專利名稱：一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種魚類精巢生物反應(yīng)器的制備方法，還涉及一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備藥用蛋白質(zhì)、工業(yè)酶、疫苗和抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器是指將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞或動植物、微生物，利用細(xì)胞增殖或生物體代謝制備外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要包括轉(zhuǎn)基因微生物生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器和轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器三大類。轉(zhuǎn)基因微生物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的產(chǎn)物一般不具備生物活性，須經(jīng)過后續(xù)的糖基化、羥基化等一系列修飾加工，工藝繁瑣，耗時費力。轉(zhuǎn)基因動植物生物反應(yīng)器的產(chǎn)物具有 天然的生物活性，產(chǎn)品無需后加工過程，受到研究者們的青睞和社會各界的關(guān)注。就轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器而言，最令人矚目的是轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器。利用乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)的重組人抗凝血酶III是第一個獲準(zhǔn)上市的動物生物反應(yīng)器蛋白藥物(GTC Bio-therapeutics. Inc. http://www. transgenics. com/pressre_leases/pr060206·html);轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組蛋白已進(jìn)入臨床III期試驗；數(shù)百種重組蛋白處于研發(fā)階段。由于轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的主體是哺乳動物，有限的卵細(xì)胞數(shù)量和胚胎的體內(nèi)發(fā)育使得轉(zhuǎn)基因操作極其困難，加上擴(kuò)群速度緩慢，產(chǎn)品難以實現(xiàn)快速規(guī)模化生產(chǎn)。魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，受精和胚胎發(fā)育過程在體外進(jìn)行，易于轉(zhuǎn)基因操作和篩選目的基因高表達(dá)的個體，以建立多途高效生物反應(yīng)器平臺；紅鯉懷卵量大，性成熟的雌魚每尾可產(chǎn)卵5萬顆以上，具有擴(kuò)群速度快的特點；紅鯉生長快，雄性個體在南方地區(qū)一年即可性成熟，精液平均產(chǎn)量10_20ml/尾/次，總蛋白含量為3. 04mg/ml ;在人工控制環(huán)境下，紅鯉可多季節(jié)，甚至常年生產(chǎn)精液，按每畝水面養(yǎng)殖1000尾雄魚，每半個月生產(chǎn)一批次精液，平均每尾產(chǎn)精液IOml計算，年產(chǎn)精液可高達(dá)240，OOOml0魚類精巢生物反應(yīng)器具有研制快捷、規(guī)?；杆俚奶攸c，適合生產(chǎn)中低需求量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，應(yīng)對瞬息萬變的市場需求。魚類精巢生物反應(yīng)器將成為生物反應(yīng)器家族中一個重要的成員。禽流感(Avian influenza, Al),又稱真性雞痕,是由A型流感病毒引起的禽類的一種急性、高度致死性傳染病。禽流感根據(jù)病原體表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)分成若干亞型，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種血凝素亞型(Hl H15)和有9種神經(jīng)氨酸酶亞型(NI N9), H 5N1屬于高致病性的一種亞型。高致病性禽流感病毒不僅可感染家禽，而且能突破種屬屏障，感染人類，禽流感被國際獸醫(yī)局定為A類傳染病，我國將其列為一類動物疫病，禽流感的預(yù)防和控制是關(guān)乎禽類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類健康的重大課題。目前，用于預(yù)防和控制病毒性流行病的疫苗主要包括全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗。全病毒滅活疫苗的生產(chǎn)存在安全隱患，可能對環(huán)境和生產(chǎn)人員健康構(gòu)成威脅；減毒活疫苗研發(fā)困難，且存在毒力恢復(fù)、形成新流感毒株的潛在的風(fēng)險。傳統(tǒng)亞單位疫苗從病毒粒子中分離獲得，雖安全性得到保障，但生化制備工藝復(fù)雜、成本高昂，難以推廣應(yīng)用。隨著基因克隆、DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，利用真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)廉價的目標(biāo)蛋白成為可能，藉此生產(chǎn)的亞單位疫苗同時具備良好的免疫原性和高度的安全性，是目前該領(lǐng)域研究的熱點。本發(fā)明利用紅鯉精巢作為生物反應(yīng)器，制備禽流感病毒H5N1表面抗原一血凝素蛋白，建立一個H5N1亞單位疫苗的生產(chǎn)平臺
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器的制備方法，方法易行，操作簡便。鯉魚精巢生物反應(yīng)器是一種以轉(zhuǎn)基紅鯉為宿主動物、紅鯉精巢為產(chǎn)物特異表達(dá)組織的生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器具有研制快捷、規(guī)模化迅速的特點，適合生產(chǎn)中低需求量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，可應(yīng)對瞬息萬變的市場需求。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備藥用蛋白質(zhì)、工業(yè)酶、疫苗和抗體中的應(yīng)用，通過將兩個魚類精巢特異高效表達(dá)啟動子分別與目的蛋白基因進(jìn)行重組，通過顯微注射方法，將重組基因?qū)爰t鯉受精卵，使其在基因組中穩(wěn)定整合，從而在精液中獲得目的蛋白，可實現(xiàn)對目的蛋白的規(guī)?；a(chǎn)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器，通過以下步驟制備得到I)、篩選精液中高表達(dá)基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達(dá)的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達(dá)量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153和BC076027 ;與斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；2)、重組載體的構(gòu)建通過重疊PCR方法，構(gòu)建分別由Q2和Q3驅(qū)動的目的蛋白基因基因表達(dá)載體；3)、轉(zhuǎn)基因魚的制備采用顯微注射法(Zhu，et al. 1985)，將兩個重組基因片段分別導(dǎo)入紅鯉受精卵中，常規(guī)方法孵化、養(yǎng)殖(可參考http: //baike. baidu. com/view/3868648, htm 中的內(nèi)容)；4)、陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采集性成熟轉(zhuǎn)基因紅鯉精液，提取基因組DNA，采用常規(guī)PCR方法，檢測篩選轉(zhuǎn)植基因陽性個體；5)、高表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采用ELISA方法，檢測轉(zhuǎn)基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達(dá)個體作為父本，繁殖擴(kuò)群，獲得反應(yīng)器群體。一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備禽流感病毒血凝素H5N1-HA (藥用蛋白質(zhì)或抗體或工業(yè)酶)中的應(yīng)用，其步驟是I)、篩選精液中高表達(dá)基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達(dá)的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達(dá)量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153和BC076027 ;與斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；2)、重組載體的構(gòu)建采用重疊PCR方法，構(gòu)建分別由Q2和Q3驅(qū)動的H5N1-HA基因的重組表達(dá)載體，分別命名為PQ2-HA (圖2)和pQ3-HA (圖3)。其中，Q2、Q3啟動子DNA片段根據(jù)步驟I)中克隆獲得的序列，從斑馬魚基因組中PCR擴(kuò)增獲得，H5N1-HA基因DNA片段根據(jù)GenBank中的序列資料(序列號EF624256)生化合成獲得(由上海生工生物工程公司合成);3)、轉(zhuǎn)基因魚的制備采用顯微注射法(Zhu，et al. 1985)，將兩個重組基因片段分別導(dǎo)入紅鯉受精卵中，常規(guī)方法孵化、養(yǎng)殖；4)、陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采集性成熟轉(zhuǎn)基因紅鯉精液，提取基因組DNA，采用常規(guī)PCR方法，檢測篩選轉(zhuǎn)植基因陽性個體；5)、高表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選及蛋白檢測采用ELISA方法，檢測轉(zhuǎn)基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達(dá)個體作為父本，繁殖擴(kuò)群，獲得反應(yīng)器群體，H5N1-HA高表達(dá)于紅鯉精液中。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果 I、研制簡便魚類的受精和胚胎發(fā)育過程在體外完成，易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作和大規(guī)模篩選，進(jìn)而獲得目的基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因個體；2、擴(kuò)群迅速魚類懷卵量大，性成熟紅鯉懷卵量高達(dá)50，000顆/尾，能迅速形成大規(guī)模轉(zhuǎn)基因魚群體；3、持續(xù)高效紅鯉生長快，雄性個體在南方地區(qū)一年即可性成熟，精液平均產(chǎn)量10-20ml/尾/次，總蛋白含量為3. 04mg/ml ;在人工控制條件下，紅鯉可常年產(chǎn)生精液。魚類精巢生物反應(yīng)器可持續(xù)高效生產(chǎn)目的基因蛋白。


圖I為一種斑馬魚精液中特異表達(dá)的六個基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖?！癕” 為分子量 Marker I”、“2”、“3”、“4”、“5” 和 “6” 泳道分別是 ΝΜ_001002099,NM_212788、BC122153、NM_001003646、BC076027 和 NM_001080035 基因的 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為一種表達(dá)載體pQ2-HA示意圖。長度8682bp ;抗性氨節(jié)。圖3為一種表達(dá)載體pQ3-HA示意圖。長度8759bp ;抗性氨芐。圖4為一種轉(zhuǎn)H5N1-HA基因紅鯉陽性魚PCR檢測電泳圖?！癕”為分子量DL2000Marker ;箭頭所示為PCR擴(kuò)增條帶。圖5為一種使用Curve Expertl. 3繪制出的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式實施例I :一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器的制備方法，通過以下步驟制備得到I)、篩選精液中高表達(dá)基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達(dá)的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達(dá)量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153(SEQ ID NO. I)和BC076027(SEQ ID NO. 3);與斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示；Q3，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示；2)、重組載體的構(gòu)建通過重疊PCR方法，構(gòu)建分別由Q2和Q3驅(qū)動的目的蛋白基因基因表達(dá)載體；3)、轉(zhuǎn)基因魚的制備采用顯微注射法(Zhu，et al. 1985)，將兩個重組基因片段分別導(dǎo)入紅鯉受精卵中，常規(guī)方法孵化、養(yǎng)殖；4)、陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采集性成熟轉(zhuǎn)基因紅鯉精液，提取基因組DNA，采用常規(guī)PCR方法，檢測篩選轉(zhuǎn)植基因陽性個體；5)、高表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采用ELISA方法，檢測轉(zhuǎn)基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達(dá)個體作為父本，繁殖擴(kuò)群，獲得反應(yīng)器群體。
實施例2 —種魚類精巢生物反應(yīng)器在制備H5N1-HA中的應(yīng)用，其步驟是A.精巢特異聞效表達(dá)基因啟動子的篩選，其步驟是首先對斑馬魚的精液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，生物信息學(xué)分析質(zhì)譜檢測結(jié)果，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達(dá)的基因(表I);然后提取斑馬魚精巢總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RT-PCR驗證(RT-PCR引物見表2)以上六個基因在精巢中的表達(dá)(圖I);最后挑選表達(dá)量最高的二個基因，序列號分別為BC122153，其核苷酸序列為SEQID NO. I所示，和BC076027，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示，與斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫比較，獲得這二個基因的啟動子序列，分別命名為Q2 (其核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示)和Q3 (其核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示)。表I斑馬魚精液中特異表達(dá)的六個基因的基本信息
權(quán)利要求
1.一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器，由以下步驟制備得到 1)、篩選斑馬魚精液中高表達(dá)基因的啟動子對斑馬魚的精液蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，割取電泳條帶進(jìn)行質(zhì)譜檢測，獲得六個在斑馬魚精液中特異表達(dá)的基因；提取斑馬魚精巢總RNA，RT-PCR篩選出六個基因中表達(dá)量最高的兩個基因，基因庫序列號為BC122153和BC076027 ;與斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫比較，獲得這兩個基因的啟動子序列，命名為Q2和Q3 ； 2)、重組基因表達(dá)載體的構(gòu)建通過重疊PCR方法，構(gòu)建分別由Q2和Q3驅(qū)動的目的蛋白基因表達(dá)載體； 3)、轉(zhuǎn)基因魚的制備采用顯微注射法，將兩個重組基因片段分別導(dǎo)入紅鯉受精卵中，常規(guī)方法孵化、養(yǎng)殖； 4)、陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采集性成熟轉(zhuǎn)基因紅鯉精液，提取基因組DNA，采用常規(guī)PCR方法，檢測篩選轉(zhuǎn)植基因陽性個體； 5)、高表達(dá)陽性轉(zhuǎn)基因魚的篩選采用ELISA方法，檢測轉(zhuǎn)基因紅鯉精液中目的蛋白含量，選擇高效表達(dá)個體作為父本，繁殖擴(kuò)群，獲得反應(yīng)器群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器，其特征在于所述的目的蛋白為禽流感病毒血凝素。
3.權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器，其特征在于所述的Q2啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
4.權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器，其特征在于所述的Q3啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4所示。
5.權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備藥用蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備藥用工業(yè)酶中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備藥用疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述的一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器在制備藥用抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器的制備方法及應(yīng)用，一種鯉魚精巢生物反應(yīng)器，其制備步驟為A.篩選在精液中高表達(dá)基因的啟動子;B.構(gòu)建在魚類精巢中特異表達(dá)的目的基因表達(dá)載體；C.將重組基因片段導(dǎo)入紅鯉受精卵，使其在基因組中穩(wěn)定整合；D.目的基因在轉(zhuǎn)基因紅鯉精巢中高效表達(dá)，獲得一種高效表達(dá)目的基因的生物反應(yīng)器。利用魚類精巢基因特異表達(dá)的屬性，可構(gòu)建安全高效、可持續(xù)利用的生物反應(yīng)器；同時魚類具有擴(kuò)群速度快和養(yǎng)殖成本低的特點，可實現(xiàn)生物反應(yīng)器的規(guī)模化、低成本運行。
文檔編號A61K39/00GK102796763SQ201210282430
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者阮慧云, 李良明 申請人:武漢達(dá)邦生物科技有限公司