存基因擴增反應中使用的試劑的試劑儲存部、和儲存陽性對照的陽性對照儲存部、和儲存陰性對照的陰性對照儲存部、和儲存與經(jīng)基因擴增反應擴增的檢測對象的基因雜交的探針DNA的探針DNA儲存部、和與這些各個儲存部連通的流路、和可以與輸送前述各儲存部和流路內(nèi)的液體的不同的微型泵連接的泵連接部；前述芯片中通過泵連接部與微型泵連接，向流路輸送儲存于試樣儲存部的試樣或從試樣中提取的DNA、和儲存于試樣儲存部的試劑，在流路內(nèi)混合，使之擴增反應后，向其下游側的流路輸送處理該反應液處理后的處理液、和儲存于探針DNA儲存部的探針DNA，在流路內(nèi)混合，使之雜交后，基于該反應生成物進行擴增反應的檢測；對于儲存于陽性對照儲存部中的陽性對照及儲存于陰性對照儲存部中的陰性對照，同樣使之與儲存于試劑儲存部的試劑在流路內(nèi)發(fā)生擴增反應后，使之與儲存于探針DNA儲存部的探針DNA在流路內(nèi)雜交，基于該反應生成物進行擴增反應的檢測。
上述基因檢測用微型反應器也可以按如下方式構成設置在前述試樣儲存部中注入試樣或從試樣提取的RNA的同時，儲存用于由其中所含的RNA通過逆轉錄反應合成cDNA的逆轉錄酶的逆轉錄酶儲存部；向流路輸送儲存于試樣儲存部中的試樣或從試樣提取的RNA，和儲存于逆轉錄酶儲存部的逆轉錄酶，在流路內(nèi)混合合成cDNA后，進行前述擴增反應及其檢測。
此外，上述基因檢測用微型反應器的特征在于在前述流路內(nèi)設置有當直至達到預先設定正方向的送液壓力的壓力時，切斷液體通過，通過施加預設的壓力以上的送液壓力使液體通過，通過前述微型泵的泵壓可以控制液體的通過的送液控制部；和防止流路內(nèi)的液體逆流的逆流防止部；前述微型泵通過送液控制部和逆流防止部控制流路內(nèi)液體的送液、定量和各液體的混合。
此外，上述基因檢測用微型反應器的特征在于前述送液控制部由按串行連結兩側相鄰的流路那樣形成于這些流路之間的、且具有比這些相鄰的流路的截面積更小的截面積的細流路構成。
上述基因檢測用微型反應器的特征在于上述逆流防止部是閥體通過逆流壓關閉流路開口部的止逆閥，或者閥體通過閥變形方法在流路開口部推壓關閉流路開口部的活動閥。
在上述基因檢測用微型反應器中，設置有由前述逆流防止部與送液控制部之間的流路構成的可以填充規(guī)定量試劑的試劑填充流路；和從該試劑填充流路分支，與連接于輸送驅動液的微型泵的泵連接部流通的分支流路；從前述逆流防止部側設置有如下方式構成的試劑定量部通過在不通過試劑的送液壓力下從前述送液控制部向前將試劑提供給試劑填充流路填充試劑后，從前述送液控制部向前在允許通過的試劑的送液壓力下通過前述微型泵自分支流路向試劑填充流路方向輸送驅動液，由前述送液控制部向前擠壓出填充于試劑填充流路的試劑，由此定量輸送試劑。
此外，上述基因檢測用微型反應器設置有輸送各試劑的多個流路；和與這些多個流路連接并混合來自這些流路的各種試劑的混合流路；和由該混合流路分支向后續(xù)步驟輸送試劑混合液的分支流路；和在混合流路中設置于比與分支流路的分支點更前的位置的第1送液控制部；和分支流路中設置在比與混合流路的分支點附近的位置的、且可劑混合液的能夠通過的送液壓力比第1送液控制部更小的第2送液控制部；其按如下方式構成輸送試劑混合液直至向混合流路輸送的試劑混合液的前端到達第1送液控制部之后時，以不通過試劑混合液的送液壓力使由第2送液控制部流向分支流路的試劑混合液通過第1送液控制部，向下一步驟輸送試劑混合液。
上述基因檢測用微型反應器的特征在于第1送液控制部中前述細流路的截面積比第2送液控制部中前述細流路的截面積更小。
上述基因檢測用反應器的特征在于在前述泵連接部和儲存了由連接于該泵連接部的微型泵輸送的內(nèi)容液的前述儲存部之間的流路中設置有由該流路分支且末端開放的、用于排出空氣的流路。
優(yōu)選的是，在上述基因檢測用微型反應器中，基因擴增反應中使用的試劑、陽性對照和陰性對照儲存于前述儲存部中。
上述基因檢測用微型反應器中的特征在于，儲存基因擴增反應中使用的試劑、陽性對照和陰性對照的各個儲存部與連通它們的流路之間在使用前填充了防止儲存部中的內(nèi)容液流出到流路中的密封劑。
前述密封劑優(yōu)選含有對水的溶解度在1％以下的油脂。
前述密封劑優(yōu)選含有對水的溶解度在1％以下且熔點為8℃-室溫(25℃)的油脂。
作為前述密封劑，優(yōu)選為明膠的水溶液。
上述基因檢測用微型反應器的特征在于基因擴增反應中使用的試劑包括與作為檢測對象的基因特異性雜交的嵌合引物，具有鏈置換活性的DNA聚合酶和核酸內(nèi)切酶。
本發(fā)明的基因檢查方法的特征在于包括以下步驟使用上述任一記載的微型反應器，由這些儲存部向流路輸送由試樣或從試樣中提取的DNA、或試樣或從試樣中提取的RNA通過逆轉錄反應合成的cDNA、和經(jīng)生物素修飾的引物，在流路內(nèi)進行基因擴增反應的步驟；和混合含有經(jīng)擴增的基因的反應液和變性液，將擴增的基因變性處理為單鏈的步驟；和將擴增基因變性處理成單鏈的處理液輸送到吸附了鏈霉親和素素的流路中，固定擴增的基因的步驟；和將末端經(jīng)FITC修飾的探針DNA輸送到固定了擴增的基因的流路中，探針DNA與固定的基因雜交的步驟；和將經(jīng)FITC抗體表面修飾的膠體金輸送到前述流路中，膠體金吸附到與固定的基因雜交的探針上的步驟；和在前述流路中光學測定膠體金的濃度的步驟。
理想的是，前述各步驟之間根據(jù)需要包括將清洗液輸送到吸附了鏈霉親和素的前述流路中的步驟。
本發(fā)明的基因檢測裝置配備有上述微型反應器的任一種和與該微型反應器的泵連接部連接的微型泵。
上述基因檢測裝置，前述微型泵配備有流路阻力根據(jù)壓力差變化的第1流路、和流路阻力的變化相對于壓力差的變化的比例比第1流路小的第2流路、和連接第1流路和第2流路的加壓室，和使該加壓室的內(nèi)部壓力變化的調(diào)節(jié)器和驅動該調(diào)節(jié)器的驅動裝置。
上述基因檢測裝置的特征在于如下述方式構成儲存試劑的各試劑儲存部的上游側設有泵連接部，微型泵與這些泵連接部連接，通過由各微型泵提供驅動液，從試劑儲存部將試劑擠出到流路中開始基因擴增反應。
上述基因檢測裝置如下述方式構成通過來自于前述微型泵的驅動裝置的驅動信號控制前述調(diào)節(jié)器的動作從而以所希望的比例混合各種試劑。
上述基因檢測裝置優(yōu)選配備有基于由擴增的基因與探針DNA雜交產(chǎn)生的反應生成物進行擴增反應的檢測的檢測裝置。
上述基因檢測裝置優(yōu)選配備有控制微型反應器的流路內(nèi)的各反應的反應溫度的溫度控制裝置。
上述基因檢測裝置的特征在于前述微型泵由檢測裝置和溫度控制裝置一體化的裝置主體以及可以裝載于該裝置主體中的微型反應器構成，通過將微型反應器裝載于裝置主體中自動進行基因擴增反應和該擴增反應的檢測。
本發(fā)明的微型反應器是面向大規(guī)模生產(chǎn)而構建的，而且由于對應于多種目的存在廣泛適用性，因此可以低成本制備。此外，由于含有泵和閥的流路系統(tǒng)結構簡單，故氣泡難以進入，由于固定體積小，因此輸送精度高。由于檢測時組裝DNA擴增過程，因此是使檢測敏感度高的檢測成為可能的微型反應器。
由于是可以包括對應于DNA分析和RNA分析的逆轉錄過程的分析反應器，因此試樣的制備容易，并且即使微量，精度也很高，可以短時間分析。
此外，本發(fā)明的基因檢測裝置由于是使形成每種試樣的試劑類型·送液系統(tǒng)元件搭載組件、和控制·檢測組件的系統(tǒng)各自分開的系統(tǒng)結構，因此對于微量分析、擴增分析，不容易產(chǎn)生諸如交叉感染，轉移感染這樣嚴重的問題。由于容易清除試樣DNA和引物、與探針的結合(或相互作用)以外的非特異性的結合物，因此可以提供背景低的微型反應器芯片。
本發(fā)明可以應用于基因表達分析、基因功能分析、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)、藥物篩選、醫(yī)藥、農(nóng)藥或各種化學物質(zhì)的安全性·毒性檢查、醫(yī)療臨床診斷、食品檢查、法醫(yī)學、化學、釀造、農(nóng)林業(yè)、漁業(yè)、畜產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)制造等領域。
下面，對本發(fā)明的微型反應器和由該微型反應器和各個控制裝置以及檢測裝置構成的基因檢測裝置，以及包括使用該裝置的基因擴增過程和檢測過程的的基因檢測方法進行說明。
微型反應器和基因檢測裝置一面參照附圖一面對本發(fā)明的微型反應器、基因檢測裝置進行說明。圖1是本發(fā)明的一個實施方式中的基因檢測用微型反應器的概況圖。圖2是本發(fā)明的一個實施方式中包括微型反應器與裝置主體的基因檢測裝置的概況圖。
圖1所示的微型反應器由樹脂、玻璃、硅、陶瓷等制備的一塊芯片構成。該芯片中通過微細加工技術在適當位置功能性設置試樣儲存部、試劑儲存部、探針DNA儲存部、對照儲存部、流路、泵連接部、送液控制部、逆流防止部、試劑定量部和混合部。此外，如果需要還可以設置逆轉錄酶部。試樣儲存部與試樣注入部連通，進行試樣的暫時儲存以及向混合部提供試樣。按照該情況還可以起到血細胞分離的作用。試劑與試劑的混合，以及試樣與試劑的混合還可以在同一混合部中按所希望的比率混合，或者也可以分成任一部分或兩部分，設置多個匯合部，最終混合成所希望的混合比率。
所述微型反應器按以下方式構建通過在微型反應器的上述試樣儲存部中注入血液等試樣，自動進行芯片內(nèi)基因擴增反應及其檢測所必需的處理，對于多個項目，可以同時且在短時間內(nèi)檢測基因。使用發(fā)明的微型反應器的優(yōu)選基因檢測裝置的形態(tài)中，封入預先確定量的必要的試劑種類，該微型反應器作為進行試樣的DNA或RNA和規(guī)定擴增反應以及進行擴增產(chǎn)物檢測的單元，可以被使用于每種試樣。
與之相反，與送液、溫度、反應的各種控制相關的控制系統(tǒng)、負責光學檢測、數(shù)據(jù)的收集和處理的單元、微型泵和光學裝置共同構成了本發(fā)明的基因檢測裝置的主體。該裝置主體通過在其中裝載上述芯片，對于試樣可以共通使用。因此，即使有多種試樣，也可以有效且迅速地處理。以往的技術中，在進行內(nèi)容不同的分析或合成等時，每次都需要構建與變化的內(nèi)容相應的微流體裝置。與之不同，本發(fā)明中可以只交換可以拆卸的上述芯片。各裝置元件的控制如果需要改變，可以適當改變設置于裝置主體中的控制程序。
本發(fā)明的基因檢測裝置，由于任一元件都被小型化而呈便于搬運的形態(tài)，因此不受使用場所和時間的制約，運作性和操作性均良好。
以上，簡要描述了本發(fā)明的微型反應器和檢測裝置，本發(fā)明的各個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的主旨可以進行任意的變形，變更，它們均包括在本發(fā)明中。也就是說，對于本發(fā)明的微型反應器和檢測裝置的整體或其一部分，只要結構、構成、配置、形狀形態(tài)、尺寸、材質(zhì)，方式、方法等滿足本發(fā)明的主旨，可以是各種形式。
基因擴增過程和試劑作為本發(fā)明的測定對象的試樣在基因檢查時，是作為成為擴增反應的模板的核酸的基因、DNA或RNA。也可以是從可能含有這種核酸的某種試樣中制備或分離的。從這種試樣中制備基因，DNA或RNA的方法沒有特別的限定，可以使用以往的技術。最近，開發(fā)了為了擴增DNA從生物體試樣中制備基因、DNA或RNA的技術，也可以以試劑盒等形態(tài)來利用。
試樣本身也沒有特別的限定，但是，例如全血、血清、血沉棕黃層(buffy coat)、尿、糞便、唾液、咳痰等生物體來源的大部分試樣；細胞培養(yǎng)物；病毒、細菌、霉菌、酵母、植物、動物等的含有核酸的試樣；可能混入或含有微生物等的某種試樣、其它可能含有核酸的所有試劑等成為對象。
DNA，可以按照常規(guī)方法通過苯酚·氯仿提取和乙醇沉淀從試樣中分離純化。為了分離核酸，一般已知的是使用有接近飽和濃度的胍鹽酸鹽，異硫氰酸鹽這樣的高濃度離液序列高的試劑。不使用上述苯酚氯仿提取法，而用含有表面活性劑的蛋白質(zhì)分解酶液直接處理試樣的方法(齊藤隆，“PCR實驗手冊”HPJ出版局1991年、P309)是一種既簡便又迅速的方法。獲得的基因組DNA或基因大時，也可以使用適當?shù)南拗菩悦?，例如BamHI，BgLII，Dral，EcoRV，HindIII，PvuII等，按照常規(guī)方法片段化。這樣一來，可以制備試樣用的DNA及其片段的集合體。
RNA的情況，如果逆轉錄反應中使用的引物可以制備就沒有特別的限制。例如，除了試樣中的總RNA之外，作為基因發(fā)揮功能的逆轉錄病毒的RNA、表達基因的直接的信息傳遞載體的mRNA、rRNA等RNA分子群成為對象。這些RNA可以通過利用適當?shù)哪孓D錄酶變化為cDNA之后進行分析。mRNA的制備方法可以按照公知的技術進行，逆轉錄酶可以容易地獲得。
與使用以往的裝置進行的手動操作的情況相比，本發(fā)明的微型反應器所需的試樣量極少。例如，基因的情況是，作為DNA為0.001-100ng。因此，包括只能獲得微量的試劑的情況的本發(fā)明的微型反應器受試樣方面的制約少，必然也可以用少量試劑類型，檢查成本降低。試樣從上述“試樣儲存部”的注入部導入。
·擴增方法本發(fā)明的微型反應器中，對擴增方法沒有限定。例如，DNA擴增技術可以使用多方面廣泛利用的PCR擴增法。用于實施該擴增技術的各種條件已經(jīng)被詳細地進行了研究，并被記載于包括其改良方面的各種文獻中。在PCR擴增中，需要使溫度在3個溫度區(qū)間內(nèi)升降的溫度管理，可以成為最適于微芯片的溫度控制的流路裝置已經(jīng)由本發(fā)明人提出(特開2004-108285)?？梢栽诒景l(fā)明的芯片的擴增用流路中應用這種裝置系統(tǒng)。因此，熱循環(huán)可以高速切換，微細流路可以作為熱容量小的微反應室，因此DNA擴增通過手動操作可以在微管，microvial等中進行，并且可以比往的方式短得多的時間內(nèi)進行。
不需要像PCR反應這樣的復雜的溫度管理的、最近開發(fā)的ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acidamplication)法具有以下特征在50-65℃的任意的一定溫度下可以在短時間內(nèi)實施DNA擴增(特許第3433929號)。因此，ICAN法由于在本發(fā)明的微型反應器中可以用簡便的溫度管理因此是最佳的擴增技術。在手動操作中需要1小時的這種方法，在本發(fā)明的生物反應器中用10-20分鐘、優(yōu)選15分鐘結束直至分析。
DNA擴增反應可以是其它的PCR改良方法，本發(fā)明的微型反應器存在可以根據(jù)流路的設計變化等對應于任意一種的柔軟性。使用任意DNA擴增反應的情況，其技術均詳細地被公開了，本領域技術人員可以容易地獲得。
·試劑類
(i)引物PCR引物是與要擴增的特定部位的DNA鏈的兩端互補的兩種核苷酸。這種設計已經(jīng)被開發(fā)了專用的應用，如果是本領域技術人員就可以通過DNA合成、化學合成等容易地制備。ICAN法用的引物是DNA和RNA的嵌合引物，其制備方法也已經(jīng)在技術上建立了(特許第3433929號)。引物的設計及選擇重要的是擴增反應成功與否，使用影響效率的最合適的引物。
此外，如果使生物素預先結合在引物上，可以通過與基板上的鏈霉親和素的結合將擴增產(chǎn)物DNA固定在基板上，可以提供擴增產(chǎn)物的定量。作為其它的引物標記物質(zhì)，可以例舉有地高辛、各種熒光色素等。
(ii)擴增反應用試劑類PCR用、ICAN法的包括在擴增反應中使用的酶在內(nèi)的試劑類，均可以容易地獲得。
作為PCR法中的試劑類型，至少包括2’-脫氧核苷5’-三磷酸、此外還包括Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
ICAN法中的試劑類至少包括2’-脫氧核苷5’-三磷酸，可以與要檢測的基因特異性雜交的嵌合引物，具有鏈置換活性的DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶的RNase。
(iii)對照內(nèi)部對照，對于目的核酸(DNA，RNA)，可以作為擴增的監(jiān)視或定量時的內(nèi)部標準物質(zhì)來使用。由于內(nèi)部對照的序列在與試樣不同的序列的兩側具有與試樣用引物相同的引物可以雜交的序列，因此可以與試樣同樣擴增。陽性對照的序列是檢測試樣的特異性序列，引物雜交部分與其之間的序列與試樣相同。對照中使用的核酸(DNA，RNA)可以使用公知技術文獻中記載的。陰性對照包含所有核酸(DNA，RNA)之外的試劑等，在感染的有無的檢查，背景補正中使用。
(IV)逆轉錄用試劑RNA的試劑的情況是，試劑為用于由RNA合成cDNA的逆轉錄酶，逆轉錄引物等，這些都有市售均可以容易獲得。
這些擴增用基質(zhì)(2’-脫氧核苷5’-三磷酸)，基因擴增用試劑等分別被預先將規(guī)定量封入一個微型反應器的上述試劑儲存部中。因此，本發(fā)明的微型反應器在使用時不必每次填充必要量的試劑，即達到可以使用的狀態(tài)。
檢測步驟檢測本發(fā)明中擴增的目的基因的DNA的方法沒有特別的限定，根據(jù)需要可以使用最佳的方法。這種方法中主流的是諸如可視分光側光法、熒光測定法、發(fā)光法這樣的檢測方法。進而，可例舉有電化學方法、表面等離子共振、晶體振蕩器微平衡等方法。
本發(fā)明的基因檢測裝置與上述微型反應器均配備有基于由擴增的基因與探針DNA的雜交產(chǎn)生的反應性生物對擴增反應的有無、規(guī)模等進行檢測的檢測裝置。
使用上述微型反應器的本發(fā)明的方法具體可以按以下方法進行。即，使用上述微型反應器，包括以下步驟的方法(1)從這些儲存部向流路輸送試樣或從試樣提取的DNA，或者由試樣或從試樣提取的RNA通過逆轉錄反應合成的cDNA與經(jīng)生物素修飾的引物，在微細流路內(nèi)擴增基因的步驟；(2)混合含有在微細流路內(nèi)擴增的基因的擴增反應液和變性液，將擴增的基因變性成單鏈的處理步驟；(3)將擴增基因變性處理成單鏈的處理液輸送到吸附了鏈霉親和素的流路中，固定前述擴增的基因的步驟；(4)末端經(jīng)FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)修飾的探針DNA流入到固定了擴增的基因的微細流路中，探針DNA與固定的基因雜交的步驟；(5)經(jīng)FITC抗體表面修飾的膠體金流入到前述微細流路中，由此使該膠體金吸附到與固定的基因雜交的經(jīng)FITC修飾的探針上的步驟；(6)光學測定前述微細流路中的膠體金的濃度的步驟。
在上述方法中，生物素化DNA、通過生物素-鏈霉親和素結合的固定化、FITC熒光標記等、FITC抗體等均是公知技術。
優(yōu)選的是，前述各過程之間根據(jù)需要包括將清洗液輸送到吸附了鏈霉親和素的前述流路中的步驟。作為這種清洗液，最佳的是例如各種緩沖液、鹽類水溶液、有機溶劑等。
本發(fā)明的上述檢測方法優(yōu)選的是通過可視光，最終可以以高敏感度測定的方式。機器比熒光測定用途廣，妨礙因素少而且數(shù)據(jù)處理更容易。優(yōu)選的是使用通過用于這種目的的光學檢測裝置與含有上述微型泵的送液手段和控制微型反應器的流路中的各反應的反應溫度的溫度控制裝置一起組裝，構成一體化的本發(fā)明的基因檢測裝置進行檢測。
在上述過程中，變性液適用于將基因DNA變成單鏈的試劑，例如，可以例舉有氫氧化鈉、氫氧化鉀等。探針可以例舉有寡聚脫氧核苷酸等。此外，除FITC之外還可以例舉有RITC(羅丹明異硫氰酸鹽)等熒光物質(zhì)。
上述擴增和檢測，如果使將在控制微型泵和溫度的同時具有與預先送液順序、容量、時間等相關設定的各個條件作為程序內(nèi)容的軟件，前述微型泵，前述檢測裝置和溫度控制裝置一體化的基因檢測裝置主體，與對于該裝置主體可以拆卸的上述微型反應器接合，微型反應器的流路也會呈工作狀態(tài)。通過注入試樣優(yōu)選自動開始分析、試樣和試劑類的送液、基于混合的基因擴增反應、基因檢測反應和光學的測定可以作為一系列的過程自動實施，測定數(shù)據(jù)、必要的條件、記錄事項一起儲存在文件內(nèi)。
基因檢查通過使用某種具有特異與特定基因的序列的引物作為擴增反應中使用的引物，通過測定擴增的有無或擴增效率，可以用于判定試樣中的基因來源的DNA與該特定基因是否相同。對根據(jù)基因迅速鑒定傳染病的病原病毒，細菌特別有用。
通過本發(fā)明的基因檢查可以獲得診斷癌基因，基因高血壓基因等的表達程度的數(shù)據(jù)。具體的是，作為這種基因的表達的證據(jù)的mRNA的種類，表達水平的分析。
或者，通過使用本發(fā)明的微型反應器的基因檢查還可以檢測與對特定疾病的病患感受性，對藥物的副作用等相關的基因變異、編碼區(qū)域以及調(diào)節(jié)基因的啟動子區(qū)域中的變異。這種情況，利用具有含有變異部分的核酸序列的引物。并且，所謂上述基因變異是指基因的核苷酸堿基中的變異。此外通過本發(fā)明的基因檢測裝置基因多型的分析對于疾病感受性基因的鑒定也有用。
根據(jù)裝置的結構和分析原理可知與以往的核酸序列分析、限制性酶分析、核酸雜交分析相比，使用本發(fā)明的基因檢測裝置的基因檢查方法用極少的試樣量、極少的麻煩和簡便的裝置可以獲得更高精度的結果。
本發(fā)明的基因檢測用微型反應器、基因檢測用裝置等可以應用于基因表達分析、基因功能分析、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)、臨床檢查·診斷、藥物篩選、醫(yī)藥、農(nóng)藥或各種化學物質(zhì)的安全性·毒性的檢查、環(huán)境分析、食品檢查、法醫(yī)學、化學、釀造、漁業(yè)、畜產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)制造、農(nóng)林業(yè)等領域。
下面，一面參照附圖，一面對本發(fā)明的實施方式進行說明。圖1是本發(fā)明的一個實施方式中的基因檢測用微型反應器的概況圖。圖2是該的微型反應器與裝置主體構成的基因檢測裝置的概況圖。
圖1所示的微型反應器由樹脂制備的一塊芯片構成，其構造是通過注入血液等試樣，在芯片內(nèi)自動進行基因擴增反應及其檢測，對于多個項目，可以同時且進行基因檢測。例如，僅將2-3μl左右的血液試樣滴落在長寬的長度為數(shù)厘米的芯片上，通過將芯片裝載于圖2的裝置主體中，就可以進行基因擴增及其檢測。
注入到圖1的試樣儲存部20中的試樣和預先封于試劑儲存部18a-18c中的基因擴增反應中使用的試劑由組裝于圖2的裝置主體的微型泵輸送到連通各儲存部的流路中，通過Y字流路在流路內(nèi)混合試劑和試劑，進行擴增反應。流路形成為例如寬100μm，深100μm左右，通過組裝于圖2的裝置主體2的光學檢測裝置(未示出)檢測擴增反應。例如，對檢查項目的每個流路用LED照射測定光，用光電二極管、光電倍增管等光檢測方法檢測透射光或反射光，通過探針DNA雜交就可以檢測被標記的擴增DNA(基因)。
裝置主體2中，還組裝了控制反應溫度的溫度控制裝置，通過在將送液泵、光學檢測裝置和溫度控制裝置一體化的小型單元中僅裝載預先封入試劑的芯片，可以簡便地進行基因診斷。這樣一來，由于可以不管場所、時間迅速的測定，因此還可以應用于緊急醫(yī)療、個人的在家醫(yī)療。由于送液中使用的多數(shù)微型泵單元等組裝到裝置主體側，因此芯片可以作為可任意使用的類型使用。
以下，基于圖14-17中所示的本發(fā)明的一個實施方式中的微型反應器，對微型反應器更具體的結構進行說明。本實施方式的微型反應器優(yōu)選是通過ICAN法進行擴增反應的微型反應器，在微型反應器中，通過血液或咳痰中提取的試樣，和包括與最為檢測對象的基因特異性雜交的經(jīng)生物素修飾的嵌合引物、具有鏈置換活性的DNA聚合酶和核酸內(nèi)切酶的試劑進行基因擴增反應。反應液在經(jīng)變性處理后被輸送到吸附了鏈霉親和素的流路中，將擴增的基因固定在流路中。然后，使經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)末端修飾的探針與固定的基因雜交，使經(jīng)FITC抗體表面修飾的膠體金吸附到與固定的基因雜交的經(jīng)FITC修飾的探針上，通過光學測定膠體金的濃度檢測擴增的基因。
本實施方式中，微型反應器按如下方式構成以便在一塊芯片中以高精度且迅速地進行高可信度的基因檢查。第1中，對照全都一體化于1塊芯片中，內(nèi)部對照、陽性對照和陰性對照均預先封入微型反應器中，在試樣的擴增反應和檢測操作的同時進行這些對照的擴增反應和檢測操作。這樣一來，就可以迅速地進行高可信度的基因檢查。
第2中，流路的各位置中配置有達到預先設定正方向的送液壓力的壓力時，切斷液體通過，通過施加預設的壓力以上的送液壓力使液體通過，通過前述微型泵的泵壓可以控制液體的通過的送液控制部；和防止流路內(nèi)的液體逆流的逆流防止部。如下所述，流路內(nèi)的液體的輸送受微型泵，送液控制部和逆流防止部的控制，可以以高精度定量輸送試劑等，可以迅速混合由分支流路導入的多種試劑。
在對本實施方式的使用微型反應器的擴增反應及其檢測進行說明之前，對該微型反應器的主要結構單元進行說明。
試劑儲存部微型反應器中，設置有用于儲存各種試劑的多個試劑儲存部，可儲存基因擴增反應中使用的試劑、變性擴增的基因的變性液，與擴增基因雜交的探針DNA等。
理想的是在試劑儲存部中預先儲存試劑以便可以無論場所和時間迅速地進行檢查。為了防止內(nèi)藏于芯片內(nèi)的試劑類等蒸發(fā)、漏失、混入氣泡、污染、變性等，可以對該試劑部表面作密封處理。進而，在保管微型反應器時，為了防止試劑從試劑儲存部隨意漏出到微細流路內(nèi)而導致試劑反應等，用密封材料封口。這種密封材料，使用前，在μ-TAS(微型反應器)被保管的冷藏條件下固化或凝膠化，使用時，溫度一達到室溫就變成融解的流動狀態(tài)。如圖3所示，優(yōu)選通過在試劑31和連通試劑儲存部18的流路15之間填充密封劑32，在試劑儲存部中封入試劑。并且，密封劑與試劑件即使存在空氣也無妨，但是從定量送液的觀點出發(fā)優(yōu)選空氣的量(相對于試劑量)足夠少。
作為這種密封劑，可以使用對水難溶性的可塑性物質(zhì)，優(yōu)選為對水的溶解度在1％以下的油脂。這種油脂可以用油脂手冊等進行研究，例如可以例舉有表1所示的油脂。
在微型反應器中預先儲存試劑時，在試劑的穩(wěn)定性上，理想的是冷藏保管微型反應器，通過使用冷藏時微固體狀態(tài)室溫下變?yōu)橐籂畹奈镔|(zhì)作為密封劑，可以在冷藏保管時成固體狀態(tài)下密封試劑，同時在使用時變成液狀容易從流路中排出。作為這種密封劑，可以列舉有對水的溶解度在1％以下并且熔點為8℃-室溫(25℃)的油脂，及明膠的水溶液。明膠的水溶液可以通過改變明膠的濃度調(diào)整凝膠化溫度，例如，為了使其在10℃前后凝膠化，可以制成約1％的水溶液。
并且，連通儲存陽性對照和陰性對照的各儲存部的流路間同樣也可以填充密封劑。
本實施方式中，試劑儲存部的上游側與微型泵連接，通過由泵向試劑儲存部側提供驅動液，向流路壓出來輸送試劑。


泵連接部本實施方式中，在試樣儲存部、試劑儲存部、陽性對照儲存部和陰性對照儲存部中均設置有輸送這些儲存部的內(nèi)容液的微型泵。微型泵與微型反應器組裝在其它用途的裝置主體中，通過將微型反應器裝載于裝置主體中，用泵連接部連接微型反應器。
本實施方式中，使用壓電泵作為微型泵。圖4(a)是表示這種泵的一個實例的截面圖，圖4(b)是其上面圖。該微型泵中設置有形成第1液室48、第1流路46、加壓室45、第2流路47及第2液室49的基板42、和層壓在基板42上的上側基板41、和層壓在基板41上的振動板43、和面向振動板43的加壓室45側層壓的壓電元件44、和用于驅動壓電元件44的驅動部(未圖示)。
該例中，作為基板42，使用厚度為500μm的感光性玻璃基板，通過進行蝕刻直至深度達到100μm，形成第1液室48、第1流路46、加壓室45、第2流路47及第2液室49。第1流路46其寬度為25μm，長度為20μm。此外，第2流路47其寬度為25μm，長度為150μm。
通過在基板42上層壓材質(zhì)為玻璃基板的上側基板41，形成第1液室48，第1流路46，第2液室49和第2流路47的上面。處于上側基板41的加壓室45上面的部分通過蝕刻等加工而貫穿。
在上側基板41的上面層壓厚度為50μm的薄板玻璃構成振動板43，在其上層壓例如由厚度為50μm的鋯鈦酸鉛(PZT)陶瓷構成的壓電元件44。
通過驅動部的驅動電壓，壓電元件44與粘附于其的振動板43振動，由此加壓室45的體積發(fā)生增減。第1流路46和第2流路47寬度和深度相同，第2流路的長度比第1流路的長，第1流路46中，壓力差一變大，流路內(nèi)像卷起漩渦這樣發(fā)生渦流，流路阻力增加。另一方面，第2流路47中，由于流路寬度長因此即使壓力差變大也容易形成層流，流路阻力的變化相對于壓力差的變化的比例比第1流路的小。
例如，如果通過對壓電元件44外加驅動電壓，使振動板43向加壓室45的內(nèi)方向迅速變位，一邊施加大壓力差一邊使加壓室45的體積減少，然后使振動板43由加壓室45向外方向慢慢地變位，一邊外加小壓力差一邊使加壓室45的體積增加，液體就會向同圖的B方向輸送。相反，如果使振動板43向加壓室45的外方向迅速變位，一邊外加大壓力差一邊使加壓室45的體積增加，然后使振動板43由加壓室45向內(nèi)方向慢慢地變位，一邊外加小壓力差一邊使加壓室45的體積減少，液體就會向同圖的A方向輸送。圖5中，表示對壓電元件44外加的驅動電壓波形與液體的位置變位之間的關系的一個例子。圖5(b)中所示液體的移動量的圖是模式化表示由泵動作獲得的流量的圖，實際上，此處由流體的慣性力產(chǎn)生的時間滯后和慣性振動成為重疊的動作。并且，第1流路和第2流路中，流路阻力對于壓力差的變化的變化比率的差異未必就是由于流路的長度不同而導致的需要，也可以是基于其它形狀的差異的差異。
如果用如上所述構成的壓電泵，通過改變泵的驅動電壓和頻率，就可以控制液體的送液方向、送液速度。圖4(c)中，顯示了該泵的其它例子。該例中，硅基板71、壓電元件44和未圖示的柔軟的配線構成泵。硅基板71是通過公知的照相平版印刷術將硅片加工成規(guī)定形狀，通過蝕刻形成加壓室45、振動板43、第1流路46、第1液室48、第2流路47和第2液室49。第1液室48中設置有端口72，第2液室49中設置有端口73，通過這種端口連通微微型反應器的泵連接部。例如，通過使端口穿孔的基板74和微型反應器的泵連接部附近上下重合，可以將泵連接到微型反應器上。此外，1塊硅基板上還可以形成多個泵。此時，理想的是驅動液泵與微型反應器連接的端口的對側的端口連接。存在多個泵時，這些泵還可以與共通的驅動液槽連接。
泵連接部周邊的結構如圖6所示。同圖(a)表示輸送驅動液的泵部的結構，同圖(b)表示輸送試劑的泵部的結構。這里，驅動液24也可是礦物油等油類，或者水類中的任一種，密封試劑的密封液25可以如圖3所示填充于流路中，或者填充于為了密封液而設置的儲留部中。在泵連接部12和試劑儲存部18之間的流路中設置有用于排放空氣的流路26。如圖7所示，該用于排放空氣的流路26自泵連接部與試劑儲存部之間的流路15分支，其末端開放。在連接泵時等情況下設法從該用于排放空氣的流路26除去存在于流路15中的氣泡。
該用于排放空氣的流路26，從防止通過流路15的例如水等水性液體27漏出的觀點考慮，優(yōu)選流路直徑為10μm以下，并且與流路內(nèi)面的水的接觸角為30°以上。
為了在微細流路內(nèi)迅速混合試劑與試劑或者試樣與試劑，輸送這些試劑和試樣的各個微型泵的驅動如下述方式控制。如圖8(a)所示，通過從Y字的分支流路的上游向A方向輸送試劑31，向B方向輸送試樣33，在流路15中混合這些物質(zhì)時，且輸送試劑31的泵的驅動，輸送試樣33的泵的驅動如圖8(c)所示方式控制。也就是說，在向A方向輸送試劑31期間，停止試樣33的輸送，在向B方向輸送試樣33期間，停止試劑31的輸送。通過交替重復這種操作，如圖8(a)所示，試劑31和試樣33以圓片狀交替填充于流路15中。通過提高泵送液的變化速度，可以使該薄片層的寬度成為例如1-2μm。層的寬度變短，試劑31和試樣33之間的擴散迅速進行，從而迅速地混合。例如，流路直徑100μm的流路內(nèi)以1∶1的一定比率將試劑31和試樣33輸送到流路15中時，如圖8(b)所示一般形成50μm寬度的試劑層和試樣層，與圖8(a)的情況相比擴散難以前進，混合變慢。
這種從多個分支流路向混合流路輸送各液體時，通過一邊改變各分支流路中的流速一邊送液，可以迅速混合，并且可以以所希望的比率混合這些液體。并且，圖8(a)方面，描述為可以迅速混合，但是如果流路寬度縮小又費時，就可以以圖8(b)的方式混合。
送液控制部本實施方式的微型反應器中，在其流路內(nèi)設置了多個如圖9(a)所示的送液控制部。這種送液控制部在向正方向的送液壓力達到規(guī)定壓力時切斷液體的通過，通過外加預設壓力以上的送液壓力允許液體通過。
如圖9(a)、(b)所示，送液控制部13由擠壓流路直徑的部分構成，由此，控制由一端側抵達該擠壓流路(細流路)51的液體向另一端側的通過。該擠壓流路51，對于例如串聯(lián)連接于兩側的長寬為150μm×150μm的流路，長寬形成為30μm×30μm。
為了將液體從細徑的擠壓流路51的端部51a擠出到大徑的流路15，由于表面張力而需要規(guī)定送液壓力。因此，通過微型泵的泵壓可以控制液體的停止和通過，因此可以預先暫時中斷流路規(guī)定區(qū)域中液體的移動，在希望的時間再開放由該區(qū)域向前面的流路的輸送。
根據(jù)需要，在擠壓流路51的內(nèi)面還施加了防水性涂層，例如氟涂層。
如上所述以串聯(lián)連接方式在這些流路之間形成與兩側相鄰的流路，通過在這些相鄰流路中設置具有比與流路軸方向垂直的截面的截面積更小的截面積的細流路構成的送液控制部，可以控制送液的時間。
逆流防止部本實施方式的微型反應器中，在該流路中設置有防止液體逆流的多個逆流防止部。這種逆流防止部由閥體通過關閉流路開口部的止逆閥或者閥體通過閥體變形方法向流路開口部擠壓從而關閉該開口部的活動閥構成。
圖10(a)、(b)是表示本實施方式的微型反應器的流路中使用的止逆閥的一個例子的截面圖。圖10(a)的止逆閥中，以微小球67作為閥體，通過該微小球67的移動開閉在基板62上形成的開口68，從而允許及中斷液體的通過。也就是說，在向A方向輸送液體時，微小球通過液壓從基板62遠離，從而開放開口68，因此可以允許液體通過。另一方面，液體由B方向逆流時，由于微小球關閉位于基板62上的開口68，因而可中斷液體通過。
圖10(b)的止逆閥中，在基板62上層壓的其端部在開口68的上側延伸的撓性基板69通過由液壓使開口68的上側上下動來開閉開口68。也就是說，在向A方向輸送液體時，撓性基板69的端部通過液壓從基板62遠離從而開放開口68，因而可以允許液體通過。另一方面，在液體自B方向逆流時，由于撓性基板69通過粘附于基板62上來關閉開口68，從而可以中斷液體的通過。
圖11是表示可在本實施方式的微型反應器的流路中使用的活動閥的一個例子的截面圖，圖11(a)表示開閥狀態(tài)，圖11(b)表示閉閥狀態(tài)。該活動閥中，形成下方突出的閥部64的撓性基板63層壓在形成開口65的基板62上。
關閥時，如圖(b)所示，通過空氣壓、油壓、水壓活塞和壓電激發(fā)器、形狀記憶合金等閥體變形方法自上側擠壓撓性基板63，使閥部64粘合以便面向基板62覆蓋開口，由此設法中斷向B方向的逆流。此外，只要活動閥通過外部的驅動裝置運作，即使閥體通過自我變形阻塞流路構成也是可以的。例如，如圖18所示，也可以設法使用雙金屬81通過通電加熱變形，或者如圖19所示也可以設法使用形狀記憶合金82通過通電加熱變形。
試劑定量部用上述送液控制部和逆流防止部，可以定量輸送試劑。圖12是表示這種試劑定量部的結構的圖，在逆流防止部16和送液控制部13a之間的流路(試劑填充流路15a)中填充規(guī)定量的試劑。此外，還設置有自該試劑填充流路15分支，與輸送驅動液的微型泵11連通的分支流路15b。
試劑的定量輸送如下方式進行。最初，自逆流防止部16側，自送液控制部13a向前以試劑31不通過的送液壓力將試劑31提供給試劑填充流路15a來填充試劑31。然后，在允許送液控制部13a向前以試劑31通過的送液壓力，通過由泵從分支流路15b向試劑填充流路15a方向輸送驅動液25，將填充于試劑填充流路15a內(nèi)的試劑31從送液控制部15a向前擠壓，由此定量輸送試劑31。分支流路15b中存在空氣，密封液等，即使在這種情況下，通過用微型泵11輸送驅動液25從而將這種空氣，密封液等送入試劑填充流路15a中可以壓出試劑。并且，通過在試劑填充流路15a中填充大容積的儲留部17a，定量的偏差變小。
試劑的混合在通過Y字流路混合兩種試劑時，即使同時輸送各種試劑，液體前端部分的混合比率也不穩(wěn)定。圖13是表示通過去掉該前端部分，穩(wěn)定混合比率之后向下一步驟輸送混合液的流路結構的圖。同圖中，混合的試劑31a和31b分別由流路15a，15b向混合流路15c輸送。
由混合流路15c向下一步驟輸送試劑混合液31c的分支流路15d，在混合流路15c中的比與分支流路15d的分支點更前的位置設置第1送液控制部13a。在分支流路15d中的與與分支流路15d的分支點的附近位置設置比試劑混合液31c可以通過的送液壓力比第1送液控制部13a更小的第2送液控制部13b。
由流路15a和流路15b向混合流路15c內(nèi)輸送的試劑31a和試劑31b的試劑混合液31c，向混合流路15c內(nèi)輸送直至其前端部31d到達第1的送液控制部13a。試劑混合液31c的前端部到達第1的送液控制部13a后，再通過向15c輸送，使試劑混合液31c由第2送液控制部13b向分支流路15d通過，將試劑混合液31c輸送到下一步驟。
例如，通過使第1送液控制部13a中的前述細流路的截面積比第2送液控制部13b中的前述細流路的截面積小，可以使第2送液控制部13b中的試劑混合液可以通過的送液壓力比第1送液控制部13a中的小。
下面，就使用具備上述各結構單元的本實施方式的微型反應器的基因擴增反應及其檢測的具體實例，一面參照圖14～17一面說明。與作為檢測對象的基因特異性雜交的經(jīng)生物素修飾的嵌合引物、具有鏈置換活性的DNA聚合酶和核酸內(nèi)切酶等試劑儲存于圖14的試劑儲存部18a，18b，18c中，在各試劑儲存部的上游側，內(nèi)藏于其它用途的裝置主體內(nèi)的壓電泵11以泵連接部12與微型反應器連接。從各試劑儲存部向下游側的流路15a通過這些泵輸送試劑。
流路15a和由流路15a分支的向下一步驟的流路、和送液控制部13a，13b構成圖13中說明的流路，設法去掉由各試劑儲存部輸送的試劑的混合液的前端部，穩(wěn)定混合狀態(tài)后將試劑混合液輸送到下一步驟。各試劑儲存部中儲存合計超過7.5μl的試劑，去掉前端的總計7.5μl的試劑混合液然后以每根2.5μl輸送到3根分支流路15a，15b，15c中。流路15b與試樣的反應，向檢測系統(tǒng)(圖15)連通，流路15c為與陽性對照的反應，向檢測系統(tǒng)(圖16)連通，流路15d為與陰性對照的反應，向檢測系統(tǒng)(圖17)連通。
流路15b中輸送的混合試劑填充于圖15的儲留部17中。并且，儲留部17a的上游側的止逆閥16和下游側的送液控制部13a之間，構成按圖12中說明的試劑填充流路，在構成了設置于與輸送驅動液的泵11連接的分支流路中的送液控制部13b的同時構成了前述試劑定量部。
從血液或咳痰中提取的試樣從試樣儲存部20注入，用與上述試劑定量部相同的機械裝置在儲留部17b中定量填充試樣(2.5μl)，向后續(xù)的流路定量輸送。填充于各儲留部17a、17b的試樣與試劑混合液通過Y字流路輸送到流路15e(容積5μl)中，在該流路15e中進行混合和ICAN反應。這里，試樣與試劑的送液，通過如圖8說明的方式交替驅動各泵11，在流路15e中以圓片狀地交替導入試樣與試劑混合液，試樣與試劑迅速擴散，混合。
通過將混合5μl反應液和儲存于停止液儲存部21a的1μl反應停止液輸送到容積為6μl的流路15f中將它們混合從而停止擴增反應。然后，向容積為1.5μl的流路15g輸送儲存于變性液儲存部21b的變性液(1μl)和反應液和停止液的混合液(0.5μl)，混合，將擴增的基因變性為單鏈。
然后，儲存于探針DNA儲存部21c的、且末端經(jīng)FITC熒光標記的探針DNA溶液(2.5μl)和變性處理了的處理液(1.5μl)向容積為4μl的流路15h輸送而混合，使探針DNA與單鏈的擴增基因雜交。
然后，該處理液以平均2μl輸送到流路內(nèi)吸附了鏈霉親和素的鏈霉親和素吸附部22a、22b中，將經(jīng)探針標記的擴增基因固定在該流路內(nèi)。
通過單一的泵11將儲存于各儲存部21d、21f、21e的清洗液、內(nèi)部對照用探針DNA溶液、以及經(jīng)FITC標記的膠體金溶液以同圖所示順序輸送到固定了這種擴增基因的流路22a中。同樣通過單一的泵11將儲存于各儲存部21d，21g，21e的清洗液、MTB用探針DNA溶液、以及經(jīng)FITC標記的膠體金溶液以同圖所示順序輸送到固定了這種擴增基因的流路22b中。
通過輸送膠體金溶液，膠體金通過FITC與固定的擴增基因結合，從而被固定。通過光學檢測這種固定的膠體金測定擴增的有無或擴增效率。
圖14的流路15c、15d分別與圖16所示的陽性對照的反應、檢測系統(tǒng)連通，以及與圖17所示的陰性對照的反應、檢測系統(tǒng)連通，通過將試劑混合液輸送到其中，與在上述試樣的反應，檢測系統(tǒng)時同樣，使之在流路內(nèi)與試劑擴增反應后，使之與儲存于探針DNA儲存部的探針DNA在流路內(nèi)雜交，基于該反應生成物檢測擴增反應。
權利要求
1.一種試樣檢測用微型反應器，其具有(1)板狀的芯片，(2)具有用于分別儲存多種試劑的儲存室的多個試劑儲存部，(3)混合從前述多個試劑儲存部的出口送出的多種試劑從而生成混合試劑的試劑混合部，(4)具有用于從外部注入試樣的注入口的試樣接收部，和(5)使從前述試劑混合部送出的混合試劑和由試樣接收部送出的試樣混合反應的反應部，前述多個試劑儲存部、試劑混合部、試樣接收部和反應部組裝在前述芯片內(nèi)，并通過流路連通，前述試劑混合部有防止初期混合試劑送出到反應部的送出防止裝置。
2.權利要求1中記載的微型反應器，其中前述試劑混合部形成混合流路，向反應部送出混合試劑的送出流路在混合流路的中間部分分叉，防止初期混合試劑儲存于該混合流路的中間部與下游末端之間從送出流路送出到反應部。
3.權利要求2中記載的微型反應器，其中前述試劑混合部在前述混合流路與前述送出流路的連接部具有在前述混合流路內(nèi)的壓力達到規(guī)定壓力以上時向前述送出流路送出混合試劑的送液控制部。
4.權利要求3中記載的微型反應器，其中前述送液控制部是比前述分支流路的截面積更小的截面積的細流路。
5.權利要求1中記載的微型反應器，其中前述各試劑儲存部具有用于在儲存室中注入驅動液的注入口和用注入的試劑從儲存室將試劑壓出的出口。
6.權利要求5中記載的微型反應器，其中前述注入口和可與外部泵連接的泵連接部連接，通過外部泵將驅動液從注入口注入到儲存室中。
7.權利要求6中記載的微型反應器，其中前述注入口與前述泵連接部的連接部設置有末端開放的空氣排出流路。
8.權利要求7中記載的微型反應器，其中前述空氣排出流路的流路直徑為10μm以下，且與流路內(nèi)面的水的接觸角為30°以上。
9.權利要求5中記載的微型反應器，其中前述各試劑儲存部的出口中填充防止試劑流出的密封劑。
10.權利要求9中記載的微型反應器，其中前述密封劑在規(guī)定溫度以下固化、在室溫下融解成流動狀態(tài)。
11.權利要求9中記載的微型反應器，其中前述密封劑的熔點為8℃-25℃。
12.權利要求9中記載的微型反應器，其中前述密封劑是油脂或明膠的水溶液。
13.權利要求1中記載的微型反應器，其還具有在前述試劑混合部與前述反應部之間填充混合試劑、輸送規(guī)定量的混合試劑的試劑填充部。
14.權利要求13中記載的微型反應器，其中前述試劑填充部具有填充混合試劑的填充流路和設置于該填充流路的入口的逆流防止部、設置于該填充流路的出口的送液控制部、和設置于該填充流路的入口附近的分支流路，前述分支流路和可以與外部泵連接的泵連接部連接，在填充流路中填充混合試劑后，由外部泵通過分支流路用驅動液加壓以使填充流路內(nèi)的液壓達到規(guī)定以上，從而由送液控制部輸送填充的混合試劑的規(guī)定量。
15.權利要求14中記載的微型反應器，其中前述逆流防止部是閥體通過逆流壓關閉流路開口的止逆閥，或者閥體通過閥變形裝置在流路開口部推壓關閉該流路開口的活動閥。
16.權利要求1中記載的微型反應器，其中前述微型反應器是基因檢測用微型反應器。
17.權利要求16中記載的微型反應器，其中前述多個試劑儲存部儲存基因擴增反應中使用的試劑，將試樣或由試樣中提取的DNA注入到前述試劑儲存部中。
18.權利要求16中記載的微型反應器，其還具有儲存陽性對照的陽性對照儲存部、儲存陰性對照的陰性對照儲存部、和儲存與經(jīng)基因擴增反應擴增的檢測對象的基因雜交的探針DNA的探針DNA儲存部。
19.權利要求17中記載的微型反應器，其中前述芯片中通過泵連接部與微型泵連接，向流路輸送儲存于試樣儲存部的試樣或從試樣中提取的DNA、和儲存于試樣儲存部的試劑，在流路內(nèi)混合使之擴增反應后，向其下游側的流路輸送處理了該反應液的處理液、和儲存于探針DNA儲存部的探針DNA，在流路內(nèi)混合使之雜交后，基于該反應生成物進行擴增反應的檢測；對于儲存于陽性對照儲存部中的陽性對照及儲存于陰性對照儲存部中的陰性對照，同樣使之與儲存于試劑儲存部的試劑在流路內(nèi)擴增反應后，使之在流路內(nèi)與儲存于探針DNA儲存部的探針DNA雜交，基于該反應生成物進行擴增反應的檢測。
20.權利要求17中記載的微型反應器，其中設置在前述試樣儲存部中注入試樣或從試樣提取的RNA的同時，儲存用于由其中所含的RNA通過逆轉錄反應合成cDNA的逆轉錄酶的逆轉錄酶儲存部；向流路輸送儲存于試樣儲存部中的試樣或從試樣提取的RNA、和儲存于逆轉錄酶儲存部的逆轉錄酶，在流路內(nèi)混合，合成cDNA后，進行前述擴增反應及其檢測。
21.一種試樣檢測用微型反應器，其設置有(1)板狀的芯片，(2)具有用于分別儲存多種試劑的儲存室的多個試劑儲存部，(3)混合從前述多個試劑儲存部的出口送出的多種試劑從而生成混合試劑的試劑混合部，(4)具有用于從外部注入試樣的注入口的試樣接收部，和(5)使從前述試劑混合部送出的混合試劑和由試樣接收部送出的試樣混合反應的反應部，前述多個試劑儲存部、試劑混合部、試樣接收部和反應部組裝在前述芯片內(nèi)，并通過流路連通；前述各試劑儲存部有用于在儲存室注入驅動液的注入口，和用于通過注入的試劑從儲存室推出試劑的出口，前述注入口和可以與外部泵連接的泵連接部連接，驅動液通過外部泵從注入口注入到儲存室，前述注入口與前述泵連接部的連接部中設置有末端開放的空氣排出流路。
22.權利要求21中記載的微型反應器，其中前述空氣排出流路的流路直徑為10μm以下，且與流路內(nèi)面的水的接觸角為30°以上。
23.權利要求21中記載的微型反應器，其中前述試劑混合部具有防止初期混合試劑送出到反應部的送出防止裝置。
24.權利要求23中記載的微型反應器，其中前述試劑混合部形成混合流路，向反應部送出混合試劑的送出流路在混合流路的中間部分分叉，防止初期混合試劑儲存于該混合流路的中間部與下游末端之間以后從送出流路送出到反應部。
25.權利要求24中記載的微型反應器，其中前述試劑混合部在前述混合流路與前述送出流路的連接部具有在前述混合流路內(nèi)的壓力達到規(guī)定壓力以上時向前述送出流路送出混合試劑的送液控制部。
26.權利要求25中記載的微型反應器，其中前述送液控制部是比前述分支流路的截面積更小的截面積的細流路。
全文摘要
一種試樣檢測用微型反應器，其具有(1)板狀的芯片、(2)具有用于分別儲存多種試劑的儲存室的多個試劑儲存部、(3)混合從前述多個試劑儲存部的出口送出的多種試劑從而生成混合試劑的試劑混合部、(4)具有用于從外部注入試樣的注入口的試樣接收部、和(5)使前述從試劑混合部送出的混合試劑和由試樣接收部送出的試樣混合反應的反應部，前述多個試劑儲存部、試劑混合部、試樣接收部、和反應部組裝在前述芯片內(nèi)，并通過流路連通，前述試劑混合部有防止初期混合試劑送出到反應部的送出防止裝置。
文檔編號C12M1/00GK1950504SQ20058001410
公開日2007年4月18日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權日2004年5月7日
發(fā)明者中島彰久, 上田榮一, 東野楠, 山東康博, 石田暢久 申請人:柯尼卡美能達醫(yī)療印刷器材株式會社