本發(fā)明涉及了一種質粒及其構建方法與應用，尤其是涉及了一種家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒及其構建方法和應用。

背景技術：

piggyBac轉座子最初是從粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368細胞株的基因組中分離得到的，是目前發(fā)現(xiàn)的轉座活性最高的DNA轉座子。piggyBac轉座系統(tǒng)是一種非病毒載體，轉座效率較高。與sleeping beauty相比，piggyBac載體容量較大，可攜帶18kb,可以實現(xiàn)多基因的共表達，且轉座片段被切除后不會在原位點留下印跡(footprint)，基因組可以實現(xiàn)切除后精確修復，在可逆轉基因的應用中具有重要作用。

piggyBac轉座子介導的轉基因家蠶絲腺生物反應器的研究開展了十幾年，世界各國的科學家致力于外源基因的表達，已經(jīng)建成了以絲素蛋白輕鏈啟動子(Fib-L Promoter)、絲素蛋白重鏈啟動子(Fib-H Promoter)和絲膠蛋白1啟動子(Ser1Promoter)表達外源蛋白的轉基因家蠶絲腺生物反應器。

由于piggyBac載體多數(shù)含有兩個表達框，具有較多的元件和相同的酶切位點，所以，每次表達不同的外源基因時，需要從頭構建質粒，組裝啟動子、信號肽、外源基因、polyA等結構，費時費力，工作效率低下。

另一方面，但縱觀十幾年來國內(nèi)外家蠶生物反應器的研究結果，轉基因家蠶絲腺生物反應器的外源蛋白表達效率都很低，不管是絲膠啟動子驅動表達的外源基因，還是絲素啟動子驅動表達的外源基因，極大多數(shù)實驗的表達量都沒有在達到繭層量的1％左右，遠遠沒有達到科學家們期望的象表達蠶絲蛋白那樣的高效表達水平。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決背景技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提出了一種家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒及其構建方法和應用，具體是利用常規(guī)構建質粒的生物技術方法構建一種不含目的基因，但擁有其它所有必需元件的通用型質粒。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案的步驟如下：

一、一種家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒：

所述的質粒為pBac[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac轉座子為基礎并帶有Amp抗性基因，包括piggyBac轉座子的兩個轉座臂PBL和PBR，以及兩個轉座臂之間的兩個功能表達框。

一個功能表達框是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一個功能表達框是包含家蠶絲膠蛋白1基因啟動子、18s rRNA啟動子、絲素蛋白輕鏈基因信號肽、六聚組氨酸、腸激酶酶切位點和家蠶絲素蛋白輕鏈基因3’末端序列的表達框，即Ser1Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。

所述的DDDDK-FLPA之間含有專一性的ApaI和NheI的兩個酶切位點，兩個酶切位點用于將質粒特異性切開連接外源基因后形成有功能的質粒。

二、一種家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒的構建方法，該方法的步驟如下：

1)通過分子生物學方法構建包含[絲膠蛋白1基因啟動子575-海腎螢光素酶基因-SV40]-[絲膠蛋白1基因啟動子4023-螢火蟲螢光素酶基因-SV40]-[A3基因啟動子-EGFP-SV40]([Ser 575-Rluc-SV40]-[Ser 4023-Fluc-SV40]-[A3-GFP-SV40])的質粒piggy-14413，以質粒piggy-14413為模板，質粒piggy-14413的堿基序列如SEQ ID NO.1，以如SEQ ID NO.2的ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2為引物，采用PCR擴增獲得片段長為583bp的絲膠基因啟動子，其堿基序列如SEQ ID NO.4；

2)用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切質粒piggy-5257，質粒piggy-5257的堿基序列如SEQ ID NO.5，得到長度為4549bp，包含18s rRNA基因啟動子-絲素輕鏈蛋白信號肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列(18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的片段；

連接步驟1)獲得的絲膠蛋白1基因啟動子與包含18s rRNA基因啟動子-絲素輕鏈蛋白信號肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列和Amp抗性基因的片段，得到包含絲膠蛋白1基因啟動子-18s rRNA基因啟動子-絲素輕鏈蛋白信號肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列(Ser 1-18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的質粒piggy-5140；

3)用AflII和BglII、ScaI酶切步驟2)獲得的piggy-5140質粒，得到長度為2493bp的包含絲膠蛋白1基因啟動子-18s rRNA基因啟動子-絲素輕鏈蛋白信號肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列 (Ser1-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；

4)用AflII和BglII雙酶切包含A3基因啟動子-綠色熒光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的質粒piggy-6212，質粒piggy-6212的堿基序列如SEQ ID NO.6，得到長度為5870bp的包含A3基因啟動子-綠色熒光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；

5)連接步驟3)獲得的包含絲膠蛋白1基因啟動子-18s rRNA基因啟動子-絲素輕鏈蛋白信號肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列的片段與步驟4)獲得的包含A3基因啟動子-EGFP-SV40的片段，得到包含A3基因啟動子-EGFP-SV40-絲膠基因啟動子-18s rRNA基因啟動子-絲素輕鏈蛋白信號肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列([A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA])的家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒piggy-8363質粒作為本發(fā)明所述的質粒，其堿基序列如SEQ ID NO.7。

三、所述質粒用于構建表達各種外源基因的donor質粒的應用。

本發(fā)明先設計引物，用PCR的方法獲得獲得絲膠蛋白1基因啟動子的序列；再分別用限制性內(nèi)切酶酶切相應的片段，電泳得到目的條帶后，切膠回收，用T4連接酶將相應的片段相連，使所需的元件(Ser Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA)依次連接；然后將標記基因與上述元件整合到同一個質粒，得到含有雙啟動子的通用型質粒，最終如圖1所示。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明質?？蓪τ谌我庖环N外源基因，只需經(jīng)一步酶切連接反應，就將任何一種外源基因導入質粒，構建成有功能的能夠表達外源基因的質粒，且可以利用雙啟動子啟動外源基因表達，旨在提高外源基因的表達量。

附圖說明

圖1是本發(fā)明Ser1和18s rRNA雙啟動子通用型質粒的組成示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明的實施例如下：

(1)設計引物，以piggy-14413質粒(SEQ ID NO.1)為模板，獲得絲膠蛋白1基因啟動子(SEQ ID NO.4)。并在啟動子5’端加EcoRⅠ的酶切位點，在3’端加KpnI的酶切位點。用EcoRⅠ和KpnI雙酶切PCR產(chǎn)物，得到593bp的片段，即絲膠蛋白1基因啟動子，然后膠回收；用EcoRⅠ和KpnI雙酶切piggy-5257 質粒(SEQ ID NO.5)，得到4549bp的片段，膠回收；將所得到的2個片段連接，連接后的質粒命名為piggy-5140質粒。

(2)用AflII和BglII、ScaI酶切piggy-5140質粒，得到長度為2493bp的片段；用AflII和BglII雙酶切piggy-6212質粒(SEQ ID NO.6)，得到長度為5870bp的片段，連接上述兩目的片段，得到piggy-8363質粒(SEQ ID NO.7)，即家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒。

(3)用ApaI和NheI雙酶切piggy-8363質粒，得到長度為8361bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA和Amp抗性基因的基因序列。將上游端帶有ApaI酶切粘性末端序列、下游端帶有NheI酶切粘性末端序列的T4連接酶基因與上述片段連接，構建成家蠶中部絲腺生物反應器表達T4連接酶基因的質粒piggy-9887，該質粒包含的表達框序列為[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]。

上述結果說明，利用家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒piggy-8363，僅僅一步就能夠得到在家蠶中部絲腺表達T4連接酶基因的質粒。

采用轉基因家蠶技術將該雙啟動子質粒導入家蠶基因組，獲得的轉基因家蠶的T4連接酶基因表達量，比用單個絲膠蛋白1啟動子啟動的T4連接酶基因表達量高1.2倍，結果差異達到顯著水平。

說明利用本發(fā)明的家蠶中部絲腺生物反應器雙啟動子通用型質粒構建轉基因家蠶的donor質粒，操作程序簡單，工作效率高，而且外源基因的表達量也有顯著提高。